CN116888476A - 成人斯蒂尔病的检查方法及检查试剂盒 - Google Patents

成人斯蒂尔病的检查方法及检查试剂盒 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种对成人斯蒂尔病(ASD)的判定有用的方法。更具体而言，本公开涉及以下。(I)一种成人斯蒂尔病的检查方法，其包含下述(1)和(2)：(1)测定从受检对象采集的血液试样中的改性CRP浓度的工序；以及(2)将测定出的改性CRP浓度和/或基于其的指标值与基准值进行比较的工序。(II)一种改性CRP特异性抗体；以及(III)一种成人斯蒂尔病的检查试剂盒。

Description

成人斯蒂尔病的检查方法及检查试剂盒
技术领域
本公开涉及成人斯蒂尔病(Still's disease)的检查方法及检查试剂盒等。
背景技术
C-反应性蛋白(CRP)作为炎症标志物而被广泛应用。作为CRP，启示存在构象不同的类型、即作为天然CRP的五聚体CRP(pCRP)、以及因五聚体CRP的改性而构成因子发生了解离的改性CRP、代表性地为单体CRP(mCRP)，分别发挥不同的生理学作用。
用于炎症指标的CRP的临床检查试剂旨在测定天然CRP的浓度，并不是能够特异性地测定mCRP那样的改性CRP的浓度的试剂，因此在临床现场，改性CRP的浓度测定并不是通常的。作为改性CRP的浓度，报告了急性心肌梗塞患者来源的血浆中的改性CRP浓度(20.96ng/mL)(非专利文献5)、以及银屑病、湿疹和荨麻疹(皮肤相关自身免疫疾病)患者来源的血浆中的改性CRP浓度(分别为35.4ng/mL、30.0ng/mL和59.8ng/mL)(非专利文献6)。
成人斯蒂尔病(Adult Still’s Disease：ASD)是以发热、关节炎、皮疹这3个症状为主的疾病。ASD中有成人发病的类型即成人发病斯蒂尔病(Adult Onset Still’sDisease：AOSD)、以及从幼年时发病的全身型幼年性特发性关节炎(sJIA)迁移的ASD。ASD容易与呈现类似症状的类似疾病混淆(非专利文献1～3)。因此，ASD的诊断按照Yamaguchi等的分类基准(非专利文献4)，以类似疾病的排除诊断为基本。作为这样的类似疾病之一，有血管炎。但是，在血管炎中，有时可见仅呈现发热和CRP高值的病例。就这样的血管炎的病例而言，难以与ASD鉴别。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：永井弥生，2006，日本皮膚科学会雑誌，116(4)：429－436.
非专利文献2：荻野昇，2009，日本内科学会雑誌，98(10)：2421－2431.
非专利文献3：長澤浩平，2010，日本内科学会雑誌，99(10)：2460－2466.
非专利文献4：Yamaguchi et al.,1992,The Journal of Rheumatology,19：424-430.
非专利文献5：Wang et al.,Atherosclerosis,2015,vol.239,p.343-349
非专利文献6：Zhang et al.,Frontiers in Immunology,2018,vol.9,Article511
发明内容
发明所要解决的课题
本公开的目的在于提供对ASD的判定有用的方法。
用于解决课题的手段
本发明者们进行了深入研究，结果发现，改性CRP浓度和/或基于其的指标值(例如CRP改性度)对ASD的检查是有用的(实施例5)。令人感兴趣且预料不到的是，ASD患者来源的血液试样中的改性CRP浓度显著地高于本发明者们掌握的已报告的改性CRP浓度，并且ASD与其他炎症性疾病相比，显示出最高的CRP改性度(实施例5)。
基于上述认知，本发明者们发现，可以基于改性CRP浓度和/或基于其的指标值来检查和鉴别ASD。
即，本公开涉及以下等内容。
在一个实施方式中，公开了一种成人斯蒂尔病的检查方法，其包含下述(1)和(2)：
(1)测定从受检对象采集的血液试样中的改性CRP浓度的工序；以及
(2)将测定出的改性CRP浓度和/或基于其的指标值与基准值进行比较的工序。
在另一实施方式中，公开了一种成人斯蒂尔病的检查试剂盒，其包含改性CRP特异性抗体。
在特定的实施方式中，上述方法和试剂盒中的受检对象可以是患有炎症性疾病的受检对象、或疑似患有炎症性疾病的受检对象。
在特定的实施方式中，上述方法及试剂盒中的受检对象也可以是患有除感染症以外的疾病的受检对象、或疑似患有除感染症以外的疾病的受检对象。
在特定的实施方式中，上述方法和试剂盒可以是用于将成人斯蒂尔病从血管炎、风湿性关节炎、风湿性多发性肌痛或系统性红斑狼疮中鉴别出来的方法和试剂盒。
在特定的实施方式中，上述方法和试剂盒中利用的指标值可以是根据改性CRP浓度与CRP值之间的关系式算出的值。
在特定的实施方式中，上述方法和试剂盒中利用的根据改性CRP浓度与CRP值之间的关系式算出的值可以是根据改性CRP浓度与CRP值之间的相对关系式算出的值。
在特定的实施方式中，上述方法和试剂盒中的受检对象可以是测定了CRP值的受检对象。
在特定的实施方式中，上述方法和试剂盒中的受检对象可以是显示比基准值高的CRP值的受检对象。
在特定的实施方式中，上述方法和试剂盒中的受检对象可以是未测定CRP值的受检对象，上述方法和试剂盒可以进一步包含测定从受检对象采集的血液试样中的CRP值的工序或针对CRP的抗体。
在特定的实施方式中，上述方法和试剂盒可以对应于进一步包含以下工序的检查：分选测定出的CRP值比基准值高的受检对象，供于所述进行比较的工序。
在特定的实施方式中，上述方法和试剂盒可以用于使用改性CRP特异性抗体来测定改性CRP浓度。
在特定的实施方式中，上述方法和试剂盒可以用于使用选自下述(1)～(3)中的改性CRP特异性抗体或其组合来测定改性CRP浓度：
(1)包含下述(1a)和(1b)的抗体
(1a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号4的氨基酸序列中的第20～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(1b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号9的氨基酸序列中的第20～131位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列；
(2)包含下述(2a)和(2b)的抗体
(2a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号14的氨基酸序列中的第20～141位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(2b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号19的氨基酸序列中的第21～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列；以及
(3)包含下述(3a)和(3b)的抗体
(3a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号24的氨基酸序列中的第20～141位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(3b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号29的氨基酸序列中的第21～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列。
在另一实施方式中，公开了一种改性CRP特异性抗体，其选自下述(1)～(3)：
(1)包含下述(1a)和(1b)的抗体
(1a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号4的氨基酸序列中的第20～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(1b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号9的氨基酸序列中的第20～131位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列；
(2)包含下述(2a)和(2b)的抗体
(2a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号14的氨基酸序列中的第20～141位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(2b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号19的氨基酸序列中的第21～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列；以及
(3)包含下述(3a)和(3b)的抗体
(3a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号24的氨基酸序列中的第20～141位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(3b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号29的氨基酸序列中的第21～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列。
发明效果
