CN104098694A - 抗人β2微球蛋白的单域抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的抗人β2微球蛋白的单域抗体及其制备方法和用途。本发明利用噬菌体展示技术对羊驼噬菌体抗体库进行多轮筛选富集具有β2微球蛋白特异性的噬菌体，通过对噬菌体培养制备抗体，并且鉴定获得阳性克隆，通过测序获得其相应的编码序列，然后在大肠杆菌中表达获得可溶性的抗体片段。本发明的抗体具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。本发明提供的抗体对β2微球蛋白具有很高的结合能力，可应用于血液净化及β2微球蛋白检测领域，有助于促进和改善对透析相关淀粉样变等疾病的诊断和治疗。

Description

抗人β2微球蛋白的单域抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及抗β2微球蛋白的抗体，特别涉及新的抗β2微球蛋白的特异性单域抗体，及其可变区的氨基酸序列和DNA编码序列，还涉及所述单域抗体的制备方法和用途。

背景技术

β2微球蛋白是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，分子质量为11.8kDa，它是细胞表面人类淋巴细胞抗原(HLA)的β链(轻链)部分(为一条单链多肽)，广泛存在于血浆、尿液、脑脊液、唾液以及初乳中，含量很低。在健康人体内β2微球蛋白以相对稳定的速率合成，健康人群其血清浓度相对稳定，一般为1.5-3mg/l(Tilman B，et.al，Massy beta2-microglobulin progressin uremic toxin research，Seminars in dialysis200922,4,378–380)。在健康人体内β2微球蛋白合成的速率大约为2.4mg/kg/d。β2微球蛋白可以从肾小球自由滤过，99.9％在近端肾小管吸收，并在肾小管上皮细胞中分解破坏。某些疾病能使β2微球蛋白的合成增加。在晚期肾病病人的血清中其含量可以达到20-50mg/l，有时甚至会高达100mg/l。

β2微球蛋白在体内的浓度增高会导致透析相关性淀粉样变。1986年，Gejyo等发现腕管综合征患者体内局部有β2微球蛋白的沉淀，被称为β2微球蛋白相关的淀粉样变[Gejyo F et.al:Serum levels ofβ2-microglobulin as a new form ofamyloid protein in patients undergoing long-term hemodialysis.The New EnglandJournal of Medicine1986314:585-586]。其发病原因是由于血中β2微球蛋白的水平升高，部分β2微球蛋白的裂解产物提高了剩余β2微球蛋白的疏水性，导致剩余β2微球蛋白分子聚集，在各种组织中沉淀下来，进而引发一系列并发症。血液中β2微球蛋白浓度的检测及血液净化去除β2微球蛋白浓度对于预防透析相关淀粉样变等疾病的发生具有重要意义，β2微球蛋白特异性抗体由于其自身的特性在上述两方面领域具有良好的应用前景。

目前，检测β2微球蛋白的方法中使用的抗β2微球蛋白特异性抗体均为IgG。基于抗β2微球蛋白IgG的检测方法有免疫扩散法、免疫电泳法、放射免疫分析法、酶联免疫法、免疫荧光法[万瑛，熊锐华，β2微球蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用，公开号CN1O1481419A]、胶乳增强免疫透射比浊法[许国和，β2微球蛋白测定试剂盒，授权公告号CN202631545U]。IgG用于β2微球蛋白检测领域存在着如下缺陷:(1)较大分子量限制了抗体在基质表面的固载密度，也增加了抗体定向固载的难度，这限制了上述检测方法灵敏度的提高。(2)单克隆IgG难以大量制备，生产成本高，而多克隆IgG的结合能力不稳定。(3)IgG的Fc段容易与非靶细胞的Fc受体结合，影响检测结果。

