CN117362417A - 广谱中和沙贝病毒的抗体及其应用 - Google Patents
广谱中和沙贝病毒的抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了广谱中和沙贝病毒的抗体及其应用。本发明提供了3种抗体(纳米抗体)。所述3种抗体为:THA‑1抗体、THA‑2抗体和THA‑3抗体。进一步,本发明还获得了3种纳米抗体和人源Fc融合的相应的3种融合抗体。本发明提供的抗体具有广谱中和SARS‑CoV‑2的效果,对野生型新型冠状病毒以及自然变异株均具有强中和能力,同时对其他沙贝病毒亚属的冠状病毒也具有强中和能力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及广谱中和沙贝病毒的抗体及其应用,具体的所述抗体可为纳米抗体或纳米抗体-Fc融合抗体。
背景技术
冠状病毒中的沙贝病毒亚属(Sarbecovirus)常以蝙蝠作为动物宿主,共有3个分支:第一类,感染人类的SARS-CoV-1病毒和与其基因组相似的蝙蝠衍生SARS-CoV-1病毒株,例如BatSARS-likeWIV1等;第二类,蝙蝠衍生SARS-CoV-1样病毒株,例如BatSARS-likeCoVZC45和BatSARS-likeCoVZXC21等;第三类,感染人类的SARS-CoV-2病毒和与其基因组相似的蝙蝠衍生和穿山甲衍生病毒株,例如BatCoVRaTG13等。二十世纪以来,沙贝病毒已在人类世界中引起了两次重大疫情(SARS-CoV-1和SARS-CoV-2),研究者也不断地从自然宿主中发现更多的与SARS-CoV-1接近的沙贝病毒。为了应对未来的变异株和可能由自然宿主进化感染人类的沙贝病毒,发现预防和治疗沙贝病毒感染的通用药物和通用疫苗,成为结束疫情大流行的关键,也是防止未来更多变异和可能的新冠状病毒爆发的关键。
常规免疫球蛋白IgG抗体由两条相同的重链(Heavy chain)和两条相同的轻链(Lightchain)组成,例如分离自人体的单克隆抗体或人源化小鼠抗体。除了常规抗体外,骆驼科动物体内还存在独特的重链抗体(HCAbs),仅由两条相同的重链组成,每个重链由1个重链可变区(VHH)和两个恒定区(CH2和CH3)组成。VHH是重链抗体最小的完整功能结构,也称为纳米抗体(Nanobody)或单域抗体。纳米抗体具有体积小、特异性强、稳定性强、易生产、穿透力强、免疫原性低等多种优势。得益于纳米抗体的小体积和高特异性,目标蛋白上众多较为隐蔽的抗体表位更容易被纳米抗体识别,有利于进一步分辨得到更多中和抗体表位,为抗体药物和疫苗研发等提供创新的思路,为疫情防控提供有效的技术和方法。
发明内容
本发明的目的是提供广谱中和沙贝病毒的抗体及其应用。
本发明提供了3种抗体(纳米抗体)。本发明保护3种抗体中的任意一种或任意组合。
所述3种抗体为:THA-1抗体、THA-2抗体和THA-3抗体。
本发明还提供了3种抗体(融合抗体)。本发明保护3种抗体中的任意一种或任意组合。
所述3种抗体为:THA-1-Fc抗体、THA-2-Fc抗体和THA-3-Fc抗体。
所述THA-1抗体包括框架区FR和互补决定区CDR;所述THA-1抗体中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列5中第26-33位、第51-58位、第97-116位氨基酸残基;所THA-1抗体中的FR1、FR2、FR3和FR4依次为序列表的序列5中第1-25位、第34-50位、第59-96位、第117-127位氨基酸残基。
所述THA-2抗体包括框架区FR和互补决定区CDR;所述THA-2抗体中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列7中第26-33位、第51-58位、第97-114位氨基酸残基;所述THA-2抗体中的FR1、FR2、FR3和FR4依次为序列表的序列7中第1-25位、第34-50位、第59-96位、第115-125位氨基酸残基。
所述THA-3抗体包括框架区FR和互补决定区CDR;所述THA-3抗体中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列9中第26-33位、第51-58位、第97-114位氨基酸残基;所述THA-3抗体中的FR1、FR2、FR3和FR4依次为序列表的序列9中第1-25位、第34-50位、第59-96位、第115-125位氨基酸残基。
具体的,所述THA-1抗体如序列表的序列5所示。
具体的,所述THA-2抗体如序列表的序列7所示。
具体的,所述THA-3抗体如序列表的序列9所示。
具体的,所述THA-1抗体自N端至C端包括如下区段:序列表的序列5所示蛋白质区段,蛋白质标签。具体的,所述THA-1抗体自N端至C端依次由如下区段组成:序列表的序列5所示蛋白质区段,蛋白质标签。
具体的,所述THA-2抗体自N端至C端包括如下区段:序列表的序列7所示蛋白质区段,蛋白质标签。具体的,所述THA-2抗体自N端至C端依次由如下区段组成:序列表的序列7所示蛋白质区段,蛋白质标签。
具体的,所述THA-3抗体自N端至C端包括如下区段:序列表的序列9所示蛋白质区段,蛋白质标签。具体的,所述THA-3抗体自N端至C端依次由如下区段组成:序列表的序列9所示蛋白质区段,蛋白质标签。
具体的,所述蛋白质标签可为His6标签。
所述THA-1-Fc抗体自N端至C端包括如下区段:THA-1抗体、Fc。
所述THA-2-Fc抗体自N端至C端包括如下区段:THA-2抗体、Fc。
所述THA-3-Fc抗体自N端至C端包括如下区段:THA-3抗体、Fc。