根据本公开，能够进行ASD的检查以及将ASD从血管炎、风湿性关节炎、风湿性多发性肌痛或系统性红斑狼疮中鉴别出来，能够辅助临床诊断。
附图说明
图1是表示人CRP的氨基酸序列(GenBank登录号：AAL48218)、以及被人改性CRP特异性中和抗体识别的人CRP中的中和表位(序列号2)(全长氨基酸序列中的第99～108位。信号除去序列中的第81～90位)的图。
图2是表示通过抑制ELISA(inhibition ELISA)对从培养杂交瘤mCRP-3C而得到的培养上清液中纯化的IgG进行分析的结果的图。抑制(-)：使用将从杂交瘤的培养上清液中纯化的IgG与不含人单体CRP(mCRP)和人五聚体(pCRP)(与单独的“CRP”的含义相同)这两者的溶液预孵育而得到的溶液时的实验结果(对照)；mCRP抑制：使用将从杂交瘤的培养上清液中纯化的IgG与含有过量的人mCRP的溶液预孵育而得到的溶液时的实验结果；pCRP抑制：使用将从杂交瘤的培养上清液中纯化的IgG与含有过量的人pCRP的溶液预孵育而得到的溶液时的实验结果(图3、图4也同样)。
图3是表示通过抑制ELISA对从培养杂交瘤mCRP-12C而得到的培养上清液中纯化的IgG进行分析的结果的图。
图4是表示通过抑制ELISA对从培养杂交瘤mCRP-3C、mCRP-12C、mCRP-18A而得到的培养上清液中纯化的IgG进行分析的结果的图。
图5是表示从培养杂交瘤mCRP-3C而得到的培养上清液中纯化的抗体(3C)中的重链中的信号序列、以及CDR1(序列号5)、CDR2(序列号6)和CDR3(序列号7)的图。
图6是表示从培养杂交瘤mCRP-3C而得到的培养上清液中纯化的抗体(3C)中的轻链中的信号序列、以及CDR1(序列号10)、CDR2(序列号11)和CDR3(序列号12)的图。
图7是表示从培养杂交瘤mCRP-12C而得到的培养上清液中纯化的抗体(12C)中的重链中的信号序列、以及CDR1(序列号15)、CDR2(序列号16)和CDR3(序列号17)的图。
图8是表示从培养杂交瘤mCRP-12C而得到的培养上清液中纯化的抗体(12C)中的轻链中的信号序列、以及CDR1(序列号20)、CDR2(序列号21)和CDR3(序列号22)的图。
图9是表示从培养杂交瘤mCRP-18A而得到的培养上清液中纯化的抗体(18A)中的重链中的信号序列、以及CDR1(序列号25)、CDR2(序列号26)和CDR3(序列号27)的图。
图10是表示从培养杂交瘤mCRP-18A而得到的培养上清液中纯化的抗体(18A)中的轻链中的信号序列、以及CDR1(序列号30)、CDR2(序列号31)和CDR3(序列号32)的图。
图11是表示成人发病斯蒂尔病(AOSD)、风湿性关节炎(RA)、风湿性多发性肌痛(PMR)以及血管炎的各患者的改性CRP浓度与CRP浓度的比率的图。
具体实施方式
(成人斯蒂尔病的检查方法)
本公开涉及一种成人斯蒂尔病(ASD)的检查方法。
检查方法包含下述(1)和(2)：
(1)测定从受检对象采集的血液试样中的改性CRP浓度的工序；以及
(2)将测定出的改性CRP浓度和/或基于其的指标值与基准值进行比较的工序。
在检查方法中，在测定出的改性CRP浓度比基准值高的情况下，可以作为成人斯蒂尔病的指标。另外，在基于改性CRP浓度的指标值是反映改性CRP浓度的高低而算出为较高的值的情况下，当基于测定出的改性CRP浓度的指标值比基准值高时，可以作为成人斯蒂尔病的指标。此外，在基于改性CRP浓度的指标值是反映改性CRP浓度的高低而算出为较低的值的情况下，当基于测定出的改性CRP浓度的指标值比基准值低时，可以作为成人斯蒂尔病的指标。
作为受检对象，例如可举出哺乳动物(例如人、猴等灵长类；小鼠、大鼠、仓鼠等啮齿类；狗、猫、兔、绵羊、山羊、驴、马、牛、猪等宠物或役用动物)。优选受检对象是人。
在一个实施方式中，受检对象可以是患有炎症性疾病的受检对象或疑似患有炎症性疾病的受检对象。在这样的受检对象中，可以检查是否有患有作为炎症性疾病的ASD的可能性。作为应与ASD鉴别的炎症性疾病，例如可举出血管炎、关节炎(例如风湿性关节炎、银屑病性关节炎、骨关节炎、幼年型关节炎)、系统性红斑狼疮、风湿性多发性肌痛、感染症(例如病毒、微生物、寄生虫)、心肌梗塞、皮肤相关炎症性疾病(例如银屑病、湿疹和荨麻疹)。根据上述方法，通过适当设定基准值等条件，可以将ASD从这样的炎症性疾病中鉴别出来。
在另一实施方式中，受检对象也可以是患有除感染症以外的疾病的受检对象、或疑似患有除感染症以外的疾病的受检对象。感染症有根据其症状常常容易诊断的情况。另外，感染症通过确定(例如基因-基因组的检测)病原体(例如病毒、微生物)而能够确诊，因此ASD大多容易与感染症区别。因此，在ASD的检查中，也可以检查患有除感染症以外的炎症性疾病的受检对象、或疑似患有除感染症以外的炎症性疾病的受检对象。
在又一实施方式中，受检对象也可以是期望将ASD与血管炎、类风湿性关节炎、风湿性多发性肌痛或系统性红斑狼疮相鉴别的受检对象。
在特定的实施方式中，受检对象也可以是测定了CRP值的受检对象。在该情况下，可以将显示比基准值高的CRP值的受检对象提供于检查方法。在CRP的临床检查中，虽然在检查机构或各国中基准可能不同，但作为处于正常范围的CRP浓度的一个标准，大多采用小于3μg/mL(0.3mg/dL)的浓度。因此，这样的基准值可以为3μg/L以上的浓度、优选为5μg/mL以上的浓度、更优选为10μg/mL以上的浓度、更进一步优选为20μg/mL以上的浓度、特别优选为30μg/mL以上的浓度、40μg/mL以上的浓度、或50μg/mL以上的浓度。这样的基准值还可以为100μg/mL以下的浓度，优选为90μg/mL以下的浓度，更优选为80μg/mL以下的浓度，更进一步优选为70μg/mL以下的浓度，特别优选为60μg/mL以下的浓度。更具体而言，这样的基准值可以为3～100μg/mL、优选为5～90μg/mL、更优选为10～80μg/mL、更进一步优选为20～70μg/mL、特别优选为30～60μg/mL、40～60μg/mL、或50～60μg/mL。
另外，在已经测定受检对象的CRP值的情况下，可以省略再次的CRP值的测定，因此可以简便地算出基于改性CRP浓度的指标值(例如根据后述那样的改性CRP浓度与CRP值之间的关系式算出的值)。
在另一特定实施方式中，受检对象可以是未测定CRP值的受检对象。在该情况下，检查方法还可以进一步包含测定从受检对象采集的血液试样中的CRP值的工序。通过这样的工序，在测定CRP值之后，可以分选出测定出的CRP值比基准值高的受检对象、以及算出基于改性CRP浓度的指标值(例如后述那样的根据改性CRP浓度与CRP值之间的关系式算出的值)。
作为血液试样，例如可举出全血(末梢血)、血浆和血清、以及对它们进行处理而得到的试样。作为这样的处理，例如可举出离心分离、分级、提取、过滤、沉淀、冷藏、冷冻以及加热。
浓度是每单位溶液量的目标物质的含量(例如以g/L、摩尔浓度等相对值规定的值)。因此，浓度也可以以规定量的溶液中的目标物质的绝对值(例如克、摩尔数)来评价。
改性CRP浓度的测定可以通过能够测定改性CRP的量的任意方法进行。作为这样的方法，例如可举出免疫测定法和色谱法(例如凝胶过滤色谱法)。作为免疫测定法，例如可举出酶免疫测定法(EIA)(例如直接竞争ELISA、间接竞争ELISA、夹心ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)、免疫层析法、发光免疫测定法、印迹法(例如Western blot法)、胶乳凝聚法。免疫测定法中，可以使用多克隆抗体、单克隆抗体、修饰抗体(例如单链抗体、Fc片段)等任意的抗体。
在通过免疫测定法进行改性CRP浓度的测定的情况下，免疫测定法可以使用改性CRP特异性抗体来进行。
“改性CRP特异性抗体”是指与对天然CRP的结合能力相比，对改性CRP(优选人单体CRP)的结合能力更高的抗体。
“人单体CRP”(mCRP)是指具有序列号1的氨基酸序列(GenBank登录号：AAL48218)的人CRP的单体蛋白(可以除去信号序列)或其天然产生的突变体(例如天然突变体、或者SNP或单体型(haplotype))。
“天然CRP”是指由上述人单体CRP构成的五聚体蛋白。
“改性CRP”是指因上述天然CRP的改性而构成因子发生了解离的改性CRP。作为改性CRP，例如可举出单体CRP(mCRP)、二聚体CRP、三聚体CRP和四聚体CRP、以及它们中的一种以上(例如两种、三种、四种)的组合。
在基于免疫测定法的改性CRP浓度的测定中，可以使用两种以上的抗体。在改性CRP浓度的测定中使用两种以上抗体的情况下(例如夹心测定)，可以使用包含改性CRP特异性的两种抗体(同种或异种，优选异种)的抗体的组。或者，也可以使用包含改性CRP特异性的一种抗体和针对天然CRP的一种抗体的组合的抗体的组。这是因为，如果至少一种抗体是改性CRP特异性抗体，则能够测定改性CRP。从提高针对改性CRP的特异性的观点出发，优选使用包含改性CRP特异性的两种抗体的抗体的组。例如，在使用两种以上的抗体的情况下，至少一种抗体可以作为固相抗体使用，至少一种抗体可以作为标记抗体使用。
改性CRP特异性抗体可以如下得到：1)通过使用改性CRP(优选人单体CRP)作为抗原，制作产生针对改性CRP的抗体的杂交瘤，2)使用改性CRP和五聚体CRP作为抗原，选择产生与单体CRP的结合能力比与五聚体CRP的结合能力高的抗体的杂交瘤，3)从所选择的杂交瘤的培养上清液中分离抗体，或者从整合有由杂交瘤产生的抗体的基因的转化细胞的培养物中分离抗体。改性CRP特异性抗体的确认可以通过下述来进行：使用改性CRP和五聚体CRP作为抗原，确认试验抗体与改性CRP的结合能力比与五聚体CRP的结合能力高(例如参照实施例中记载的抑制ELISA)。或者，作为改性CRP特异性抗体，存在公知的抗体(例如非专利文献3和4)，因此也可以将这样的公知的抗体用作改性CRP特异性抗体。
