CN103342750B - 一种载脂蛋白b纳米抗体、其编码序列及应用 - Google Patents
一种载脂蛋白b纳米抗体、其编码序列及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种载脂蛋白B的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，公开了框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列和互补决定区CDR氨基酸序列，本发明还公开了一种载脂蛋白B纳米抗体，还公开了一种DNA分子，它编码本发明所述的载脂蛋白B的纳米抗体的VHH链或本发明所述的载脂蛋白B纳米抗体，还公开了一种宿主细胞，它可以表达载脂蛋白B的纳米抗体。还公开了该载脂蛋白B纳米抗体用于检测载脂蛋白B的用途。通过本发明所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于载脂蛋白B检测试剂的研发。
Description
技术领域
本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及一种针对于载脂蛋白B的纳米抗体。
背景技术
载脂蛋白（apolipoprotein，apo）是血浆脂蛋白中的蛋白质，其基本功能是运载脂类。载脂蛋白B（apoB）存在于低密度脂蛋白的表面，细胞识别和摄取LDL主要通过识别载脂蛋白B实现。apoB由于氨基酸组成的差异，可分为以下亚类：apoB48和apoB100。apoB48是乳糜微粒（CM）的载脂蛋白之一；apoB100是极低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）的载脂蛋白之一。载脂蛋白B增多时，即使LDL水平正常，也可使冠心病发病率增高。apoB是LDL（低密度脂蛋白）的主要蛋白质，因此，血清中apoB主要代表LDL水平，与LDL－C成显著正相关。在流行病学与临床研究中已确认，高apoB是冠心病的危险因素。在冠心病高血症的药物干预实验中，表明降低apoB可以减少冠心病及促进粥样斑块的消退。
目前市场上用于检测载脂蛋白B的试剂盒(免疫比浊法)的工作原理主要通过一种针对于载脂蛋白B的抗体来实现的，但是这种传统意义上的抗体稳定性差、灵敏度低、生产成本高，所有因素均限制了对于载脂蛋白B的检测。1993年比利时科学家首次在Nature报道：在骆驼血液中的抗体，有一半没有轻链，而且更让人惊喜的是，这些缺失轻链的“重链抗体”能像正常抗体一样与抗原等靶标紧密结合，这种抗体只包含一个重链可变区和两个常规的CH2与CH3区，更重要的是单独克隆并表达出来的VHH区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，分子量只是普通抗体的1/10，所以VHH也称Nanobody（纳米抗体）；与此同时纳米抗体化学性质也更加灵活，稳定性好，可溶性高，表达容易且容易获得，容易偶联其他分子，因此应用纳米抗体技术研发载脂蛋白B检测试剂具有广阔的前景。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种针对载脂蛋白B表位的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。
技术方案：为实现上述目的，本发明的第一方面，提供了一种载脂蛋白B的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列中任意一种：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4；或SEQ ID NO：5所示的FR1，SEQ ID NO：6所示的FR2，SEQ ID NO：7所示的FR3，SEQ ID NO：8所示的FR4；
所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列中任意一种：
SEQ ID NO：9所示的CDR1，SEQ ID NO：10所示的CDR2，SEQ ID NO：11所示的CDR3；或SEQ ID NO：12所示的CDR1，SEQ ID NO：13所示的CDR2，SEQID NO：14所示的CDR3；
优选地，所述的载脂蛋白B的纳米抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。
本发明第二方面，一种载脂蛋白B纳米抗体，它针对载脂蛋白B表位的纳米抗体，包括两条具有SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的VHH链。
本发明第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述的载脂蛋白B的纳米抗体的VHH链，或本发明所述的载脂蛋白B纳米抗体。
优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18
本发明的第四方面，提供了一种表达载体，它含SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18
所示的核苷酸序列。
本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的表达载体。
本发明的第六方面，提供了本发明所述的载脂蛋白B纳米抗体用于检测载脂蛋白B的用途。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明将血液中提取的载脂蛋白B免疫新疆双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对于载脂蛋白B的纳米抗体基因库，试验中将载脂蛋白B偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），从而获得了针对载脂蛋白B特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
附图说明
图1是载脂蛋白B抗原SDS-聚丙烯凝胶电泳图；其中泳道1是蛋白分子标准，泳道2是载脂蛋白B;
图2是纳米抗体的基因电泳图；其中泳道1是DNA分子标准，泳道2是PCR扩增重链抗体可变区片段
图3是对于所构建的载脂蛋白B特异性的单域抗体文库进行的菌落PCR电泳图；其中泳道1是DNA分子标准，泳道2-25是在所构建的载脂蛋白B纳米抗体文库中随机的挑取克隆，通过菌落PCR检测文库的插入率，计算结果表明文库插入率至100%。
图4是用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆的模式图；其中1是将载脂蛋白偶联在酶标板上，2是纳米抗体，3是鼠抗HA抗体，4是山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的抗体，5是碱性磷酸酶显色液；
图5是表达的载脂蛋白B纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中泳道1是蛋白分子标准，泳道2是破菌后蛋白总的粗提液样品，泳道3是总的蛋白粗提液过镍柱后的样品，泳道4是含50毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品，泳道5是含100毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品，6-7是250毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品，8-10是500毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品
图6为载脂蛋白B纳米抗体检测特异性分析的模式图
具体实施方式
本发明首先将人血液中提取的载脂蛋白B免疫一只新疆双峰驼，经过4次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并构建了载脂蛋白B特异的单域重链抗体文库。将载脂蛋白B偶联在NUNC酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，使得载脂蛋白B的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选载脂蛋白B免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：针对于载脂蛋白B的纳米抗体文库的构建：
（1）由人血液中提取的载脂蛋白B（购自南京汇标生物科技有限公司）利用SDS-PAGE电泳胶检测该蛋白的纯度,图1从左到右各蛋白带分别是：第一为蛋白分子标准，第二为样品载脂蛋白B；图1显示载脂蛋白B的纯度达到了99%以上，同时用于免疫的载脂蛋白B的浓度为500微克每毫升，每次免疫将20mg载脂蛋白B与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼(句容圣龙家畜养殖厂)，每周一次，共免疫4次，除第一次使用完全的弗氏佐剂，剩余几次全部使用弗式不全佐剂，免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。（2）4次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100ml并提取总RNA参照QIAGEN公司提供的RNA提取试剂盒（3）按照Super-Script III FIRST STRANDSUPERMIX试剂盒说明书,将提取的RNA反转录成cDNA。用巢式PCR扩增重链抗体的可变区片段：第一轮PCR：
上游引物GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC
下游:GGTACGTGCTGTTGA
ACTGTTCC
扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段,54℃退火,25个循环;
第二轮PCR：
以第一轮PCR产物作模板，
