CN109160948B - 一种乙肝表面抗原纳米抗体及核酸分子和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乙肝表面抗原纳米抗体及核酸分子和应用，涉及基因工程抗体技术领域。本发明公开的抗人乙肝表面抗原的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明公开的乙肝表面抗原纳米抗体可以作为抗体应用于乙肝表面的抗原检测、乙肝表面抗原与乙肝疫苗的纯化。较传统抗体和抗体片段(scFv,Fab)，该乙肝表面抗原纳米抗体具有较高的特异性，高亲和力，结构更加稳定，耐酸碱，耐高温等特性，使其免疫检测与其在作为纯化配基时纯化稳定性得到了极大的提升，同时对环境耐受能力也到了提升。该乙肝表面抗原纳米抗体的制备成本低廉，通过原核表达就能得到高效的表达。

Description

一种乙肝表面抗原纳米抗体及核酸分子和应用

技术领域

本发明涉及纳米抗体技术领域，具体而言，涉及一种乙肝表面抗原纳米抗体及核酸分子和应用。

背景技术

乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的外壳蛋白，本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的标志。它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、泪水、鼻咽分泌物、精液及阴道分泌物中。在感染乙肝病毒后2～6个月，当丙氨酸氨基转移酶升高前2～8周时，可在血清中测到阳性结果。急性乙型肝炎患者大部分可在病程早期转阴，慢性乙型肝炎患者该指标可持续阳性。因此快速检测乙肝病毒是临床需要。

传统乙肝疫苗纯化方法常采用吸附，高速离心，离子交换等多步凑进行分离纯化，过程复杂，回收率低，成本高，急需要一种新的纯化方法。

羊驼血清中存在的一种天然缺失轻链的抗体，即重链抗体（heavy-chainantibody，hcAb）。单域重链抗体（single domain antibody，sdAb）是指仅由重链抗体可变区（Variable region）组成的基因工程抗体，又称为VHH抗体（variable domain of heavychain of heavy-chain antibody，VHH antibody）或纳米抗体（Nanobody，Nb）。与传统抗体相比，单域抗体具有分子量小，稳定性高，水溶性好等优点，其次天然缺失轻链，洗脱时不会像传统抗体那样造成轻链脱落造成二次污染，因此可作为新一代的亲和纯化配体，用于乙肝疫苗的纯化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙肝表面抗原纳米抗体。

本发明的另一目的在于提供一种分离的核酸分子。

本发明的另一目的在于提供一种载体。

本发明的另一目的在于提供一种宿主细胞。

本发明的另一目的在于提供一种制备上述纳米抗体的方法。

本发明的另一目的在于提供一种试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述纳米抗体的应用。

本发明是这样实现的：

本发明的一方面涉及一种乙肝表面抗原纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，本发明的纳米抗体的氨基酸序列并不限于SEQ ID NO.1所示的序列，其还可以是在SEQ ID NO.1所示的序列上经过一个或多个氨基酸残基的替换和/或删除得到的，且具有与SEQ ID NO.1相同生物活性例如与乙肝表面抗原特异性结合的活性或者是活性加强或者活性减弱的衍生序列。这类衍生序列也属于本发明的保护范围。

本发明的另一方面涉及一种分离的核酸分子，该核酸分子编码上述的乙肝表面抗原纳米抗体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

对本领域技术人员而言，根据密码子的简并性，容易在上述核苷酸序列的基础进行一个或多个核苷酸的替换，得到相应的衍生序列，以使编码出本发明提供的SEQ ID NO.1所示的纳米抗体。因此，在上述核苷酸序列的基础进行一个或多个核苷酸的替换，得到相应的编码出本发明提供的纳米抗体的衍生的核苷酸序列也属于本发明的保护范围。

本发明的另一方面涉及一种载体，其含有上述的分离的核酸分子。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述载体包括但不限于克隆载体和表达载体。

本发明的另一方面涉及一种宿主细胞，其含有上述的载体。

本发明的另一方面涉及一种偶联物，该偶联物含有上述的乙肝表面抗原纳米抗体以及偶联部。

偶联部的具体类别，均可以根据使用需求进行选择。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述偶联部包括但不限于放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质、多聚物例如琼脂糖、聚乙二醇等、活性多肽、蛋白、核素，核酸，小分子毒素、受体或配体等。

本发明的另一方面涉及一种制备上述的乙肝表面抗原纳米抗体的方法，其包括：培养上述的宿主细胞。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述方法还包括：从细胞培养物中纯化得到上述乙肝表面抗原纳米抗体。