尿毒症患者由于肾功能衰竭而导致体内β2微球蛋白浓度升高，进而导致透析相关淀粉样变等相关疾病。降低血液中β2微球蛋白浓度可以预防透析相关淀粉样变等疾病的发生。血液净化去除β2微球蛋白的方法有透析和全血灌流。使用普通血液透析的方法对的去除效果并不是十分理想，因为血液透析主要是通过扩散方式清除溶质，低通量透析膜的孔径限制了对β2微球蛋白等中分子物质的去除，而且有研究表明经过透析后，尿毒症患者体内的β2微球蛋白水平甚至会升高[Ameer G，A modalities for the removal of beta-2-microglobulin fromblood，Semin Dial2001.14:103-6.]。血液灌流是将患者的血液引出体外并经过装有吸附剂血液灌流器，达到清除血液中β2微球蛋白的目的。目前，已经商品化的β2微球蛋白吸附剂均使用疏水性配基[Furuyoshi S，et.al，New adsorptioncolumn(lixelle)to eliminate beta-2-microglobulin for direct hemoperfusion，TherApher.2:13-7.]。疏水性吸附剂利用能够β2微球蛋白具有较强结合能力的疏水性配基有效清除β2微球蛋白，同时结合体积排阻的方法减少血液中有益成分的损失。但这类吸附剂无法避免血液中其他疏水性中小分子的损失，对患者具有一定程度的副作用。与疏水性吸附剂相比，使用β2微球蛋白特异性抗体的亲和配基吸附剂具有亲和性强、非特异吸附低的优点。虽然现有的抗体配基吸附剂还处于研究阶段，尚没有商品化的产品，但是这类吸附剂已经展示出在血液灌流领域的良好应用前景。目前，血液灌流中使用的亲和配基有IgG[Mogi M，et.al，Selective removal of beta-2-microglobulin from human plasma by high-performanceimmunoaffinity chromatography，J Chromatogr B Biomed Sci Appl.1989496:194-200.]和单链可变区抗体(scFv)两种[Guillermo A.Ameer G，A novelimmunoadsorption device for removing b2-microglobulin from whole blood，KidneyInternational，Vol.59，2001，1544-1550]。单链可变区抗体是利用噬菌体表面展示技术制备的小分子抗体片段，它没有完整抗体的Fc段，只包含VH和VL片段以及中间的连接肽。scFv与IgG相比，具有分子小、免疫原性低、穿透力强，单位体积固载密度高、易于表达和生产、易于实现定向固载等优点。如果能够使用更小分子量的亲和配基，则可以进一步提高亲和性配基吸附剂对β2微球蛋白的吸附性能。

近年来，在对骆驼科动物的研究中发现，双峰驼、单峰驼、羊驼和美洲驼中存在一种天然缺少轻链，仅由重链组成、但具有完整功能的抗体，称为重链抗体(heavy chain antibody，hcAb)，其可变区仍具有很好的抗原识别和结合能力，与抗原结合的亲和力和常规抗体相当。重链抗体的可变区(variable domains ofthe hcAb，简称为VHH)，分子量为15kDa，仅为常规抗体的1/10，是目前可以得到的具有完整抗体功能的最小分子片段，称为单域抗体(single domainantibody，sdAb)。更为独特的是，骆驼单域抗体的抗原结合区仅由VHH的三个超变区(H1-H3)组成，在空间上形成了与常规抗体典型结构不同的抗原结合域。其中H3的平均长度比常规抗体长，在空间上呈突出的指状结构。因此，单域抗体可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位。另外，由于在框架区FR2中有四个位点被亲水性氨基酸替换，重组的VHH在大肠杆菌中可以获得高表达。

获得单域抗体基因序列的方法是通过噬菌体抗体库进行筛选。噬菌体抗体库是用基因克隆技术将羊驼全套sdAb可变区基因克隆出来，组装到表达载体内并表达到噬菌体表面形成噬菌体抗体的群体。噬菌体抗体库的筛选包括两个主要步骤：淘选和鉴定。淘选是将噬菌体抗体库与选择用的抗原共同孵育，通过几轮洗脱，收集结合的噬菌体。将获得的噬菌体感染细菌并扩增，再进行下一轮的淘选。经几轮淘选后，便可富集到与抗原特异性结合的噬菌体感染的多克隆菌株。鉴定过程是从噬菌体感染的多克隆菌株中挑选出单克隆菌株，即将淘筛出的噬菌体感染细菌、铺板、挑选，即可得到高特异性单克隆菌株。通过基因测序，分析比对后即可获得相关抗体的基因序列及其蛋白质编码。选择适当的载体进行表达后即可获得具有活性的sdAb。

单域抗体与IgG及scFv抗体相比，具有分子小、免疫原性低、穿透力强等优点，使得该抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、药物开发等领域有广阔的应用前景。抗β2微球蛋白单域抗体可以通过基因重组技术制备，降低生产成本。与传统抗体相比更小的分子质量有利于实现单域抗体在基质表面的高密度定向固载，这不仅有利于提高检测β2微球蛋白的灵敏度，也提高了固载单域抗体的血液净化吸附剂的吸附性能。抗β2微球蛋白单域抗体将进一步扩展抗体在β2微球蛋白的检测及血液净化治疗方面的应用。