优选改性CRP特异性抗体可以为后述的抗体。
在一个实施方式中，将测定出的改性CRP浓度与基准值进行比较。就ASD而言，明确了血液试样中的改性CRP浓度高(实施例5)。因此，关于测定出的改性CRP浓度与基准值的比较结果，在测定出的改性CRP浓度比基准值高的情况下，可以判定为受检对象有可能患有ASD。
在另一实施方式中，将基于测定出的改性CRP浓度的指标值与基准值进行比较。这样的指标值只要是能够反映改性CRP浓度的高低的指标就没有特别限定。另外，明确了ASD中血液试样中的CRP值高以及ASD中改性CRP浓度与CRP值的相对比率(改性CRP浓度/CRP值)即CRP改性度高这样的认知(实施例5)，因此指标值可以基于这样的相对比来设定。
CRP值的测定可以通过能够测定CRP的量的任意方法进行。作为这样的方法，例如可举出上文所述的免疫测定法和色谱法(例如凝胶过滤色谱法)。
在通过免疫测定法进行CRP值的测定的情况下，免疫测定法可以使用针对CRP的抗体来进行。在包含针对用作炎症的指标的CRP的抗体的CRP的临床检查试剂虽然通常旨在测定天然CRP的浓度，但有时未确认或公开与改性CRP的结合性。这认为是由于天然CRP作为传统的炎症标志物而一直以来被广泛使用，但改性CRP的存在和意义一直以来并不明确，缺乏确认与改性CRP的结合性的动机，或者不需要公开与改性CRP的结合性或者需要性低。因此认为，CRP的临床检查试剂根据其种类不同有时包含能够与天然CRP和至少一部分的改性CRP结合的抗体来测定天然CRP和至少一部分的改性CRP的合计浓度。因此，CRP值可以是天然CRP浓度、或天然CRP浓度和至少一部分的改性CRP的浓度的合计浓度。在CRP的测定中，可以使用能够仅测定天然CRP的浓度的CRP的临床检查试剂、以及能够测定天然CRP和至少一部分的改性CRP的合计浓度的CRP的临床检查试剂中的任意一种。另外，由于能够与天然CRP和改性CRP结合的抗体是公知的(例如日本特开2004-189665号公报)，因此也可以将这样的公知的抗体用于测定。
在优选的实施方式中，基于改性CRP浓度的指标值是根据改性CRP浓度与CRP值之间的关系式算出的值。就ASD而言，如上所述，已明确了改性CRP浓度高、CRP值高以及改性CRP浓度与CRP值的相对比率高这样的认知。基于改性CRP浓度的指标值根据应鉴别的受检对象的种类(例如健康受检对象、炎症性疾病患者、血管炎患者、风湿性关节炎患者、风湿性多发性肌痛患者、系统性红斑狼疮患者)、以及所期望的诊断灵敏度和诊断特异性等因素的不同而不同，可以根据检查目的而适当设定。
作为根据改性CRP浓度与CRP值之间的关系式算出的值，例如可举出根据改性CRP浓度与CRP值之间的相对关系式算出的值、以及根据改性CRP浓度与CRP值之间的非相对关系式算出的值。
作为根据改性CRP浓度与CRP值之间的相对关系式算出的值，例如可举出根据下述式算出的值。
(A)(改性CRP浓度)n1/(CRP值)m1
[在此，n1是任意的指数(简单而言是1的整数)，m1是任意的指数(简单而言是1的整数)]。
[(B)(CRP值)n2/(改性CRP浓度)m2
在此，n2是任意的指数(简单而言是1的整数)，m2是任意的指数(简单而言是1的整数)]。
根据(A)的关系式算出的值是反映改性CRP浓度的高低而算出为较高的值。因此，在使用根据(A)的关系式算出的值作为指标值的情况下，当指标值比基准值高时，可以判定为受检对象有可能患有ASD。
另一方面，根据(B)的关系式算出的值是反映改性CRP浓度的高低而算出为较低的值。因此，在使用根据(B)的关系式算出的值作为指标值的情况下，当指标值比基准值低时，可以判定为受检对象有可能患有ASD。
简单而言，根据改性CRP浓度与CRP值之间的上述相对关系式算出的值可以是根据下述式算出的值。
(A')改性CRP浓度与CRP值的比率(改性CRP浓度/CRP值)(即CRP改性度)
(B')CRP值与改性CRP浓度的比率(CRP值/改性CRP浓度)
作为根据改性CRP浓度与CRP值之间的非相对关系式算出的值，例如可举出根据下述式算出的值。
(C)(改性CRP浓度)n5×(CRP值)m5
[在此，n5是任意的指数(最简单而言是1的整数)，m5是任意的指数(最简单而言是1的整数)]。
根据(C)的关系式算出的值是反映改性CRP浓度的高低而算出为较高的值。因此，在使用根据(C)的关系式算出的值作为指标值的情况下，当指标值比基准值高时，可以判定为受检对象有可能患有ASD。
简单而言，根据改性CRP浓度与CRP值之间的上述非相对关系式算出的值可以是根据下述式算出的值。
(C')改性CRP浓度×CRP值
作为根据改性CRP浓度与CRP值之间的关系式算出的值，优选根据改性CRP浓度与CRP值之间的相对关系式算出的值，更优选根据上述式(A)或(B)算出的值，特别优选根据上述式(A)算出的值(即CRP改性度)。
改性CRP浓度或基于其的指标值的基准值可以根据应鉴别的受检对象的种类(例如健康受检对象、炎症性疾病患者、血管炎患者、风湿性关节炎患者、风湿性多发性肌痛患者、系统性红斑狼疮患者)、以及所期望的诊断灵敏度和诊断特异性等因素的不同而不同。例如，作为这样的基准值，对于比较受检对象(例如健康受检对象、炎症性疾病患者、血管炎患者、风湿性关节炎患者、风湿性多发性肌痛患者、系统性红斑狼疮患者)的血液试样中的改性CRP浓度或基于其的指标值，可以适当使用在通常的范围内的值。另外，作为这样的基准值，例如可以使用临界值、或比较受检对象来源的血液试样中的改性CRP浓度或基于其的指标值的平均值、或者对该平均值加上一定的值而得到的值(例如平均值+SD、平均值+2SD)。临界值只要是本领域技术人员就可以适当设定。这样的基准值有时还根据改性CRP浓度和CRP值的测定方法的种类(例如免疫测定法中使用的抗体的种类)和有无使用作为用于根据CRP值分选受检对象的临界值的CRP值等因素而发生变动。
更具体而言，如果示出改性CRP浓度或基于其的指标值的例子，则改性CRP浓度的基准值例如可以为200ng/mL以上的值，优选为300ng/mL以上的值，更优选为400ng/mL以上的值，更进一步优选为500ng/mL以上的值(表5、7)。另外，作为改性CRP浓度的基准值，也可以方便地设置上限值。例如，这样的上限值可以为3000ng/mL以下的值、2500ng/mL以下的值、2000ng/mL以下的值、或1500ng/mL以下的值。
或者，如果示出CRP改性度(改性CRP浓度/CRP值)作为基于改性CRP浓度的指标值，则以改性CRP浓度(ng/mL)和CRP值(μg/mL)这样的不同的浓度单位计算比率时，CRP改性度的基准值可以为2.2以上的值，优选为2.3以上的值，更优选为2.4以上的值，更进一步优选为2.6以上的值(表5、7)。另外，作为CRP改性度的基准值，也可以方便地设置上限值。例如，这样的上限值可以为100以下的值、50以下的值、20以下的值、10以下的值、8以下的值、或6以下的值。当然，在以相同的浓度单位(ng/mL)计算比率的情况下，上述基准值为10-3的值。
改性CRP浓度或基于其的指标值可以多种组合使用。例如，作为组合，可以使用改性CRP浓度和基于其的1个以上的指标值的组合、以及基于改性CRP浓度的2个以上的指标值的组合。在这样的情况下，也可以平缓地设定各基准值的值。
ASD患者的改性CRP浓度在CRP值显示高值的炎症性疾病中也突出地高。因此，根据上述方法，可以将ASD(例如AOSD)患者从规定的受检对象(例如健康受检对象、炎症性疾病患者、血管炎患者、风湿性关节炎患者、风湿性多发性肌痛患者、系统性红斑狼疮患者)中鉴别出来。因此，上述方法对ASD(例如AOSD)的检查是有用的。
(抗体)
本公开涉及改性CRP特异性抗体及其相关发明。
抗体可以为选自下述(1)～(3)中的抗体。
(1)包含下述(1a)和(1b)的抗体
(1a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号4的氨基酸序列中的第20～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(1b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号9的氨基酸序列中的第20～131位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列；
(2)包含下述(2a)和(2b)的抗体
(2a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号14的氨基酸序列中的第20～141位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(2b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号19的氨基酸序列中的第21～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列；以及
(3)包含下述(3a)和(3b)的抗体
(3a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号24的氨基酸序列中的第20～141位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(3b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号29的氨基酸序列中的第21～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列。
优选抗体可以为选自下述(1)～(3)中的抗体。
(1)包含下述(1a)和(1b)的抗体
