CN104447988A

CN104447988A - 双峰驼源ApoE纳米抗体、其编码序列及应用

Info

Publication number: CN104447988A
Application number: CN201410768323.5A
Authority: CN
Inventors: 万亚坤; 严俊荣
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明公开了针对于载脂蛋白ApoE的纳米抗体，同时还公开了编码该纳米抗体的基因序列以及能够表达该纳米抗体的宿主细胞。通过本发明所公开的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于ApoE分子检测试剂的研发。

Description

双峰驼源ApoE纳米抗体、其编码序列及应用

技术领域

本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，具体涉及一种针对于ApoE分子的纳米抗体、其编码序列及应用。

背景技术

载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)是一种富含精氨酸的碱性蛋白，人ApoE是由299个氨基酸残基组成，分子量为34145D，含32个Arg和12个Lys，是血浆的乳糜微粒、极低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等脂蛋白的组成成分，能够与低密度脂蛋白受体结合，在血浆胆固醇和甘油三脂的代谢中发挥作用。正常人血浆Apo E浓度为0.03～0.05g/L，Apo E的浓度与血浆甘油三酯含量呈正相关。ApoE生理功能有：①是LDL受体的配体，也是肝细胞乳糜微粒残粒受体的配体，它与脂蛋白代谢有密切相关性；②ApoE具有多态性，多态性是决定个体血脂水平与动脉粥样硬化发生发展密切相关；③参与激活水解脂肪的酶类，参与免疫调节及神经组织的再生。人类ApoE主要在肝脏和脑组织合成，在其他组织包括单核细胞(含巨噬细胞)也有合成能力。人的肾上腺、卵巢颗粒细胞也能合成ApoE。脑中ApoE的mRNA表达总量是肝脏的1/3，星形细胞是其主要合成部位。脑中生成的ApoE的作用可能是使细胞内的脂类重新分配而保持脑环境中的胆固醇平衡。脑肿瘤中发现有高浓度的ApoE，推断它可能作为神经胶质细胞瘤的标记。ApoE蛋白具有三个亚型：ApoE2，ApoE3和ApoE4，其区别在于112位Cys和158位的Arg。ApoE3为一种较普遍的亚型,其112位为Cys，158位为Arg。ApoE2112位和158位都是Cys，ApoE4则在112位和158位均为Arg，每二种亚型之间只有一个氨基酸的变化，如此小的变化却发生了功能上的巨大变化，ApoE的这种结构与功能间的构效关系正在被人们深入探究。许多研究表明，ApoE多态性与心血管疾病、Alzheimer’s(AD)病的发生密切相关，这些领域已引起人们广泛关注与浓厚兴趣。

纳米抗体，是骆驼重链抗体HCAbs的抗原结合位点。HCAbs最初由比利时科学家Hamers在骆驼血液中发现。普通的抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而从骆驼血液中发现的新型抗体只有两条重链，没有轻链，这些HCAbs能像正常抗体一样与抗原等靶标紧紧结合，但不像单链抗体那样相互黏连聚集成块。以HCAbs为基础获得的纳米抗体不仅分子量仅有15kDa，而且化学性质稳定性好，可溶性高，免疫原性低，亲和力高，能在大肠杆菌或酵母中高效表达，并容易进行C端功能化修饰。因此应用纳米抗体技术研发ApoE检测试剂具有广阔的前景。

发明内容

本发明目的是提供一种针对ApoE的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在检测ApoE分子方面的应用。

本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面，提供了一种针对ApoE纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR包括下组的FR1～FR4的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4；所述互补决定区CDR包括下组的CDR1～CDR3的氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。

优选地，所述的ApoE纳米抗体的VHH链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

本发明第二方面，提供了一种ApoE纳米抗体，其针对ApoE表位的纳米抗体，包括一条如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的VHH链。

本发明第三方面，提供了一种DNA分子，其编码选自下组的蛋白质：本发明所述的ApoE纳米抗体的VHH链，或本发明所述的ApoE纳米抗体。

优选地，所述的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

本发明第四方面，提供了一种宿主细胞，其可以表达本发明所述的ApoE纳米抗体。

本发明第五方面，提供了本发明所述的ApoE纳米抗体在检测ApoE分子方面的应用。

本发明的有益效果：本发明将血液中提取的ApoE蛋白免疫新疆双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对于ApoE的纳米抗体基因库，试验中将ApoE偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了针对ApoE特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

附图说明

图1是菌落PCR检测所建文库的插入率的DNA电泳图，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为2000bp的分子标记，其余孔道为PCR产物，PCR产物带约为500bp。

图2是ApoE纳米抗体纯化图，左道为蛋白标准分子，右道为经过镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的ApoE纳米抗体。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

本发明首先将人血液中提取的ApoE免疫一只新疆双峰驼，经过4次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并构建了ApoE特异的纳米抗体文库。将ApoE偶联在NUNC酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，使得ApoE的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选ApoE免疫性的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