发明内容

鉴于目前抗β2微球蛋白抗体的研究现状，通过噬菌体库的筛选，发现新的抗β2微球蛋白抗体有助于促进和改善对透析相关淀粉样变等疾病的诊断和治疗。

本发明的第一方面，提供了一种抗β2微球蛋白的单域抗体，所述的单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.10、与所述SEQ ID NO.1所示的序列同源性在95％以上的氨基酸序列或与所述SEQ ID NO.10所示的序列同源性在95％以上的氨基酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种编码以上所述的单域抗体的核苷酸序列。

进一步，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.11。其中编码SEQID NO.1所示的单域抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码SEQ ID NO.10所示的单域抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

进一步，所述的核苷酸序列SEQ ID NO.2包括4个框架区(FR)序列和3个互补决定区(CDR)序列，其中所述4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，所述3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的序列分别为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9；所述的核苷酸序列SEQ ID NO.11包括4个框架区序列和3个互补决定区序列，其中所述框架区序列分别为SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.615，所述互补决定区序列分别为SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18。

SEQ ID NO.2中所述框架区和互补决定区在核苷酸序列中的位置如图1所示。

SEQ ID NO.11中所述框架区和互补决定区在核苷酸序列中的位置如图2所示。

本发明的第三方面，提供了一种含有以上所述的核苷酸序列的重组表达载体。

进一步，所述载体选自原核或真核表达载体，优选选自pET23a。

本发明的第四方面，提供了一种含有以上所述的核苷酸序列的宿主细胞。

进一步，所述宿主细胞含有以上所述的重组表达载体。

进一步，以上所述的宿主细胞能够表达所述的抗β2微球蛋白的单域抗体。

进一步，所述宿主细胞优选的是大肠杆菌(Escherichia coli)。

本发明的第五方面，提供了本发明所述的抗β2微球蛋白的单域抗体在制备检测或去除β2微球蛋白试剂中的应用。

进一步的，本发明还提供以上所述的氨基酸序列或核苷酸序列在制备检测或去除β2微球蛋白试剂中的应用。

本发明的有益效果：本发明的通过噬菌体库的筛选，发现新的抗β2微球蛋白抗体，生物学实验结果表明，该抗体对β2微球蛋白具有很高的特异性结合能力，可应用于血液净化及β2微球蛋白检测领域，有助于促进和改善对透析相关淀粉样变等疾病的诊断和治疗。

附图说明

图1为单域抗体A核苷酸序列(SEQ ID NO.2)示意图。

图2为单域抗体B核苷酸序列(SEQ ID NO.11)示意图。

图3为单域抗体A融合蛋白表达情况的SDS-PAGE电泳检测结果，其中泳道M为标记物，泳道1为未IPTG诱导的单域抗体A全菌，泳道2为IPTG诱导后的单域抗体A全菌，泳道3为单域抗体A全菌经裂解得到的上清液，泳道4为单域抗体A全菌经裂解得到的沉淀。

图4为单域抗体B融合蛋白表达情况的SDS-PAGE电泳检测结果，其中泳道M为标记物，泳道1为未IPTG诱导的单域抗体B全菌，泳道2为IPTG诱导后的单域抗体B全菌，泳道3为单域抗体B全菌经裂解得到的上清，泳道4为单域抗体B全菌经裂解得到的沉淀。

图5为单域抗体A纯化情况的SDS-PAGE电泳检测结果，其中泳道M为标记物，泳道1为未纯化的单域抗体A，泳道2为纯化后的单域抗体A。

图6为单域抗体B纯化情况的SDS-PAGE电泳检测结果，其中泳道M为标记物，泳道1为未纯化的单域抗体B，泳道2为纯化后的单域抗体B。

图7为固载单域抗体A的吸附剂对β2微球蛋白吸附能力的检测结果，其中A为固载后单域抗体A对β2微球蛋白的吸附等温线；B为Scatchard法作图线性回归结果。

图8为固载单域抗体B的吸附剂对β2微球蛋白吸附能力的检测结果，其中A为固载后单域抗体B对β2微球蛋白的吸附等温线；B为Scatchard法作图线性回归结果。

图9为单域抗体A对β2微球蛋白的特异性结合能力的ELISA检测结果。

图10为单域抗体B对β2微球蛋白的特异性结合能力的ELISA检测结果。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本领域技术人员可以明白，根据本申请公开的内容结合本领域技术常识，本申请公开的DNA序列和氨基酸序列可以按照本领域常用的其他方法合成，例如通过化学合成的方法得到本申请公开的序列。而且，本领域技术人员可以将本申请获得的新的DNA序列构建到任何合适的载体、宿主细胞中。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明做出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。

