CN103421115A

CN103421115A - 一种cd38纳米抗体及应用

Info

Publication number: CN103421115A
Application number: CN201310392116XA
Authority: CN
Inventors: 万亚坤; 孙燕燕; 王平艳
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2013-09-02
Filing date: 2013-09-02
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2033-09-02
Also published as: CN103421115B

Abstract

本发明公开了一种CD38的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，公开了框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列和互补决定区CDR氨基酸序列，本发明还公开了一种CD38纳米抗体，还公开了一种DNA分子，它编码本发明所述的CD38的纳米抗体的VHH链或本发明所述的CD38纳米抗体，还公开了一种宿主细胞，它可以表达CD38的纳米抗体。还公开了该CD38纳米抗体用于检测CD38的用途。通过本发明所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于CD38检测试剂的研发。

Description

一种CD38纳米抗体及应用

技术领域

本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及一种针对于CD38的纳米抗体。

背景技术

人CD38分子是在20世纪80年代早期由Reinnerz等用单克隆抗体的方法鉴定出来的,定名为T10,最初被认为是一种活化抗原,主要用于白细胞分类及表型鉴定。CD38分子表达与分布相当广泛,主要表达在不成熟的造血细胞和活化的淋巴样细胞,在骨骼肌、心肌、气道平滑肌和子宫平滑肌CD38分子也有表达。尤其是在淋巴细胞中表达的特点,表明它可能在细胞的某个成熟阶段参与细胞生长与分化的调节,所以在慢性淋巴细胞白血病中CD38分子有独立的预测价值。同时CD38分子可以作为反映类风湿性关节炎病情活动的有效指标,CD38分子在CD8+细胞上的表达可以作为残留病毒复制的指标。CD38分子自身免疫反应性糖尿病的诊断指标,并可用于艾滋病及巨细胞病毒的检测及系统性红斑狼疮的病情监测。

目前市场上用于检测CD38的试剂盒主要是“白细胞分化抗原CD38检测试剂盒”(流式细胞仪法-FITC)的工作原理主要通过FITC荧光素标记的抗CD38单克隆抗体来实现的，但是这种传统意义上的抗体稳定性差、灵敏度低、生产成本高，所有因素均限制了对于CD38的检测。1993年比利时科学家首次在Nature报道：在骆驼血液中的抗体，有一半没有轻链，而且更让人惊喜的是，这些缺失轻链的“重链抗体”能像正常抗体一样与抗原等靶标紧密结合，另外不像scFv那样互相粘连，甚至聚集成块。这种抗体只包含一个重链可变区和两个常规的CH2与CH3区，更重要的是单独克隆并表达出来的VHH区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，分子量只是普通抗体的1/10，所以VHH也称Nanobody（纳米抗体）；与此同时纳米抗体化学性质也更加灵活，稳定性好，可溶性高，表达容易且容易获得，容易偶联其他分子，因此应用纳米抗体技术研发CD38检测试剂具有广阔的前景。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种针对CD38表位的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。

技术方案：为实现上述目的，本发明的第一方面，提供了一种CD38的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4；或SEQ ID NO：5所示的FR1，SEQ IDNO：6所示的FR2，SEQ ID NO：7所示的FR3，SEQ ID NO：8所示的FR4；

所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：

SEQ ID NO：9所示的CDR1，SEQ ID NO：10所示的CDR2，SEQ ID NO：11所示的CDR3；或SEQ ID NO：12所示的CDR1，SEQ ID NO：13所示的CDR2，SEQID NO：14所示的CDR3；

优选地，所述的CD38的纳米抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。

本发明第二方面，一种CD38纳米抗体，它针对CD38表位的纳米抗体，包括两条具有SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的VHH链。

本发明第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述的CD38的纳米抗体的VHH链，或本发明所述的CD38纳米抗体。

优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18

本发明的第四方面，提供了一种表达载体，它含SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18

所示的核苷酸序列。

本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的表达载体。

本发明的第六方面，提供了本发明所述的CD38纳米抗体用于检测CD38的用途。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明将CD38抗原胞外段多肽人工合成，并随之免疫新疆双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对于CD38的纳米抗体基因库，试验中将CD38多肽偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），从而获得了针对CD38特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

附图说明

图1是纳米抗体的基因电泳图；其中泳道1是DNA分子标准，泳道2是PCR扩增重链抗体可变区片段

图2是对于所构建的CD38特异性的单域抗体文库进行的菌落PCR电泳图；其中泳道1是DNA分子标准，泳道2-25是在所构建的CD38纳米抗体文库中随机的挑取克隆，通过菌落PCR检测文库的插入率，计算结果表明文库插入率至100%。