(1a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号4的氨基酸序列中的第20～469位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(1b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号9的氨基酸序列中的第20～238位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列；
(2)包含下述(2a)和(2b)的抗体
(2a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号14的氨基酸序列中的第20～465位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(2b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号19的氨基酸序列中的第21～240位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列；以及
(3)包含下述(3a)和(3b)的抗体
(3a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号24的氨基酸序列中的第20～476位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(3b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号29的氨基酸序列中的第21～240位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列。
或者，抗体也可以是包含下述(a)抗体重链和(b)抗体轻链的抗体，所述(a)抗体重链包含与序列号61、序列号63、序列号65、序列号67、序列号69、或序列号71的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，所述(b)抗体轻链包含与序列号73、序列号75、序列号77、或序列号79的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列。
上述同源性可以为91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上。同源性的计算可以通过算法blastp进行。更具体而言，同源性的算定可以在国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)中提供的算法blastp中，使用默认设定的评分参数(ScoringParameters)(Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence＝11Extension＝1；CompositionalAdjustments：Conditional compositional score matrix adjustment)来进行。
另外，与目标氨基酸序列显示所期望的同源性的氨基酸序列可以通过相对于目标氨基酸序列的所期望数量的氨基酸残基的突变来确定。氨基酸残基的突变是选自氨基酸残基的缺失、替换、添加和插入中的一种、两种、三种或四种突变。氨基酸残基的变异可以被导入氨基酸序列中的一个区域，也可以被导入多个不同的区域。例如，在目标氨基酸序列由400个以上的氨基酸残基构成的情况下，与目标氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列相对于目标氨基酸序列允许有40个以下的氨基酸残基的突变，与目标氨基酸序列显示95％以上的同源性的氨基酸序列相对于目标氨基酸序列允许有20个以下的氨基酸残基的突变。另外，在目标氨基酸序列由300个以上的氨基酸残基构成的情况下，与目标氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列相对于目标氨基酸序列允许有30个以下的氨基酸残基的突变，与目标氨基酸序列显示95％以上的同源性的氨基酸序列相对于目标氨基酸序列允许有15个以下的氨基酸残基的突变。此外，在目标氨基酸序列由200个以上的氨基酸残基构成的情况下，与目标氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列相对于目标氨基酸序列允许有20个以下的氨基酸残基的突变，与目标氨基酸序列显示95％以上的同源性的氨基酸序列相对于目标氨基酸序列允许有10个以下的氨基酸残基的突变。另外，在目标氨基酸序列由100个以上的氨基酸残基构成的情况下，与目标氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列相对于目标氨基酸序列允许有10个以下的氨基酸残基的突变，与目标氨基酸序列显示95％以上的同源性的氨基酸序列相对于目标氨基酸序列允许有5个以下的氨基酸残基的突变。
作为人改性CRP特异性抗体的同种型，例如可举出IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(例如IgA1、IgA2)、IgD或IgE，优选为IgG或IgM，进一步优选为IgG。
本公开还涉及一种多核苷酸，其包含编码人改性CRP特异性抗体的核苷酸序列。作为多核苷酸，可举出DNA和RNA，优选DNA。
本公开还涉及一种表达载体，其包含上述多核苷酸及与其可工作地连接的启动子。作为启动子，例如可举出在所期望的宿主细胞中高表达的基因的启动子和病毒来源的启动子。启动子还可以是构成性启动子，也可以是诱导性启动子。
表达载体还可以进一步包含在宿主细胞中发挥功能的终止子、核糖体结合位点、以及耐药性基因等要素。作为耐药性基因，例如可举出针对四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、潮霉素、草胺膦(Phosphinothricin)等药剂的抗性基因。
为了与宿主细胞的基因组DNA进行同源重组，表达载体可以进一步包含能够与宿主细胞的基因组进行同源重组的区域。例如，表达载体可以设计为其中包含的表达单元位于一对同源区域(例如与宿主细胞的基因组中的特定序列同源的同源臂、loxP、FRT)之间。作为表达单元应导入的宿主细胞的基因组区域(同源区域的靶标)，没有特别限定，可以是在宿主细胞中表达量多的基因座(gene locus)。
表达载体可以为质粒、病毒载体、噬菌体或人工染色体。表达载体可以是整合型(integrative)载体或非整合型载体。整合型载体可以是其整体整合进宿主细胞的基因组这种类型的载体。或者，整合型载体可以是仅其一部分(例如表达单元)整合进宿主细胞的基因组中则这种类型的载体。表达载体还可以为DNA载体或RNA载体(例如逆转录病毒)。
本公开还涉及一种包含表达单元的转化细胞，所述表达单元包含上述多核苷酸及与其可工作地连接的启动子。
“表达单元”是指能够转录包含应表达为蛋白的特定的多核苷酸及与其可工作地连接的启动子的所述多核苷酸、甚至能够产生由所述多核苷酸编码的蛋白的最小单元。表达单元还可以包含终止子、核糖体结合位点和耐药性基因等要素。表达单元可以为DNA也可以为RNA，但优选为DNA。表达单元还可以是包含应表达为蛋白的1个多核苷酸及与其可工作地连接的启动子的表达单元(即，能够表达单顺反子性mRNA的表达单元)、或包含应表达为蛋白的多个多核苷酸(例如，编码重链的多核苷酸、及编码轻链的多核苷酸)及与其可工作地连接的启动子的表达单元(即，能够表达多顺反子性mRNA的表达单元)。表达单元可以在1个或2个以上(例如1、2、3、4或5个)的不同位置地包含在基因组区域中。作为非基因组区域中所包含的表达单元的具体形态，例如可举出质粒、病毒载体、噬菌体、及人工染色体。启动子与上述的启动子是同样的。
转化细胞可以通过本领域中公知的任意方法制作。例如，转化细胞可以通过使用表达载体的方法(例如感受态细胞法、电穿孔法)或基因组修饰技术来制作。在表达载体是与宿主细胞的基因组DNA发生同源重组的整合型(integrative)载体的情况下，表达单元可以通过转化整合到宿主细胞的基因组DNA中。另一方面，在表达载体为不与宿主细胞的基因组DNA发生同源重组的非整合型载体的情况下，表达单元不会通过转化被整合到宿主细胞的基因组DNA中，而是在宿主细胞内，直接以表达载体的状态独立于基因组DNA地存在。或者，通过基因组编辑技术(CRISPR/Cas系统、转录激活因子样效应因子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALEN))，能够将表达单元整合到宿主细胞的基因组DNA中。作为转化细胞的宿主细胞，例如可举出真核细胞(例如动物细胞(例如哺乳动物细胞)、植物细胞、真核微生物)和原核细胞(例如原核微生物)。
(检查试剂盒)
本公开还涉及一种检查试剂盒，其包含改性CRP特异性抗体。
改性CRP特异性抗体的详细情况如上所述。
在一个实施方式中，试剂盒为ASD的检查试剂盒。
在另一个实施方案中，试剂盒可以进一步包含针对CRP的抗体或CRP的临床检查试剂。即，试剂盒可以是包含改性CRP特异性抗体与针对CRP的抗体或CRP的临床检查试剂的组合的疾病的检查试剂盒。本发明者们据所掌握的，首次发现了利用改性CRP特异性抗体能够测定的改性CRP浓度与利用针对CRP的抗体或CRP的临床检查试剂能够测定的CRP值的比率(例如CRP改性度)对疾病的诊断是有用的。即，根据本发明者们的研究成果，首次产生了使用这些组合的动机，而基于尚未着眼于这样的比率的现有技术，还不会产生将它们组合的动机。因此，疾病的诊断中的这样的组合的使用并不是能够从现有技术中容易地想到的。