下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

实施例1 单克隆噬菌体抗体的筛选

利用噬菌体展示技术对羊驼噬菌体抗体库进行多轮富集筛选，以纯化的β₂微球蛋白为抗原进行了四轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选，显示每轮筛选回收率呈递增趋势，说明经过筛选后，具有β₂微球蛋白特异性的噬菌体得到了高度富集。

具体方法如下：

1.羊驼噬菌体抗体库的建立

所用引物名称以及其序列如表1，划线部分为酶切位点。

表1.引物名称以及其序列

(1)淋巴细胞的分离及总RNA的分离

采取3岁雌性的羊驼100ml外周血，装入抗凝管后，加入等体积的淋巴细胞分离液(上海生工淋巴细胞分离液，主要成分是Ficoll400与泛影酸葡甲胺)进行淋巴细胞的分离。在1850rpm≈680g水平离心机离心15分钟，吸取细胞，用D-Hank’s液洗涤数次，得淋巴细胞，使用invitrogen公司的Plus RNAPurification System试剂盒提取总RNA。

(2)RT-PCR

a)cDNA模板的合成：以CH2-CR为反转录引物，将步骤(1)得到的总RNA转录为cDNA，RNA转录按照NEB公司的ProtoScript M-MμlV第一链cDNA试剂盒步骤进行。

b)cDNA的PCR扩增

以步骤a)得到的cDNA为模板，以CH2-CR和VHH-LD分别作为上游和下游引物，按照NEB公司的Q5^TM热启动超保真2X Master Mix试剂盒所述的步骤进行PCR基因扩增反应。

待反应结束后，取5μL PCR产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测目的基因，电泳结果显示，扩增基因片段在700bp附近呈现特异性亮带。使用OMEGA公司的Gel Extraction Kit对目的基因条带进行回收，得模板DNA。

c)以步骤b)得到的模板DNA为模板，以FR1-EcoRI为上游引物，LONG-HindIII，SHORT-HindIII为下游引物进行第二轮PCR扩增反应，其

反应体系为：

PCR循环参数为：98℃预变性30s；98℃10s，72℃30s，15～20个循环；72℃终延伸2min。

待反应结束后，取5μL PCR产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测目的基因。电泳结果显示，扩增基因片段在450bp附近呈现特异性亮带。使用OMEGA公司的Gel Extraction Kit对目的基因条带进行回收，得到第二轮PCR产物DNA。

(3)PCR产物的酶切

步骤c)得到的PCR产物，使用Thermo公司的Fastdigest Enzyme进行酶切，其反应体系如下：

无核酸酶H2O	体积μl
		10X FastDigest Green Buffer	2μl
PCR产物DNA	～0.2μg
		FastDigest enzyme EcoRI+HindIII	1μl+1μl
总体积	30μl

反应体系在37℃孵育20min后，用1％琼脂糖凝胶立即进行电泳，经纯化获得长度为400bp的酶切DNA目的基因片段，在-20℃保存，或将37℃孵育20min的反应体系在80℃孵育10min以灭活酶，在-20℃保存，待用。

(4)噬菌体载体克隆

将步骤(3)中酶切回收后DNA片段连接到T7载体臂中，将连接产物进行包装，得T7噬菌体，测定得滴度为10⁸pfu，保存。连接反应以及连接产物的包装均使用Merck公司的T7select cloning试剂盒，具体方法参见试剂盒说明书。

