CN102232087A - 修饰的人igf-1/e肽的抗体 - Google Patents

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Abstract

高特异性抗体可鉴别修饰的(例如hIGF-1/Ea 3mut)和内源人IGF-1蛋白。这些抗体与hIGF-1或hIGF-2具有很低的或没有交叉反应。它们与啮齿类IGF-1或IGF-2具有很低的或没有交叉反应。所述抗体可用于已施用于人或动物的IGF-1/E肽的药物代谢动力学(PK)/药效动力学(PD)评估。使用本发明抗体作为捕获抗体的三明治ELISA测定可定量样品中的突变IGF-1/E蛋白。

Description

修饰的人IGF-1/E肽的抗体
发明领域
此发明一般涉及免疫球蛋白、抗体和其片段。具体来说，本发明涉及与修饰的人胰岛素样生长因子1蛋白免疫特异性结合的抗体的制备和用途。
发明背景
胰岛素样生长因子1(IGF-1，生长调节素)为小的单链蛋白质，其诱导肌肉肥大和阻碍骨骼肌萎缩。IGF-1在人体内最初以IGF-1/E前体合成，其中E为成熟IGF-1蛋白C-端的延伸肽。成熟IGF-1最初由3种已知的剪接变体mRNA之一编码。每种mRNA的开放阅读框编码一种前体蛋白，所述前体蛋白包含70个氨基酸的IGF-1基团和C-端的特定延伸(E)肽，取决于特定的IGF-1mRNA，E可为Ea、Eb或Ec。C-端肽之后被切割为IGF-1成熟体。
在公开的PCT专利申请WO2007/146689中构建和描述了修饰的重组人IGF-1/E蛋白。这些修饰的IGF-1/E肽与野生型IGF-1相比具有更长的半衰期，增加的稳定性，与抑制性胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)降低的亲和性，和增加的效力。示例性修饰人IGF-1/E蛋白为hIGF-1/Ea 3mut(见图1)。名称“3mut”指hIGF-1-E-肽前体具有以下3组修饰：(1)G1，P2和E3的缺失；(2)Arg 37至Ala(R37A)的突变；和(3)R71和S72的缺失。建议将这些hIGF-1/Ea 3mut肽作为潜在的新药用于治疗骨骼肌萎缩。
然而，评估此候选药物的药物代谢动力学(PK)和药效动力学(PD)有困难，因为野生型和修饰的hIGF-1/E仅在整个肽链长度的3个分离的位置的1或2个氨基酸上彼此有差异(图1)。尚无市售的抗体可识别hIGF-1/Ea 3mut肽而不同时检测内源hIGF-1。
发明概述
本发明提供可区分修饰的(例如hIGF-1/Ea 3mut)和内源人IGF-1蛋白的高特异性抗体。本发明的抗体与hIGF-1或hIGF-2具有极低的或没有交叉反应。其与啮齿类IGF-1或IGF-2也具有极低的或没有交叉反应。所述抗体对已经施用于人或动物的IGF-1/E肽的药物代谢动力学(PK)和药效动力学(PD)评估有用。
在一个实施方案中，本发明的抗体与肽GPTLCGAELV(SEQ ID NO：1)免疫特异性结合，但不与肽GPETLCGAELV(SEQ ID NO：2)免疫特异性结合。在另一个实施方案中，本发明的抗体与肽PAKSAVRAQR(SEQ ID NO：6)免疫特异性结合，但不与肽PTKAARSIRAQR(SEQ ID NO：7)免疫特异性结合。
本发明因此提供了抗体QC1，QC2，QQ2，QQ5和QQ6。
抗体可为单克隆或多克隆的。其可通过免疫合适的哺乳动物，例如小鼠、兔、山羊、马、骆驼或鲨鱼产生。
在本发明范围内还包括产生本发明抗体的杂交瘤细胞，编码所述抗体的核酸序列，包含所述核酸序列的载体例如表达载体，以及由所述载体转化的细胞。
本发明还提供杂交瘤(保藏于DSMZ，因霍芬路7B，D-38124不伦瑞克，德国)，其可用于分别表达抗体QC1，QC2，QQ2，QQ5和QQ6。
本发明还提供了用于评估修饰的重组人IGF-1/E肽的药物代谢动力学(PK)/药效动力学(PD)关系的生物分析测定。在一个实施方案中，所述测定为放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)，例如三明治ELISA，进行测定以定量在临床前和临床样品中的突变IGF-1/E蛋白，其中使用本发明的抗体作为免疫吸附剂(捕获抗体)。在这些应用中，可使用分析法可检测的试剂例如放射性同位素、荧光分子或酶标记抗体。
此外，本发明的抗体可用于纯化大量IGF-1/E 3mut肽，例如通过亲和层析。本发明的抗体因此对治疗肌肉萎缩的药物的商业规模纯化有用。
在一个实施方案中，在上述方法中使用的抗体选自QC1，QC2，QQ2，QQ5和QQ6。
发明详述
本发明的抗体
定义。下面提供在此说明书中使用的某些术语的定义。其他术语的定义可在Illustrated Dictionary of Immunology，第二版，Cruse，J.M.和Lewis，R.E.，编(CRC Press，Boca Raton，Florida，1995)中找到。
对受试者施用试剂或药物包括自我施用和通过他人施用。还应当理解描述的医学病症的各种治疗或预防模式旨在表示“基本上”，其包括完全治疗或预防，但也包括不完全治疗或预防，其中获得一些生物学或医学相关结果。