在特定的实施方式中，试剂盒可以包含用于测定改性CRP浓度(例如夹心免疫测定法)的两种以上的抗体。作为这样的两种以上的抗体，可以使用包含改性CRP特异性的两种抗体(同种或异种，优选为异种)的抗体的组。或者，也可以使用包含改性CRP特异性的一种抗体和针对天然CRP的一种抗体的组合的抗体的组。这是因为，如果至少一种抗体是改性CRP特异性抗体，则能够测定改性CRP。从提高对改性CRP的特异性的观点出发，优选可以使用包含改性CRP特异性的两种抗体的抗体的组。例如，在使用两种以上的抗体的情况下，至少一种抗体可以作为固相抗体使用，至少一种抗体可以作为标记抗体使用。
在另一特定的实施方式中，试剂盒为免疫测定用试剂盒。试剂盒优选为ELISA用试剂盒，更优选为夹心ELISA用试剂盒。因此，试剂盒可以包含以下：
(1)改性CRP特异性的第一抗体(固相抗体)；
(2)改性CRP特异性的第二抗体(标记抗体)；和
(3)固相。
在又一特定的实施方式中，试剂盒是除改性CRP浓度以外还能够测定CRP值的免疫测定用试剂盒。试剂盒进一步包含针对CRP的一种以上的抗体。试剂盒优选为ELISA用试剂盒，更优选为夹心ELISA用试剂盒。因此，试剂盒可以包含以下：
(1)改性CRP特异性的第一抗体(固相抗体)；
(2)改性CRP特异性的第二抗体(标记抗体)；
(3)(a)针对CRP的第一抗体与针对CRP的第二抗体的组合、或(b)CRP的临床检查剂；和
(4)固相。
抗体可以使用多克隆抗体、单克隆抗体、修饰抗体(例如单链抗体、Fc片段)等任意的抗体。抗体可以固定于固相。作为固相，例如可举出平板、支承体、膜、粒子(例如磁性粒子、胶乳粒子)。例如，在试剂盒为ELISA用试剂盒的情况下，试剂盒也可以构成为包含固定有固相抗体的固相和标记抗体。另外，在试剂盒为除ELISA用试剂盒以外的试剂盒、例如免疫层析用试剂盒的情况下，试剂盒也可以构成为包含固定有针对目标物质的固相抗体和标记抗体的支撑体。
试剂盒还可以包含辅助手段。作为这样的辅助手段，例如可举出缓冲液、稳定剂、用于抗体的标记的酶及其酶的底物、血液的预处理用的容器(例如采血管)。
试剂盒例如可以优选用于上述方法中。
实施例
通过以下的实施例更详细地说明本公开，但本公开并不限定于以下的实施例。
实施例1：人改性CRP特异性单克隆抗体的制作
(1)抗原(人mCRP)的制备
将人五聚体CRP(C-反应性蛋白人胸膜液(C-Reactive Protein Human PleuralFluid)，Lee biosolutions，产品编号：140-11)(人pCRP)在8MUrea/10mM EDTA中在37℃下处理2小时，制备人单体CRP(人mCRP)溶液。制备后，使用透析管，在10mM磷酸缓冲液(pH为7.4)、15mM NaCl中进行透析。将透析后的溶液移至透析管之后，4℃、以3,500×g离心、浓缩。
(2)使用抗原(人mCRP)对小鼠的免疫
将抗原(人mCRP)浓度调整为200μg/0.5mL，等量加入佐剂，用玻璃注射器制作乳液。佐剂仅在初次免疫时使用弗氏完全佐剂(FCA，DIFCO，USA)，在第二次以后使用弗氏不完全佐剂(FICA，DIFCO，USA)。免疫4次后，确认抗体效价上升，进行最终免疫(i.p./50μg/只)。
将得到的乳液用27G注射针注射到小鼠的皮下和皮内。以后每7天合计免疫4次，在4次免疫后的7天后从尾静脉少量采血。在固相化有人mCRP的免疫平板中添加稀释抗血清，通过抗小鼠IgG-HRP检测，确认抗血清的效价。具体而言，抗血清的效价的确认通过以下的固相ELISA来进行。
(3)固相ELISA
作为固相ELISA的材料，使用以下材料。
(a)平板：Nunc制ELISA用免疫平板(96孔)
(b)底物：O.P.D tablet(SIGMA)
(c)固相化用缓冲液：0.1M碳酸缓冲液、pH为9.5(IBL)
(d)抗血清稀释用缓冲液：含1％BSA、0.05％Tween-20(关东化学)的PBS溶液
(e)标记抗体稀释用缓冲液：含1％BSA、0.05％Tween-20的PBS溶液
(f)清洗用缓冲液：含0.05％Tween-20的0.1M磷酸缓冲液
(g)底物用缓冲液：K2HPO4-柠檬酸缓冲液(pH为5.1)
(h)反应停止液：1mol/L-H2SO4(和光纯药)
(i)固相蛋白：人mCRP或BSA(对照)
固相ELISA按照以下的顺序进行。
(a)以50ng/孔(50μL/孔)使用蛋白，在4℃下放置16小时，由此将蛋白固相化于平板。
(b)将固相蛋白用Dulbecco PBS(D-PBS)(200μL/孔)清洗2次。
(c)将200μL的含有0.1％BSA和0.05％NaN3的D-PBS添加到各孔中，在4℃下放置一夜，由此进行封闭。
(d)将各孔用清洗用缓冲液清洗2次。
(e)将样品(抗血清)用稀释用缓冲液稀释，将稀释液添加到各孔中(50μL/孔)，在37℃下放置30分钟。
(f)将各孔用清洗用缓冲液清洗4次以上。
(g)将作为标记抗体的抗小鼠IgG(γ特异性)-HRP添加到各孔中(50μL/孔)，在37℃下放置30分钟。
(h)将各孔用清洗用缓冲液清洗4次以上。
(i)在各孔中添加底物液(400μg/mL)(100μL/孔)，由此引发显色反应，在遮光下、室温下使其反应15分钟。
(j)15分钟后，通过添加1mol/L硫酸(100μL/孔)使反应停止，测定吸光度(490nm)。
(4)产生人改性CRP特异性抗体的杂交瘤的制备
使用聚乙二醇(PEG)将从小鼠采集的脾脏细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞(X-63.Ag 8 653(ATCC))进行细胞融合(96孔板19张)，所述小鼠是通过上述固相ELISA确认到对人mCRP的效价显著性地上升的小鼠。使用HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)选择培养基，选择性地培养杂交瘤。然后，确认杂交瘤的集落形成，使用杂交瘤的培养物的上清稀释物作为样品，利用上述的固相ELISA(固相抗原：人mCRP)进行筛选，选择出36个阳性克隆。
(5)抑制ELISA(inhibition ELISA)
接着，通过抑制ELISA选择产生具有与人mCRP结合的能力的人改性CRP特异性抗体的杂交瘤。
在抑制ELISA中，作为样品，使用(i)将杂交瘤的培养上清液与含有过量的人mCRP的溶液进行了预孵育的溶液、(ii)将杂交瘤的培养上清液与含有过量的人pCRP的溶液进行了预孵育的溶液、(iii)将杂交瘤的培养上清液与不含有人mCRP和人pCRP这两者的溶液进行了预孵育的溶液(对照)，进行如上所述的固相ELISA(固相抗原：人mCRP)。在这样的抑制ELISA中，产生具有与人mCRP特异性结合的能力的抗人mCRP抗体的杂交瘤的培养上清液在(i)中，由于与溶液中的人mCRP结合而不能与固相抗原(人mCRP)结合，因此实质上没有检测到信号。另一方面，这样的培养上清液在(ii)中，由于不与溶液中的人pCRP结合而能够与固相抗原(人mCRP)结合，因此检测到充分的信号。另外，这样的培养上清液在(iii)中，由于溶液中不存在人mCRP和人pCRP而能够与固相抗原(人mCRP)结合，因此检测到充分的信号。
具体而言，抑制ELISA如下进行。
(a)将人mCRP用稀释用缓冲液调整为40μg/mL(溶液a1)。或者，将人pCRP用稀释用缓冲液调整为40μg/mL(溶液a2)。
(b)将培养上清液用稀释用缓冲液稀释2倍(溶液2)。
(c)将溶液a1与溶液2分别各50μL混合，使培养上清液中的抗体与人mCRP在4℃下反应16小时以上。另外，将溶液a2与溶液2分别各50μL混合，使培养上清液中的抗体与人pCRP在4℃下反应16小时以上。
(d)之后的顺序与固相ELISA的上述(a)～(j)的顺序是同样的。将抑制ELISA的(c)中得到的溶液用作固相ELISA的(e)中使用的样品。将结果示于表1。
表1.对36个阳性克隆的抑制ELISA的结果
(i)mCRP (ii)pCRP (iii)对照
1 0.001 0.203 0.303
2 0.007 -0.002 0.023
3 0.043 1.245 1.390
4 0.000 -0.002 0.009
5 0.014 0.357 0.414
6 0.031 0.237 0.258
7 0.036 1.311 1.533
8 0.024 0.010 0.019
9 0.001 0.002 0.007
10 0.021 0.046 0.027
11 0.067 0.103 0.103
12 0.826 2.197 2.175
13 0.068 1.809 1.977
14 0.039 1.020 1.347
15 0.004 0.205 0.394
16 0.022 0.556 0.945
18 0.921 2.446 2.291
19 2.024 2.366 2.293
20 0.094 1.882 2.007
21 0.220 2.243 2.129
22 -0.002 0.048 0.205
24 -0.002 -0.006 0.003
25 0.005 0.081 0.182
26 0.013 0.047 0.142
28 0.712 2.297 2.227
29 0.071 2.152 2.062
30 0.117 2.085 2.098
32 0.021 0.466 0.713
33 -0.001 0.093 0.234
34 0.004 0.192 0.411
35 0.045 1.409 1.671
36 0.180 2.151 2.123
其结果，在36个阳性克隆中的大多克隆中，与(ii)和(iii)相比，(i)中信号显示小的值。这表明许多克隆产生具有与人mCRP特异性结合的能力的抗人mCRP抗体。从这些克隆中，选择在(i)中实质上未检测到信号，而在(ii)和(iii)中检测到充分的信号的7种克隆(3、12、18、19、21、35、36)。认为这样的7种克隆能够产生具有与人mCRP结合的能力的优异的人改性CRP特异性抗体。