T7噬菌体滴度测定：取适量T7噬菌体在M9TB培养基中，37℃摇床培养至OD600为1.0左右，4℃储存菌液。融化的carb-LB固体培养基倒平板(20ml)备用，开始经前37℃预热。融化顶层琼脂糖(按5ml每板准备)，转移到45-50℃水浴中。用LB或TB培养基梯度稀释T7噬菌体。在一系列5ml无菌离心管中加入250μl宿主菌BLT5403(来自T7select cloning试剂盒)、100μl梯度稀释的T7噬菌体。加入3ml预热的顶层琼脂糖，立即在37℃预热的固体培养基上倾倒平板，并用玻璃刮刀推均匀。静置数分钟使培养基硬化，倒置37℃培养3～4小时或室温过夜。进行噬菌斑计数，计算噬菌体滴度，计算包装效率。

T7噬菌体噬菌斑的准备：BLT5615与噬菌体保存液/裂解液(1‰到0.1‰)混合后倒入carb-LB固体培养基上培养4h，37℃摇床培养至菌体裂解，溶菌后，立即加入NaCl至终浓度为0.5M，10,000rpm离心10min，取上清，回收噬菌体，在4℃保存。

(5)噬菌体抗体库的构建

a)宿主菌的活化：受体菌BLT5615，在carb-LB(羧苄青霉素含量为200μg/l的LB培养液)固体培养基上，倒置37℃过夜培养。挑取单菌落，接种到LB培养基中，37℃摇床培养到OD600为0.6～1，得到的过夜菌液以1:200比例接种于LB培养基中，在37℃摇床4.5～5小时(OD600约0.6～0.8)，得到BLT5615菌液；

b)在50ml TB培养基中加入1ml培养过夜的宿主BLT5403菌液，37℃摇床培养至OD600为0.6～1；

c)10ml步骤b)的菌液中加入T7噬菌体(1×10⁶T7噬菌体每10ml菌液)，混匀，在20min内倒平板；

d)1ml步骤c)的混合物中加入10ml融化的顶层琼脂糖培养基，在carb-LB固体平板上倒平板；

e)水平静置使顶层琼脂糖凝固，倒置37℃培养3～4小时(或室温过夜)使噬菌斑几乎融合，加入10ml的Phage Extraction Buffer，4℃水平静置2小时到过夜(顶层培养基溶解即可)；

f)收集步骤e中裂解液到洁净容器中，加入1/20裂解液体积的氯仿，3000g/5min离心，收集上清，即为羊驼噬菌体抗体库，测定得滴度为10⁸pfu，在4℃可以存放数月，长期存放需加入10％体积的80％无菌甘油，-80℃保存

(6)羊驼噬菌体抗体库的多样性评价

任意挑选100个步骤(5)的e的噬菌斑，加入100μl10mM EDTA，65℃处理10min，冷却到室温，14000g离心3min，取上清98℃处理5min，取少许上清作为模板DNA进行PCR检测抗体库多样性。

PCR扩增反应体系为：

试剂

使用量

终浓度

10×PCR Buffer	5μl	1x
			模板DNA	4μl
dNTP Mixture(各2.5mM)	4μl
			上游引物25μM	1μl	0.5μM
下游引物25μM	1μl	0.5μM
			无菌水	至50μl
TaKaRa Taq(5units/μl)	0.25μl

反应体系中所述TaKaRa Taq宝生物公司的聚合酶，所述上游引物和下游引物来自T7select cloning试剂盒。

PCR循环参数为：在94℃预变性30s；98℃10s，55℃30s，72℃60s，30个循环；72℃终延伸7min。

PCR产物取样电泳，回收450bp附近的产物，编号保存，送交大连宝生物公司测序。测序结果显示，从100个噬菌斑扩增产生的序列中得到50条不同的序列，说明构建的噬菌体库具有较好的多样性。

2.单克隆噬菌体抗体的筛选

(1)噬菌体抗体库的扩增:取100μl宿主BLT5403菌液，接种到100ml2×YT-AG(含100μg/ml羧苄青霉素，1％葡萄糖的ZXYT)培养基中，37℃振荡培养至对数期。加10¹²pfu(噬菌斑形成单位)噬菌体抗体于培养液，37℃水浴30min，4℃离心后弃上清。用100ml2×YT-AK(含100μg/ml羧苄青霉素，50mg/ml卡那霉素的ZXYT)重悬沉淀，37℃培养过夜。4℃离心，上清即为扩增后的噬菌体抗体库。