术语“抗体”指包含来自免疫球蛋白基因框架区的多肽或其片段，其特异性结合和识别表位，例如在修饰的IGF-1/E肽而不是野生型IGF上发现的表位，例如肽A和肽C抗原的表位，均在下面描述。术语抗体的使用旨在包括完整抗体，包括单链完整抗体和其抗原结合片段。术语“抗体”包括抗原结合抗体片段，其包括单链抗体，其可单独包含可变区，或包含可变区和以下多肽元件的全部或部分的组合：抗体分子的铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。在本发明中还包括可变区和铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任意组合。可作为本发明的结合试剂使用的抗体相关分子包括但不限于，例如Fab，Fab’和F(ab’)2，Fd，单链Fv(s cFv)，单链抗体，二硫键连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。示例包括：(i)Fab片段，由VL，VH，CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区由二硫键连接的2个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单个臂的VL或VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341：544-546，1989)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。术语“抗体”包括单结构域抗体、巨抗体(maxibody)、微抗体(minibody)、细胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv(见，例如Hollinger&Hudson，Nature Biotechnology，23，9，1126-1136(2005))。一旦抗体已生成，其可进行嵌合或人源化。例如，为生成嵌合抗体，可将可变区连接至人恒定区，使用本领域已知的方法(见，例如属于Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为生成人源化抗体，可将CDR区插入人框架，使用本领域已知的方法。见，例如属于Winter的美国专利号5225539，和属于Queen等人的美国专利号5530101；5585089；5693762和6180370。或者，可将抗体的抗原结合部分移植进基于多肽例如纤维连接蛋白III型(Fn3)的支架中(见美国专利号6,703,199，其描述了纤维连接蛋白多肽单抗体(monobody))。可将抗原结合部分插入含有一对串联Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)；和美国专利号5,641,870)。
术语“生物样品”指来自或与活细胞接触的样品材料。术语“生物样品”旨在包括从受试者中分离的组织、细胞和生物液体，以及在受试者体内存在的组织、细胞和液体。
术语“表位”指能够特异性结合抗体的蛋白决定簇。表位通常由化学活性的表面分子例如氨基酸或糖侧链基团组成，并通常具有特定的三维结构特征和特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下丧失与前者而不是后者的结合。
术语“免疫反应条件”指允许针对特定抗原表位生成的抗体与该表位以下述程度结合，即相比抗体和基本上所有其他表位的结合可检测的更多，一般至少是背景结合的2倍，优选至少是背景结合的5倍。免疫反应条件取决于抗体结合反应的类型，所述类型一般指在免疫测定实验方案中使用的那些。免疫测定类型和条件的描述见Harlow&Lane，Antibodies，ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Publications，New York，1988)。
如此处使用的术语“免疫特异性”指单个抗体结合位点仅和一个抗原决定簇反应的能力。抗体的结合位点位于分子的Fab部分，由重和轻链的高变区构成。抗体的结合亲和力是单个抗原决定簇和抗体上的单个结合位点之间反应的强度。它是抗原决定簇和抗体结合位点之间吸引和排除力的总和。如此处使用的，对IgG抗体而言，术语“高亲和力”指抗体对靶抗原具有10-8M或更低，10-9M或更低，或10-10M，或10-11M或更低的KD。然而，“高亲和力”结合对其他抗体同种型可能是不同的。例如，对IgM同种型的“高亲和力”结合指抗体具有10-7M或更低，或10-8M或更低的KD。术语“单克隆抗体”指来源于单个克隆包括任意真核、原核或噬菌体克隆的抗体，不是指产生其的方法。单克隆抗体组合物展示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体可通过本领域已知的多种技术制备，包括但不限于，例如杂交瘤细胞、重组和噬菌体展示技术。
术语“多克隆抗体”指来源于至少2种不同的产生抗体的细胞系的抗体制剂。此术语的使用包括至少2种抗体的制剂，其包含特异性结合抗原的不同表位或区域的抗体。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在此处可互换使用，指包含通过肽键或修饰的肽键(即肽等构物)彼此连接的2个或更多氨基酸的聚合物。多肽指通常被称为肽、糖肽或寡聚物的短链和一般被称为蛋白质的长链二者。多肽可包含基因编码的20个氨基酸以外的氨基酸。多肽包括通过自然加工例如翻译后加工或本领域熟知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。这些修饰在基础教科书和更详细的专著以及大量研究文献中详细描述了这些修饰。具体来说，修饰的IGF-1/E蛋白可为在公开的PCT专利申请WO2007/146689中描述的任意修饰的IGF-1/E蛋白，以及其任意二级修饰的(糖基化，PEG化，等等)蛋白质。
当涉及例如细胞，或核酸，蛋白质，或载体使用术语“重组的”时，其表示所述细胞，核酸，蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者所述物质来源于被这样修饰的细胞。具体来说，重组的IGF-1/E蛋白可为在公开的PCT专利申请WO2007/146689中描述的任意的重组IGF-1/E蛋白，以及其任意二级修饰的(糖基化，PEG化，等等)蛋白质。
