CN111057145B - 猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体及其应用。所述的纳米抗体命名为Nb12，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明将截短表达的Nsp2重组蛋白免疫骆驼后分离骆驼外周血淋巴细胞利用RT‑PCR扩增经过免疫的双峰驼VHH基因，将其连入pCANTAB 5E噬菌体载体，构建双峰驼重链抗体可变区文库，利用噬菌体展示技术经过3轮淘选，共筛选到44株Nsp2特异性纳米抗体，试验证明这些纳米抗体能够与Nsp2蛋白特异性反应，其中Nb12有较强的结合力。抗病毒试验结果表明在接毒量为0.01个MOI时，纳米抗体Nb12在PAM细胞和Marc‑145细胞上均显示出对病毒复制的抑制作用。因此，本发明的提出为后续PRRSV Nsp2的研究以及PRRSV的防控和诊断提供了新的技术手段。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种纳米抗体以及应用，特别涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体及其应用，本发明属于生物技术领域。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由 PRRS病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的病毒性传染病，该病在临床上主要引起母猪流产以及各年龄段猪的呼吸系统疾病，给养猪业造成不可挽回的经济损失。由于PRRSV具有高度变异性和抗体依赖的增强作用，现有的疫苗并不能给猪群提供完全的免疫保护，因此有必要尝试研究新型抗病毒策略。PRRSV的非结构蛋白2(Nonstructural protein 2，Nsp2)是PRRSV最大的非结构蛋白，它的顺式结构和反式结构都具有蛋白酶活性，对病毒的毒力至关重要，是研发抗PRRSV药物的理想靶标蛋白。
纳米抗体(Nanobody)具有分子量小、结构稳定、可溶性好、特异性强、生产成本低以及可以识别特殊抗原表位等优点。目前已有针对多种人类病毒纳米抗体的相关报道，研究结果显示其具有良好的临床应用前景，例如针对呼吸道合胞病毒的 ALX-0171，是第一个处于临床阶段的抗病毒纳米抗体药物。与之相反在动物病毒疾病中纳米抗体鲜见报道。
因此，本发明以Nsp2为靶标蛋白，选取保守性较强的蛋白酶段和B细胞表位段作为免疫原免疫骆驼，利用噬菌体展示技术筛选具有高亲和力的针对PRRSV Nsp2的特异性纳米抗体，并对其进行鉴定，为后续PRRSV Nsp2的研究以及PRRSV 的防控和诊断提供新的技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体及其在抗猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(Nsp2)的纳米抗体，本发明将截短表达的Nsp2重组蛋白免疫骆驼后分离骆驼外周血淋巴细胞利用RT-PCR 扩增经过免疫的双峰驼VHH基因，将其连入pCANTAB 5E噬菌体载体，构建双峰驼重链抗体可变区文库，利用噬菌体展示技术经过3轮淘选，共筛选到44株Nsp2 特异性纳米抗体，试验证明这些纳米抗体能够与Nsp2蛋白特异性反应，其中Nb11、 Nb12和Nb60与Nsp2有较强的结合力，被选用于下一步抗病毒试验的研究。我们分别在PAM细胞和Marc-145细胞开展了病毒感染实验，选取了本实验室分离的高致病性PRRSV HuN4株，试验表明在接毒量为1个MOI时纳米抗体没有显示出抗病毒效果，减小接毒量至0.01个MOI后，在PAM细胞和Marc-145细胞上均显示出对病毒复制的抑制作用。
因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2 蛋白纳米抗体，所述的纳米抗体命名为Nb12，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
编码所述纳米抗体的多核苷酸以及含有所述多核苷酸的表达载体也在本发明的保护范围之内。其中，优选的，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
进一步的，本发明还提出了所述的纳米抗体、编码所述纳米抗体的多核苷酸以及含有所述多核苷酸的表达载体在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒试剂中的用途。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明选取纳米抗体而非单链抗体或Fab段，是因为纳米抗体具有其他类型抗体所不具备的优势：分子量小、结构稳定、可溶性好、特异性强、生产成本低以及可以识别特殊抗原表位。本发明发明人先期纯化了骆驼IgG，SDS-PAGE结果显示，双峰驼IgG存在两种重链，一类分子量与传统IgG重链分子量一致(55ku左右)，另外一类分子量为43ku左右，与此前报道的HcAb的重链大小一致。本发明利用可溶性Nsp2重组蛋白结合佐剂免疫双峰驼，经过4次免疫后，骆驼血液中Nsp2特异性抗体的ELISA效价高达1:128 000，说明可溶性Nsp2重组蛋白具有较好的免疫原性，机体对其产生了较强的体液免疫反应。
在构建VHH噬菌体展示文库时，由于这类纳米抗体与人源VH有很高的同源性，为避免VH的干扰，本发明利用套式PCR经两轮扩增后，将其克隆入pCANTAB 5E载体，获得了库容为6.5×107的骆驼VHH噬菌体展示文库，该库容量可以满足后续淘选实验，且序列分析结果表明文库具有较好的多样性。纳米抗体与传统的VH 最显著的区别在于FR2区的4个氨基酸的替换(Val37Phe/Tyr,Gly44Glu/Gln,Leu45Arg 和Trp47Gly/Phe/Leu，序号之前为VH的保守氨基酸，之后为VHH特有的亲水性氨基酸)，本发明筛选到了44株纳米抗体，随机选取8株，发现它们在FR2区均存在典型的亲水氨基酸的替换，这些亲水氨基酸增加了VHH的水溶性，对其溶解性和稳定性起到重要作用。此外，这选取的8株纳米抗体在CDR1区和CDR3区分别含有1个半胱氨酸，在此前报道中显示，这对半胱氨酸可以形成二硫键，从而稳定抗原结合区的构象。
