TWI579297B - 用於預防豬病感染之混合疫苗 - Google Patents

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Description

用於預防豬病感染之混合疫苗
本發明係關於獸醫學生物製品，尤其係關於用於預防豬生殖及呼吸症候群、豬瘟及豬假性狂犬病毒之活組合疫苗及其製備方法。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張以下3篇中國專利申請案之優先權：2011年5月27日申請之題為「Combination Vaccines for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome and Classical Swine Fever and Uses Thereof」之201110140951.5；2011年10月27日申請之題為「Combination Vaccines for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome and Porcine Pseudorabies Virus and Uses Thereof」之201110331206.9；2011年10月27日申請之題為「Triple Combination Vaccines for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,Classical Swine Fever and Porcine Pseudorabies Virus and Preparation Methods Thereof」之201110331159.8，其均以全文引用的方式併入本文中。
豬生殖及呼吸症候群(PRRS)為對世界各地之養豬業造成威脅的主要傳染病之一。自從2006年中國爆發高病原性豬生殖及呼吸症候群(亦稱為高病原性藍耳病(highly-pathogenic blue ear disease))以來，PRRS已使中國養豬業遭受巨大經濟損失且被中國農業部列為需要強制接種疫苗 之疾病之一。
除PRRS外，豬亦可另外感染其他傳染病，諸如豬瘟(CSF)及假性狂犬病。然而，已知PRRS病毒(PRRSV)在感染其宿主後誘發免疫抑止，且因此通常引起對繼發傳染之免疫反應降低或甚至引起疫苗接種失敗。研究表明PRRSV藉由(例如)破壞對產生免疫反應起重要作用之肺泡巨噬細胞及/或抑止賦予針對繼發傳染之免疫防禦之細胞激素表現來損害宿主免疫系統。舉例而言，已發現PRRSV感染顯著抑制對豬瘟病毒(CSFV)疫苗之宿主免疫反應，甚至引起CSFV疫苗接種失敗(Suradhat,S.等人，Vaccine,24：2634-3642(2006)；Li,H.等人，Veterinary Microbiology,95：295-301(2003))。據報導減毒PRRSV及減毒CSFV之共同疫苗接種(Co-vaccination)具有約60%之低免疫保護率，其無法滿足疫苗接種要求。為接種針對兩種病原體之疫苗，需要間隔14天進行個別疫苗接種(參見例如Du,X.Z.等人，Zhejiang Journal Animal Science and Veterinary Medicine,2：第5-6頁(2011))。作為另一實例，已發現PRRSV不利地影響假性狂犬病毒(PRV)之疫苗接種效果，且顯著降低或延緩對PRV之宿主免疫反應(De Bruin,M.G.M.等人，Veterinary Immunology and Immunopathology,76(1-2)：p125-135(2000))。
PRRSV之免疫抑制傾向於使豬疫苗接種方案複雜化且降低疫苗接種功效及效率。當對豬接種針對PRRSV及其他病毒之疫苗時，通常需要施用重複注射及多劑量，使得疫苗 接種過程耗時、勞動強度大且成本高。此外，在多疫苗接種方案中，遺漏一次疫苗接種可直接影響疫苗之保護功效，而頻繁且重複的疫苗接種會引起免疫麻痹且誘導免疫壓力。
因此，極需要用於PRRSV及其他豬傳染病之無顯著免疫抑制作用之混合疫苗組合物。
本發明之一個態樣係關於疫苗組合物，其包含豬生殖及呼吸症候群病毒(PRRSV)疫苗及第二豬病毒疫苗，其中PRRSV疫苗及第二疫苗實質上不具有針對彼此之免疫抑制作用。在某些實施例中，疫苗組合物另外包含第三豬病毒疫苗，其中PRRSV疫苗、第二疫苗及第三疫苗實質上不具有針對彼此之免疫抑制作用。
在某些實施例中，第二豬病毒疫苗係選自豬瘟病毒(CSFV)疫苗及假性狂犬病毒(PRV)疫苗。在某些實施例中，第三豬病毒疫苗係選自豬瘟病毒(CSFV)疫苗及假性狂犬病毒(PRV)疫苗。第二疫苗與第三疫苗不同。