具体的,所述THA-1-Fc抗体自N端至C端依次包括如下区段:序列表的序列5所示蛋白质区段,连接肽,Fc。具体的,所述THA-1-Fc抗体自N端至C端依次由如下区段组成:序列表的序列5所示蛋白质区段,连接肽,Fc。
具体的,所述THA-2-Fc抗体自N端至C端依次包括如下区段:序列表的序列7所示蛋白质区段,连接肽,Fc。具体的,所述THA-2-Fc抗体自N端至C端依次由如下区段组成:序列表的序列7所示蛋白质区段,连接肽,Fc。
具体的,所述THA-3-Fc抗体自N端至C端依次包括如下区段:序列表的序列9所示蛋白质区段,连接肽,Fc。具体的,所述THA-3-Fc抗体自N端至C端依次由如下区段组成:序列表的序列9所示蛋白质区段,连接肽,Fc。
所述连接肽具体可为“GGGGS”。
所述Fc具体可为人源Fc。
具体的,所述人源Fc如序列表的序列27所示。
本发明还提供了3种基因。本发明保护3种基因中的任意一种或任意组合。
所述3种基因为:编码THA-1抗体的基因、编码THA-2抗体的基因、编码THA-3抗体的基因。
本发明还提供了3种基因。本发明保护3种基因中的任意一种或任意组合。
所述3种基因为:编码THA-1-Fc抗体的基因、编码THA-2-Fc抗体的基因、编码THA-3-Fc抗体的基因。
本发明保护以上任一所述抗体或抗体组合在制备用于抑制冠状病毒的药物中的应用。
本发明还保护一种用于抑制冠状病毒的药物,其活性成分为以上任一所述抗体或抗体组合。
本发明保护以上任一所述抗体或抗体组合在制备用于中和冠状病毒的药物中的应用。
本发明还保护一种用于中和冠状病毒的药物,其活性成分为以上任一所述抗体或抗体组合。
本发明保护以上任一所述抗体或抗体组合在制备用于预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病的药物中的应用。
本发明还保护一种用于预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病的药物,其活性成分为以上任一所述抗体或抗体组合。
具体的,所述冠状病毒为β属冠状病毒。
具体的,所述冠状病毒为沙贝病毒亚属病毒。
具体的,所述冠状病毒为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
具体的,所述新型冠状病毒可为如下任一:野生型新型冠状病毒、新型冠状病毒Alpha株、新型冠状病毒Beta株、新型冠状病毒Gamma株、新型冠状病毒Delta株、新型冠状病毒Omicron BA.1株、新型冠状病毒Omicron BA.2株。
具体的,所述冠状病毒为严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-1)。
具体的,所述沙贝病毒亚属病毒为Pangolin CoV GD、Pangolin CoV GX、Bat CoVWIV16或Bat CoV RaTG13。
本发明从免疫后的羊驼体内分离获得了3种纳米抗体,命名为THA-1抗体、THA-2抗体和THA-3抗体。进一步,本发明还获得了4种纳米抗体和人源Fc融合的相应的3种融合抗体。本发明提供的抗体具有广谱中和SARS-CoV-2的效果,对野生型新型冠状病毒以及自然变异株均具有强中和能力,同时对其他沙贝病毒亚属的冠状病毒也具有强中和能力。本发明对于新型冠状病毒和/或其他沙贝病毒的防控具有重大的应用价值,将产生深远的社会意义。
附图说明
图1为SARS-CoV-2 RBD蛋白纯化过程中的凝胶过滤层析色谱图。
图2为SARS-CoV-1 RBD蛋白纯化过程中的凝胶过滤层析色谱图。
图3为3种纳米抗体对野生型新型冠状病毒假病毒的中和试验结果。
图4为3种纳米抗体对SARS-CoV-1假病毒的中和试验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。实施例中的重组质粒均已进行测序验证。如无特殊说明,以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。293F细胞:Thermo FisherScientific,R79007。质粒pFastBac-dual:Gibco,10712024。质粒pcDNA3.1(+):Invitrogen公司,产品目录号V790-20。293T细胞:盖德,CRL-11268。昆虫细胞培养基(Sf-900II SFM):Gibco.,货号为10902-088。pMD18-T载体为Takara货号6011的pMDTM 18-T Vector CloningKit的组件,https://www.takarabiomed.com.cn/ProductShow.aspx?m=20141220150817403017&productID=20141227130215047304。
hACE2-hela细胞(即文献中的“HeLa cell lines stably expressing the ACE2molecules”),记载于如下文献:Wang,R.,Zhang,Q.,Ge,J.,Ren,W.,Zhang,R.,Lan,J.,Ju,B.,Su,B.,Yu,F.,Chen,P.,Liao,H.,Feng,Y.,Li,X.,Shi,X.,Zhang,Z.,Zhang,F.,Ding,Q.,Zhang,T.,Wang,X.&Zhang,L.Analysis of SARS-CoV-2 variant mutations revealsneutralization escape mechanisms and the ability to use ACE2 receptors fromadditional species.Immunity 54,1611-1621.e1615,doi:10.1016/j.immuni.2021.06.003(2021).。