在鉴定实验中，筛选到的Nsp2特异性纳米抗体与同样带有His标签的PRRSV Nsp1α蛋白、PRV gE蛋白和PCV2 cap蛋白均不能发生反应，表明筛选到的纳米抗体具有高度的特异性，可以满足其作为诊断和治疗用抗体的要求；同时检测了44 株特异性纳米抗体的效价，结果显示Nb11、Nb12和Nb60与Nsp2重组蛋白具有更高的结合力。本发明成功运用噬菌体展示技术筛选到44株PRRSV Nsp2特异性纳米抗体，不仅可为Nsp2蛋白的研究提供物质基础，还可通过后续标记建立检测方法或进行抗病毒研究，应用于PRRS的检测或防控。
附图说明
图1为基因片段的PCR产物；
1:DL 2000DNA Marker；2:PCR产物；3:水对照；
图2为pET-NSP2重组质粒的鉴定；
其中：1:DL 2000DNA Marker；2:EcoRI and BamHI双酶切；3:DL 15000DNAMarker；
图3为重组pET-NSP2质粒在E.coli BL21中的表达；
其中：1:蛋白分子量Mark；2:pET-30a空载体对照(IPTG诱导4小时)； 3:pET-NSP2诱导之前表达蛋白；4:pET-NSP2 IPTG诱导2小时后的表达蛋白；5: pET-NSP2 IPTG诱导3小时后的表达蛋白；6:pET-NSP2 IPTG诱导4小时后的表达蛋白；7:pET-NSP2 IPTG诱导5小时后的表达蛋白；8:pET-NSP2 IPTG诱导上清； 9:pET-NSP2 IPTG诱导沉淀；
图4为表达重组蛋白的Western blot检测；
其中：1:蛋白分子Marker；2:纯化后的重组蛋白；3:pET-30a/BL21(DE3) 空载体阴性菌诱导后；
图5为噬菌体ELISA检测筛选过程中特异性噬菌体的富集；
图6为8株纳米抗体的氨基酸比对；
图7为ELISA检测Nsp2特异性纳米抗体的特异性(A)和结合力(B)；
图8为pCAGGS-HA-Nsp2载体构建；
其中：(A)Nsp2基因的PCR扩增；(B)pCAGGS-Nsp2的载体图谱；
图9为pEGFP-N2-NbX载体图谱；
图10为胞内纳米抗体与Nsp2的相互作用；
其中：(A)荧光显微镜下观察结果；(B)免疫共沉淀结果；
图11为胞内纳米抗体在PAM细胞中对病毒复制的影响；
其中：(A)荧光显微镜观察纳米抗体表达情况；(B)用Q-PCR检测细胞感染病毒后N蛋白的变化水平；
图12为胞内纳米抗体在Marc-145细胞中对病毒复制的影响。
其中：(A)荧光显微镜观察纳米抗体表达情况；(B)用Q-PCR检测细胞感染病毒后N蛋白的变化水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1表达诊断抗原重组质粒pET-NSP2的构建及重组抗原蛋白的表达鉴定
1方法
1.1PRRSV HuN4毒株的培养
以0.25％胰蛋白酶消化Mark-145细胞，加入含6％小牛血清的MEM生长液分装克氏瓶静止培养，24小时贴壁后换为含3％犊牛血清的MEM维持液。待细胞形成单层后，倾去培养液。将冻干的PRRSV HuN4种毒以维持液稀释后，取10ml加于细胞单层上37℃吸附30分钟，补加100ml维持液，37℃继续培养。
1.2病毒RNA提取
将病毒培养物反复冻融三次，取病毒原液300μl，加TriZol(购自上海生工公司)600μl，剧烈摇晃数次，加入900μl三氯甲烷，于4℃，12 000g离心5分钟，小心抽取上层液体，置于微量离心管中，加入等量的异丙醇，混匀，于－20℃以下保存备用。未接毒的Marc-145细胞RNA也以同法制备。
1.3引物的设计与合成
引物序列见表1，引物由宝生物(大连)公司合成。
表1NSP2蛋白基因引物
Figure RE-RE-GDA0002411634340000051
1.4cDNA的合成与PCR
用随机引物作为反转录引物，利用禽源反转录酶(AMV)进行反转录，合成 cDNA。以获得的cDNA为模板，以表1所述的引物进行PCR扩增，得到NSP2蛋白基因片段。
1.5表达载体的构建
利用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切pET-30a原核表达载体和得到的 PCR产物，回收NSP2基因和同样处理的pET-30a原核表达载体，然后将二者进行连接，转化至BL21(DE3)感受态菌。碱裂解法小量提取质粒，BamH I和EcoR I 双酶切筛选阳性重组质粒，将阳性质粒命名为pET-NSP2。将鉴定为阳性的质粒送上海博亚生物公司测序。
1.6PRRSV NSP2基因的诱导表达
将含有重组质粒pET-NSP2的BL21(DE3)菌种(命名为pET-NSP2/BL21(DE3)) 在含氨苄青霉素(Kan+)的LB琼脂平板上划线，37℃培养过夜，挑取单个菌落，接种于含Kan+的LB液体培养基中，置37℃摇床培养至OD600为0.6～0.7时，加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，继续于37℃振摇培养4小时，收获细菌。离心后将菌体用含有0.5mol/L NaCl的20mmol/LTris-C1(pH值7.6)洗2次，然后用 PBS悬浮细胞，加入新鲜配制的溶菌酶至终浓度lmg/ml于4℃作用过夜后，在高强度超声波的作用下裂解6次，每次10秒，间隔10秒，然后，离心取上清和沉淀分别加入等体积的2X SDS电泳上样缓冲液裂解细胞，置于沸水中煮沸10分钟，使蛋白质充分变性后进行10％凝胶SDS-PAGE蛋白电泳，具体操作按分子克隆试验指南所述进行。电泳完毕后，用0.25％考马斯亮兰染色液染色2小时，用脱色液脱色后，观察电泳结果，蛋白质大小参照低分子量蛋白标准。
1.7PRRSV Nsp2重组蛋白的western blot检测以及纯化