图3是用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆的模式图；其中1是将载脂蛋白偶联在酶标板上，2是纳米抗体，3是鼠抗HA抗体，4是山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的抗体，5是碱性磷酸酶显色液；

图4是表达的CD38纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中泳道1是蛋白分子标准，泳道2是破菌后蛋白总的粗提液样品，泳道3是总的蛋白粗提液过镍柱后的样品，泳道4是含50毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品，泳道5是含100毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品，6-7是250毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品，8-11是500毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品；

图5CD38纳米抗体检测特异性分析结果。

具体实施方式

本发明首先将人工合成的CD38多肽免疫一只新疆双峰驼，经过4次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并构建了CD38特异的单域重链抗体文库。将CD38偶联在NUNC酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，使得CD38的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选CD38免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：针对于CD38的纳米抗体文库的构建：

（1）将人工合成的CD38多肽，由南京金斯瑞公司合成，.其序列为GenBank:BAA18966.1，浓度为500微克每毫升，每次免疫将20mgCD38与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼(句容圣龙家畜养殖厂)，每周一次，共免疫4次，除第一次使用完全的弗氏佐剂，剩余几次全部使用弗式不全佐剂，免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。（2）4次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100ml并提取总RNA，参照QIAGEN公司提供的RNA提取试剂盒。（3）按照Super-Script III FIRST STRANDSUPERMIX试剂盒说明书，将提取的RNA反转录成cDNA并利用套式PCR扩增VHH链，第一轮PCR：

上游引物GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC

下游:GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC

扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段,54℃退火,25个循环;

第二轮PCR：

以第一轮PCR产物作模板，

上游引物：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG

下游引物：GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段(长片段和短片段),60退火,17个循环,回收目的片段，结果如图1显示，从左到右的DNA条带分别是：第一为100bP的分子Marker，第二纳米抗体基因电泳带约为500bp。（4）使用限制性的内切酶（购自NEB）PstI及NotI酶切20μg pComb3噬菌体展示载体（Biovector供应）及10μg VHH，并用T4DNA连接酶（购自TaKaRa公司）连接两个片段。（5）将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1（北京神州红叶科技有限公司）中，构建CD38的纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小为1.5*10⁸；与此同时，通过菌落PCR检测所建文库的插入率检测结果插入率约100%，图3显示菌落PCR结果。文库构建完成后，为检测文库的插入率，我们随机的选取24颗克隆做菌落PCR。结果显示：即我们的插入率已达到100%。

实施例2：针对CD38的纳米抗体筛选过程：

（1）将溶解在100毫摩pH8.2NaHCO₃中的CD38200微克偶联在NUNC酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照。（2）第二天两个孔中分别加入100微升0.1%酪蛋白，室温封闭2小时。（3）2小时后，加入100μl噬菌体（8*10¹¹tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库），在室温下作用1小时。(4）用PBST（PBS中含有0.05%吐温20）洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体。(5）用三乙基胺（100mM）将与CD38特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3-4轮。在不断地筛选的过程中，阳性的克隆将不断的被富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中CD38特异抗体的目的。该实验的原理模式图如图4所示。

实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆：

（1）从上述3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100微克每毫升的氨苄青霉素的TB培养基(1升TB培养基中含有2.3克磷酸二氢钾，12.52克磷酸氢二钾，12克蛋白胨，24克酵母提取物，4毫升甘油)中，生长至对数期后，加终浓度1毫摩尔的IPTG，28℃培养过夜。（2）利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。（3）用PBST洗去未结合的抗体，加入一mouse anti-HA tag antibody（抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置1小时。（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入anti-mouse alkaline phosphatase conjugate（山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置1小时。（5）用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。（6）当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。（7）将阳性克隆孔的菌转摇在含有100微克每毫升的LB液体中以便提取质粒并进行测序。

根据序列比对软件VectorNTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终共有2株不同的抗体。其抗体的VHH链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：15,SEQID NO：16所示。

实施例4：纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化：

（1）将前面测序分析所获得两种纳米抗体亚克隆至表达性的载体PET32b中，并将测序鉴定正确的重组质粒转化到表达型宿主菌DE3中，其涂布在含有100微克每毫升氨苄青霉素的LB固体培养基的板上，37℃过夜，（2）挑选单个菌落接种在15毫升含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜，（3）接种1ml的过夜菌种至330mlLB培养基中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6-1时，加入IPTG，28℃摇床培养过夜，（4）第二天，离心收菌，（5）将菌体破碎以获得抗体粗提液，（6）经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液（50毫摩尔，100毫摩尔）用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液（250毫摩尔，500毫摩尔）最终可制备纯度达90%以上的蛋白。图5所示从左到右的条带分别是：第一为标准蛋白分子，第二为破菌后蛋白总的粗提液样品，第三为总的蛋白粗提液过镍柱后的样品，第四为含有50毫摩咪唑的洗脱液洗脱的样品，第五为含有100毫摩咪唑的洗脱液洗脱的样品，第六，七为含有250毫摩咪唑的洗脱液洗脱样品，第八、九、十为含有500毫摩咪唑的洗脱液洗脱样品；结果显示，纳米抗体经过该纯化后，其纯度可达到95%以上。