pVRC8400载体(即文献中的pVRC8400expression vector)记载于如下文献:LukeH Chao,Daryl E Klein,Aaron G Schmidt,Jennifer MStephen C Harrison.;Sequential conformational rearrangements in flavivirus membrane fusion;eLife,2014;3:e04389。
实施例1、纳米抗体的筛选
一、免疫原蛋白的制备
1、SARS-CoV-2 RBD蛋白的制备
将质粒pcDNA3.1(+)的BamHI和HindIII酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列2所示的双链DNA分子,得到重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2 RBD。
序列表的序列2所示的DNA分子编码序列表的序列1所示的蛋白质。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为SARS-CoV-2 RBD蛋白。SARS-CoV-2 RBD蛋白以二聚体形式存在,二聚体的预期分子量约为50kDa。
序列表的序列1中,第1-33位氨基酸残基组成信号肽,第34-256位氨基酸残基组成SARS-CoV-2 RBD,第257-264位氨基酸残基组成strep标签,第265-272位氨基酸残基组成Flag标签,第273-278位氨基酸残基组成His6标签。
将重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2 RBD转染293F细胞,采用SMM 293-TII培养基培养72h,然后4000rpm离心30min,收集含SARS-CoV-2 RBD蛋白的上清液。
2、SARS-CoV-1 RBD蛋白的制备
(1)构建重组质粒
将质粒pFastBac-dual的EcoRI和XbaI酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列4所示的双链DNA分子,得到重组质粒pFastBac-SARS-CoV-1 RBD。
序列表的序列4所示的DNA分子编码序列表的序列3所示的蛋白质。将序列表的序列3所示的蛋白质命名为SARS-CoV-1 RBD蛋白。
序列表的序列3中,第1-222位氨基酸残基组成SARS-CoV-1胞外区,第223-228位氨基酸残基组成His6标签。
(2)重组Bacmid的制备
①将重组质粒pFastBac-SARS-CoV-1 RBD加入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,冰上放置30min;然后42℃热激75s,放回冰上2min;然后加入500μl LB液体培养基,37℃复苏5h;然后吸取10μl涂布于含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素、40μg/mlIPTG和100μg/ml X-gal的LB固体培养基,避光培养三天至长出清晰的蓝白斑。
②挑取白色单菌落,接种于5mL含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素的LB液体培养基,37℃、220rpm振荡培养12小时。
③取步骤②得到的培养体系,采用的质粒小提试剂盒(QIAprep Spin MiniprepKit,Qiagen公司,货号为27106,其中含有P1试剂、P2试剂和P3试剂)提取质粒,具体步骤依次如下:将培养体系13000rpm离心2min,收集菌体沉淀,用P1试剂重悬菌体;加入P2试剂,缓慢颠倒混匀6-8次;加入P3试剂,缓慢颠倒混匀6-8次(可见白色沉淀),13000rpm离心10min,取上清液;取600μl上清液,加入800μl预冷的异丙醇,-20℃放置10min,然后13000rpm离心15min,收集沉淀;用500μl预冷的70%乙醇水溶液重悬沉淀,13000rpm离心5min,收集沉淀,将酒精完全吹干后,用65℃预热的ddH2O溶解沉淀,13000rpm离心5min,吸取上清,即为重组Bacmid的溶液,简称Bacmid溶液。
(3)重组病毒的制备与扩增
①取Sf9细胞,加入10cm培养皿中,静置10min,细胞贴壁,显微镜下观察,保证培养皿底部约有70%-80%被细胞覆盖。
②取Cellfectin II Reagent 15μl,用100μl昆虫细胞培养基稀释。
③取15-20μl步骤(2)得到的Bacmid溶液,用100μl昆虫细胞培养基稀释。
④将步骤②得到的液相缓慢加入步骤③得到的液相中,缓慢吹打均匀,室温静置30min,用昆虫细胞培养基稀释至2ml。
⑤取完成步骤①的培养皿,弃去上清,缓慢均匀的将步骤④得到的液相滴加至培养皿中,27℃静置培养5h后吸弃上清,加入7ml新鲜的昆虫细胞培养基,用封口膜密封后27℃静置培养8天,收集培养液,600g离心6min,取上清液,加入胎牛血清并使其体积浓度为2-5%,长期保存,即为P0代重组病毒的病毒液。
⑥取P0代重组病毒的病毒液,按照1:1000的体积比加入摇瓶培养的细胞浓度为2×106个细胞/mL的Sf9细胞液中,27℃、110rpm培养5天,收集培养液,600g离心6min,取上清液,即为P1代重组病毒的病毒液,简称P1代病毒液。