为了进一步确定该蛋白是否为带有His标签的Nsp2重组蛋白，本实验利用western blot对样品进行检测。使用Ni-NTA亲和层析纯化，取纯化后的蛋白，参考试剂盒说明书测定蛋白浓度。
2结果
2.1PRRSV NSP2基因的鉴定
2.1.1PRRSV HuN4株Nsp2基因的RT-PCR扩增的结果
以接种HuN4株病毒的Marc-145细胞进行病毒RNA的提取，进行反转录，以得到的cDNA为模板进行PCR均扩增出特异性片段，与预期结果相符(如图1)，水对照组没有扩增出条带。因此初步确定已获得Nsp2基因片段(825bp)。
2.1.2重组表达质粒的鉴定结果
将以上扩增的Nsp2基因片段克隆到pET-30a中，所得重组质粒经EcoR I、BamH I双酶切均能获得载体与插入片段两部分(图2)。进一步测序显示，插入表达载体的NSP2编码的基因(SEQ ID NO.1所示)与GenBank上登录的PRRSV(HuN4株) NSP2基因进行序列比较，同源性分析表明，二者核苷酸序列同源性为100％。表明重组表达质粒构建成功，分别命名为pET-NSP2。
2.1.3SDS-PAGE分析
经1.0mmol/L IPTG诱导的pET-NSP2/BL21(DE3)中在2～5小时的表达情况如图3所示，可见NSP2基因获得了融合表达，融合蛋白的相对分子量约为63.5kDa，经超声裂解后在沉淀与上清中均有表达。重组菌诱导4小时后，蛋白表达量与诱导 5小时相差不大，故定诱导4小时为最佳诱导时间。而含空质粒pET-30a的E.coli BL21(DE3)未见蛋白表达。
2.1.4Nsp2重组蛋白在大肠杆菌中的表达纯化与抗原性检测
western blot检测结果如图4所示，图4结果显示，His MAb和PRRSV阳性猪血清均可以特异性识别该条带。用Ni-NTA亲和层析柱对细菌裂解液上清中带有His 标签的Nsp2重组蛋白进行纯化得到了纯度较高的Nsp2重组蛋白。以上结果表明，带有His标签的Nsp2重组蛋白得到了正确的表达，纯化的Nsp2重组蛋白浓度为1.7 mg/mL，蛋白产量约为10mg/L培养基，表达获得的NSP2重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体的筛选及其鉴定
1材料与方法
1.1质粒、菌株和实验动物
BL21(DE3)感受态细胞购自Thermo公司；pCANTAB 5E噬菌体、E.coli TG1和辅助噬菌体M13KO7由西北农林科技大学周恩民教授实验室赠送；6～8周龄 BALB/c小鼠购自北京实验动物中心；成年大棕双峰骆驼购自内蒙古农业大学。
1.2主要试剂
PRRSV抗体阳性猪血清由本实验室保存；鼠源anti-His单克隆抗体(MAb)购自Life Technology公司；山羊抗小鼠IgG/辣根酶标记和山羊抗兔IgG/辣根酶标记购自北京中杉金桥公司；Ni-NTA Agarose购自GE公司；兔抗E-tag多克隆抗体、Protein G纯化介质购自南京金斯瑞公司；HRP标记的鼠抗M13噬菌体单克隆抗体购自Sino Biological公司；
Figure RE-RE-GDA0002411634340000073
Plus Mini RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；
Figure RE-RE-GDA0002411634340000072
PLUS淋巴细胞分离液购自GE公司；Leucosep淋巴细胞分离管购自 Greiner bio-one公司。
1.3鼠抗骆驼抗血清的制备
1.3.1骆驼IgG的纯化
选择成年雄性大棕双峰驼，颈静脉采血，分离血清。用等体积PBS缓冲液1:1 稀释，按照说明书组装层析柱并纯化骆驼IgG。用超微量分光光度计测定每管洗脱液中IgG含量，将浓度大于0.5mg/mL的样品合并，混匀后测定浓度分装，-20℃保存。留取少量样品用SDS-PAGE经考马斯亮蓝染色分析蛋白浓度。
1.3.2动物免疫
取纯化后的骆驼IgG免疫小鼠，与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后，皮下注射，每只剂量为200μL(100μg)，此后每隔两周用弗氏不完全佐剂与抗原充分乳化，腹腔注射加强免疫2次，最后一次免疫后7d，尾静脉采血，分离血清，-20℃保存。
1.3.3抗体滴度测定
用纯化的骆驼IgG作为抗原包被酶标板，用间接ELISA方法根据得到的 OD450nm检测骆驼IgG抗血清抗体效价，免疫前小鼠血清作为阴性对照，若样品孔比阴性孔值大于2.1判定为阳性。
1.4双峰驼免疫及Nsp2抗体效价测定
将5mL Nsp2重组蛋白(1mg/mL，实施例1制备)与等体积弗氏完全佐剂混合并充分乳化，颈部皮下免疫雄性大棕双峰驼，此后每隔两周用弗氏不完全佐剂与抗原充分乳化，使用同样方法加强免疫5次，最后一次免疫后4d采集血清，用ELISA 方法检测骆驼血清中Nsp2抗体效价，免疫前血清作为阴性对照。若样品孔比阴性孔值大于2.1判定为阳性。
1.5VHH噬菌体抗体文库的构建
最后一次免疫后4d，采集200mL抗凝血并用等体积RPMI1640稀释，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，血细胞计数板计数后分装，1×107个细胞/支，直接用于 RNA提取。按照说明书操作步骤提取RNA，反转录为cDNA。根据参考文献[Vincke C,Gutierrez C,Wernery U,et al.Generation of single domain antibody fragments derived from camelidsand generation of manifold constructs[J].Methods Mol Biol,2012, 907:145-176.]及双峰驼VHH基因上下游序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物，由库美生物公司合成，序列如表2所示。
表2VHH片段扩增所用引物