术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”指Fv片段的2个结构域VL和VH的抗体融合分子。尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分隔的基因编码，可使用重组方法将它们连接，通过合成的接头使它们成为单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成被称为单链Fv(scFv)的单价分子。见，例如Bird等人，Science 242：423-426(1988)；和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-5883(1988)。当涉及术语“抗体”片段时包括所述单链抗体，通过重组技术或完整抗体的酶促或化学切割可制备所述单链抗体。
术语“特异性结合”指本发明的抗体和表位(在此处描述的肽上(肽A、肽B或肽C)或包含所述肽的蛋白质)的接触具有至少10-6M的结合亲和力。优选的结合物质以至少约10-7M的亲和力结合，优选10-8M至10-9M，10-10M，10-11M，或10-12M的亲和力。
如上面指出的，本发明的抗体可被标记。标记的抗体可在多种测定中应用，应用多种标签。通过将可检测的物质连接至抗体，可以使本发明抗体和目的表位之间的抗体-抗原复合物形成的检测更容易。合适的检测方式包括使用下述标签，例如放射性核素、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂、色原体、酶底物或辅因子、酶抑制剂、辅基复合物、自由基、颗粒、染料，等等。合适酶的示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质示例包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸盐、罗丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的示例为发光氨；生物发光物质的示例包括荧光素酶、萤光素和水母发光蛋白；以及合适的放射性物质的示例包括125I，131I，35S，或3H。
多肽
本发明提供分离的多肽，其包含序列GPTLCGAELV(SEQ ID NO：1)，CPAKSAVRAQR(SEQ ID NO：5)或PAKSAVRAQR(SEQ ID NO：6)或由上述序列组成。所述多肽在根据本发明生成抗体中有用。本发明的多肽还可构成更大的多肽的一部分。例如，本发明的多肽两侧可具有另外的N-端和/或C-端氨基酸。
一般的，在非天然存在环境中提供本发明的多肽，即它们从其天然存在环境中被分离。在某些实施方案中，多肽在与对照相比富含该多肽的组合物中存在。本发明的多肽因此优选的以分离的或基本上分离的形式提供，即多肽在基本上不含其它被表达的多肽的组合物中存在，其中基本上不含指少于75％(以重量计)，优选少于50％，和更优选少于10％(例如5％)的组合物由其它被表达的多肽组成。
核酸分子
本发明的另一个方面涉及编码本发明多肽或抗体的核酸分子。核酸可在整个细胞中、细胞裂解液中存在或为部分纯化或基本上纯的形式的核酸。当从其他细胞成分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白质中纯化出时，核酸为“分离的”或“变为基本上纯的”，所述纯化通过下述标准技术进行，包括碱/SDS处理、CsCl梯度离心、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和其他本领域熟知的技术。见，F.Ausubel，等人，编1987Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，NewYork。本发明的核酸可为例如DNA或RNA，可包含或可不包含内含子序列。在一个实施方案中，核酸为cDNA分子。核酸可在载体例如噬菌体展示载体或重组质粒载体中存在。可使用标准分子生物学技术得到本发明的核酸。对杂交瘤细胞表达的抗体例如此处描述的那些，可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术得到编码杂交瘤细胞产生的抗体轻链和重链的cDNA。
产生单克隆抗体的转染瘤的生成
一旦得到编码本发明抗体的核酸，本发明的抗体也可在宿主细胞转染瘤中制备，使用例如重组DNA技术和基因转染方法的组合，如本领域所熟知的(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。
例如，为表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如，使用表达目的抗体的杂交瘤的cDNA克隆)得到编码部分或全长轻链和重链的DNA，可将DNA插入表达载体使基因与转录和翻译控制序列有效连接。在此上下文中，术语“有效连接”旨在指将抗体基因连接进载体使载体内的转录和翻译控制序列发挥其预期功能，即调节抗体基因的转录和翻译。选择表达载体和表达控制序列，使其与使用的表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入不同的载体或，更一般的，将2种基因插入相同的表达载体。通过标准方法(例如连接抗体基因片段和载体上的互补限制性内切位点，或者平端连接，如果没有限制性内切位点的话)将抗体基因插入表达载体。此处描述的抗体轻链和重链可变区可用于生成任意抗体同种型的全长抗体基因，通过将其插入已经编码预期同种型重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使VH片段与载体内的CH片段有效连接，VL片段与载体内的CL片段有效连接。另外或可选的，重组表达载体可编码信号肽使抗体链从宿主细胞的分泌更容易。