CN105622730A - 一种特异性结合igf-1的多肽及其应用 - Google Patents

一种特异性结合igf-1的多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合IGF-1的多肽及其应用。该多肽的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，编码核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。该多肽能特异性结合IGF-1，且与IGF-1的亲和力高。因此，其能用于制备IGF-1检测试剂盒、用于制备针对IGF-1治疗性多肽药物以及用于制备以IGF-1为治疗靶点的去除痤疮类化妆产品。

Description

一种特异性结合IGF-1的多肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种特异性结合IGF-1的多肽及其应用。
背景技术
胰岛素样生长因子1(IGF-1)是由70个氨基酸残基组成的多肽，主要是由肝脏细胞分泌，在人体内发挥多种功能，如促进中枢神经系统的发育、调节神经元的生理活动，以及影响体细胞对胰岛素的敏感性等。
痤疮是一种主要由雄性激素引起的毛囊皮脂腺慢性炎症性疾病，在青少年人群中有较高的发病率。由于痤疮的发生部位多在面部，病情严重时会影响患者的外貌，从而使患者在人际交往中承受极大的心理压力，严重影响了患者的生活质量，某些患者甚至会由于承受的心理压力过大而导致出现精神方面的疾病，如抑郁和焦虑等。当前治疗痤疮的策略主要是在发病时缓解患者的病情，尚未出现能完全根治的治疗药物或手段。
越来越多的研究人员和专家认为痤疮的发病与IGF-1的表达水平有着紧密的联系。有研究表明痤疮患者血清中IGF-1的水平与痤疮病变程度具有明显的相关性。由细胞外IGF-1引起的细胞信号转导，最终可以导致皮脂细胞增生和皮质细胞油脂分泌增多，从而诱导或加重痤疮的病情。因此，干预IGF-1在皮肤细胞中的功能有望成为有效治疗痤疮的新策略。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种特异性结合IGF-1的多肽。
本发明的另一目的在于提供所述特异性结合IGF-1的多肽的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种特异性结合IGF-1的多肽，氨基酸序列如下所示：
QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTISNYNMSWVRQAPGKGLEWVSSIKGKRGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIRKGSTEKSLYWGQGTLVTVSS。
上述氨基酸序列由3个互补决定区和4个框架区组成，其中，3个互补决定区的氨基酸序列分别如下所示：RTISNYNMS、SIKGKR、IRKGSTEKSLY；4个框架区的氨基酸序列分别如下所示：QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG、WVRQAPGKGLEWVS、GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA、WGQGTLVTVSS。上述多肽的互补决定区的氨基酸序列主要负责对IGF-1的特异性识别和结合，框架区主要起到维持上述多肽特定的三维空间结构以及辅助该多肽与IGF-1之间识别和结合的作用。
上述特异性结合IGF-1的多肽的编码基因的核苷酸序列如下所示：
CAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGACGTACGATCAGCAACTATAATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAAGTATTAAGGGCAAACGCGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGATTAGAAAGGGGTCTACGGAGAAGTCGCTGTATTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC。
上述特异性结合IGF-1的多肽由119个氨基酸组成，对应的编码基因的长度为357个核苷酸。