(6)杂交瘤的一次克隆和亚类的鉴定
将筛选出的7种克隆通过有限稀释法进行1次克隆。2周后，用EIA法进行筛选，选拔出阳性孔。每3孔(A、B、C)地选择阳性孔，采集上清液，进行固相ELISA和抑制ELISA。其结果，在1种克隆中，未确认到良好的抗体反应性，但在分别与6种克隆(克隆号3、12、18、19、21、35)对应的三种亚克隆(A、B、C)中，确认到良好的抗体反应性。之后的实验使用这些亚克隆(3C、12C、18A、19C、21A、35A)。
接着，使用1个各克隆的培养上清液，实施基于夹心ELISA的亚类检查，结果如下。
(a)mCRP-3C：小鼠IgG2b、κ
(b)mCRP-12C：小鼠IgG1、κ
(c)mCRP-18A：小鼠IgG2a、κ
(d)mCRP-19C：小鼠IgG1、κ
(e)mCRP-21A：小鼠IgG2a、κ
(f)mCRP-35A：小鼠IgG2a、κ
(7)IgG纯化
从通过常规方法培养6种杂交瘤(3C、12C、18A、19C、21A、35A)而得到的培养上清液中纯化IgG，分析与mCRP的结合能力。
IgG的纯化和分析中使用的材料和设备如下：
(a)蛋白A柱
(b)结合缓冲液(甘氨酸-NaCl，pH为8.9)
(c)洗脱缓冲液(柠檬酸，pH为4.0)
(d)再生缓冲液(柠檬酸，pH为2.0)
(e)D-PBS
(f)吸光度监控器-280nm(ATTO)
(g)AKTA系统(GE Healthcare)
(h)AKTA用分析柱(GE Healthcare)
IgG的纯化和分析如下进行。
(IgG的纯化)
(a)将培养上清液用0.45μm过滤，硫酸铵盐析后，用结合缓冲液稀释。
(b)添加到经结合缓冲液平衡化的ProteinA柱中。
(c)为了除去夹杂蛋白，用结合缓冲液充分清洗柱。
(d)用洗脱缓冲液将IgG洗脱。在回收容器中预先加入回收液的1/10量左右的中和缓冲液，中和洗脱物的pH。
(e)将洗脱物在PBS中、冷藏下进行透析。
(f)回收IgG，用0.22μm过滤。
(g)OD280nm下进行测定，算出IgG浓度。
(h)通过超滤法浓缩至5mg/mL左右，用0.22μm过滤后，分注冷冻保存。
(IgG的分析)
(a)测定280nm的吸光度，将A280＝1.382记为1mg/mL，算出蛋白浓度。
(b)通过利用AKTA FPLC的凝胶过滤分析，确认纯度。
(c)通过上述的固相ELISA确认效价。
其结果确认了，从培养6种杂交瘤得到的培养上清液中纯化的IgG均具有与人mCRP的结合能力。
实施例2：具有人改性CRP特异性单克隆抗体产生能力的杂交瘤的2次筛选
将实施例1中得到的杂交瘤的亚克隆(mCRP-3C、mCRP-12C、mCRP-18A)通过有限稀释法进行2次克隆。细胞培养和IgG的纯化和分析分别与实施例1同样地进行。
其结果，通过上述的固相ELISA确认效价，结果确认了从培养供于2次克隆的三种杂交瘤(mCRP-3C、mCRP-12C、mCRP-18A)得到的培养上清液中纯化的IgG均具有与人mCRP的结合能力。
另外，通过实施例1(5)中记载的抑制ELISA分析从培养这些杂交瘤得到的培养上清液中纯化的IgG，结果确认了这些IgG为具有与人mCRP结合的能力的人改性CRP特异性单克隆抗体(图2～4)。
实施例3：人改性CRP特异性单克隆抗体的结构分析
从实施例2中2次筛选得到的三种杂交瘤(mCRP-3C、mCRP-12C、mCRP-18A)中提取mRNA，使用逆转录酶制作cDNA。使用小鼠重链和轻链特异性引物，进行5’-RACE(rapidamplification of cDNA ends，cDNA末端快速扩增)法，确定重链和轻链的N末端的碱基序列。将N末端碱基序列的翻译起始甲硫氨酸周边序列作为N末端侧引物，将重链和轻链的全长cDNA克隆到表达载体中。CDR及可变区利用NCBI中的IgBLAST按照Kabat等的定义来确定。
其结果，由各杂交瘤产生的人改性CRP特异性单克隆抗体具有下述表2所示的结构性特征(也可参照图5～10)。
表2.由各种杂交瘤产生的人改性CRP特异性单克隆抗体的结构
以上示出了，包含上述那样的CDR的抗体能够特异性地识别人mCRP。
以下，对于人改性CRP特异性抗体，有时使用下述简称。
1)由杂交瘤mCRP-3C产生的人改性CRP特异性抗体：3C抗体
2)由杂交瘤mCRP-12C产生的人改性CRP特异性抗体：12C抗体
3)由杂交瘤mCRP-18A产生的人改性CRP特异性抗体：18A抗体
实施例4：人改性CRP特异性单克隆抗体的表位分析
(1)肽合成(其一)
分析3C抗体的表位。首先，合成表位分析中使用的下述肽。下述肽为了能够固定于固相，在人mCRP的表位的C末端附加有半胱氨酸残基(C)。
1)mCRP(19)：QTDMSRKAFVC(序列号33)
2)mCRP(29)：FPKESDTSYVC(序列号34)
3)mCRP(39)：SLKAPLTKPLC(序列号35)
4)mCRP(49)：KAFTVCLHFYC(序列号36)
5)mCRP(59)：TELSSTRGYSC(序列号37)
6)mCRP(69)：IFSYATKRQDC(序列号38)
7)mCRP(79)：NEILIFWSKDC(序列号39)
8)mCRP(89)：IGYSFTVGGSC(序列号40)
9)mCRP(99)：EILFEVPEVTC(序列号41)
10)mCRP(109)：VAPVHICTSWC(序列号42)
11)mCRP(119)：ESASGIVEFWC(序列号43)
12)mCRP(129)：VDGKPRVRKSC(序列号44)
13)mCRP(139)：LKKGYTVGAEC(序列号45)
14)mCRP(149)：ASIILGQEQDC(序列号46)
15)mCRP(159)：SFGGNFEGSQC(序列号47)
16)mCRP(169)：SLVGDIGNVNC(序列号48)
17)mCRP(179)：MWDFVLSPDEC(序列号49)
18)mCRP(189)：INTIYLGGPFC(序列号50)
19)mCRP(199)：SPNVLNWRALC(序列号51)
20)mCRP(209)：KYEVQGEVFTKPQLWPC(序列号52)
(2)表位分析(其一)
作为表位分析的材料，使用以下材料。
(a)平板：Nunc制ELISA用免疫平板(96孔)
(b)底物：O.P.D tablet(SIGMA)
(c)固相化用缓冲液：0.01M碳酸缓冲液pH为9.5(IBL)
(d)抗血清稀释用缓冲液：含1％BSA、0.05％Tween-20(关东化学)的PBS溶液
(e)标记抗体稀释用缓冲液：含1％BSA、0.05％Tween-20的PBS溶液
(f)清洗用缓冲液：含0.05％Tween-20的0.1MPB
(g)底物用缓冲液：K2HPO4-柠檬酸缓冲液(pH为5.1)(IBL)
(h)反应停止液：1mol/L-H2SO4(和光纯药)
(i)固相肽
表位分析通过以下的顺序进行。
(a)以50ng/孔(50μL/孔)使用肽，在4℃下放置16小时，由此将肽固相化于平板。
(b)将固相肽用Dulbecco PBS(D-PBS)(200μL/孔)清洗2次。
(c)将200μL的含有0.1％BSA和0.05％NaN3的D-PBS添加到各孔中，在4℃下放置一夜，由此进行封闭。
(d)将各孔用清洗用缓冲液清洗2次。
(e)用稀释用缓冲液将抗体稀释至1μg/mL，将稀释液添加到各孔中(50μL/孔)，在37℃下放置30分钟。
(f)将各孔用清洗用缓冲液清洗4次以上。
(g)将作为标记抗体的抗小鼠IgG(γ特异性)-HRP添加到各孔中(50μL/孔)，在37℃下放置30分钟。
(h)将各孔用清洗用缓冲液清洗4次以上。
(i)在各孔中添加底物液(400μg/mL)(100μL/孔)，由此引发显色反应，在遮光下、室温下使其反应15分钟。
(j)15分钟后，通过添加1mol/L硫酸(100μL/孔)使反应停止，测定吸光度(490nm)。
其结果，对于含有EILFEVPEVT(序列号2)的肽，3C抗体显示出与mCRP同样的反应性(表3)。另外，在上述(e)中，在将添加到各孔的抗体浓度变更为5μg/mL的情况下，也确认到同样的结果。需要说明的是，关于作为人改性CRP特异性单克隆抗体的12C抗体、18A抗体(图3、4)，确认是否与包含EILFEVPEVT(序列号2)的肽结合的结果是，不与该肽结合。这表明这些抗体识别与3C抗体不同的表位。因此，认为人改性CRP特异性单克隆抗体的表位不是仅存在一种，而是存在多种。
表3：3C抗体的表位分析(其一)
19 29 39 49 59 69 79
吸光度 0.004 -0.001 0.001 0 0.001 0.002 0
89 99 109 119 129 139 119
吸光度 0 1.581 -0.001 0.005 0.002 0.002 0.001
159 169 179 189 199 209 159
吸光度 0.002 0.001 0.003 0.007 0.006 0 0.002
由以上可知，作为人改性CRP特异性单克隆抗体的表位，存在包括作为3C抗体的表位的EILFEVPEVT(序列号2)(图1)在内的多个表位。
(3)肽合成(其2)
为了验证，分析3C抗体表位。作为表位，代替上述1)～20)的肽，合成更长的下述肽来使用。
21)mCRP(1-30)：QTDMSRKAFVFPKESDTSYVSLKAPLTKPLC(序列号53)
22)mCRP(31-60)：KAFTVCLHFYTELSSTRGYSIFSYATKRQDC(序列号54)
23)mCRP(61-90)：NEILIFWSKDIGYSFTVGGSEILFEVPEVTC(序列号55)
24)mCRP(91-120)：VAPVHICTSWESASGIVEFWVDGKPRVRKSC(序列号56)