实施例1：针对于ApoE的纳米抗体文库的构建：

(1)首先将1mg ApoE与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共免疫7次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；(2)7次免疫结束后，提取100mL骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；(3)合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH；(4)利用限制性内切酶Pst I及Not I酶切20ug pComb3噬菌体展示载体(Biovector供应)及39ug VHH并连接两个片段；(5)将连接产物转化至电转感受态细胞TG1中，构建ApoE纳米抗体文库并测定库容，库容大小为4.9×10⁹CFU/mL；(6)随机挑取24颗克隆，通过菌落PCR检测所建文库的插入率检测结果插入率为83.3％，图1显示菌落PCR结果，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为2000bp的分子标记，其余孔道为PCR产物，PCR产物带约为500bp。

利用套式PCR扩增VHH的具体条件如下：

第一步PCR程序：

第一步PCR的体系：

引物序列：

正向引物CALL001如SEQ ID NO：10所示：

5′-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3′

反向引物CALL002如SEQ ID NO：11所示：

5′-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3′

第二步PCR程序：

第一步PCR的体系：

引物序列：

正向引物1BACK-1如SEQ ID NO：12所示：

5’-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGG-3′

正向引物2BACK-2如SEQ ID NO：13所示：

5’-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGG-3′

反向引物PMCF如SEQ ID NO：14所示：

5’-CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT-3′

实施例2：针对ApoE的纳米抗体筛选过程：

(1)将溶解在100mM NaHCO₃、pH 9.5中的20ug ApoE偶联在NUNC酶标板上，4℃放置过夜；(2)第二天加入100uL 0.1％酪蛋白，室温封闭2h；(3)2h后，加入100uL噬菌体(5×10¹¹tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库)，室温作用1h；(4)用PBS+0.05％Tween-20(PBST)洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体；(5)用100mM三乙醇胺TEA(triethylamine)将与ApoE特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，37℃培养1h，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3～4轮，逐步得到富集。

实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆：

(1)从上述3～4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100ug/mL氨苄青霉素的TB培养基(1L TB培养基中含有2.3g磷酸二氢钾，12.52g磷酸氢二钾，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油)中，生长至对数期后，加入终浓度1mM的IPTG，28℃培养过夜。(2)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1h。(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入mouse anti-HA tag antibody(鼠源抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司)，在室温下放置1h。(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入anti-mouse alkalinephosphatase conjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司)，在室温下放置1h。(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。(6)当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。(7)将阳性克隆转摇在含有100ug/mL氨苄青霉素的LB液体中以便提取质粒并进行测序。

根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，其抗体的VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

实施例4：纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化：

(1)将前面测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌WK6中，并将其涂布在LA+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；(2)挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；(3)接种1mL的过夜菌种至330mL TB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6～1时，加入终浓度1mM的IPTG，28℃摇床培养过夜；(4)离心，收菌；(5)利用渗透法，获得抗体粗提液；(6)经镍柱离子亲和层析可制备纯度达90％以上的蛋白。如图2所示，左道为蛋白标准分子，右道为经过镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的ApoE纳米抗体，结果显示，ApoE纳米抗体经过该纯化过程，其纯度可达到90％以上。

实施例5：ApoE纳米抗体检测特异性分析

(1)将载脂蛋白ApoE，前白蛋白PA用100mM NaHCO₃(pH 8.2)透析后包被在酶标板上，同时直接加入100mM NaHCO₃(pH 8.2)作为空白对照，各包被三个孔，将ApoE纳米抗体加入到包被有ApoE、PA的孔和空白对照的孔中，在室温下放置1h。(2)用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tag antibody(抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司)，在室温下放置1h。(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入二抗goat anti-mouse alkaline phosphatase conjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司)，在室温下放置1h。(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值，并计算平均值。结果显示ApoE纳米抗体能特异性的识别ApoE。结果如下：

包被抗原	ApoE	前白蛋白PA	空白对照
				读值(平均值)	3.413	0.231	0.225

Claims

1.一种针对ApoE纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，所述框架区FR包括下组的FR1～FR4的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4；所述互补决定区CDR包括下组的CDR1～CDR3的氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。

2.根据权利要求1所述的ApoE纳米抗体的VHH链，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

3.一种ApoE纳米抗体，其特征在于，其针对ApoE表位的纳米抗体，包括一条如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的VHH链。

4.一种DNA分子，其特征在于，其编码选自下组的蛋白质：权利要求1或2所述的ApoE纳米抗体的VHH链，或权利要求3所述的ApoE纳米抗体。

5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

6.一种宿主细胞，其特征在于，其可以表达权利要求3所述的ApoE纳米抗体。

7.权利要求3所述的ApoE纳米抗体在检测ApoE分子方面的应用。