(4)蛋白的表达
取P1代病毒液,按照1:100的体积比加入1L细胞浓度为2×106个细胞/mL的Sf9细胞液中,27℃、125rpm培养72小时,4000rpm离心15min,收集上清液,即为含SARS-CoV-1 RBD蛋白的上清液。
3、蛋白的纯化
待纯化蛋白液分别为:步骤1制备的含SARS-CoV-2 RBD蛋白的上清液或者步骤2制备的含SARS-CoV-1 RBD蛋白的上清液。
(1)亲和层析
亲和层析的层析柱规格:长度3cm,内径1cm。
亲和层析的柱填料:镍柱beads(购自Qiagen公司,产品目录号为30230)。
依次进行如下操作步骤:①将500ml待纯化蛋白液上样于亲和层析柱,4℃孵育3小时;②用100mL含20mM咪唑的HEPEs buffer(pH7.2、1M)洗涤柱子;③用30mL含500mM咪唑的HEPEs buffer(pH7.2、1M)洗脱目的蛋白,收集过柱后溶液。
(2)取亲和层析后得到的过柱后溶液,用10kD浓缩管(购自Merck公司,产品目录号为UFC800396)进行浓缩,得到体积为1mL的浓缩液。
(3)凝胶过滤层析
凝胶过滤层析的层析柱规格:长度24cm,内径2cm。
凝胶过滤层析的柱填料:superdex200 increase 10/300GL(购自GEHealthcare公司,产品目录号为28-9909-44)。
进行如下操作步骤:上样0.5mL步骤(2)得到的浓缩液,用流速为0.5mL/min的PBS缓冲液(pH7.2、10mM)洗脱,收集目标峰对应的过柱后溶液,即为纯化后蛋白液。
待纯化蛋白液为步骤1制备的含SARS-CoV-2 RBD蛋白的上清液时,凝胶过滤层析色谱图见图1,目标峰对应的保留体积为18.192mL,得到的纯化后蛋白液命名为SARS-CoV-2RBD蛋白溶液。
待纯化蛋白液为步骤2制备的含SARS-CoV-1 RBD蛋白的上清液时,凝胶过滤层析色谱图见图2,目标峰对应的保留体积为16.630mL,得到的纯化后蛋白液命名为SARS-CoV-1RBD蛋白溶液。
后续步骤以及后续实施例中用到的相关蛋白均是由纯化后蛋白液提供的。
二、免疫后羊驼纳米抗体展示文库筛选
1、羊驼的免疫和纳米抗体展示文库的建立
羊驼免疫过程依次如下:
第一次免疫:免疫SARS-CoV-2 RBD蛋白,蛋白免疫剂量为200μg/只(具体是将蛋白溶液稀释至1mL,然后与1mL完全弗氏佐剂混匀后使用);
第二次免疫:免疫SARS-CoV-2 RBD蛋白,蛋白免疫剂量为200μg/只(具体是将蛋白溶液稀释至1mL,然后与1mL不完全弗氏佐剂混匀后使用);
第三次免疫:免疫SARS-CoV-2 RBD蛋白,蛋白免疫剂量为200μg/只(具体是将蛋白溶液稀释至1mL,然后与1mL不完全弗氏佐剂混匀后使用);
三次免疫均采用颈部皮下免疫的方式。
第三次免疫7天后,颈部静脉采血50mL,送至成都阿帕克生物科技有限公司进行纳米抗体展示噬菌体文库的构建,得到多样性为108的噬菌体文库。
2、噬菌体文库的筛选
(1)亲和淘选
将SARS-CoV-1 RBD蛋白用碳酸盐缓冲液稀释后包被酶标板,然后弃除包被液;用PBS缓冲液洗涤后加入封闭液,孵育后弃除封闭液;用PBS缓冲液洗涤后加入100μL噬菌体文库,孵育后用缓冲液洗涤去除未结合的噬菌体;加入洗脱液,洗脱结合的噬菌体,然后迅速用中和缓冲液中和;测定洗脱物滴度,计算淘选回收率,其余洗脱物进行扩增,用于下一轮亲和淘选。
(2)淘选后文库扩增
将淘选洗脱物侵染处于对数生长前期的E.coli TG1,然后加入葡萄糖并使其工作浓度为1%,加入M13K07噬菌体和抗性物质(氨苄和卡那),待M13K07侵染入TG1后,补加液体;将培养物常温离心,沉淀用加入含抗性物质(氨苄和卡那)的液体培养基重悬,振荡培养过夜;将过夜培养物4℃离心,在上清中加入1/5体积的PEG-NaCl(PEG-NaCl即20%PEG8000/2.5M NaCl溶液)沉降噬菌体,混匀后置于4℃;4℃离心去除上清,将沉淀重悬于1mLPBS缓冲液中,加入1/5体积的PEG-NaCl再次沉降,混匀后置于4℃;离心去除上清,将沉淀重悬于200μL PBS缓冲液中,即为扩增产物,用于下一轮淘选或者分析。
(3)特异性噬菌体克隆的鉴定和分析
从淘选洗脱物滴度的平板上随机挑取单克隆振荡培养于氨苄抗性的培养基中。取部分培养物,加入M13K07辅助噬菌体帮助噬菌粒的扩增和分泌,补加具有氨苄和卡那抗性的培养基,剧烈振荡培养过夜。常温离心,取上清,用于单克隆ELISA鉴定。
将SARS-CoV-1 RBD蛋白用碳酸盐缓冲液稀释后包被酶标板,孵育后弃除包被液;用缓冲液洗涤后加入脱脂牛奶进行封闭,孵育后弃除封闭液;用缓冲液洗涤后加入噬菌体培养菌液上清和脱脂牛奶孵育;缓冲液洗涤后加入抗M13抗体孵育;缓冲液洗涤后加入显色液进行显色,显色后加入终止液终止反应,测光密度。
将阳性克隆菌液进行测序,获得纳米抗体基因序列。
共获得3种纳米抗体,依次命名为THA-1纳米抗体、THA-2纳米抗体、THA-3纳米抗体。
THA-1纳米抗体的氨基酸序列如序列表的序列5所示,其编码基因如序列表的序列6所示。所述THA-2纳米抗体的氨基酸序列如序列表的序列7所示,其编码基因如序列表的序列8所示。所述THA-3纳米抗体的氨基酸序列如序列表的序列9所示,其编码基因如序列表的序列10所示。
实施例2、纳米抗体-Fc融合蛋白的制备
一、重组表达载体的构建