(2)抗体库的富集筛选:以纯化的β2微球蛋白(400ng/孔)包被酶标板8个孔，4℃放置过夜。次日用2％MPBS(含2％脱脂奶粉的PBS)37℃封闭2h，弃上清，用PBS溶液洗孔后，每孔加入100μl步骤(1)中扩增后的噬菌体抗体上清，37℃孵育2h。弃上清，用PBS溶液洗孔，除去未结合噬菌体(第一轮筛选时洗3次，第二轮洗5次，第三轮以后洗10次以上)。每孔加100μl100mmol甘氨酸-盐酸(pH＝2.2)洗脱特异性噬菌体，室温孵育10min后，立即加入1mol/LTris(pH＝7.4)中和洗脱下来的特异性噬菌体。将中和的特异性噬菌体洗脱液加入2ml新鲜制备的对数期大肠杆菌TG1菌液中，37℃水浴30min后，取少量菌液测噬菌体抗体滴度，滴度为10¹²pfu。其余全部涂TYE-AG平板，37℃培养过夜，次日从TYE板上刮下菌落，扩增所得到的菌落并将其用于制备下一轮筛选用噬菌体。共进行四轮筛选。

实施例2 对单克隆噬菌体抗体进行检测:

(1)从第四轮筛选后过夜培养的TY-AG平板上随机挑取80个单细菌克隆，BLT5615与噬菌体保存液/裂解液(1‰到0.1‰)混合后，37℃摇床培养至菌体裂解，溶菌后，立即加NaCl到其在溶液中的浓度为0.5M，10000rpm离心10min，取上清，回收噬菌体液。检测用ELISA法：抗原β₂微球蛋白包被酶标板(0.4μg/孔)，封闭后向每孔加100μl单克隆噬菌体液，37℃温育2h。洗涤后加入1:5000的HRP标记鼠抗M13抗体，37℃温育1h。阳性对照为一抗(鼠抗人β₂微球蛋白)，二抗(羊抗鼠IgG)；阴性对照仅加入2％MPBS。以邻苯二胺为底物，2M硫酸终止反应，经酶标仪OD490nm检测。OD值大于阴性对照的5倍，判断为阳性。单克隆噬菌体抗体与β₂微球蛋白抗原结合的检测结果：经ELISA检测，共得到2个阳性克隆(A、B)。2个阳性克隆ELISA结果的A值均高于阴性对照5倍以上。A，B两个阳性克隆均可特异性识别β₂微球蛋白纯化抗原，不与阴性对照无关抗原结合，且ELISA检测A值高于阴性对照5倍以上。

(2)PCR鉴定步骤(1)中筛选得到的阳性克隆菌液：按照实施例1步骤(6)中的PCR体系扩增第四轮筛选后获得的阳性克隆菌A和B的DNA。引物扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析。结果：2个阳性菌经质粒提取后经PCR扩增，凝胶电泳，可见2个克隆片段均为420bp左右，符合预期sdAb抗体片段PCR产物的理论值。

实施例3 对阳性克隆的DNA序列测定:

分别提取A和B阳性克隆的噬菌粒，利用sdAb DNA测序引物(上游引物和下游引物来自T7select cloning试剂盒)，经双脱氧末端终止法对SdAb DNA进行序列测定。

获得A和B克隆的核苷酸序列，并运用Blast软件对所获得的序列与GeneBank中的单域抗体可变区基因进行综合比对分析。分析结果表明:所获得的A和B克隆的可变区基因符合SdAb抗体基因，推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构，蛋白序列根据blast和Kabat编码确定出CDR的起始和终止部位。互补决定区(CDR)其氨基酸组成和排列顺序高度可变。3个CDR共同组成免疫球蛋白的抗原结合部位，负责识别及结合抗原，从而发挥免疫效应。其余部分为骨架区(FR)，其氨基酸组成和排列顺序相对不易变化。2个克隆的基因序列不同，表明2个克隆菌来源于不同的原始噬菌粒。

其中A克隆(命名为单域抗体A)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

单域抗体A的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)包括4个框架区(FR)序列和3个互补决定区(CDR)序列，其中所述4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，所述3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的序列分别为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9。所述框架区和互补决定区在核苷酸序列中的位置如图1所示。

B克隆(命名为单域抗体B)的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.10；

单域抗体B的核苷酸序列(SEQ ID NO.11)包括4个框架区(FR)序列和3个互补决定区(CDR)序列，其中所述4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的序列分别为SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15，所述3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的序列分别为SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18。所述框架区和互补决定区在核苷酸序列中的位置如图2所示。

