CN104610451A

CN104610451A - 一种针对黄曲霉毒素b1纳米抗体及其编码序列和应用

Info

Publication number: CN104610451A
Application number: CN201510051598.1A
Authority: CN
Inventors: 万亚坤; 龚雪
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2015-01-30
Publication date: 2015-05-13

Abstract

本发明公开了针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体，同时还公开了编码该纳米抗体的基因序列以及能够表达该纳米抗体的宿主细胞。通过本发明所公开的黄曲霉毒素B₁纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于黄曲霉毒素B₁分子检测试剂的研发。

Description

一种针对黄曲霉毒素B1纳米抗体及其编码序列和应用

技术领域

本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，尤其涉及一种针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体及其编码序列和应用。

背景技术

黄曲霉毒素是黄曲霉与寄生霉素产生毒株的代谢产物,它是化学结构相似的一类化合物,根据其结构的差异分别被称为黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁和G₂等,其中以黄曲霉毒素B₁最为常见,也是已知最强的化学致癌物之一。黄曲霉毒素B₁(Aflatoxin B₁，AFB₁)是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，对人和若干动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝脏的损害，人的原发性肝癌也很可能与黄曲霉毒素有关。早在1993年黄曲霉毒素B₁就被世界卫生组织(World Health Organization,WHO)的癌症研究机构认定为1类致癌物。黄曲霉毒素B1主要是污染花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品，且以南方高温高湿地区受污染最为严重。黄曲霉毒素耐热，280℃才可裂解，一般烹调加工温度下难以破坏，故国家质检总局规定黄曲霉毒素B1是大部分食品的必检项目之一。

来源于双峰驼的纳米抗体在基础研究、新药开发以及疾病的诊断和治疗以及食品科学领域具有广阔的应用前景，已经成为一个重要研究热点。利用抗体技术获得来源于双峰驼特异性针对黄曲霉毒素B₁的纳米抗体，从而应用于临床诊断和靶向治疗，具有广阔前景。

发明内容

本发明目的是提供一种针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体用于检测黄曲霉毒素B₁分子的用途。

本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面，提供了一种针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR包括下组的FR1～FR4的氨基酸序列：SEQ IDNO:1所示的FR1，SEQ ID NO:2所示的FR2，SEQ ID NO:3所示的FR3，SEQ ID NO:4所示的FR4；所述互补决定区CDR包括下组的CDR1～CDR3的氨基酸序列：SEQ IDNO:5所示的CDR1，SEQ ID NO:6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。

优选地，所述的针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体的VHH链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

本发明第二方面，提供了一种针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体，其包括一条如SEQ IDNO：8所示氨基酸序列的VHH链。

本发明第三方面，提供了一种DNA分子，其编码选自下组的蛋白质：本发明所述的针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体的VHH链，或本发明所述的针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体。

优选地，所述的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

本发明第四方面，提供了一种表达载体，其含SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。

本发明第五方面，提供了一种宿主细胞，其可以表达本发明所述的针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体。

本发明第六方面，提供了本发明所述的针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体用于检测黄曲霉毒素B₁分子的用途。

本发明的有益效果：

本发明使用黄曲霉毒素B₁免疫双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对黄曲霉毒素B₁的噬菌体展示纳米抗体文库。随后试验中将黄曲霉毒素B₁偶联在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体文库，从而获得了针对黄曲霉毒素B₁的特异性纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

本发明获得的纳米抗体具有相对分子质量小、稳定性强、产量高、能特异识别黄曲霉毒素B₁，较常规抗体用途更广。

附图说明

图1是经镍柱纯化后得到的黄曲霉毒素B₁纳米抗体的SDS-PAGE的电泳图，左道为蛋白标准分子，右道为经过镍柱纯化后的黄曲霉毒素B₁纳米抗体。

具体实施方式

本发明首先将黄曲霉毒素B₁免疫一只双峰驼，经过7次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并构建了黄曲霉毒素B₁特异的单域重链抗体文库。将黄曲霉毒素B₁抗原偶联在酶标板上，黄曲霉毒素B₁表面的抗原表位得以暴露出来，利用噬菌体展示技术从文库中筛选黄曲霉毒素B₁免疫性的纳米抗体基因，而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株，并对黄曲霉毒素B₁具有高度特异性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：针对黄曲霉毒素B₁的纳米抗体文库的构建