1、在pMD18-T载体的EcoRV酶切位点插入序列表的序列11所示的双链DNA分子,得到人源Fc载体。序列表的序列11中,第51-354位核苷酸组成CMV Enhancer,第355-558位核苷酸组成CMV Promoter,第947-952核苷酸组成NheI酶切识别序列,第954-961位核苷酸组成NotI酶切识别序列,第977-1672位核苷酸编码人源Fc(人源Fc的氨基酸序列如序列表的序列27所示),第1673-1675位核苷酸为终止密码子,第1748-1869位核苷酸组成SV40Poly(A)。
2、将人源Fc载体的NheI和NotI酶切识别序列之间的小片段(含NheI酶切识别序列和NotI酶切识别序列,即GCTAGCCGCGGCCGC)替换为序列表的序列6所示的双链DNA分子,得到重组质粒THA-1-Fc。重组质粒THA-1-Fc表达如下融合蛋白,自N端至C端依次由信号肽、序列5所示蛋白区段(THA-1纳米抗体)、连接肽(GGGGS)和序列27所示蛋白区段(人源Fc)组成。在细胞中信号肽被切除,剩余如下活性蛋白,自N端至C端依次由序列5所示蛋白区段(THA-1纳米抗体)、连接肽(GGGGS)和序列27所示蛋白区段(人源Fc)组成。
3、将人源Fc载体的NheI和NotI酶切识别序列之间的小片段(含NheI酶切识别序列和NotI酶切识别序列,即GCTAGCCGCGGCCGC)替换为序列表的序列8所示的双链DNA分子,得到重组质粒THA-2-Fc。重组质粒THA-2-Fc表达如下融合蛋白,自N端至C端依次由信号肽、序列7所示蛋白区段(TH-2纳米抗体)、连接肽(GGGGS)和序列27所示蛋白区段(人源Fc)组成。在细胞中信号肽被切除,剩余如下活性蛋白,自N端至C端依次由序列7所示蛋白区段(THA-2纳米抗体)、连接肽(GGGGS)和序列27所示蛋白区段(人源Fc)。
4、将人源Fc载体的NheI和NotI酶切识别序列之间的小片段(含NheI酶切识别序列和NotI酶切识别序列,即GCTAGCCGCGGCCGC)替换为序列表的序列10所示的双链DNA分子,得到重组质粒THA-3-Fc。重组质粒THA-3-Fc表达如下融合蛋白,自N端至C端依次由信号肽、序列9所示蛋白区段(THA-3纳米抗体)、连接肽(GGGGS)和序列27所示蛋白区段(人源Fc)组成。在细胞中信号肽被切除,剩余如下活性蛋白,自N端至C端依次由序列9所示蛋白区段(THA-3纳米抗体)、连接肽(GGGGS)和序列27所示蛋白区段(人源Fc)。
二、制备纳米抗体-Fc融合蛋白
1、将步骤一制备的重组质粒转染293F细胞,然后采用SMM 293-TII培养基培养72h,然后4℃、4000rpm离心30min,收集上清液。
2、亲和层析
亲和层析的层析柱规格:长度3cm,内径1cm;
亲和层析的柱填料:protein A beads(Thermo,产品目录号10006D);
依次进行如下操作步骤:①将300mL步骤1得到的上清液上样于亲和层析柱,4℃孵育16小时;②用60mL PBS缓冲液(pH7.2、10mM)洗涤柱子;③用30mL洗脱缓冲液洗脱目的蛋白,收集过柱后溶液。
洗脱缓冲液:取甘氨酸7.5g,溶于水并用水定容至500mL,用盐酸调pH至3.0。
3、取步骤2得到的过柱后溶液,用超滤浓缩管浓缩并将体系置换为PBS缓冲液(pH7.2、10mM),得到1mL抗体溶液(抗体浓度约为5mg/mL)。
重组质粒THA-1-Fc进行步骤二,得到的抗体溶液命名为THA-1-Fc抗体溶液。
重组质粒THA-2-Fc进行步骤二,得到的抗体溶液命名为THA-2-Fc抗体溶液。
重组质粒THA-3-Fc进行步骤二,得到的抗体溶液命名为THA-3-Fc抗体溶液。
实施例3、纳米抗体-Fc融合蛋白对SARS-CoV-2以及其他沙贝病毒的中和活性的检测
7种新型冠状病毒毒株的膜蛋白来源如下:
野生型新型冠状病毒(Genbank:MN908947.3);
新型冠状病毒Alpha株(GISAID:EPI_ISL_601443),包含9个突变:69-70del、144del、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H;B.1.1.7;
新型冠状病毒Beta株(GISAID:EPI_ISL_700450),包含10个突变:L18F、D80A、D215G、242-244del、S305T、K417N、E484K、N510Y、D614G、A701V;B.1.351;
新型冠状病毒Gamma株(GISAID:EPI_ISL_792681),包含12个突变:L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、T1027I、V1176F;P.1。
新型冠状病毒Delta株(GISAID:EPI_ISL_1534938),包含个10个突变:T19R、G142D、156-157del、R158G、A222V、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N;B.1.617.2;
新型冠状病毒Omicron BA.1株(GISAID:EPI_ISL_6752027),包含个34个突变:A67V、69-70del、T95I、G142D、143-145del、211del、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K、L981F;BA.1;
新型冠状病毒Omicron BA.2株(GISAID:EPI_ISL_8515362),包含个29个突变:T19I、24-26del、A27S、G142D、V213G、G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N969K、Q954H;BA.2;