实施例4 可溶性抗β₂微球蛋白sdAb片段的表达复性和鉴定:

1.单域抗体的表达：将如图1、2所示的单域抗体A、单域抗体B的基因序列分别插入表达载体pET23a，并转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞，用LB培养基，在温度37℃的条件下培养，待菌体OD₆₀₀达到1-1.5时，加入终浓度为1mmol的IPTG进行诱导，继续培养3-4小时后弃上清，收集单域抗体A全菌或单域抗体B全菌，用裂解缓冲液(10mmol/L Tris pH8.5，1mmol/L EDTA，5mL/L Triton-x-100，200mg/L溶菌酶)重悬，超声裂解细胞，在10000rpm离心5min，收集上清液以及沉淀。

以15％SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的表达情况,结果如图3和图4显示，其中图3为单域抗体A融合蛋白表达结果，其中泳道M为标记物，泳道1为未IPTG诱导的单域抗体A全菌，泳道2为IPTG诱导后的单域抗体A全菌，泳道3为单域抗体A全菌经裂解得到的上清液，泳道4为单域抗体A全菌经裂解得到的沉淀。图4为单域抗体B融合蛋白表达结果，其中泳道M为标记物，泳道1为未IPTG诱导的单域抗体B全菌，泳道2为IPTG诱导后的单域抗体B全菌，泳道3为单域抗体B全菌经裂解得到的上清，泳道4为单域抗体B全菌经裂解得到的沉淀。

图3和图4的结果显示，经诱导的重组表达菌与未诱导的重组菌相比，在约15kD处有一与蛋白sdAb理论分子量相符的蛋白条带，且表达菌经超声破碎后，只有裂解液沉淀有目的蛋白，上清中没有目的蛋白，说明表达的单域抗体以包涵体的形式存在。

2.包涵体蛋白的复性：上述1中由IPTG诱导的抗体A全菌或抗体B全菌，经裂解后得到的沉淀用5倍质量体积的6mol/L尿素溶解4h，在4℃、10000r/min下离心5min，上清移入透析袋中。依次使用10mmol/L Tris pH8.5，4mol/L尿素；10mmol/L Tris pH8.5，2mol/L尿素；10mmol/L Tris pH8.5以相对于样品溶液30倍的透析液体积各透析6h。回收透析袋中的液体，4℃下8000rpm离心5min，取上清，待用。

3.融合蛋白的纯化：采用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白：层析柱用上样缓冲液(15mmol PBS，20mmol咪唑，500mmolNaCl)清洗后，加入上述2中收集的上清液，先用清洗缓冲液(15mmol PBS，100mmol咪唑，500mmolNaCl)清洗去除杂蛋白，再用洗脱缓冲液(15mmol PBS，300mmol咪唑，500mmolNaCl)洗脱获得融合蛋白，收集洗脱液，用PBS在温度4℃条件下透析脱盐，再用聚乙二醇在温度4℃条件下浓缩，得纯化单域抗体A，或纯化单域抗体B，定浓度后，置温度4℃保存。

将纯化单域抗体A或纯化单域抗体B以15％SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的纯化情况，结果如图5或图6所示。

图5为单域抗体A融合蛋白的纯化结果，其中泳道M为标记物，泳道1为未纯化的单域抗体A(步骤2中的上清)，泳道2为纯化后的单域抗体A。

图6为单域抗体B融合蛋白的纯化结果，其中泳道M为标记物，泳道1为未纯化的单域抗体B(步骤2中的上清)，泳道2为纯化后的单域抗体B。

图5、6的结果显示，单域抗体A或B经镍柱亲和层析和透析纯化处理后，获得条带较为单一的sdAb，条带大小为15000Da,符合预期单域抗体分子大小。

实施例5 单域抗体吸附剂的制备以及吸附剂对β₂微球蛋白吸附能力的检测

(1)取琼脂糖凝胶Sepharose CL-4B5mL，置于锥形瓶中。然后加0.1gN,N'-羰基二咪唑，反应1h。反应结束后用丙酮抽滤清洗，取活化后的凝胶，依次用超纯水和硼酸缓冲液(0.15M，pH＝8.2)反复抽滤后，加入纯化后的特异性单域抗体A或单域抗体B溶液(抗体浓度为1mg/ml)5mL，反应2h，用超纯水抽滤清洗，得单域抗体A吸附剂或单域抗体B吸附剂。