可将抗体链基因克隆进载体使信号肽依读框的连接至抗体链基因的N端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因，本发明的重组表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调控序列。术语“调控序列”旨在包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)。所述调控序列在例如Goeddel(Gene Expression Technology.Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA 1990)中描述。本领域技术人员将理解，表达载体的设计(包括调控序列的选择)将取决于这些因素，如待转化的宿主细胞的选择，期望的蛋白质表达水平，等等。用于哺乳动物宿主细胞的调控序列包括在哺乳动物细胞中控制高水平蛋白质表达的病毒元件，例如来自巨细胞病毒(CMV)、猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。可选的，可使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或P-球蛋白启动子。此外，(可使用)由不同来源的序列组成的调控元件，例如SRa启动子系统，其包含来自SV40早期启动子和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复序列(Takebe，Y.等人，1988Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
除了抗体链基因和调控序列以外，本发明的重组表达载体可携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和可选择的标记基因。可选择的标记基因使已引入载体的宿主细胞的选择更容易(见，例如美国专利号4,399,216，4,634,665和5,179,017，都属于Axel等人)。例如，一般可选择的标记基因赋予已引入载体的宿主细胞对药物例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。可选择的标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在dhfr-宿主细胞中使用甲氨蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
为表达轻链和重链，将编码重和轻链的表达载体通过标准技术转染至宿主细胞。术语“转染”的各种形式旨在包括多种通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。理论上由可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体。考虑在真核细胞，特别是哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为这些真核细胞，特别是哺乳动物细胞，与原核细胞相比更有可能组装和分泌正确折叠和具免疫活性的抗体。已有报导抗体的原核表达对制备高产量的活性抗体是无效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.，1985 Immunology Today 6：12-13)。
表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin，1980Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，其与DH FR可选择标记一起使用，例如在R.J.Kaufman和P.A.Sharp，1982Mol.Biol.159：601-621中所描述的)，NSO骨髓瘤细胞，COS细胞和SP2细胞。特别的，在NSO骨髓瘤细胞中可使用的另一种表达系统是在WO 87/04462，WO 89/01036和EP338,841中显示的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞足够的时间制备抗体，以允许抗体在宿主细胞中表达或将抗体分泌至培养宿主细胞的培养基中。可使用标准蛋白质纯化方法将抗体从培养基中回收。
诊断方法/治疗方法
如上面所指出的，本发明的抗体可用于多种测定以确定样品中的修饰的IGF-1/E浓度。
因此，本发明提供了确定患者中修饰的IGF-1/E蛋白水平的方法，其包含以下步骤：
(i)从患者中获得血液样品，已对所述患者施用了所述修饰IGF-1/E，和
(ii)使用本发明的抗体检测在所述样品中的修饰IGF-1/E。
可使用标准技术定量修饰的IGF-1/E的水平，例如通过使用已知量的修饰的IGF-1/E建立标准曲线，比较检测样品得到的结果和使用校准标记得到的结果(见，例如实施例)。
能够确定患者中修饰的IGF-1/E蛋白的水平也使医师能够确定合适的剂量以得到治疗效果。因此本发明也提供了在需要其的患者中维持修饰的IGF-1/E的最优剂量的方法，其包含：
(i)从患者中获得血液样品，已对所述患者施用了所述修饰的IGF-1/E，和
(ii)使用本发明的抗体检测在所述样品中的修饰的IGF-1/E，和
(iii)当患者血液样品中的修饰的IGF-1/E水平低于预设的水平时，对所述患者施用额外剂量的所述修饰的IGF-1/E。
值得注意的是，有时血液样品已从患者中得到。因此本发明提供了确定患者中修饰的IGF-1/E蛋白水平的方法，其包含使用本发明抗体检测从患者中得到的血液样品中的修饰的IGF-1/E的步骤。
本发明也提供在需要其的患者中维持修饰的IGF-1/E的最优剂量的方法，其包含：
(i)使用本发明的抗体检测在已施用修饰的IGF-1/E的患者血液样品中的修饰的IGF-1/E，和