一、假病毒的制备
表达病毒膜蛋白的质粒和骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞,孵育后能够得到具有感染性但没有复制能力的假病毒,其感染性同活病毒相似。骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase,即含有Luciferase的骨架质粒pNL4-3R-E(即文献中的vector with theluciferase gene containing backbone pNL4-3R-E):Wang Q,Liu L,Ren W,Gettie A,Wang H,Liang Q,Shi X,Montefiori DC,Zhou T,Zhang L.Cell Rep.2019。
将病毒(病毒指的是上述7种新型冠状病毒毒株中的任意一种或者5种沙贝病毒毒株的任意一种)的膜蛋白的编码基因插入pcDNA3.1(+)载体的BamH II和EcoR I酶切位点之间,得到表达病毒膜蛋白的质粒。将表达膜蛋白的质粒和骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞,37℃静置孵育(采用含10%胎牛血清的DMEM培养基),转染60小时后收集细胞培养上清,即为含有相应假病毒的病毒液。
野生型新型冠状病毒中,膜蛋白如序列表的序列12所示。新型冠状病毒膜蛋白的编码基因如序列表的序列13所示时(编码序列表的序列12所示的蛋白质),进行上述步骤,得到野生型新型冠状病毒假病毒。在序列表的序列13的基础上增加各种突变(新型冠状病毒Alpha株的相应突变见表1,新型冠状病毒Beta株的相应突变见表2,新型冠状病毒Gamma株的相应突变见表3,新型冠状病毒Delta株的相应突变见表4),然后作为病毒膜蛋白的编码基因,进行上述步骤,分别得到新型冠状病毒Alpha株假病毒、新型冠状病毒Beta株假病毒、新型冠状病毒Gamma株假病毒、新型冠状病毒Delta株假病毒。新型冠状病毒OmicronBA.1株膜蛋白的编码基因如序列表的序列14所示,进行上述步骤,得到新型冠状病毒Omicron BA.1株假病毒。新型冠状病毒Omicron BA.2株膜蛋白的编码基因如序列表的序列15所示,进行上述步骤,得到新型冠状病毒Omicron BA.2株假病毒。
表1
蛋白质突变 | DNA突变(相对应于序列13的位置) |
69-70del(缺失两个氨基酸残基“HV”) | 缺失205-210位的“CACGTG” |
144del(缺失一个氨基酸残基“Y”) | 缺失430-432位的“TAT” |
N501Y(一个氨基酸残基突变) | 1501位的“A”突变为“T” |
A570D(一个氨基酸残基突变) | 1709位的“C”突变为“A” |
D614G(一个氨基酸残基突变) | 1841位的“A”突变为“G” |
P681H(一个氨基酸残基突变) | 2042位的“C”突变为“A” |
T716I(一个氨基酸残基突变) | 2147位的“C”突变为“T” |
S982A(一个氨基酸残基突变) | 2944-2945位的“AG”突变为“GC” |
D1118H(一个氨基酸残基突变) | 3352位的“G”突变为“C” |
表2
蛋白质突变 | DNA突变(相对应于序列13的位置) |
L18F(一个氨基酸残基突变) | 52位的“C”突变为“T”,54位的“G”突变为“C” |
D80A(一个氨基酸残基突变) | 239位的“A”突变为“C” |
D215G(一个氨基酸残基突变) | 644位的“A”突变为“G” |
242-244del(缺失三个氨基酸残基) | 缺失724-732位的“CTGGCCCTG” |
S305T(一个氨基酸残基突变) | 914位的“G”突变为“C” |
K417N(一个氨基酸残基突变) | 1251位的“G”突变为“C” |
E484K(一个氨基酸残基突变) | 1450位的“G”突变为“A” |
N501Y(一个氨基酸残基突变) | 1501位的“A”突变为“T”,1503位的“T”突变为“C” |
D614G(一个氨基酸残基突变) | 1841位的“A”突变为“G” |
A701V(一个氨基酸残基突变) | 2102-2103位的“CC”突变为“TG” |
表3
表4
蛋白质突变 | DNA突变(相对应于序列13的位置) |
T19R(一个氨基酸残基突变) | 55位的“A”突变为“C”,56位的“C”突变为“G” |
G142D(一个氨基酸残基突变) | 425位的“G”突变为“A” |
156-157del(缺失两个氨基酸残基) | 缺失467-472位的“AGTTCC” |
R158G(一个氨基酸残基突变) | 474位的“C”突变为“T” |
A222V(一个氨基酸残基突变) | 665位的“C”突变为“T” |
L452R(一个氨基酸残基突变) | 1355位的“T”突变为“G” |
T478K(一个氨基酸残基突变) | 1433位的“C”突变为“A” |
D614G(一个氨基酸残基突变) | 1841位的“A”突变为“G” |
P681R(一个氨基酸残基突变) | 2041-2043位的“CCT”突变为“AGA” |
D950N(一个氨基酸残基突变) | 2848位的“G”突变为“A”,2850位的“C”突变为“T” |