Figure RE-RE-GDA0002411634340000081
注：R＝A/G
第一轮PCR以cDNA为模板，用引物CALL001和CALL002进行。第二轮PCR 扩增以第一轮PCR胶回收产物为模板，用引物VHH-FOR和VHH-REV扩增VHH 基因片段，切取目的条带，用胶回收试剂盒回收，测定浓度用于下一步实验。将VHH 基因片段通过PstⅠ和NotⅠ酶切位点克隆入pCANTAB 5E噬菌体展示载体中，得到 pCANTAB 5E-Nbs质粒。将连接产物电转化TG1感受态细胞，转化产物留取100μL 用于文库鉴定，将剩余培养物均匀涂布于LB/AMP-GLU平板，收集菌苔，-80℃保存。取100μL电转产物，用LB/AMP-GLU培养基10倍梯度稀释，分别取100μL 涂布于LB/AMP-GLU平板，37℃培养8h。计数平板上的菌落，计算转化子数量。随机挑选50个单克隆，通过菌液PCR鉴定。鉴定为阳性的克隆由库美公司测序。用MegAlign软件比对测序结果，鉴定文库多样性。
1.6Nsp2特异性纳米抗体的淘选
取100μL噬菌体展示载体文库扩增培养至对数期，加入M13KO7辅助噬菌体感染，过夜培养离心收集上清，计数重组噬菌体滴度。包被Nsp2重组蛋白抗原，PBS作为无抗原对照，用2％脱脂乳粉稀释重组噬菌体溶液至5×1011pfu/mL，加入酶标板，室温孵育2h后，弃去噬菌体样品，洗涤，每孔加入100μL新鲜配制的0.1 M三乙胺，室温静置10min，吸出洗脱液迅速用等体积1M Tris-HCl(pH 7.4)中和，测定洗脱液噬菌体滴度；扩增洗脱噬菌体用于下一轮筛选；重复上述步骤2次，完成第二轮和第三轮淘选。
1.7重组纳米抗体的诱导表达及ELISA检测
1.7.1重组噬菌体的富集
将Nsp2重组蛋白作为包被抗原，取原始噬菌体库以及每轮筛选后扩增的噬菌体库，用噬菌体ELISA[张国奇.BVDV纳米抗体的筛选、表达及抗病毒效果的研究 [D].石河子.石河子大学]检测特异性重组噬菌体。
1.7.2重组纳米抗体的诱导
取第三轮筛选后洗脱得到的噬菌体，10倍梯度稀释后与对数期TG1细胞混匀静置15min，涂布于LB/AMP-GLU平板，37℃培养8h。随机挑选96个单克隆，分别接种于1mL TB培养基于24孔板中培养，37℃220r/min培养至对数期。每孔加入IPTG诱导过夜。取培养板，离心弃上清，放入-20℃冰箱，冷冻30min。取出室温放置15min，每孔加入500μL PBS，250r/min震荡30min重悬菌体。离心收集上清即为可溶性重组纳米抗体粗提物，用于下一步实验。
1.7.3可溶性重组纳米抗体的ELISA检测
将Nsp2重组蛋白作为抗原包被酶标板，通过间接ELISA方法[Liu Hongliang,Wang Yan,Duan Hong,et al.An intracellularly expressed Nsp9-specific nanobodyin Marc-145cells inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virusreplication[J].Vet Microbiol,2015,181:252-260]检测重组纳米抗体，PBS作为阴性对照，根据OD450nm值判定，若样品孔比阴性孔值大于2.1判定为阳性。
1.7.4Nsp2特异性纳米抗体的鉴定
根据测序结果，用ELISA方法检测阳性纳米抗体的特异性和效价。取Nsp1α重组蛋白(同样带有His标签，表达纯化系统同Nsp2重组蛋白)作为对照组，与Nsp2 重组蛋白同时包被酶标板，鉴定Nsp2纳米抗体特异性；将阳性纳米抗体粗提物倍比稀释，测定Nsp2纳米抗体效价。
1.8Nsp2特异性纳米抗体的测序分析
选择ELISA结果阳性的克隆，交由库美公司测序，用MegAlign软件比对测序结果，根据纳米抗体高变区序列将其分类。
2结果
2.1VHH噬菌体抗体文库的构建
用纯化的Nsp2重组蛋白免疫双峰驼，用间接ELISA方法检测4次免疫后抗体效价，免疫骆驼血清中Nsp2特异性抗体的效价可以达到1:256 000。最后一次免疫后4d采集抗凝血，从200mL血液样品中一共分离到2×108个淋巴细胞。提取细胞总RNA反转录得到cDNA，利用套式PCR经两轮扩增，最终得到了大小约450bp 的目的条带。回收目的条带，将其克隆入噬菌体展示载体pCANTAB 5E，转化TG1 感受态细胞，最终得到库容为6.5×107的VHH噬菌体展示文库。对随机挑选的50 株单克隆进行菌液PCR鉴定，结果显示，96％的克隆含有目的基因的插入。阳性克隆测序结果表明，噬菌体抗体文库多样性良好，可进行下一步淘选工作。
2.2Nsp2特异性纳米抗体的筛选
将Nsp2重组蛋白作为包被抗原筛选特异性纳米抗体。在筛选过程中，通过检测每轮洗脱液中重组噬菌体的滴度来评估特异性VHH重组噬菌体的富集效果。每轮筛选前加入的噬菌体数量记为Input，筛选后从包被Nsp2的酶标孔中收获的噬菌体量记为P，阴性对照孔中收获的噬菌体量记为N，P/Input表示回收率，P/N值越高表示特异性噬菌体所占比例越高。结果显示，在3轮筛选过程中，噬菌体回收率逐轮升高，第三轮筛选后，P/N值可以达到2200(表3)，表明特异性重组噬菌体得到了非常显著的富集。取每轮筛选后扩增的噬菌体溶液进行噬菌体ELISA检测，结果显示，吸光度值呈逐轮增加的趋势(图5)，表明经过3轮筛选后，Nsp2特异性噬菌体得到了明显的富集，与表中数据反映的结果一致。从第三轮筛选后的细菌平板上随机挑取96个单克隆，经扩增诱导后，制备可溶性重组纳米抗体粗提物用于ELISA 检测，初步鉴定纳米抗体克隆与Nsp2重组蛋白的反应性，ELISA结果显示，选取的96个单克隆中有93个阳性克隆(OD450nm值大于PBS对照3倍以上判定为阳性)，表明筛选到的特异性纳米抗体与Nsp2反应性良好。
表3筛选过程中特异性噬菌体的富集情况
Figure RE-RE-GDA0002411634340000101
Figure RE-RE-GDA0002411634340000111
2.4Nsp2特异性纳米抗体的测序鉴定