上述特异性结合IGF-1的多肽的编码基因可以通过合适的表达系统在原核细胞和真核细胞中进行表达，得到所述特异性结合IGF-1的多肽。
一种表达载体，包含上述特异性结合IGF-1的多肽的编码基因。
所述的表达载体包括原核表达载体和真核表达载体；优选为原核表达载体。
一种转基因细胞株，包含上述表达载体。
所述的细胞优选为大肠杆菌。
所述特异性结合IGF-1的多肽在科学研究和临床上检测IGF-1中的应用，是将所述特异性结合IGF-1的多肽制备成IGF-1检测试剂盒，具体应用时，利用本发明的针对IGF-1的多肽与IGF-1的特异性结合能力，采用酶联免疫吸附法和亲和层析法等进行检测。
所述特异性结合IGF-1的多肽在制备针对IGF-1治疗性多肽药物中的应用。
所述特异性结合IGF-1的多肽在制备以IGF-1为治疗靶点的去除痤疮类化妆产品中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供的特异性结合IGF-1的多肽与IGF-1的亲和力高。本发明的特异性结合IGF-1的多肽在开发以IGF-1为治疗靶标的去除痤疮类化妆产品中具有广阔的前景。
附图说明
图1是50个克隆在450nm处的光吸收检测结果图。
图2是18号克隆与不同的抗原的结合力的检测结果图。
图3是12、20、24、33、48号克隆与不同抗原结合力的检测结果图。
图4是18号克隆作用人永生化表皮细胞HaCaT的检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1多肽噬菌体展示文库的构建
(1)抽取广东省健康志愿者的外周血100ml，将外周血与生理盐水以1：1的比例进行混合，混合后的液体采用常规的淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离外周血中的单个核淋巴细胞并提取其总RNA；
(2)以OligodTPrimer为引物、上述提取的总RNA为模板通过反转录反应合成cDNA，使用M-MLV反转录酶，反应条件为42℃1h
(3)以上述反转录反应生成的第一天cDNA链为模板，利用PCR扩增人抗体的重链可变区片段(PCR扩增反应所使用的引物选自沈倍奋编写的《重组抗体》科学出版社、2005、ISBN7-03-014638-7)；
(3)采用SfiI和NotI两个限制性核酸内切酶(上海碧云天生物技术有限公司)对上述PCR产生的片段和pHEN1噬菌体展示质粒进行双酶切，反应条件为37℃、10min，通过2％的琼脂糖凝胶(将0.6g琼脂粉溶解于30mlTAE电泳缓冲液中)电泳鉴定和纯化酶切产物，使用T4DNA连接酶连接两个酶切片段，反应条件为4℃、12h；
pHEN1噬菌体展示质粒通过如下步骤构建得到：以fd-tet-DOG1质粒(构建方法参考文献“ClacksonT,etal.Makingantibodyfragmentsusingphagedisplaylibraries.[J].Nature,1991,352(6336):624-628”)为模板，以引物F1和R1为上下游引物进行PCR反应，反应条件为95℃20s、62℃30s、72℃2min，30个循环，PCR反应得到的产物两端分别带有EcoRI和HindIII这两个限制性内切酶的酶切位点(引物F1和R1序列中用下划线标出的即为酶切位点)，使用EcoRI和HindIII内切酶(上海碧云天生物技术有限公司)双酶切上述PCR反应的产物和pUC119质粒(上海北诺生物科技有限公司)，反应条件为37℃、10min，通过2％的琼脂糖凝胶(将0.6g琼脂粉溶解于30mlTAE电泳缓冲液中)电泳鉴定和纯化酶切产物，使用T4DNA连接酶连接两个酶切片段，反应条件为4℃、12h，连接反应得到的产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，使用引物F1和R1筛选，得到的阳性克隆测序，确定得到pHEN1噬菌体展示质粒；
F1：5’-CAGTGAATTCTTATTAAGACTCCTTATTACGCAGTATGTTAGC-3’；
R1：5’-TGCGAAGCTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACG-3’。
(4)将上述连接产物电转化至大肠杆菌TG1(购自上海碧云天生物技术有限公司)感受态细胞中，将转化好的菌液涂布于固体培养板上(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃培养过夜；