SARS-CoV-1的膜蛋白如序列表的序列16所示,膜蛋白的编码基因如序列表的序列17所示,进行上述步骤,得到SARS-CoV-1假病毒。Pangolin CoV GD的膜蛋白如序列表的序列18所示,膜蛋白的编码基因如序列表的序列19所示,进行上述步骤,得到Pangolin CoVGD假病毒。Pangolin CoV GX的膜蛋白如序列表的序列20所示,膜蛋白的编码基因如序列表的序列21所示,进行上述步骤,得到Pangolin CoV GX假病毒。Bat CoV WIV16的膜蛋白如序列表的序列22所示,膜蛋白的编码基因如序列表的序列23所示,进行上述步骤,得到BatCoVWIV16假病毒。Bat CoV RaTG13的膜蛋白如序列表的序列24所示,膜蛋白的编码基因如序列表的序列25所示,进行上述步骤,得到Bat CoV RaTG13假病毒。
二、单克隆抗体的中和活性检测
供试抗体为:THA-1-Fc(实施例2中制备的THA-1-Fc抗体溶液)、THA-2-Fc(实施例2中制备的THA-2-Fc抗体溶液)或THA-3-Fc(实施例2中制备的THA-3-Fc抗体溶液)。
1、采用含10%FBS的DMEM培养基将供试抗体进行稀释,得到稀释液。
2、将100μl步骤1得到的稀释液与50μl步骤一制备的病毒液(病毒含量为100TCID50)混合,37℃静置孵育1小时。设置用100μl含10%FBS的DMEM培养基代替100μl稀释液的空白对照。
3、完成步骤2后,加入50μl hACE2-hela细胞悬液(约含2×104个细胞),37℃静置孵育48小时。
4、完成步骤3后,加入100μl PBS缓冲液和50μl细胞裂解液(Bright-GloTMLuciferase Assay System,Promega,E2650),静置2min,然后用化学发光仪检测荧光素酶活性。
每种处理设置3个复孔,结果取平均值。
中和活性=(空白对照组的荧光强度-加入稀释液的实验组的荧光强度)/空白对照组的荧光强度×100%。
中和活性为50%时对应的抗体浓度即为IC50值。
THA-1-Fc、THA-2-Fc和THA-3-Fc三个抗体对野生型新型冠状病毒以及自然变异株均具有强中和能力,IC50值结果见表5。表5中,数据单位为μg/ml。表5中,N.D.代表THA-2-Fc和THA-3-Fc对Omicron BA.2无中和活性。
THA-1-Fc、THA-2-Fc和THA-3-Fc三个抗体对其他5个沙贝病毒均具有强中和能力,IC50值结果见表6。表6中,数据单位为μg/ml。
表5
表6
抗体 | SARS-CoV-1 | Pangolin CoV GD | Pangolin CoV GX | Bat CoV WIV16 | Bat CoV RaTG13 |
THA-1-Fc | 0.0260 | 0.0220 | 0.0793 | 0.0541 | 0.0170 |
THA-2-Fc | 0.0176 | 0.0157 | 0.0259 | 0.0227 | 0.0102 |
THA-3-Fc | 0.0356 | 0.0256 | 0.0231 | 0.0354 | 0.0287 |
实施例4、纳米抗体的制备
一、重组表达载体的构建
1、在pVRC8400载体的NotI和BamHI酶切位点插入序列表的序列26所示的双链DNA分子,得到pVRC8400-His tag载体。序列表的序列26中,第1-57位核苷酸编码信号肽,第58-65位核苷酸组成NotI酶切识别序列,第81-86位核苷酸组成NheI酶切识别序列,第87-104位核苷酸编码His6标签,第105-107位核苷酸为终止密码子。
2、将pVRC8400-His tag载体中NotI和NheI酶切识别序列中的小片段(含NotI酶切识别序列和NheI酶切识别序列,即GCGGCCGCGGAGGTGGAGGTAGTGCTAGC)替换为序列表的序列6所示的双链DNA分子,得到重组质粒THA-1。重组质粒THA-1表达如下融合蛋白,自N端至C端依次由信号肽、序列5所示蛋白区段(THA-1纳米抗体)和His6标签组成。在细胞中信号肽被切除,剩余如下活性蛋白,自N端至C端依次由序列5所示蛋白区段(THA-1纳米抗体)和His6标签组成。
3、将pVRC8400-His tag载体中NotI和NheI酶切识别序列中的小片段(含NotI酶切识别序列和NheI酶切识别序列,即GCGGCCGCGGAGGTGGAGGTAGTGCTAGC)替换为序列表的序列8所示的双链DNA分子,得到重组质粒THA-2。重组质粒THA-2表达如下融合蛋白,自N端至C端依次由信号肽、序列7所示蛋白区段(THA-2纳米抗体)和His6标签组成。在细胞中信号肽被切除,剩余如下活性蛋白,自N端至C端依次由序列7所示蛋白区段(THA-2纳米抗体)和His6标签组成。
4、将pVRC8400-His tag载体中NotI和NheI酶切识别序列中的小片段(含NotI酶切识别序列和NheI酶切识别序列,即GCGGCCGCGGAGGTGGAGGTAGTGCTAGC)替换为序列表的序列10所示的双链DNA分子,得到重组质粒THA-3。重组质粒THA-3表达如下融合蛋白,自N端至C端依次由信号肽、序列9所示蛋白区段(THA-3纳米抗体)和His6标签组成。在细胞中信号肽被切除,剩余如下活性蛋白,自N端至C端依次由序列9所示蛋白区段(THA-3纳米抗体)和His6标签组成。
二、制备纳米抗体蛋白
重组质粒分别为:重组质粒THA-1、重组质粒THA-2或重组质粒THA-3。
1、将步骤一制备的重组质粒转染293F细胞,然后采用SMM 293-TII培养基培养72h,然后4℃、4000rpm离心30min,收集上清液。
2、亲和层析
亲和层析的层析柱规格:长度3cm,内径1cm;
亲和层析的柱填料:镍柱beads(购自Qiagen公司,产品目录号为30230)。