将ELISA鉴定为阳性的93株克隆进行测序分析，根据抗体高变区氨基酸序列将其分类。进化树分析结果显示阳性克隆中一共包含44株不同的纳米抗体。我们从中抽取序列差异较大的8株抗体序列与人的抗体重链可变区(VH)进行序列比对，从结果图可以看到，所有序列在FR2区均具有纳米抗体典型的亲水氨基酸替换(红色框)(图6)。
我们对44株纳米抗体的特异性进行了分析，ELISA结果表明，44株纳米抗体均可以特异性结合Nsp2重组蛋白，与PRRSV NSP1a蛋白、PRV gE蛋白及PCV2 cap 蛋白没有交叉反应，具有高度特异性。图7A显示，44株纳米抗体均可以特异性结合Nsp2重组蛋白，与Nsp1α重组蛋白没有交叉反应。为了进一步分析44株纳米抗体对Nsp2的结合能力，通过ELISA检测了纳米抗体效价，同时选择一株Nsp2阴性纳米抗体(Nb57)作为阴性对照，结果显示相对于其他纳米抗体，Nb11、Nb12和 Nb60具有更高的结合力(图7B)，其中纳米抗体Nb12的氨基酸序列如SEQ ID NO.3 所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4。
实施例3胞内纳米抗体活性检测及抗病毒功能研究
1材料
1.1质粒、细胞及病毒
pCAGGS载体、pEGFP-N2载体本实验室保存；pET-Nsp2质粒由实施例1构建得到；pCANTAB 5E-Nbs质粒由实施例2构建得到；PAM永生化细胞和Marc-145 细胞本实验室保存)；高致病性PRRSV HuN4(GenBank ID:EF635006)本实验室保存。
1.2主要试剂耗材
鼠抗GFP单克隆抗体购自碧云天公司、鼠抗His单克隆抗体购自TIANGEN公司、鼠抗HA单克隆抗体购自Sigma公司；
Figure RE-RE-GDA0002411634340000112
beads购自Chromotek公司；羊抗鼠IgG(DyLight800)抗体购自赛默飞公司；PCR酶Primer Star购自Takara 公司，限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XHoⅠ购自赛默飞公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Omega公司，RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；反转录试剂盒购自Takara公司；RAPI细胞裂解液购自索莱宝公司；DMEM培养基和Opti-MEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自金源康公司；X-tremeGeneHP DNA转染试剂购自Roche公司；PVDF膜购自Millipore公司；Real time PCR八连管购自Axygen 公司；细胞培养板购自Costar公司。
2方法
2.1载体的构建
2.1.1pCAGGS-HA-Nsp2载体构建
(1)根据上下游序列设计引物，在上下游引物5’端分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，引物序列如下表4所示:
表4pCAGGS-HA-Nsp2载体构建所用引物
Figure RE-RE-GDA0002411634340000121
注：下划线标记的序列为限制性酶切位点。
(2)以pET-Nsp2质粒为模板，用引物HA-Nsp2-F和HA-Nsp2-R扩增Nsp2 基因，反应体系如下：
Figure RE-RE-GDA0002411634340000122
反应程序：95℃预变性5min；95℃30s，58℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保持。
(3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切取目的条带，回收PCR产物，测定回收产物的浓度。
(4)将回收的PCR产物和pCAGGS载体分别用XHoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，反应体系为：
Figure RE-RE-GDA0002411634340000123
Figure RE-RE-GDA0002411634340000131
37℃酶切过夜。
(5)酶切产物直接纯化回收，测定浓度。
(6)用T4 DNA连接酶连接目的片段与载体，反应体系为：
Figure RE-RE-GDA0002411634340000132
16℃连接仪过夜连接。
(7)将连接产物转化DH5α感受态细胞，按照说明书操作进行。取100μL转化产物涂布于LB/AMP平板，置于37℃培养箱中培养8-12h。
(8)挑取菌落形状规则且分散度较好的单菌落，接种于5ml LB/AMP培养基， 37℃220r/min培养6-8h。
(9)送少量菌液样品交酷美公司测序。
(10)选取一株正确的阳性克隆，用去内毒素质粒提取试剂盒按照说明书抽提质粒。
2.1.2pEGFP-N2-NbX表达载体的构建
(1)利用融合PCR方法将纳米抗体基因通过(G3S)3Linker与pEGFP-N2载体融合，所用引物如下表5：
表5pEGFPN2-NbX载体构建所用引物
Figure RE-RE-GDA0002411634340000133
注：下划线标记的序列为限制性酶切位点。
(2)以pCANTAB 5E-NbX质粒为模板，扩增纳米抗体基因，反应体系如下：
Figure RE-RE-GDA0002411634340000134
Figure RE-RE-GDA0002411634340000141
反应程序：95℃预变性5min；95℃30s，58℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保持。
(3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切取目的条带，回收PCR产物，用于下一步实验。