(ii)当患者血液样品中的修饰的IGF-1/E水平低于预设的水平时，对所述患者施用额外剂量的所述修饰的IGF-1/E。
本发明也允许操控修饰的IGF-1/E的制备。因此，可从制备植物中得到样品并使用本发明的抗体检测以确认正在制备正确形式的修饰的IGF-1/E。
本发明也提供治疗患有肌肉疾病的患者的方法，其包含：
(i)使用根据本发明的抗体检测从之前已施用修饰的IGF-1/E的患者中得到的血液样品中修饰的IGF-1/E的血清浓度，和
(ii)如果hIGF-1/Ea 3mut的血清浓度低于预设的最优水平，对患者施用更多的修饰的IGF-1/E。
在以上描述的实施方案中，修饰的IGF-1/E可为hIGF-1/Ea 3mut或在WO2007/146689中描述的之一。例如，修饰的IGF-1/E可为在WO2007/146689的实施例1中描述的那些(在那里被称为SEQ ID NO：8，在此处为修饰的IGF-1/E No.1)，或在WO2007/146689的实施例45中描述的那些(在那里被称为SEQ ID NO：53，在此处为修饰的IGF-1/E No.2)。
蛋白质纯化
如上面所指出的，本发明的抗体也可用于修饰的IGF-1/E的商业规模纯化(即用于治疗肌肉萎缩的药物)。例如，本发明的抗体可用于亲和层析以纯化修饰的IGF-1/E。
重组多肽的纯化是本领域熟知的，包括亲和层析纯化技术等等(一般的见Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，1982))。也见Bailon等人，An Overview of Affinity Chromatography，HumanaPress(2000))。用于生物治疗蛋白质的商业规模纯化的亲和层析方法(例如基于膜的亲和技术)是本领域已知的。见Brandt等人，Bio/Technology6：779-782(1988)。
优选的，通过这些方法纯化的修饰的IGF-1/E可为hIGF-1/Ea 3mut，或在WO2007/146689中所描述的。例如，修饰的IGF-1/E可为在WO2007/146689的实施例1中描述的那些(在那里被称为SEQ ID NO：8，在此处为修饰的IGF-1/E No.1)，或在WO2007/146689的实施例45中描述的那些(在那里被称为SEQ ID NO：53，在此处为修饰的IGF-1/E No.2)。
等同物
以上的说明中详细陈述了本发明的一个或多个实施方案。尽管在本发明的实施或检测中可使用与此处描述的这些类似或等同的任意方法和材料，现在描述优选的方法和材料。从描述和权利要求中，本发明的其他特征、目的和优势将是显而易见的。一般的，酶促反应和纯化步骤根据制造商的说明书进行。技术和程序一般根据本领域传统方法和多种一般参考进行。一般的见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork，1989)，在此文档通篇提供此参考。
本发明不受限于在此申请中描述的具体实施方案，所述实施方案旨在单独说明本发明的各个方面。对本领域技术人员显而易见的，可对此发明进行多种修改和变化而不背离其精神和范围。通过以下描述，在本发明范围内除了此处列举的那些以外的功能等同方法和仪器对本领域技术人员将是显而易见的。这些修改和变化旨在落入随附的权利要求范围内。本发明仅受限于随附的权利要求以及这些权利要求赋予的等同物的全部范围。
附图简述
图1是hIGF-1，hIGF-1/Ea wt，hIGF-1/Ea 3mut和hIGF-2的氨基酸序列比对。hIGF-1/E wt和hIGF-1/E 3mut之间的氨基酸差异用粗体突出显示。序列中的线表示缺失的残基。下划线的是下面描述的从hIGF-1/Ea3mut中选为抗原用于动物免疫的肽。
图2是一组图表，其显示了经肽A免疫生成的hIGF-1/E 3mut特异性小鼠单克隆抗体的活性。从杂交瘤细胞克隆QC1(A)和QC2(B)中收集细胞培养上清，并在用hIGF-1，hIGF-1/Ea wt，hIGF-1/Ea 3mut，hIGF-2，mIGF-1或mIGF-2包被的微滴定孔中稀释。结合在板上的抗体通过辣根过氧化物酶缀合的多克隆山羊抗小鼠IgG抗体检测。
图3是一组图表，其显示了经肽B免疫生成的hIGF-1/E 3mut反应性小鼠单克隆抗体的活性。从杂交瘤细胞克隆BP1(A，mg/ml)和BP2(B，mg/ml)中制备和纯化单克隆抗体，并在用hIGF-1，hIGF-1/E wt，hIGF-1/E3mut，hIGF-2，mIGF-1或mIGF-2包被的微滴定孔中以1∶10-1∶100,000稀释。结合在板上的抗体通过辣根过氧化物酶缀合的多克隆山羊抗小鼠IgG抗体检测。
图4是一组图表，其显示了肽C免疫生成的hIGF-1/E 3mut特异性小鼠单克隆抗体的活性。从杂交瘤细胞克隆QQ2(A)，QQ5(B)和QQ6(C)中收集细胞培养上清，并在用hIGF-1，hIGF-1/E wt，hIGF-1/E 3mut，hIGF-2，mIGF-1或mIGF-2包被的微滴定孔中稀释。结合在板上的抗体通过辣根过氧化物酶缀合的多克隆山羊抗小鼠IgG抗体检测。
图5是一组图表，其显示了经肽C免疫生成的单克隆抗体的三明治ELISA分析。在用QQ2(A)，QQ5(B)和QQ6(C)包被的微滴定板上加入不同浓度的hIGF-1/Ea 3mut，hIGF-1/Ec 3mut，糖基化hIGF-1/Ea 3mut和hIGF-1肽。结合在板上的IGF-1肽通过辣根过氧化物酶缀合的单克隆小鼠抗-hIGF-1抗体检测。
实施例
针对肽A生成的抗体。通过肽A，GPTLCGAELV(IGF-1/E 3mut的1-10位氨基酸)(SEQ ID NO：1)的小鼠免疫生成2种单克隆抗体(见表1)。QC1和QC2识别的表位与野生型hIGF-1和mIGF-1序列GPETLCGAELV(SEQ IDNO：2)仅相差1个氨基酸。选择此肽用于动物免疫，尽管使用Biobench和Abie Pro 3.0的蛋白质结构分析提示其具有低表面可能性和低抗原指数。