25)mCRP(121-150)：LKKGYTVGAEASIILGQEQDSFGGNFEGSQC(序列号57)
26)mCRP(151-180)：SLVGDIGNVNMWDFVLSPDEINTIYLGGPFC(序列号58)
27)mCRP(181-206)：SPNVLNWRALKYEVQGEVFTKPQLWPC(序列号59)
(4)表位分析(其2)
表位分析的材料与实施例4(2)相同。表位分析的顺序与实施例4(2)同样地进行。
其结果，3C抗体与包含EILFEVPEVT(序列号2)的肽发生反应(表4)。另外，在不是将肽直接固定于固相而是经由牛血清白蛋白(BSA)固定于固相的情况下，也确认到同样的结果。
表4：3C抗体的表位分析(其二)
1-30 31-60 61-90 91-120 121-150 151-180 181-206
吸光度 -0.001 0.03 1.982 0.03 0.017 0.108 0.006
由以上确认了，3C抗体的表位为EILFEVPEVT(序列号2)(图1)。
实施例5：基于改性CRP浓度的疾病的检查
(1)CRP值和改性CRP浓度的测定
本试验已得到公益财团法人田附兴风会医学研究所北野医院伦理委员会以及关西电力医院伦理委员会的认可。另外，向患者呈递了书面文书，仅从得到同意的患者实施检样采集。
作为患者，除被诊断为双重疾病名的患者以外，将诊断为单一炎症性疾病的患者作为对象。作为对象的炎症性疾病是类风湿性关节炎(RA)、成年发病斯蒂尔病(AOSD)、血管炎、风湿性多发性肌痛(PMR)、系统性红斑狼疮(SLE)、感染症。
作为用于CRP值和改性CRP浓度的测定的试样，使用了患者来源的血浆。
CRP值的测定使用包含针对CRP的抗体的CRP的临床检查试剂即N-assay LA CRP-TNittobo、或N-assay LA CRP-S Nittobo D-type(Nittobo Medical株式会社)进行。
改性CRP浓度的测定通过使用了上述实施例中得到的12C抗体(固相抗体)和18A抗体(标记抗体)的夹心ELISA来进行。具体而言，改性CRP浓度的测定如下进行。
(a)将纯化的12C抗体用固相化用缓冲液调整为20μg/mL，以2μg/孔(100μL/孔)使用，在4℃下放置一夜，由此将12C抗体固相化于平板。
(b)将固相抗体用清洗用缓冲液清洗2次。
(c)将200μL的含有0.1％BSA和0.05％NaN3的D-PBS添加到各孔中，在4℃下放置一夜，由此进行封闭。
(d)将各孔用清洗用缓冲液清洗2次。
(e)将检样用稀释用缓冲液稀释，将稀释液添加到各孔中(100μL/孔)，在37℃下放置60分钟。
(f)将各孔用清洗用缓冲液清洗4次。
(g)将作为标记抗体的Fab’化18A抗体-HRP用稀释用缓冲液调整为0.4μg/mL，添加到各孔中(100μL/孔)，在37℃下放置30分钟。
(h)将各孔用清洗用缓冲液清洗5次。
(i)向各孔中添加底物液(100μL/孔)，由此引发显色反应，在遮光下、室温下使其反应30分钟。
(j)30分钟后，通过添加反应停止液(100μL/孔)使反应停止，测定吸光度(450nm和650nm)。
(k)根据基于测定值制作的标准曲线，算出检样中的改性CRP浓度。作为标准曲线制作用蛋白(标准品)，使用人mCRP。
结果如下。
表5：改性CRP浓度及CRP值(不存在基于CRP值的临界值)
炎症性疾病 改性CRP浓度 CRP值 浓度比
RA(N＝53) 49±105 57±71 2.81±5.76
AOSD(N＝13) 612±696 136±90 3.94±3.42
血管炎(N＝17) 46±72 86±72 2.80±606
PMR(N＝21) 156±226 104±81 1.80±2.05
SLE(N＝19) 8±7 11±31 10.22±8.19
感染症(N＝32) 305±372 168±99 2.05±2.29
N表示进行了试验的患者数。
改性CRP浓度表示血液中的平均浓度±SD(ng/mL)。
CRP值表示血液中的平均浓度±SD(μg/mL)。
浓度比表示改性CRP平均浓度(ng/mL)/CRP值(μg/mL)的比率。(以下同样)
接着，选择CRP值超过基准值的改性CRP阳性的患者。作为CRP值的基准值，采用≥50μg/mL。另外，作为改性CRP阳性的基准值，采用≥150ng/mL。
表6.CRP值超过基准值的改性CRP阳性的患者数
接着，对于CRP值超过上述基准值的患者，提取改性CRP浓度和CRP值、以及它们的比率，在成人发病斯蒂尔病(AOSD)与其他疾病之间，通过Dunn-Bonferroni检验算出p值，研究统计学上的显著性差异。
但是，对于SLE，由于改性CRP浓度压倒性地低，CRP值超过50μg/mL的患者也只能看到1例，因此省略以后的分析。但是，可以理解的是，由于AOSD与SLE的改性CRP浓度和CRP值这两者根本上不同，因此无论是否有无后续的分析，通过测定改性CRP浓度和/或CRP值，可以容易地将AOSD从SLE中鉴别出来。
表7.改性CRP浓度和CRP值(存在基于CRP值的临界值)
炎症性疾病 改性CRP浓度 CRP值 比率
RA(N＝22) 93±148 124±65 0.88±1.35
AOSD(N＝11) 722±702 157±83 4.62±3.26
血管炎(N＝12) 21±27 116±65 0.15±0.17
PMR(N＝16) 203±241 134±69 1.60±1.92
感染症(N＝32) 305±372 168±99 2.05±2.29
表8.统计学上的显著性差异
实施例6：仅基于改性CRP浓度的疾病的检查
增加病例数，与实施例5记载的方法同样地测定改性CRP浓度和CRP值(不存在基于CRP值的临界值)。
结果如下。
表9.改性CRP浓度和CRP值(不存在基于CRP值的临界值)
炎症性疾病 改性CRP浓度 CRP值 浓度比
RA(N＝55) 42±97 56±70 1.89±5.21
AOSD(N＝20) 477±582 149±93 3.34±2.81
血管炎(N＝18) 88±175 93±65 42.12±172.72
PMR(N＝23) 162±214 101±75 1.33±1.71
SLE(N＝19) 8±7 11±31 10.22±8.19
感染症(N＝40) 281±342 173±99 1.89±2.13
N表示进行了试验的患者数。
改性CRP浓度表示血液中的平均浓度±SD(ng/mL)。
CRP值表示血液中的平均浓度±SD(μg/mL)。
浓度比表示改性CRP平均浓度(ng/mL)/CRP值(μg/mL)的比率。(以下同样)
最后，提取改性CRP浓度和CRP值、以及它们的比率，在成人发病斯蒂尔病(AOSD)与其他疾病之间，通过Dunn-Bonferroni检验算出p值，研究统计学上的显著性差异。
其中，关于SLE，由于改性CRP浓度压倒性地低，因此省略以后的分析。然而，可以理解的是，由于AOSD与SLE的改性CRP浓度和CRP值两者根本上不同，因此无论有无后续的分析，通过测定改性CRP浓度和/或CRP值，均能够容易地将AOSD从SLE中鉴别出来。
表10.统计学上的显著性差异
(ASD)
这次，作为ASD，将AOSD用于评价。AOSD和感染症与其他炎症性疾病相比，血浆中的改性CRP浓度高(表5～10)。令人感兴趣的是，AOSD患者来源的血浆中的改性CRP浓度显著地高于心肌梗塞患者来源的血浆中的已报道的改性CRP浓度(20.96ng/mL)(Wang et al.，Atherosclerosis，2015，vol.239，p.343-349)，另外，也显著地高于银屑病、湿疹和荨麻疹(皮肤相关自身免疫疾病)患者来源的血浆中的已报道的改性CRP浓度(分别为35.4ng/mL、30.0ng/mL和59.8ng/mL)(Zhang etal.，Frontiers in Immunology，2018，vol.9，Article511)。即，令人感兴趣且预料不到的是，AOSD患者来源的体液中的改性CRP浓度高于本发明者们掌握的已报道的改性CRP浓度。感染症有根据其症状常常容易诊断的情况。另外，感染症由于通过确定(例如基因、基因组的检测)病原体(例如病毒、微生物)而能够确诊，因此AOSD大多容易与感染症区别。如上所述，考虑到AOSD与感染症相互容易区别，因此高的改性CRP浓度对于AOSD的检查是有用的。
因此，确认了改性CRP浓度的高值和与其相关的CRP改性度的高值〔例如高比率(改性CRP浓度/CRP值)〕作为AOSD等ASD的指标是有用的。
(血管炎)
血管炎和SLE与其他炎症性疾病相比，血浆中的改性CRP浓度低(表5、9)。可以理解的是，由于血浆中的CRP值低(表5、9)，因此根据低的CRP值，改性CRP浓度也容易降低。SLE可以通过双链DNA、尿蛋白和自身抗体等标记物的测定来进行检查，因此，能够容易地将血管炎从SLE中鉴别出来。另外，由于SLE显示与血管炎不同的低的CRP值(表5、9)，因此能够容易地将血管炎从SLE鉴别出来。如上所述，考虑到血管炎与SLE相互容易鉴别，因此低的改性CRP浓度作为血管炎的指标是有用的。
另外，在炎症性疾病中，血管炎由于高CRP值和显著地低的改性CRP浓度而显示了最低的比率(改性CRP平均浓度/CRP平均值)(表5～10)。
因此，确认了改性CRP浓度的低值和与其相关的CRP改性度的低值〔例如低比率(改性CRP浓度/CRP值)〕作为血管炎的指标是有用的。
(ASD与血管炎的鉴别)
AOSD与血管炎在改性CRP浓度和CRP改性度这两者中均显示了高度的统计学上的显著性差异(表8、10、图11)。这表明CRP改性度作为用于鉴别AOSD这样的ASD与血管炎的指标是极其优异的。因此，确认了CRP改性度对于ASD与血管炎的鉴别是有用的。
(ASD与RA和PMR的鉴别)