(5)在上述固体培养板上加入1ml2×TY液体培养基使用涂布棒将其上的细菌刮下，接种到200ml2×TY液体培养基中，37℃、220rpm培养至OD600＝0.6-0.9；
(6)在上述菌液中加入1013个M13辅助噬菌体(购自NEB公司)侵染上述含有噬菌粒的大肠杆菌，25℃，220rpm继续培养过夜；
(7)8000g离心上述过夜培养物，收集上清，在该上清中加入四分之一的PEG6000，纯化上清中的噬菌体颗粒，此即为构建好的多肽噬菌体展示文库，可用于后续特异性结合IGF-1多肽的亲和淘选。
实施例2特异性结合IGF-1多肽的亲和淘选
(1)将溶解于10ml50mM、pH＝8.5NaHCO3缓冲液的100μgIGF-1包被NUNC酶标板：酶标板中的每孔加入100μl蛋白溶液，4℃静置过夜；
(2)第二天使用浓度0.01M、pH＝7.4磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次后，每孔加入300μlBSA-PBS(浓度为质量体积比4％，即4gBSA粉末溶解于100ml的PBS中)，室温封闭1h；
(3)1h后，从实施例1制备的多肽噬菌体展示文库中取1×1012个噬菌体加入步骤(2)处理好的酶标板中，室温孵育1h；
(4)吸出未结合的噬菌体，用0.2％Tween-20-PBS溶液(即用PBS将2ml吐温20定容至1000mL得到)洗涤10次。
(5)用0.2M、pH＝2.2的Glycine-HCl(甘氨酸-盐酸)溶液将与IGF-1结合的噬菌体洗脱下来，并感染处于生长对数期的大肠杆菌TG1菌株，表达和纯化噬菌体用于下一轮亲和淘选。
(6)用同样的方法进行第2、3、4轮的亲和淘选。经过4轮淘选，与IGF-1特异性结合的多肽将得到逐步富集。
实施例3采用酶联免疫吸附方法(ELISA)淘选结合IGF-1的单个阳性克隆
(1)从上述第四轮淘选后洗脱的噬菌体平板上挑取50个单菌落，并接种于500μl含有100μg/ml氨苄青霉素的2×TY培养基中，于37℃，220rpm生长至对数期后，在培养基中加入终浓度为1mM的IPTG，25℃培养过夜；
(2)离心收集上述过夜的细菌培养物上清，将该上清转移至预先包被IGF-1和4％BSA-PBS封闭的ELISA板中，室温孵育1h；
(3)用PBST洗涤3次，使用PBST+5％脱脂奶粉(用PBS将2ml吐温20和50g脱脂奶粉定容至1000mL得到)将鼠抗HIS标签抗体(上海碧云天生物技术有限公司)进行1：5000稀释，每孔加入100μl上述稀释液，室温孵育1h；
(4)用PBST洗涤3次，使用PBST+5％脱脂奶粉将HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体(上海碧云天生物技术有限公司)进行1:5000稀释，每孔加入100μl上述稀释液，室温孵育1h；
(5)用PBST洗涤3次，加入100μlTMB底物溶液(上海碧云天生物技术有限公司)，避光显色10min，加入50μl1M硫酸溶液终止显色反应，用酶标仪测定450nm处的吸收值；
(6)OD值大于对照孔OD值3倍以上的克隆判为阳性克隆(见图1)，即为12、18、20、24、33和48号克隆。
实施例4在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达和纯化
(1)将实施例3挑选到的阳性克隆(12、18、20、24、33和48号)分别转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)(北京博特森生物技术有限公司)菌株，并涂布LB固体培养平板上(含有100μg/ml氨苄青霉素和质量体积比2％葡萄糖)，37℃培养过夜；
(2)挑取单个菌落接种于5mlLB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃、220rpm培养过夜。
(3)接种5ml上述过夜培养菌液至1LLB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃、220rpm摇床培养到OD600值等于0.6-0.9时，在上述菌液中加入IPTG使菌液中IPTG的终浓度为1mM，于25℃，220rpm摇床继续培养过夜；
(4)对上述1L菌液采用8000g离心10min处理，收集细菌沉淀，重悬沉淀并进行超声(超声条件为：40％的功率、工作3s、停8s，工作50min)破菌；