GP-TLCGAELV    hIGF-1/E 3mut(SEQ ID NO：1)
GP TLCGAELV
GPETLCGAELV    hIGF-1/E wt，hIGF-1，mIGF-1(SEQ ID NO：2)
使用(1)重组hIGF-1/E 3mut(用于阳性克隆)；(2)重组hIGF-1/Ewt蛋白(用于阴性克隆)；(3)重组hIGF-2(用于阴性克隆)，和(4)重组mIGF-2蛋白(用于阴性克隆)筛选杂交瘤。
使用肽A-KLH缀合物免疫3次的5只小鼠的抗血清滴度范围从1∶500至1∶16,000，使用hIGF-1/E 3mut通过ELISA测定。从最佳响应者#3小鼠中产生约1,000个杂交瘤，发现其中4个与hIGF-1/E 3mut有强反应性，而与hIGF-1/E wt，hIGF-1，hIGF-2，mIGF-1和mIGF-2没有或仅有弱反应性。对所有4个hIGF-1/E 3mut反应性杂交瘤细胞进行亚克隆，选出2个分别来自独立杂交瘤细胞的最终亚克隆QC1(7B9C6)和QC2(8B7A2)，通过ELISA确认可产生特异性针对hIGF-1/E 3mut的单克隆抗体(图2，表1)。
2种mAb，QC1(7B9C6)和QC2(8B7A2)对hIGF-1/E 3mut具高度特异性，可作为免疫吸附剂(捕获抗体)在三明治ELISA中使用以定量临床前和临床样品中修饰的重组人IGF-1/E肽。表达2种mAb，QC1(7B9C6)和QC2(8B7A2)的杂交瘤细胞在DSMZ中分别以登记号和保藏。
针对肽B生成的抗体。通过肽B，CGDRGFYFN-KPTGYGSS(IGF-1/E 3mut的17-33位氨基酸)(SEQ ID NO：3)的小鼠免疫生成2种单克隆抗体(见表1)。选择此肽因为其具有高表面可能性和高抗原指数。然而，hIGF-1和hIGF-1/E 3mut在此区域具有相同的序列。因此，针对此肽产生的抗体识别所有以下蛋白质：hIGF-1，hIGF-1/E wt和hIGF-1/E 3mut。此外，mIGF-1和hIGF-1在此区域展示了仅一个氨基酸的差异。
CGDRGFYFNKPTGYGSS hIGF-1/E 3mut，hIGF-1，hIGF-1/E wt
(SEQ ID NO：3)
CG RGFYFNKPTGYGSS
CGPRGFYFNKPTGYGSS mIGF-1(SEQ ID NO：4)
使用(1)重组hIGF-1/E 3mut(用于阳性克隆)；(2)重组hIGF-2(用于阴性克隆)；(3)重组mIGF-1(用于阴性克隆)，和(4)重组mIGF-2蛋白(用于阴性克隆)筛选杂交瘤细胞。
小鼠针对肽B的免疫反应很强。使用肽B-KLH缀合物免疫4次的5只小鼠的抗血清滴度范围从1∶1,000至＞1∶32,000。从最佳响应者#5小鼠中产生约1,000个杂交瘤细胞，发现其中21个与hIGF-1，hIGF-1/E wt和hIGF-1/E 3mut有强反应性，而与hIGF-2，mIGF-1和mIGF-有弱反应性。对所有13个杂交瘤细胞进行亚克隆，选出2个分别来自独立杂交瘤细胞的最终亚克隆BP1(2F11D8)和BP2(3C5D10)，并确认产生可与hIGF-1，hIGF-1/E wt和hIGF-1/E 3mut结合的单克隆抗体(图3，表1)。
2种mAb，BP1(2F11D8)和BP2(3C5D10)均识别hIGF-1和hIGF-1/E3mut，并与hIGF-2、mIGF-1和mIGF-2交叉反应。不管怎样，这些mAb可能对IGF-1的研究有用。
针对肽C生成的抗体。通过肽C，CPAKSAVRAQR(IGF-1/E 3mut的65-74位氨基酸，外加用于缀合的N-端)(SEQ ID NO：5)的小鼠免疫生成3种单克隆抗体(见表1)。选择此hIGF-1/E 3mut肽因为其具有高表面可能性和高抗原指数。其跨越成熟hIGF-1和突变E肽的交界区。
PAKSA--VRAQR  hIGF-1/E 3mut  (SEQ ID NO：6)
P K+A+RAQR
PTKAARSIRAQR  mIGF-1(SEQ ID NO：7)
使用(1)重组hIGF-1/E 3mut(用于阳性克隆)；(2)重组hIGF-1(用于阴性克隆)；(3)重组hIGF-1/E wt(用于阴性克隆)，(4)重组mIGF-1(用于阴性克隆)；和(5)重组mIGF-2蛋白(用于阴性克隆)筛选杂交瘤细胞。
使用肽C-KLH缀合物免疫4次的5只小鼠的抗血清滴度范围从1∶400至1∶3,200。从最佳响应者#4小鼠中产生约1,000个杂交瘤细胞，发现其中188个在标准ELISA中与hIGF-1/E 3mut有强反应性，而与hIGF-1无反应性。对188个杂交瘤细胞中的20个进行亚克隆，选出3个分别来自独立杂交瘤细胞的最终亚克隆QQ2(2C10B7)，QQ5(6H6G11)和QQ6(7B1H12)，并确认可产生识别hIGF-1/E 3mut而不识别hIGF-1的单克隆抗体(图4，表1)。然而，这些mAb与hIGF-1/E wt具有交叉反应。
QQ2，QQ5和QQ6识别的表位是PAKSAVRAQR(aa 65-74).(SEQ ID NO：6)。这3个mAb，QQ2(2C10B7)，QQ5(6H6G11)和QQ6(7B1H12)识别hIGF-1/E3mut，与hIGF-1/E wt具有交叉反应，但不结合hIGF-1。这些mAb各自可作为免疫吸附剂(捕获抗体)在三明治ELISA中使用，以定量多种修饰的重组人IGF-1/E肽。表达3种mAb，QQ2(2C10B7)，QQ5(6H6G11)和QQ6(7B1H12)的杂交瘤细胞在DSMZ中分别以登记号，和保藏。
表1
结果总结
制备本发明抗体的方法
制备抗体的一般方法。制备针对定义抗原(例如肽A、肽B或肽C)的多克隆和单克隆抗体的许多方法是本领域已知的。见Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Publications，New York，1988)和以上引用的其他参考。