在本发明公开了乙肝表面抗原纳米抗体的氨基酸序列的前提下，本领域技术人员容易通过基因工程技术、化学合成等方法得到本发明的抗乙肝表面抗原纳米抗体，其相应的制备方法均属于本发明的保护范围。

本发明的另一方面涉及一种检测检测乙肝表面抗原的试剂盒，其包括上述的乙肝表面抗原纳米抗体，或者上述的偶联物。

本发明的另一方面涉及上述的乙肝表面抗原纳米抗体在检测乙肝表面抗原中的应用，该应用以非诊断或治疗为目的。

本发明的再一方面涉及上述的乙肝表面抗原纳米抗体在制备乙肝表面抗原检测试剂盒中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的乙肝表面抗原纳米抗体，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其可以作为抗体应用于乙肝表面的抗原检测、乙肝表面抗原与乙肝疫苗的纯化。较传统抗体和抗体片段（scFv,Fab），该乙肝表面抗原纳米抗体具有较高的特异性，高亲和力，结构更加稳定，耐酸碱，耐高温等特性，使其免疫检测与其在作为纯化配基时纯化稳定性得到了极大的提升，同时对环境耐受能力也到了提升。同时该乙肝表面抗原纳米抗体的制备成本低廉，通过原核表达就能得到高效的表达。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中的洗脱液的电泳结果。

图2为本发明实施例1中ELISA检测纳米抗体的特异性结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

乙肝表面抗原纳米抗体的制备

1 免疫：

取健康成年羊驼，将乙肝表面抗原蛋白HBsAg（ad），HBsAg（ay）与佐剂混合后，采取背部皮内、皮下多点注射的方式进行免疫，免疫程序如表1所示，第三次加强免疫后第七天，采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。

表1 羊驼免疫程序

	初次免疫	加强免疫1	加强免疫2	加强免疫3
					免疫时间	0	第28 天	第49天	第70天
免疫剂量	1 mg	0.5mg	0.25 mg	0.25 mg
					佐剂	弗氏完全佐剂	弗氏不完全佐剂	弗氏不完全佐剂	弗氏不完全佐剂
免疫方式	皮下、皮内免疫	皮下免疫	皮下免疫	皮下免疫

2羊驼淋巴细胞分离：

在15mL离心管中加入6mL淋巴细胞分离液，再加入等体积的全血样品，800g 常温离心20min；

小心吸取中间层悬浮的白细胞至一新的离心管中，加入2倍体积的PBS,800g,常温离心15min；

小心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解红细胞；450g 常温离心15min，去上清并计数，按10⁷个淋巴细胞加入2mL Trizol充分裂解，备用。

3总RNA提取：

向上述裂解液中加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡20s充分乳化，冰上静止10min；4℃，12000g 离心10min，取上清转移至另一新鲜离心管中；

加入等体积的异丙醇，充分混匀后冰上静止10min；4℃ 12000g离心10min，弃上清，加入75%的乙醇，充分混匀；

4℃，12000g离心10min，去上清；室温干燥5min，加入适量RNase-free 水溶解沉淀，待RAN沉淀完全溶解后于-80℃保存。

4 cDNA合成：

反转录体系如下：

步骤1：按如下表中体系配制反应液

混匀后，65℃保温5 min，迅速冰浴；

步骤 2：按如下表中体系配制cDNA反应液

混匀后，按如下条件反转录：25℃ 10min；50℃，50 min ；85℃，5 min；离心后每管加入1μL RNase H 37℃，20 min。

5 抗体基因扩增

巢氏第一轮PCR体系如下：

其中，AlpVh-LD的序列如下: CTTGGTGGTCCTGGCTGC；

CH2-R的序列如下: GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC

反应程序：94℃，5min；98℃10s，50℃ 15s，72℃ 1min，共30循环；反应结束后，凝胶电泳，割胶回收400bp左右的目的片段。

巢氏第二轮PCR体系如下

94℃，5min；98℃10s，57℃ 15s，72℃45s，共30循环。

其中，lpVh-F1的序列如下:

CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC；

AlpVHH-R1的序列如下:

CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG；

AlpVHH-R2的序列如下:

CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG。

6 文库构建：

6.1 载体和目的片段酶切

目的片段双酶切体系（160μL体系）如下：

50℃酶切过夜。

载体双酶切体系（160μL）如下：

6.2 载体与目的片段的连接

50μL 连接体系如下：

16℃连接过夜，加入 5 µL（1/10 量）的 3 M CH₃COONa（pH 5.2）和 125 µL（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20 ℃静置 30-60 min，12000 g离心回收沉淀，用 70 % 的冷乙醇清洗沉淀，室温干燥，溶于15µL 去离子水中。

7 电转化：

（1）将感受态细胞100µL置于冰上融化，加入 1µL 连接产物轻轻混匀，冰上放置30 min；

（2）将上述混合液转入 0.2 cm 的电击杯中，调节电击参数：电压为2.5kV，电场强度为 2.5 kV/cm，电击转化；

（3）立即向电击杯中加入 1 mL SOC 培养基，悬浮细胞，37℃ 180 r/min培养1 h进行细胞复苏；

（4）将复苏培养物 10 倍梯度稀释后均匀涂布于 SOB-AG 平板，37℃倒置培养过夜。

8 抗乙肝表面抗原纳米抗体亲和淘选：

1）将乙肝表面抗原用 PBS 稀释至终浓度为 100 μg /mL，按10µL/孔加入酶标孔中，4℃包被12 h；

2）弃包被液，PBS 洗涤 3 次，每孔加入300 µL 3% BSA-PBS封闭液，37℃封闭 2h；

3）PBS洗涤6次，加入 100 µL噬菌体文库，噬菌体数量约为2×10¹¹ cfu，37℃孵育2h；

4）吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤5次，PBS洗涤10次；

5）加入 100 µL Gly-HCl 洗脱液，37℃孵育 8 min，洗脱特异性结合的噬菌体；将该洗脱液转移至一无菌离心管中，迅速用50 μL Tris-HCl中和缓冲液中和；

7）取 10 µL 进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，用于下一轮亲和淘选。

8）将文库扩增结果进行下一轮淘选，改变淘选条件，每一轮淘选条件如表2。

表2 亲和淘选条件

轮次	抗原包被浓度（µg/mL）	封闭液	文库投入量(cfu)	结合时间（h）	PBST洗涤次数
						1	10	BSA-PBS	2.0×10<sup>11</sup>	2	5
2	5	OVA-PBS	2.0×10<sup>11</sup>	1	10
						3	1	BSA-PBS	2.0×10<sup>11</sup>	0.5	15

9特异性噬菌体克隆的鉴定：

1）从第三轮淘选洗脱物滴度的平板上（菌落数30 ~ 200个），用灭菌牙签随机挑取48个单克隆接种于1 mL 2×YT-GA中，进行扩增。

2）将乙肝表面抗原稀释至2 μg/mL，按100 µL/孔加入酶标孔中，4℃包被12 h；

3）弃包被液，PBST 洗涤 3 次，每孔加入300 µL 3% 脱脂牛奶，37℃封闭 2 h；

4）PBST洗涤3次，加入100 μL/孔的培养上清，37 ℃，孵育1 h；

5）PBST洗涤5次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体（用3 %脱脂牛奶，按1:5000稀释），100 μL/孔，37 ℃作用1 h；

6）PBST洗板6次。加入TMB显色液显色，100 μL/孔，37 ℃，5 min，加入终止液终止反应，50 μL/孔，于450 nm下测光密度。OD₄₅₀大于1.0的为阳性克隆。

7) 挑取阳性克隆测序，基因序列如SEQ ID NO.2所示，编码的纳米抗体的氨基序列如SEQ ID NO.1所示。

10 乙肝表面抗原纳米抗体表达纯化：

（1）将筛选到的SEQ ID NO.2的序列亚克隆至pet-25b（+）载体上，酶切位点为NcoI和Not I。将重组质粒VHH-pET25b⁺ 转化大肠杆菌Rosetta DE3表达菌株中，挑取单克隆菌株接种于4mL LB-Amp 培养基，37℃ 250rpm 培养4~5h；

（2）按照1%（V/V）接种于100mL LB-Amp-0.2% Glu 培养基（用500mL摇瓶），37℃250rpm 培养至OD600约0.5；

（3）加入终浓度0.1mM IPTG，30℃ 220rpm 诱导过夜；

（4）（圆底离心管）12000rpm 离心10min，弃上清，收集菌体，-20℃保存备用；

（5）取上述菌，加结合Buffer（50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl）重悬；每100mL菌液用30mL结合Buffer；