依次进行如下操作步骤:①将200ml步骤1得到的上清液上样于亲和层析柱,4℃孵育3小时;②用100mL含20mM咪唑的HEPEs buffer(pH7.2、1M)洗涤柱子;③用30mL含500mM咪唑的HEPEs buffer(pH7.2、1M)洗脱目的蛋白,收集过柱后溶液。
3、取步骤2得到的过柱后溶液,用超滤浓缩管浓缩并将体系置换为PBS缓冲液(pH7.2、10mM),得到1mL抗体溶液(抗体浓度约为4mg/mL)。
重组质粒THA-1进行步骤二,得到的抗体溶液命名为THA-1抗体溶液。
重组质粒THA-2进行步骤二,得到的抗体溶液命名为THA-2抗体溶液。
重组质粒THA-3进行步骤二,得到的抗体溶液命名为THA-3抗体溶液。
实施例5、纳米抗体对SARS-CoV-2以及SARS-CoV-1的中和活性的检测
供试假病毒分别为:实施例3制备的野生型新型冠状病毒假病毒或SARS-CoV-1假病毒。
供试抗体分别为:THA-1(实施例4中制备的THA-1抗体溶液)、THA-2(实施例4中制备的THA-2抗体溶液)或THA-3(实施例4中制备的THA-3抗体溶液)。
检测供试抗体的中和活性,方法同实施例3的步骤二。
结果见图3和图4。
THA-1、THA-2和THA-3三个抗体对野生型新型冠状病毒以及SARS-CoV-1均具有强中和能力,针对野生型新型冠状病毒的IC50值结果依次为0.227、0.178和0.254μg/ml,针对SARS-CoV-1病毒的IC50值结果依次为0.026、0.018和0.036μg/ml。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.3种抗体中的任意一种或任意组合;
所述3种抗体为:THA-1抗体、THA-2抗体和THA-3抗体;
所述THA-1抗体包括框架区FR和互补决定区CDR;所述THA-1抗体中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列5中第26-33位、第51-58位、第97-116位氨基酸残基;所THA-1抗体中的FR1、FR2、FR3和FR4依次为序列表的序列5中第1-25位、第34-50位、第59-96位、第117-127位氨基酸残基;
所述THA-2抗体包括框架区FR和互补决定区CDR;所述THA-2抗体中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列7中第26-33位、第51-58位、第97-114位氨基酸残基;所述THA-2抗体中的FR1、FR2、FR3和FR4依次为序列表的序列7中第1-25位、第34-50位、第59-96位、第115-125位氨基酸残基;
所述THA-3抗体包括框架区FR和互补决定区CDR;所述THA-3抗体中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列9中第26-33位、第51-58位、第97-114位氨基酸残基;所述THA-3抗体中的FR1、FR2、FR3和FR4依次为序列表的序列9中第1-25位、第34-50位、第59-96位、第115-125位氨基酸残基。
2.3种抗体中的任意一种或任意组合;
所述3种抗体为:THA-1-Fc抗体、THA-2-Fc抗体和THA-3-Fc抗体;
所述THA-1-Fc抗体自N端至C端包括如下区段:THA-1抗体、Fc;
所述THA-2-Fc抗体自N端至C端包括如下区段:THA-2抗体、Fc;
所述THA-3-Fc抗体自N端至C端包括如下区段:THA-3抗体、Fc;
THA-1抗体为权利要求1中所述的THA-1抗体;THA-2抗体为权利要求1中所述的THA-2抗体;THA-3抗体为权利要求1中所述的THA-3抗体。
3.3种基因中的任意一种或任意组合;
所述3种基因为:编码THA-1抗体的基因、编码THA-2抗体的基因、编码THA-3抗体的基因;
THA-1抗体为权利要求1中所述的THA-1抗体;THA-2抗体为权利要求1中所述的THA-2抗体;THA-3抗体为权利要求1中所述的THA-3抗体。
4.3种基因中的任意一种或任意组合;
所述4种基因为:编码THA-1-Fc抗体的基因、编码THA-2-Fc抗体的基因、编码THA-3-Fc抗体的基因;
THA-1-Fc抗体为权利要求2所述的THA-1-Fc抗体;THA-2-Fc抗体为权利要求2所述的THA-2-Fc抗体;THA-3-Fc抗体为权利要求2所述的THA-3-Fc抗体。
5.权利要求1或2所述抗体或抗体组合在制备用于抑制冠状病毒的药物中的应用。
6.一种用于抑制冠状病毒的药物,其活性成分为权利要求1或2所述抗体或抗体组合。
7.权利要求1或2所述抗体或抗体组合在制备用于中和冠状病毒的药物中的应用。
8.一种用于中和冠状病毒的药物,其活性成分为权利要求1或2所述抗体或抗体组合。
9.权利要求1或2所述抗体或抗体组合在制备用于预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病的药物中的应用。
10.一种用于预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病的药物,其活性成分为权利要求1或2所述抗体或抗体组合。
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CN116284359B (zh) * | 2023-02-11 | 2024-07-09 | 四川大学 | 两种靶向新冠病毒s2亚基茎螺旋表位的中和纳米抗体及其潜在应用 |
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