动物免疫，杂交瘤细胞的筛选和mAb的制备。用缀合KLH的各选定肽免疫几组BALB/c小鼠(每组5只)。通过标准ELISA使用(1)重组hIGF-1/E3mut；(2)重组hIGF-1/E wt；(3)重组hIGF-1；(4)重组hIGF-2；(5)重组mIGF-1；和/或(6)重组mIGF-2筛选杂交瘤细胞，选择具有期望特异性的杂交瘤细胞进行3轮亚克隆和二次筛选。使用蛋白质A亲和柱从最终选定的杂交瘤细胞培养上清中纯化单克隆抗体。
3种抗原肽(肽A、肽B和肽C)在GL Biochem(Shanghai)Ltd.，Shanghai，China化学合成和经HPLC纯化。通过质谱分析测定肽纯度为免疫级(约85％)。这些肽包含C残基并通过购自Pierce(货号77605)的试剂盒与马来酰亚胺活化的KLH缀合。
使用6-8周大的BALB/c小鼠产生抗体。为了引发免疫反应，对几组BALB/c小鼠(每组5只)经皮下注射分别施用50μg在CFA中的3种抗原肽-KLH缀合物(用于首次注射)和25μg在IFA中的各抗原(用于第二次和第三次注射)。通过腹腔注射25μg抗原进行最终加强免疫，不使用任何佐剂。免疫时间表如下：
第0天：免疫前取血；首次抗原注射
第26天：第二次抗原注射
第52天：第三次抗原注射
第63天：血液检测；抗血清滴度ELISA
第69天：最终加强免疫
第73天：脾切除术
通过ELISA检查免疫后的抗原特异性抗体的产生。使用1μg/ml在碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(Pierce，货号28382)中的hIGF-1/E 3mut，hIGF-1/Ewt，hIGF-1，hIGF-2，mIGF-1或mIGF-2包被Nunc-Immuno微滴定板，与连续稀释的免疫前和抗血清和/或杂交瘤细胞上清样品孵育，使用辣根过氧化物酶缀合的多克隆山羊抗小鼠IgG抗体(Sigma，货号A0168)和之后用BM蓝PO底物(Roche Diagnostics，货号1.484.281)显色检测结合抗原的小鼠IgG。在用2.0M H2SO4终止过氧化物酶反应后在450nm处读取微滴定板，使用软件SoftMax Pro v5.2(Molecular Devices)分析ELISA数据。结果显示于图2-4。
通过标准程序将从免疫小鼠中分离的脾细胞和无分泌骨髓瘤Sp2/0-Ag14细胞融合生成杂交瘤细胞。进行ELISA测定以鉴定特异性针对hIGF-1/E 3mut肽的杂交瘤细胞。
将选择的杂交瘤细胞在无血清生长培养基中适应(Sigma，货号24621C-500)。从杂交瘤细胞上清中通过蛋白质A亲和柱根据标准程序纯化单克隆抗体并通过透析更换至PBS中。使用购自Southern Biotech(货号5300-05)的小鼠IgG同种型试剂盒测定纯化抗体的同种型。
将抗原特异性杂交瘤细胞通过有限稀释进行3轮亚克隆(并通过ELISA二次筛选)。
通过肽A、肽B和肽C免疫生成的抗体结果在上面已描述。
使用本发明抗体的方法
检测样品中修饰的IGF-1/E的免疫测定。本发明提供了诊断测定，用于测定生物样品(例如血液、血清、细胞、组织)或已施用IGF-1/E蛋白的个体中修饰的IGF-1/E蛋白。诊断测定例如竞争性测定依赖于标记的类似物(“示踪物”)与检测样品被测物在共同结合对象的有限数目结合位点上的竞争能力。一般在竞争前或后使结合对象不溶，之后将与结合对象结合的示踪物和被测物与未结合的示踪物和被测物分离。此分离通过倾析(其中预先使结合对象不溶)或通过离心(其中在竞争反应后沉淀结合对象)完成。通过测量标记物的量(可知)检测样品被测物的量与结合的示踪物的量成反比。绘制已知量被测物的剂量响应曲线并与检测结果比较，以定量测定在检测样品中存在的被测物量。当使用酶作为检测标记时，将这些测定称为酶联免疫吸附测定(ELISA)系统。这些测定，特别是ELISA检测形式的测定在临床环境和常规血液筛选中具有大量应用。免疫测定形式和条件的描述见Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Publications，New York，1988)。
本发明的免疫测定在预测医学领域中有用，其中使用诊断测定、预测测定、药物基因组学和监测临床试验用于预测(预防)目的。
使用本发明单克隆抗体的三明治ELISA测定。分别使用针对肽C生成的3种mAb，QQ2，QQ5和QQ6作为捕获抗体和使用市售的IGF-1mAb作为检测试剂，也用于检查QQ2，QQ5和QQ6的特异性。如图5所示，所有3种mAb与hIGF-1/Ea 3mut，hIGF-1/Ec 3mut和糖基化hIGF-1/Ea 3mut结合，但不与hIGF-1肽结合。甚至当hIGF-1浓度高达10nM时仍没有QQ2，QQ5或QQ6与hIGF-1的结合(图5)。
在ELISA测定中，从连续稀释的抗血清和杂交瘤细胞上清样品中得到的平均OD值分别与类似处理的预免疫血清和细胞生长培养基的平均OD值比较。当其OD值比阴性对照的高至少2倍时认为抗血清或杂交瘤细胞上清样品与包被的抗体有反应性。
“分离的”或“纯化的”多肽或其生物活性部分基本上不含生成本发明抗体的细胞或组织来源的细胞物质或其他污染多肽，或当为化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学药品。例如，分离的IGF-1/E应不含干扰试剂的诊断或治疗用途的物质。这些干扰物质可包括酶、激素和其他蛋白质和非蛋白质溶质。
抗体选择性的评估
与wt人IGF相比，抗体针对修饰的IGF-1/E的选择性通过下述确认：对动物施用修饰的IGF-1/E No.1或No.2，之后使用根据本发明的抗体回收修饰的IGF-1/E。如果回收的量比施用于动物的原始修饰的IGF-1/E量多，则表示非特异性结合(即与wt IGF结合)。