上游引物：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
下游引物：GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段(长片段和短片段),60退火,17个循环,回收目的片段，结果如图2显示，该片段的大小约为500bp，即从左到右的DNA条带分别是：第一为100bp的分子Marker，第二纳米抗体基因电泳带约为500bp。（4）使用限制性的内切酶（购自NEB）PstI及NotI酶切20μg pComb3噬菌体展示载体（Biovector供应）及10μg VHH并用T4DNA连接酶（购自TaKaRa公司）连接两个片段，（5）将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1（北京神州红叶科技有限公司）中，构建载脂蛋白B的纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小为1.33×108；与此同时，通过菌落PCR检测引物使用第二轮PCR引物，Tm55℃。所建文库的插入率检测结果插入率约100%，图3显示菌落PCR结果。文库构建完成后，为检测文库的插入率，我们随机的选取24颗克隆做菌落PCR。结果显示：即我们的插入率已达到100%。
针对载脂蛋白B的纳米抗体筛选过程：
（1）将溶解在100毫摩尔pH8.2NaHCO3中的200微克载脂蛋白B偶联在NUNC酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照。（2）第二天两个孔中分别加入100微升.1%牛奶，室温封闭2小时。（3）2小时后，加入100μl噬菌体（8×1011tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库），在室温下作用1小时。(4）用PBST（PBS中含有0.05%吐温20）洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体。(5）用三乙基胺（100mM）将与载脂蛋白B特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3-4轮。在不断地筛选的过程中，阳性的克隆将不断的被富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中载脂蛋白B特异抗体的目的。该实验的原理模式图如图4所示，具体检测如下：
用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆：
（1）从3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100微克每毫升的氨苄青霉素的TB培养基(1升TB培养基中含有2.3克磷酸二氢钾，12.52克磷酸氢二钾，12克蛋白胨，24克酵母提取物，4毫升甘油)中，生长至对数期后，加终浓度1毫摩尔的IPTG，28℃培养过夜。（2）利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。（3）用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tag antibody（抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置1小时。（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入二抗anti-mouse alkaline phosphataseconjugate（山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置1小时。（5）用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。（6）当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。（7）将阳性克隆孔的菌转摇在含有100微克每毫升的LB液体中以便提取质粒并进行测序。
根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终共有2株不同的抗体。其抗体的VHH链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：15,SEQID NO：16所示。
纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化：
（1）将前面测序分析所获得两种纳米抗体亚克隆至表达性的载体PET32b中，并将测序鉴定正确的重组质粒转化到表达型宿主菌DE3中，其涂布在含有100微克每毫升氨苄青霉素的LB固体培养基的板上，37℃过夜，（2）挑选单个菌落接种在15毫升含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜，（3）接种1ml的过夜菌种至330mlLB培养基中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6-1时，加入IPTG，28℃摇床培养过夜，（4）第二天，离心收菌，（5）将菌体破碎以获得抗体粗提液，（6）经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液（50毫摩尔，100毫摩尔）用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液（250毫摩尔，500毫摩尔）最终可制备纯度达90%以上的蛋白。图5所示从左到右的条带分别是：第一为标准蛋白分子，第二为破菌后蛋白总的粗提液样品，第三为总的蛋白粗提液过镍柱后的样品，第四为含有50毫摩咪唑的洗脱液洗脱的样品，第五为含有100毫摩咪唑的洗脱液洗脱的样品，第六，七为含有250毫摩咪唑的洗脱液洗脱样品，第八、九、十为含有500毫摩咪唑的洗脱液洗脱样品；结果显示，纳米抗体经过该纯化后，其纯度可达到95%以上。
（2）载脂蛋白B纳米抗体检测特异性分析
将载脂蛋白B，前白蛋白碳酸盐透析后包被在酶标板上，同时做空白孔对照，各包被两个孔，将载脂蛋白纳米抗体及对照抗体前白蛋白纳米抗体分别转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。（3）用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tag antibody（抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置1小时。（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入二抗anti-mouse alkaline phosphatase conjugate（山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置1小时。（5）用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。结果显示载脂蛋白B纳米抗体能特异性的识别载脂蛋白。模式图见图6，结果如下：
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 东南大学
<120> 一种载脂蛋白B纳米抗体、其编码序列及应用
<130>
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
20 25
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Asp Trp Val Ala Ala
1 5 10 15
<210> 3
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Lys
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Arg
<210> 7
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
His Tyr Ala Asp Phe Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
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<211> 11
<212> PRT
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<212> PRT
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<211> 8
<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Gly Phe Thr Ser Arg Met Thr Phe Ser Asp Ser Ala
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Ile Asp Pro Gly Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Ser Leu Arg Asn Thr Asp Leu Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Ser Asp Arg Ala Val
20 25 30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Asp Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Gly Gly Cys Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Lys Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Ser Gln Val Gln Ile Thr Leu Ser Gln Asn Leu Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Arg Met Thr