ASD、RA、PMR中发热、关节痛、肌肉痛为共同的症状。由于也大多可见CRP从中等程度的高度上升，因此鉴别诊断难以进行的情况并不少。如果出现AOSD特征性的皮疹则有助于鉴别，但由于不出现皮疹的AOSD存在20％～30％，因此此时更加难以鉴别。另外，RA中存在30％左右的所谓的血清阴性RA(seronegativeRA，RF阴性和CCP阴性)，在PMR中目前尚未确认到特异性的标记物。在血管炎中除一部分血管炎(ANCA相关血管炎)以外也不存在特异性的标记物。因此，AOSD这样的ASD与血清学上阴性的血管炎、血清学上阴性的RA、PMR的鉴别在临床上是极其重要的。从该观点出发，基于改性CRP浓度、或者改性CRP浓度/CRP的鉴别方法作为临床上非常有用的手段而受到期待。
实施例7：人源化抗体和嵌合抗体的制作和分析
(1)人源化抗体和嵌合抗体的制作
制作与上述实施例中得到的人改性CRP特异性单克隆抗体(3C抗体)共有重链(HC)和轻链(LC)中的互补决定区(CDR)1～3的人源化抗体和嵌合抗体，分析它们的结合能力。
首先，根据3C抗体的重链和轻链的氨基酸序列、基于Kabat和IMGT编号方案(numbering scheme)，鉴定CDR1～3。将鉴定出的CDR1～3移植到基于人免疫球蛋白重链可变基因(IGHV)和人免疫球蛋白κ可变基因(IGKV)的可变区。
接着，将移植后的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)分别克隆到具有IgG1(G1m17，1)和IgK1(Km3)的恒定区的氨基酸序列的表达载体中，制作包含将3C抗体(小鼠抗体)的重链中的CDR1～3移植到人抗体而成的重链(HC1～5)和将3C抗体的轻链中的CDR1～3移植到人抗体而成的轻链(LC1～3)的人源化抗体。
另外，还一并制作了包含将3C抗体(小鼠抗体)的重链可变区与人抗体的重链恒定区连接而成的重链(HC0)、以及将3C抗体的轻链可变区与人抗体的轻链恒定区连接而成的轻链(LC0)的嵌合抗体。
将所制作的各抗体的重链(HC0～5)及轻链(LC0～3)的信息示于表11。
表11.嵌合抗体和人源化抗体的重链和轻链与特定区域的关系
(2)人源化抗体和嵌合抗体的分析
分析所制作的各抗体的结合能力。将表达载体导入CHO细胞，培养后，从培养上清液中使用AKTATM design色谱系统对所表达的抗体进行纯化。用两种方法分析得到的10种纯化抗体的结合能力。
首先，使用利用生物膜层干涉法(Bio-Layer Interferometry：BLI)的OctetSystems，分析纯化抗体的结合能力。将嵌合抗体(HC0/LC0)的结合能力记为100％，以百分率评价人源化抗体(HCx/LCx)的结合能力。
接着，通过Biacore TM分析纯化抗体的结合能力。
其结果，确认了10种纯化抗体均显示高的结合能力(表12)。
表12.纯化抗体的结合能力
*表示抗体中的重链(HC)和(轻链)的组合。
根据以上所述的至少一个实施方式，能够辅助临床诊断。
对本发明的几个实施方式进行了说明，但这些实施方式是作为例子而提出的，其并不为了限定发明的范围。这些新的实施方式可以以其他各种方式实施，在不脱离发明的主旨的范围内，可以进行各种省略、替换、变更。这些实施方式及其变形包含在发明的范围、主旨中，并且包含在权利要求书所记载的发明及与其等同的范围内。

Claims (14)

1.一种成人斯蒂尔病的检查方法，其包含下述(1)和(2)：
(1)测定从受检对象采集的血液试样中的改性CRP浓度的工序；以及
(2)将测定出的改性CRP浓度和/或基于其的指标值与基准值进行比较的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，受检对象是患有炎症性疾病的受检对象、或疑似患有炎症性疾病的受检对象。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，受检对象是患有除感染症以外的疾病的受检对象、或疑似患有除感染症以外的疾病的受检对象。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述方法是用于将成人斯蒂尔病从血管炎、风湿性关节炎、风湿性多发性肌痛或系统性红斑狼疮中鉴别出来的方法。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述指标值是根据改性CRP浓度与CRP值之间的关系式算出的值。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，根据改性CRP浓度与CRP值之间的关系式算出的值是根据改性CRP浓度与CRP值之间的相对关系式算出的值。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，受检对象是测定了CRP值的受检对象。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，受检对象是显示比基准值高的CRP值的受检对象。
9.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，
受检对象是未测定CRP值的受检对象，
所述方法进一步包含测定从受检对象采集的血液试样中的CRP值的工序。
10.根据权利要求9所述的方法，其进一步包含以下工序：分选测定出的CRP值比基准值高的受检对象，供于所述进行比较的工序。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，使用改性CRP特异性抗体来测定改性CRP浓度。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，使用选自下述(1)～(3)中的改性CRP特异性抗体或其组合来测定改性CRP浓度：
(1)包含下述(1a)和(1b)的抗体
(1a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号4的氨基酸序列中的第20～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(1b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号9的氨基酸序列中的第20～131位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列；
(2)包含下述(2a)和(2b)的抗体
(2a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号14的氨基酸序列中的第20～141位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(2b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号19的氨基酸序列中的第21～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列；以及
(3)包含下述(3a)和(3b)的抗体
(3a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号24的氨基酸序列中的第20～141位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(3b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号29的氨基酸序列中的第21～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列。
13.一种改性CRP特异性抗体，其选自下述(1)～(3)：
(1)包含下述(1a)和(1b)的抗体
(1a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号4的氨基酸序列中的第20～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(1b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号9的氨基酸序列中的第20～131位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列；
(2)包含下述(2a)和(2b)的抗体
(2a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号14的氨基酸序列中的第20～141位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(2b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号19的氨基酸序列中的第21～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列；以及
(3)包含下述(3a)和(3b)的抗体
(3a)包含下述可变区的抗体重链，所述可变区包含与由序列号24的氨基酸序列中的第20～141位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列，和
(3b)包含下述可变区的抗体轻链，所述可变区包含与由序列号29的氨基酸序列中的第21～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列。
14.一种成人斯蒂尔病的检查试剂盒，其包含改性CRP特异性抗体。
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