在7只猴子和7只狗的血清样品中加入80ng/ml突变IGF No.1或200ng/ml突变IGF No.2，在6只大鼠的血清中加入30ng/ml突变IGF No.1。对突变IGF No.1使用抗体QQ2或对突变IGF No.2使用抗体QQ5分析突变IGF的浓度。
对2种抗体以相同的方式进行测定。用100μl抗体(QQ2或QQ5)以2.5μg/μl浓度包被96孔板并放置过夜。之后用300μl封闭缓冲液洗2次，用300μl洗涤缓冲液洗4次。用测定缓冲液以1∶10稀释血清样品，将100μl各血清与100μl对照(10-3000ng/m浓度)加入板。之后将板在室温孵育4小时并摇晃。
之后加入100μl生物素化的抗-人IGF-1(75ng/ml浓度在测定缓冲液中)，将板在室温再孵育1小时并摇晃。之后如上所述洗涤板4次。
加入100μl链霉抗生物素-HRP缀合物(100ng/ml)，将板在室温再孵育30分钟并摇晃。之后如上所述洗涤板4次。
之后加入100μl TMB底物至各孔并孵育10分钟。之后加入100μl终止溶液，在30分钟内读取450nm处的光密度。
对照用于绘制标准曲线(未显示)。
抗体QQ2的结果
Figure BDA0000060202280000211
Figure BDA0000060202280000221
Figure BDA0000060202280000222
抗体QQ5的结果
Figure BDA0000060202280000231
Figure BDA0000060202280000232
7
Figure BDA0000060202280000241
特异性/选择性是分析方法在其他类似和/或无关成分存在时测量和鉴别样品中被测物的能力。通过评估测量加入的和从生物基质中回收的被测物的量得到的精度进行研究。特异性/选择性的目的接受标准是对至少80％评估的基质得到可接受的回收。在我们的方法中定义可接受的回收为75-125％。因为研究的各基质均在接受标准内，我们认为此方法是特异性和选择性的。
Figure IDA0000060202360000011
Figure IDA0000060202360000021
Figure IDA0000060202360000051
Figure IDA0000060202360000061
PCT/RO/134表
Figure QDA00000602023200011
Figure QDA00000602023200021

Claims (17)

1.抗体，其与肽GPTLCGAELV(SEQ ID NO：1)免疫特异性结合，而不与肽GPETLCGAELV(SEQ ID NO：2)免疫特异性结合。
2.抗体，其与包含肽GPTLCGAELV(SEQ ID NO：1)的多肽免疫特异性结合，而不与包含肽GPETLCGAELV(SEQ ID NO：2)的多肽免疫特异性结合。
3.抗体，其与肽PAKSAVRAQR(SEQ ID NO：6)免疫特异性结合，而不与肽PTKAARSIRAQR(SEQ ID NO：7)免疫特异性结合。
4.抗体，其与包含肽PAKSAVRAQR(SEQ ID NO：6)的多肽免疫特异性结合，而不与包含肽PTKAARSIRAQR(SEQ ID NO：7)的多肽免疫特异性结合。
5.根据权利要求1-4中任一项的抗体，其中所述抗体选自QC1(由杂交瘤表达)，QC2(由杂交瘤表达)，QQ2(由杂交瘤表达)，QQ5(由杂交瘤表达)和QQ6(由杂交瘤表达)。
6.选自的杂交瘤，其均在DSMZ中保藏。
7.分离的多肽，其包含序列GPTLCGAELV(SEQ ID NO：1)，CPAKSAVRAQR(SEQ ID NO：5)或PAKSAVRAQR(SEQ ID NO：6)。
8.核酸，其编码根据权利要求5的抗体或根据权利要求7的多肽。
9.载体，其包含根据权利要求8的核酸。
10.宿主细胞，其包含根据权利要求9的载体。
11.改进的酶联免疫吸附测定(ELISA)，用于检测修饰的胰岛素样生长因子1/E(IGF-1)，其包含根据权利要求1-5中任一项的抗体。
12.改进的亲和层析方法，用于从溶液中纯化修饰的胰岛素样生长因子1/E(IGF-1)，其中改进包含使用根据权利要求1-5中任一项的抗体进行纯化。
13.测定患者中修饰的IGF-1/E蛋白水平的方法，其包含以下步骤：使用根据权利要求1-5中任一项的抗体检测从患者处得到的血液样品中的修饰的IGF-1/E。
14.在有需要的患者中维持修饰的IGF-1/E的最优剂量的方法，其包含：
(i)使用根据权利要求1-5中任一项的抗体检测在已施用修饰的IGF-1/E的患者血液样品中的修饰的IGF-1/E，和
(ii)当患者血液样品中的修饰的IGF-1/E水平低于预设的水平时，对所述患者施用额外剂量的所述修饰的IGF-1/E。
15.治疗患有肌肉疾病的患者的方法，其包含：
(i)使用根据权利要求1-5中任一项的抗体检测从之前已施用修饰的IGF-1/E的患者中得到的血液样品中修饰的IGF-1/E的血清浓度，和
(ii)如果hIGF-1/Ea 3mut的血清浓度低于预设的最优水平，则对患者施用更多的修饰的IGF-1/E。
16.根据权利要求11的测定或根据权利要求12-15中任一项的方法，其中所述修饰的IGF-1/E是WO2007/146689中描述的之一。
17.根据权利要求13-16中任一项的方法，其中所述hIGF-1/Ea 3mut选自WO2007/146689的实施例1中描述的那些(在那里被称为SEQ ID NO：8，在此处为修饰的IGF-1/E No.1)，或在WO2007/146689的实施例45中描述的那些(在那里被称为SEQ ID NO：53，在此处为修饰的IGF-1/E No.2)。
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