(4)以第一轮PCR产物为模板扩增pEGFPN2-NbX的目的基因。
Figure RE-RE-GDA0002411634340000142
反应程序：95℃预变性5min；95℃30s，58℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保持。
(5)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切取目的条带，回收PCR产物，测定回收产物的浓度。
(6)将第二次PCR回收产物和pEGF-PN2真核表达载体分别用XhoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，酶切反应体系为：
Figure RE-RE-GDA0002411634340000143
37℃酶切过夜。
(7)酶切产物直接纯化回收，测定浓度。
(8)用T4 DNA连接酶连接目的片段与载体，反应体系为：
Figure RE-RE-GDA0002411634340000144
Figure RE-RE-GDA0002411634340000151
16℃连接仪过夜连接。
(9)将连接产物转化DH5α感受态细胞，按照说明书操作进行。取100μL转化产物涂布于LB/AMP平板，置于37℃培养箱中培养8-12h。
(10)挑取菌落形状规则且分散度较好的单菌落，接种于5ml LB/AMP培养基， 37℃220r/min培养6-8h。
(11)送少量菌液样品交库美公司测序。
(12)选取一株正确的阳性克隆，用去内毒素质粒提取试剂盒按照说明书抽提质粒。
2.2胞内表达纳米抗体的活性检测
2.2.1转染HEK293T细胞
接种HEK293T细胞于6孔细胞培养板中，约4×105个细胞/孔，置于37℃、CO2浓度4.9％温箱中培养至60％-80％覆盖度，使用Roche脂质体转染试剂转染，具体步骤：
(1)先将6孔板中的培养基弃掉，轻轻加PBS清洗两遍；
(2)用Opti-MEM培养基换液，每孔500μL；
(3)稀释质粒：在EP管中先加500μL Opti-MEM培养基，2μg pEGFP-NbX质粒和2μgPCAGGS-Nsp2质粒，混匀，静置5min。
(4)各加入10μL转染试剂，涡旋混匀15s，静置15min。
(5)将转染复合物逐滴均匀加入培养孔中，轻轻晃匀，置于37℃CO2浓度4.9％温箱中培养，4-6h后换成2％FBS的DMEM培养基。
2.2.2免疫共沉淀实验检测胞内纳米抗体与Nsp2的相互作用
(1)细胞转染后48h，从培养箱取出，用PBS洗1次，每孔加入150μL Triton-100 (用前加入PMSF和cocktail)，冰上裂解1h(混匀器，4℃)，13000r/min,10min，4℃离心。
(2)洗珠子：每个样品35μL左右，2500r/min，3min离心，预冷PBS洗3遍。
(3)将离心后的上清取50μL留做Input实验，其他全部用于孵育珠子。
(4)将与珠子孵育的样品置于混匀器上，4℃孵育6-8h。
(5)将孵育好的样品300r/min，3min离心弃上清，加入新的预冷PBS洗掉未结合的蛋白，4℃混匀器上作用10-20min，离心弃上清，加入PBS，重复2-3次。
(6)加入50μL左右PBS将珠子悬浮，加LoadingBuffer，煮样。
(7)Western Blot，一抗加鼠抗HA(1：10000)，鼠抗GFP(1：5000)。二抗加抗鼠荧光标记抗体(1：5000)，避光孵育，扫膜观察结果。
2.3胞内纳米抗体对PRRSV HuN4复制的影响
2.3.1胞内表达的Nb11、Nb12和Nb60对PAM细胞感染HuN4的影响
接种PAM细胞于12孔细胞培养板中，置于37℃、CO2浓度4.9％温箱中培养至60％-80％覆盖度，使用Roche脂质体转染试剂转染，具体步骤：
(1)先将12孔板中的培养基弃掉，轻轻加PBS清洗两遍；
(2)用Opti-MEM培养基换液，每孔200μL；
(3)稀释质粒：在EP管中先加200μL Opti-MEM培养基，2μg pEGFP-NbX质粒，混匀，静置5min。
(4)各加入6μL转染试剂，涡旋混匀15s，静置15min。
(5)将转染复合物逐滴均匀加入培养孔中，轻轻晃匀，置于37℃CO2浓度4.9％温箱中培养，4-6h后换成2％FBS的DMEM培养基。
(6)转染24h后在倒置荧光显微镜下观察荧光，然后接毒HuN4 F5， MOI＝0.1/0.01。
(7)接毒24h后收样，提取RNA反转录为cDNA，用N蛋白探针做Q-PCR 实验。
2.3.2胞内表达的Nb11、Nb12和Nb60对Marc-145细胞感染HuN4的影响
接种Marc-145细胞于12孔细胞培养板中，置于37℃、CO2浓度4.9％温箱中培养至60％-80％覆盖度，使用Roche脂质体转染试剂转染，具体步骤：
(1)先将12孔板中的培养基弃掉，轻轻加PBS清洗两遍；
(2)用Opti-MEM培养基换液，每孔200μL；
(3)稀释质粒：在EP管中先加200μL Opti-MEM培养基，2μg pEGFP-NbX质粒，混匀，静置5min。
(4)各加入6μL转染试剂，涡旋混匀15s，静置15min。
(5)将转染复合物逐滴均匀加入培养孔中，轻轻晃匀，置于37℃CO2浓度4.9％温箱中培养，4-6h后换成2％FBS的DMEM培养基。
(6)转染24h后在倒置荧光显微镜下观察荧光，然后接毒HuN4 F5， MOI＝0.01/0.001。
(7)接毒24h后收样，提取RNA反转录为cDNA，用N蛋白探针做Q-PCR 实验。
表5荧光定量PCR所用引物探针
Figure RE-RE-GDA0002411634340000171
以cDNA为模板进行Q-PCR实验，反应体系如下：
Figure RE-RE-GDA0002411634340000172
反应程序：95℃预变性5min；95℃20s，54℃1min，40个循环。
3结果
3.1真核表达载体的构建
3.1.1pCAGGS-HA-Nsp2载体构建