实施例5CD38纳米抗体检测特异性分析

将CD38，前白蛋白碳酸盐透析后包被在酶标板上，同时做空白孔对照，各包被两个孔，将CD38纳米抗体及对照抗体前白蛋白纳米抗体分别转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。（3）用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tag antibody（抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置1小时。（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入二抗anti-mouse alkaline phosphatase conjugate（山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置1小时。（5）用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。结果显示CD38纳米抗体能特异性的识别CD38。模式图见图5，结果如下：

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 东南大学

<120> 一种CD38纳米抗体、其编码序列及应用

<130>

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Leu Gly Gln Glu Arg Glu Gly Val Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 3

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly

1 5 10 15

Asp Lys Asn Val Ala Tyr Leu Glu Met His Asn Leu Arg Pro Asp Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Leu Gly Gln Glu Arg Glu Gly Val Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 7

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly

1 5 10 15

Asp Lys Asn Val Ala Tyr Leu Glu Met His Asn Leu Arg Pro Asp Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Glu Tyr Asn Phe Ser Thr Phe Cys

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Ile Ser Thr Asn Pro Leu Pro Thr

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Ala Ala Asp Arg Leu Cys Gly Ala Leu Cys Ser Gln Thr Gln Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Glu Tyr Thr Ser Cys Thr Ser Cys

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Ile Ser Lys Ile Gly Leu Ala Thr

1 5

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Ala Ala His Arg Val Cys Arg Val Leu Cys Ser Gln Arg Asn Tyr Val

1 5 10 15

Tyr

<210> 15

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Asn Phe Ser Thr Phe

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Leu Gly Gln Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Thr Asn Pro Leu Pro Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Asp Lys Asn Val Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met His Asn Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Arg Leu Cys Gly Ala Leu Cys Ser Gln Thr Gln Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Thr Ser Cys Thr Ser

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Leu Gly Gln Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Lys Ile Gly Leu Ala Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Asp Lys Asn Val Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met His Asn Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala His Arg Val Cys Arg Val Leu Cys Ser Gln Arg Asn Tyr Val

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 17

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctgaata caacttcagt accttctgca tgggctggtt ccgccaggct 120

ctcgggcagg agcgcgaggg ggtcgctgct atttccacga atcctctgcc cacagcctat 180

gccgactcag tgaagggccg attcaccatc tctcgagacg gcgacaagaa cgtggcgtat 240

ctggaaatgc acaacctgag acctgacgac actgccatgt actactgtgc ggcagaccga 300

ctgtgcggtg cgttgtgctc acagacgcag ttcgactact ggggccaggg gacccaggtc 360

accgtctcct ca 372

<210> 18

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctgaata cacctcctgt acctcctgca tgggctggtt ccgccaggct 120

ctcgggcagg agcgcgaggg ggtcgctgct atttccaaga ttggtctggc gactgcctat 180

gccgactcag tgaagggccg attcaccatc tctcgagacg gcgacaagaa cgtggcgtat 240

ctggaaatgc acaacctgag acctgacgac actgccatgt actactgtgc ggcacaccga 300

gtgtgccgcg tgttgtgctc acagaggaac tacgtctact ggggccaggg gacccaggtc 360

accgtctcct ca 372

Claims

1.一种CD38的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：

SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4；

或SEQ ID NO：5所示的FR1，SEQ ID NO：6所示的FR2，SEQ ID NO：7所示的FR3，SEQ ID NO：8所示的FR4；

所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：

SEQ ID NO：9所示的CDR1，SEQ ID NO：10所示的CDR2，SEQ ID NO：11所示的CDR3；

或SEQ ID NO：12所示的CDR1，SEQ ID NO：13所示的CDR2，SEQ ID NO：14所示的CDR3。

2.根据权利要求1所述的CD38的纳米抗体的VHH链，其特征在于，它具有SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。

3.一种CD38纳米抗体，其特征在于，它针对CD38表位的纳米抗体，包括具有SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的VHH链。

4.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质：权利要求1或2所述的CD38的纳米抗体的VHH链，或权利要求3所述的CD38纳米抗体。

5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：

SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。

6. 一种表达载体，其特征在于，它含SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列。

7.一种宿主细胞，其特征在于，它可以表达CD38的纳米抗体。

8.权利要求3所述的CD38纳米抗体用于检测CD38的用途。