(2)将纯化后的β₂微球蛋白溶液用稀释缓冲液(PBS缓冲液，pH＝7.4)分别稀释至8μg/mL、16μg/mL、24μg/mL、32μg/mL、40μg/mL、48μg/mL、64μg/mL、72μg/mL，取各稀释液2mL及不同配基密度的单域抗体(单域抗体A0.6mg/ml，单域抗体B0.7mg/ml)吸附剂0.1mL加入至15mL样品瓶中，样品瓶封口后放入摇床中，在37℃，150r/min的条件下亲和吸附2h。反应后离心取上清，利用BCA法检测反应后溶液中单域抗体浓度。差量计算单域抗体吸附剂对β₂微球蛋白的吸附量。利用Scatchard法作图，线性回归得到吸附剂对β₂微球蛋白的最大理论吸附容量、平衡解离常数和亲和常数，经过计算得固载单域抗体A的吸附剂对β₂微球蛋白的最大理论吸附容量0.24mg/ml(图7A)，平衡解离常数为2.92μg/mL和亲和常数5.13×10^-6L/mol(如图7B)；固载单域抗体B的吸附剂对β₂微球蛋白的最大理论吸附容量0.16mg/ml(图8A)，平衡解离常数为13.36μg/mL，亲和常数1.1×10^-6L/mol(图8B)。

实施例6 ELISA检测抗体特异性

(1)包被抗原：取30μlβ₂微球蛋白(0.5mg/ml)，用包被液(0.05mol/l、pH9.6的碳酸盐缓冲液，4℃保存。称取Na₂CO₃0.15g、NaHCO₃0.293g，用蒸馏水稀释至100ml)按1:50稀释。每孔加200μl(2μgβ₂微球蛋白)，37℃温育1h后，于4℃冰箱中放置16～18h；

(2)洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液(0.01mol/l、pH7.4的PBS-Tween-20，4℃保存。称取NaCl8g、KH₂PO₄0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O2.9g、Tween-200.5ml，用蒸馏水定容至1000ml)，静置3min，反复3次，最后将板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；

(3)封闭：加封闭液(0.5％牛血清白蛋白，pH7.4的PBS)200μl，37℃放置1h后洗涤，洗涤同步骤(2)；

(4)加样：按如下实验设计加样，每孔加样200μl，反应0.5小时后洗涤，洗涤同步骤(2)；

(5)加一抗：将anti-6×His Tag antibody(0.5mg/ml)按1:1000稀释，每孔加100μl，37℃放置1h后洗涤，洗涤同步骤(2)；

(6)加酶标二抗：将羊抗兔IgG-HRP(0.5mg/ml)按1:1000稀释，每孔加200μl，37℃放置1h；

(7)加底物：加TMB工作液200μl，于室温下在暗处放置10-15min，加终止液，每孔50μl。

(8)酶标仪检测：用酶标仪记录450nm处的读数，结果如图9和10所示。

酶标仪检测结果如图9或10所示，其中图9显示单域抗体A与β₂微球蛋白的结合能力，图10显示单域抗体B与β₂微球蛋白的结合能力。

图9和图10的结果显示，单域抗体A或单域抗体B对β₂微球蛋白呈现很高的结合能力，有望应用于血液净化及β2微球蛋白检测领域。

Claims (10)

1.一种抗人β2微球蛋白的单域抗体，其特征在于，所述的单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.10。

2.一种编码权利要求1所述的单域抗体的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.11。

4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，包括4个框架区序列和3个互补决定区序列，其中所述框架区序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6，所述互补决定区序列分别为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9；所述的SEQ IDNO.11所示的核苷酸序列，包括4个框架区序列和3个互补决定区序列，其中所述框架区序列分别为SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15，所述互补决定区序列分别为SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.18。

5.一种含有权利要求2～4的任一项所述的核苷酸序列的重组表达载体。

6.一种含有权利要求2～4的任一项所述的核苷酸序列的宿主细胞。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求5所述的重组表达载体。

8.根据权利要求6或7所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞能够表达权利要求1所述的单域抗体。

9.权利要求1所述的单域抗体在制备检测或去除β2微球蛋白试剂中的应用。

10.权利要求2或3所述的核苷酸序列在制备检测或去除β2微球蛋白试剂中的应用。