以pET30a-Nsp2质粒为模板，用引物HA-Nsp2-F和HA-Nsp2-R扩增Nsp2基因，大小约825bp(图8A)，通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点连入pCAGGS载体，转化感受态细胞，挑取单克隆菌落送库美公司测序，测序结果显示Nsp2基因无碱基突变，插入位点正确。图8B为pCAGGS-HA-Nsp2真核表达载体结构图。
3.1.2pEGFP-N2-NbX表达载体的构建
利用Overlap PCR将纳米抗体基因(Nb11，Nb12，Nb60，Nb57，Nb93)与EGFP 基因融合，得到大小约1000bp。通过XhoⅠ和EcoRⅠ将融合片段连入pCANTAB 5E 载体，转化感受态细胞，挑取单克隆送库美公司测序。测序结果显示，纳米抗体基因通过(G3S)3Linker与pEGFP-N2载体融合，无碱基突变。图9为pEGFP-N2-NbX 真核表达载体结构图。
3.2胞内纳米抗体与Nsp2相互作用
将pEGFP-N2-Nb11、pEGFP-N2-Nb12和pEGFP-N2-Nb60分别与pCAGGS-Nsp2 共转染HEK293T细胞。转染后48h在倒置荧光显微镜下观察，结果显示绿色荧光蛋白得到高效表达(图10A)，收集细胞裂解，部分作为Input进行Western Blot检测，其余用GFP-beads进行免疫共沉淀实验，目的蛋白分别使用mouse anti-HA和 mouse anti-GFP单克隆抗体检测。结果显示，Nsp2蛋白和NbX蛋白均得到表达，其中，Nb11、Nb12和Nb60均能与Nsp2相互作用(图10B)，表明胞内表达的纳米抗体依然具有结合抗原的活性。
3.3胞内纳米抗体对PRRSV HuN4毒株复制的影响
为了初步检测胞内纳米抗体对HuN4感染PRRSV噬性细胞的影响，本实验将 pEGFP-N2-Nb11、pEGFP-N2-Nb12、pEGFP-N2-Nb57、pEGFP-N2-Nb60以及 pEGFP-N2-Nb93分别转染Marc-145细胞和PAM细胞，然后用不同MOI的HuN4 株感染Marc-145细胞和PAM细胞，接毒24h后，用倒置荧光显微镜观察纳米抗体表达情况，用Q-PCR检测细胞感染病毒后N蛋白的变化水平。结果发现在接毒量为1个MOI时纳米抗体没有显示出抗病毒效果，减小接毒量至0.01个MOI后，在 PAM细胞和Marc-145细胞上均显示出对病毒复制的抑制作用(图11、12)。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
<120> 猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体及其应用
<130> KLPI190300
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 843
<212> DNA
<213> Nsp2
<400> 1
gctgcggaca cctcctttga ttggaatgtt gtgcttcctg gggttgaggc ggcgaatcag 60
acaaccgaac aacctcacgt caactcatgc tgcaccctgg tccctcccgt gactcaagag 120
cctttgggca aggactcggt ccctctgacc gccttctcac tgtccaattg ctattaccct 180
gcacaaggtg acgaggttca tcaccgtgag aggttaaatt ccgtactctc taagttggaa 240
gaggttgtcc tggaagaata tgggctcatg tccactggac ttggcccgcg acccgtgctg 300
ccgagcgggc tcgacgagct taaagaccag atggaggagg atctgctaaa actagccaac 360
acccaggcga cttcagaaat gatggcctgg gcggctgagc aggtcgattt aaaagcttgg 420
gtcaaaagct acccgcggtg gacaccacca ccccctccac caagagttca acctcgaaga 480
acaaagtctg tcaaaagctt gccagagggc aagcctgtcc ctgctccgcg caggaaggtc 540
agatccgatt gcggcagccc ggttttgatg ggcgacaatg tccctaacgg ttcggaagaa 600
actgtcggtg gtcccctcaa ttttccgaca ccatccgagc cgatgacacc tatgagtgag 660
cccgtactta tgcccgcgtc gcgacgtgtc cccaagctga tgacaccttt gagtgggtcg 720
gcaccagttc ctgcaccgcg tagaactgtg acaacaacgc tgacgcacca ggatgagcct 780
ctggatttgc ctgcgtcctc acagacggaa tatgaggctt tccccctagc accatcgcag 840
aac 843
<210> 2
<211> 281
<212> PRT
<213> Nsp2
<400> 2
Ala Ala Asp Thr Ser Phe Asp Trp Asn Val Val Leu Pro Gly Val 15
Glu Ala Ala Asn Gln Thr Thr Glu Gln Pro His Val Asn Ser Cys 30
Cys Thr Leu Val Pro Pro Val Thr Gln Glu Pro Leu Gly Lys Asp 45
Ser Val Pro Leu Thr Ala Phe Ser Leu Ser Asn Cys Tyr Tyr Pro 60
Ala Gln Gly Asp Glu Val His His Arg Glu Arg Leu Asn Ser Val 75