(1)用黄曲霉毒素B₁免疫双峰驼，每次将黄曲霉毒素B₁与弗氏佐剂按1：1体积混合，每周一次，共免疫7次，第一次使用完全的弗氏佐剂，剩余六次全部使用弗式不完全佐剂，在免疫过程中刺激B细胞表达特异针对黄曲霉毒素B₁的纳米抗体。(2)7次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100ml并提取总RNA。(3)将提取的RNA反转录成cDNA并利用巢式PCR扩增VHH链，该片段的大小约为500bp。(4)使用限制性的内切酶Pst I及Not I(购自NEB)酶切20μg pComb3噬菌体展示载体(购自Biovector)及10μg VHH并连接两个片段。(5)将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1(购自北京神州红叶科技有限公司)中，构建黄曲霉毒素B₁的纳米抗体文库并测定库容，库容的大小为3×10⁸CFU/mL。(6)文库构建完成后，为检测文库的插入率，随机的选取24颗克隆做菌落PCR。结果显示：文库插入率已达到100％。

利用巢式PCR扩增VHH链的具体条件如下：

第一次PCR体系：

引物序列：

正向引物CALL001如SEQ ID NO：10所示：

5′-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3′

反向引物CALL002如SEQ ID NO：11所示：

5′-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3′

第一次PCR程序：

第二步PCR体系：

引物序列：

正向引物1BACK-1如SEQ ID NO：12所示：

5’-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGG-3′

正向引物2BACK-2如SEQ ID NO：13所示：

5’-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGG-3′

反向引物PMCF如SEQ ID NO：14所示：

5’-CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT-3′

第二步PCR程序：

实施例2：针对黄曲霉毒素B₁的纳米抗体筛选过程

(1)将溶解在100mM pH 8.2NaHCO₃中的200μg黄曲霉毒素B₁偶联在NUNC酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照包被NaHCO₃。(2)第二天两个孔中分别加入100μg 1wt％脱脂牛奶，室温封闭2h。(3)2h后，加入100μLOD为35的噬菌体，在室温下作用1h。(4)用PBST(PBS中含有0.05wt％Tween 20)洗5遍，以洗掉不能抗原结合的噬菌体。(5)用100mM三乙醇胺将与黄曲霉毒素B₁特异性结合的噬菌体洗脱下，并侵染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3-4轮。在不断地筛选的过程中，阳性的克隆将不断地被富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中黄曲霉毒素B₁特异抗体的目的。

实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆

(1)从上述3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100μg/ml的氨苄青霉素的TB培养基(1L TB培养基中含有2.3g磷酸二氢钾，12.52g磷酸氢二钾，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油)中，生长至对数期后，加终浓度1mM的IPTG，28℃培养过夜。(2)利用渗透压法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1h。(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tag antibody(抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司)，在室温下放置1h。(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入anti-mouse alkalinephosphatase conjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司)，在室温下放置1h。(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，使用酶标仪在405nm波长，读取吸收值。(6)当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。(7)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中以便提取质粒并进行测序。

根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终得到氨基酸序列SEQ ID NO：8所示的纳米抗体。

实施例4：纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化

(1)将前面测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌WK6中，并将其涂布在含有氨苄青霉素和葡萄糖的LB培养平板上，37℃培养过夜；(2)挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；(3)接种1mL的过夜菌种至330mL TB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6～1.0时，加入终浓度为1mmol IPTG，28℃摇床培养过夜；(4)离心，收菌；(5)利用渗透法，获得抗体粗提液；(6)经镍柱离子亲和层析可制备纯度达90％以上的蛋白，结果见图1。

实施例5针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体检测特异性分析

将黄曲霉毒素B₁、前白蛋白PA、禽流感病毒H7N2用100mM NaHCO₃(pH 8.2)透析后包被(5μg/mL，100μL)在酶标板上，同时直接加入100μL 100mM NaHCO₃(pH8.2)作为空白对照，各包被三个孔，将黄曲霉毒素B₁纳米抗体加入到各孔中，在室温下放置1h。(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tag antibody(鼠源抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司)，在室温下放置1h。(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入二抗goat anti-mouse alkaline phosphatase conjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司)，在室温下放置1h。(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值，并计算平均值。结果显示，黄曲霉毒素B₁纳米抗体能特异性的识别黄曲霉毒素B₁。结果如下：

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，所述框架区FR包括下组的FR1～FR4的氨基酸序列：SEQ ID NO:1所示的FR1，SEQ ID NO:2所示的FR2，SEQ ID NO:3所示的FR3，SEQ ID NO:4所示的FR4；所述互补决定区CDR包括下组的CDR1～CDR3的氨基酸序列：SEQ ID NO:5所示的CDR1，SEQ ID NO:6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。

2.根据权利要求1所述的针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体的VHH链，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

3.一种针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体，其特征在于，其包括一条如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的VHH链。

4.一种DNA分子，其特征在于，其编码选自下组的蛋白质：权利要求1或2所述的针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体的VHH链，或权利要求3所述的针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体。

5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

6.一种表达载体，其特征在于，其含SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。

7.一种宿主细胞，其特征在于，其可以表达权利要求3所述的针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体。

8.权利要求3所述的针对黄曲霉毒素B₁纳米抗体用于检测黄曲霉毒素B₁分子的用途。