(5)破碎后，25000g离心25min，取上清，此上清即为所述多肽的粗提取物，将此上清经过镍离子金属螯合亲和层析柱(上海七海复泰生物科技有限公司)纯化，按照纯化柱附带说明书叙述的方法进行样品纯化工作，收集洗脱的样品进行SDS-PAGE电泳鉴定，纯化过程最终可得到纯度达90％以上的目的多肽。
实施例5所述多肽结合IGF-1的特异性鉴定
(1)在ELISA板上分别包被0.2μg的IGF-1、EGF、VEGF、FGF2和BSA，每种蛋白各包被3个复孔，用于检测结合IGF-1的特异性，4℃包被过夜，然后在每个孔中加入300μl4％BSA-PBS，室温封闭1h；
(2)在相应的孔中分别加入100μl所述多肽的纯化产物(实施例4制备得到)，室温孵育1h；
(3)用PBST洗涤3次，使用PBST+5％脱脂奶粉将鼠抗HIS标签抗体进行1:5000稀释，每孔加入100μl上述稀释液，室温孵育1h；
(4)用PBST洗涤3次，使用PBST+5％脱脂奶粉将HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体进行1:5000稀释，每孔加入100μl上述稀释液，室温孵育1h；
(5)用PBST洗涤3次，加入100μlTMB底物溶液，避光显色10min，加入50μl1M硫酸溶液终止显色反应，用酶标仪测定各孔在450nm处的光吸收值。结果显示18号克隆较其他克隆而言，特异性更好，对IGF-1的亲和力更强(见图2和图3)。
(6)将18号阳性克隆进行摇菌，提取质粒测序，得到编码所述的特异性结合IGF-1多肽的基因序列，如下所示：
CAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGACGTACGATCAGCAACTATAATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAAGTATTAAGGGCAAACGCGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGATTAGAAAGGGGTCTACGGAGAAGTCGCTGTATTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC。
实施例6所述多肽对人永生化表皮细胞(HaCaT)生长的抑制作用
(1)按每孔3000个的细胞数量将HaCaT细胞(ATCC)接种到常规96孔细胞培养板的60个孔中(分10个实验组，每组分别设置6个生物学重复，因此板上接种60个孔)，每个孔的接种体积为100μl，将96孔板放置于37℃二氧化碳培养箱中培养；
(2)细胞培养4小时后，除了第1组，剩余9个实验组的孔中均加入IGF-1，IGF-1的终浓度为80ng/ml。
(3)按如下浓度梯度：0、0、10、20、40、80、160、320、640、1280ng/ml在各个实验组的孔中加入相应浓度的纯化好的多肽(18号)，将96孔板放回培养箱中继续培养；
(4)在细胞培养箱中培养72小时后，每孔加入10μl质量体积比0.5％的MTT溶液，在细胞培养箱中孵育4小时；
(5)将孔内的培养液移除，每孔加入50μlDMSO，在摇床上缓慢摇晃10min，然后使用酶标仪检测OD570nm处各孔的吸光值。结果显示所述多肽具有抑制表皮细胞增殖的作用，且抑制效果呈现浓度依赖性(见图4)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种特异性结合IGF-1的多肽，其特征在于：氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1所述的特异性结合IGF-1的多肽的编码基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.一种表达载体，其特征在于：包含权利要求2所述的特异性结合IGF-1的多肽的编码基因。
4.一种转基因细胞株，其特征在于：包含权利要求3所述的表达载体。
5.根据权利要求4所述的转基因细胞株，其特征在于：所述的表达载体为原核表达载体，所述细胞为大肠杆菌。
6.权利要求1所述特异性结合IGF-1的多肽在制备成IGF-1检测试剂盒中的应用。
7.权利要求1所述特异性结合IGF-1的多肽在制备针对IGF-1治疗性多肽药物中的应用。
8.权利要求1所述特异性结合IGF-1的多肽在制备以IGF-1为治疗靶点的去除痤疮类化妆产品中的应用。
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