Leu Ser Lys Leu Glu Glu Val Val Leu Glu Glu Tyr Gly Leu Met 90
Ser Thr Gly Leu Gly Pro Arg Pro Val Leu Pro Ser Gly Leu Asp 105
Glu Leu Lys Asp Gln Met Glu Glu Asp Leu Leu Lys Leu Ala Asn 120
Thr Gln Ala Thr Ser Glu Met Met Ala Trp Ala Ala Glu Gln Val 135
Asp Leu Lys Ala Trp Val Lys Ser Tyr Pro Arg Trp Thr Pro Pro 150
Pro Pro Pro Pro Arg Val Gln Pro Arg Arg Thr Lys Ser Val Lys 165
Ser Leu Pro Glu Gly Lys Pro Val Pro Ala Pro Arg Arg Lys Val 180
Arg Ser Asp Cys Gly Ser Pro Val Leu Met Gly Asp Asn Val Pro 195
Asn Gly Ser Glu Glu Thr Val Gly Gly Pro Leu Asn Phe Pro Thr 210
Pro Ser Glu Pro Met Thr Pro Met Ser Glu Pro Val Leu Met Pro 225
Ala Ser Arg Arg Val Pro Lys Leu Met Thr Pro Leu Ser Gly Ser 240
Ala Pro Val Pro Ala Pro Arg Arg Thr Val Thr Thr Thr Leu Thr 255
His Gln Asp Glu Pro Leu Asp Leu Pro Ala Ser Ser Gln Thr Glu 270
Tyr Glu Ala Phe Pro Leu Ala Pro Ser Gln Asn 281
<210> 3
<211> 139
<212> PRT
<213> Nb12
<400> 3
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Met Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val 15
Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ala Cys Val Ala Ser Gly Asn 30
Ile His Ser Lys Cys Arg Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly 45
Lys Glu Arg Glu Leu Val Ser Ser Ile Arg Thr Asp Asp Ser Ser 60
Thr Arg Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Tyr Gln 75
Asn Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys 90
Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Ala Tyr Gly Cys Gly 105
Ser Gly Ser Pro Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 120
Ser Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu 135
Pro Arg Ala Ala 139
<210> 4
<211> 348
<212> DNA
<213> Nb12
<400> 4
atgagggctg tctgtggaat gctacaggcg ttgtggtttg tactggtgac gaaactcagt 60
gttacggtac atgggttcct attgggcttg ctatccctga aaatgagggt ggtggctctg 120
agggtggcgg ttctgagggt ggcggttctg agggtggcgg tactaaacct cctgagtacg 180
gtgatacacc tattccgggc tatacttata tcaaccctct cgacggcact tatccgcctg 240
gtactgagca aaaccccgct aatcctaatc cttctcttga ggagtctcag cctcttaata 300
ctttcatgtt tcagaataat aggttccgaa ataggcaggg tgcattaa 348

Claims (6)

1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV) Nsp2蛋白纳米抗体，所述的纳米抗体命名为Nb12，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述的纳米抗体的多核苷酸。
3.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求2所述的多核苷酸。
4.权利要求1所述的纳米抗体在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒试剂中的用途。
5.权利要求2所述的多核苷酸在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒试剂中的用途。
6.权利要求3所述的表达载体在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒试剂中的用途。
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