（6）超声破碎菌体；超声条件为：25~35min、超声5s 间隔7s、功率35%；

（7）12000rpm 4℃离心20min，取上清，过0.45μm 滤膜以用于纯化。

11抗乙肝表面抗原纳米抗体的纯化：

（1）纯化过程中使用到的所有试剂均需要提前过0.45μm 滤膜，以防柱子发生堵塞；

（2）加8~10个柱体积超纯水清洗Ni柱；

（3）加8~10个柱体积结合Buffer（50mM NaH₂PO₄+500mM NaCl）平衡柱子；

（4）将过膜后的样品加入到Ni柱中，收集流出液；

（5）加8~10个柱体积结合Buffer平和柱子；

（6）依次用含50mM，100mM，250mM和500mM 咪唑的结合Buffer洗脱纳米抗体，其中，各咪唑浓度的洗脱体积依次为5mL、4mL、4mL和6mL；收集洗脱液。电泳，结果见图1。可以看出，该纳米抗体的分子量与预测大小相符。

（7）加5mL 500mM咪唑溶液彻底清洗柱子；

（8）加8~10个柱体积结合Buffer清洗（平衡）Ni柱；

（9）8~10柱体积超纯水清洗Ni柱；

（10）20%乙醇保存柱子。

12 ELISA检测上述纳米抗体特异性。结果见图2，图中：Ad，ay代表乙肝表面抗原的两个亚型，BSA 代表牛血清白蛋白。可以看出，本发明的纳米抗体能够特异性结合乙肝表面抗Ad和ay。

实施例2

本实施例提供了一种含抗乙肝表面抗原纳米抗体的偶联物，该偶联物包括实施例1提供的抗乙肝表面抗原纳米抗体和偶联部，偶联部琼脂糖微球。该偶联物的制备方法如下：

将NHS活化的琼脂糖用0.1M HCl 洗涤10次，每次平衡5min。用偶联缓冲液10mMNa₂HPO₄，pH 7.4 洗涤10次，加入纯化的抗乙肝表面抗原纳米抗体4mg/mLNHS 活化的琼脂糖微球，室温反应1h，使纳米抗体共价偶联到NHS活化的琼脂糖微球。用偶联的缓冲液洗涤3次，加入1M Tris buffer pH 8.8，封闭未反应的活性基团。用10mM Na₂HPO₄，pH 7.4 洗涤3次，既得到乙肝表面抗原-B 结构域的免疫亲和吸附材料即含抗乙肝表面抗原纳米抗体的偶联物，吸附材料加入20%乙醇，4℃保存。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都阿帕克生物科技有限公司

<120> 一种乙肝表面抗原纳米抗体及核酸分子和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Arg

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Val Val

35 40 45

Ser Cys Asn Arg Gly Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Arg Ile Gly Thr Val Tyr Thr Gly Tyr Ser Gly Arg Cys

100 105 110

Gly Asn Asn Phe Val Glu Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Pro Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln

130 135

<210> 2

<211> 414

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagctgcagc tggttgaatc tggtggtggt tctgttcagc cgggtggttc tctgcgtctg 60

tcttgcgctg cttctggttt caccctggac taccgtgcta tctcttggtt ccgtcaggct 120

ccgggtaaag aacgtgacgt tgtttcttgc aaccgtggtg ctggtggttc taccaactac 180

gctgactctg ctaaaggtcg tttcaccatg tctcgtgaca acgctaaaaa caccgtttac 240

ctgcagatga actctctgaa accggacgac accggtgttt actactgcgc tgcttctcgt 300

atcggtaccg tttacaccgg ttactctggt cgttgcggta acaacttcgt tgaagtttgg 360

ggtcagggta ccctggttac cgttccgtct gaaccgaaaa ccccgaaacc gcag 414

Claims (10)

1.一种乙肝表面抗原纳米抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的乙肝表面抗原纳米抗体。

3.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种载体，其特征在于，其含有权利要求2或3所述的分离的核酸分子。

5.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求4所述的载体。

6.一种偶联物，其特征在于，其含有权利要求1所述的乙肝表面抗原纳米抗体以及偶联部。

7.一种制备权利要求1所述的乙肝表面抗原纳米抗体的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求5所述的宿主细胞。

8.一种检测乙肝表面抗原的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的乙肝表面抗原纳米抗体，或者权利要求6所述的偶联物。

9.权利要求1所述的乙肝表面抗原纳米抗体在检测乙肝表面抗原中的应用，其特征在于，所述应用以非诊断或治疗为目的。

10.权利要求1所述的乙肝表面抗原纳米抗体在制备乙肝表面抗原检测试剂盒中的应用。

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