20 25 30
Phe Ser Asp Ser Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Gly Gly Gly Ser Thr His Tyr
50 55 60
Ala Asp Phe Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
65 70 75 80
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Met Tyr Tyr Cys Ser Leu Arg Asn Thr Asp Leu Thr Arg Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Cys
20 25 30
Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly
35 40 45
Thr Cys Thr Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr
50 55 60
Gly Thr Gly Thr Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Ala
65 70 75 80
Cys Ala Gly Cys Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Cys Cys Gly Thr Cys
85 90 95
Ala Ala Cys Ala Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Thr Thr Cys Cys
100 105 110
Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala
115 120 125
Ala Gly Ala Cys Cys Gly Cys Gly Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys
130 135 140
Gly Cys Ala Gly Cys Thr Ala Thr Thr Thr Cys Gly Cys Gly Thr Gly
145 150 155 160
Gly Thr Gly Gly Thr Thr Gly Thr Cys Thr Cys Ala Cys Ala Thr Ala
165 170 175
Cys Thr Ala Thr Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly
180 185 190
Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala
195 200 205
Thr Cys Thr Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Gly Gly Thr Gly Thr Ala Thr
225 230 235 240
Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Cys
245 250 255
Thr Gly Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys
260 265 270
Thr Gly Cys Cys Ala Thr Ala Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr
275 280 285
Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys
290 295 300
Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Ala Ala Thr Cys Ala Cys Ala Cys Thr
305 310 315 320
Gly Thr Cys Ala Cys Ala Gly Ala Ala Thr Thr Thr Gly Gly Thr Ala
325 330 335
Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys
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Cys Ala Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr
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Cys Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly
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Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr
20 25 30
Gly Gly Thr Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Thr Cys Thr Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr
50 55 60
Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr
65 70 75 80
Cys Ala Cys Cys Thr Cys Thr Cys Gly Ala Ala Thr Gly Ala Cys Cys
85 90 95
Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Cys Cys Ala
100 105 110
Thr Gly Ala Gly Thr Thr Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala
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Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Gly Gly Gly Ala
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Cys Thr Cys Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Thr Cys Ala Cys
145 150 155 160
Gly Thr Ala Thr Thr Gly Ala Thr Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly
165 170 175
Cys Gly Gly Thr Ala Gly Cys Ala Cys Thr Cys Ala Cys Thr Ala Thr
180 185 190
Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Thr Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly
195 200 205
Gly Cys Cys Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys
210 215 220
Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly
225 230 235 240
Ala Ala Cys Ala Cys Gly Cys Thr Gly Thr Ala Thr Cys Thr Gly Cys
245 250 255
Ala Ala Thr Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Ala
260 265 270
Ala Ala Cys Ala Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Gly Gly Cys Gly
275 280 285
Ala Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Thr Cys Ala Thr
290 295 300
Thr Ala Cys Gly Thr Ala Ala Thr Ala Cys Gly Gly Ala Thr Cys Thr
305 310 315 320
Thr Ala Cys Thr Ala Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Gly
325 330 335
Ala Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr
340 345 350
Cys Cys Thr Cys Ala 355
Claims (3)
1.一种载脂蛋白B的纳米抗体，其特征在于，所述的载脂蛋白B的纳米抗体的VHH链为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。
2.一种宿主细胞，其特征在于，其表达权利要求1所述的载脂蛋白B的纳米抗体。
3.根据权利要求1所述的载脂蛋白B纳米抗体在检测载脂蛋白B应用。
Priority Applications (1)
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