在某些實施例中，疫苗組合物包含PRRSV疫苗、CSFV疫苗及PRV疫苗，其中PRRSV疫苗、CSFV疫苗及PRV疫苗實質上不具有針對彼此之免疫抑制作用。
在某些實施例中，PRRSV疫苗包含減毒PRRSV。在某些實施例中，減毒PRRSV包含由DNA序列編碼之Nsp2核苷酸，該DNA序列與SEQ ID NO：4相比缺乏包含至少50個相連核苷酸之核苷酸片段，其中該片段與SEQ ID NO：8之等 長度部分具有至少約80%同源性。在某些實施例中，DNA片段包含至少100個、至少120個、至少150個、至少180個、至少200個、至少210個、至少220個、至少230個、至少240個、至少250個、至少260個、至少270個、至少280個、至少290個、至少300個、至少310個、至少320個、至少330個、至少340個、至少350或至少360個相連核苷酸。在某些實施例中，DNA片段與SEQ ID NO：8之等長度部分具有至少約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%同源性。在某些實施例中，DNA片段包含SEQ ID NO：8。
在某些實施例中，減毒PRRSV包含編碼Nsp2蛋白質序列之Nsp2核苷酸，該Nsp2蛋白質序列與SEQ ID NO：11相比缺乏包含至少20個相連胺基酸之肽片段，其中該片段與SEQ ID NO：9之等長度部分具有至少約80%同源性。在某些實施例中，肽片段包含至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少105個、至少110個、至少115個或至少120個相連胺基酸。在某些實施例中，肽片段與SEQ ID NO：9之等長度部分具有至少約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99% 或100%同源性。在某些實施例中，肽片段包含SEQ ID NO：9。
在某些實施例中，減毒PRRSV係自高病原性PRRSV減毒。在某些實施例中，減毒PRRSV包含由DNA序列編碼之Nsp2核苷酸，該DNA序列與SEQ ID NO：5相比缺乏SEQ ID NO：6內的不連續的90個核苷酸。在某些實施例中，Nsp2核苷酸係由與SEQ ID NO：2具有至少90%同源性之序列編碼。在某些實施例中，Nsp2核苷酸係由包含SEQ ID NO：2之序列編碼。
在某些實施例中，減毒PRRSV另外包含Nsp1核苷酸序列，其由與SEQ ID NO：1具有至少90%同源性之序列編碼。在某些實施例中，減毒PRRSV包含由SEQ ID NO：1編碼之Nsp1核苷酸序列及由SEQ ID NO：2編碼之Nsp2核苷酸序列。
在某些實施例中，減毒PRRSV包含由與SEQ ID NO：3具有至少90%同源性之序列編碼之PRRSV核苷酸序列。在某些實施例中，減毒PRRSV包含由SEQ ID NO：3編碼之PRRSV核苷酸序列。在某些實施例中，減毒PRRSV之微生物寄存編號為CGMCC第3121號。
在某些實施例中，CSFV疫苗包含減毒CSFV。在某些實施例中，減毒CSFV係由與SEQ ID NO：10具有至少80%同源性之序列編碼。在某些實施例中，減毒CSFV由SEQ ID NO：10編碼。在某些實施例中，減毒CSFV之微生物寄存編號為CGMCC第3891號。
在某些實施例中，PRV疫苗包含減毒PRV。在某些實施例中，減毒PRV包含與NCBI參考編號為NC_006151之序列具有至少80%同源性之序列。
在某些實施例中，減毒PRV具有選自由TK、PK、RR、dUTPase、gG、gC、gE、gD及gI組成之群的一或多種不活化基因。在某些實施例中，減毒PRV具有不活化gE基因。在某些實施例中，減毒PRV之微生物寄存編號為CGMCC第5076號。
在某些實施例中，本文中提供之疫苗組合物包含免疫有效量之PRRSV疫苗、CSFV疫苗及/或PRV疫苗。在某些實施例中，PRRSV疫苗之免疫有效量為至少104.5 TCID50、105.0 TCID50或105.5 TCID50，CSFV疫苗之免疫有效量為至少100.5 FA-TCID50(螢光抗體TCID50)、101.0 FA-TCID50、101.5 FA-TCID50、102.0 FA-TCID50、102.5 FA-TCID50、103.0 TCID50、103.5 FA-TCID50、104.0 FA-TCID50、104.5 FA-TCID50或105.0 FA-TCID50，或為至少2.5 RID(兔感染劑量)、3 RID、5 RID、10 RID、30 RID、100 RID、150 RID、300 RID、750 RID、1000 RID、3000 RID或7500 RID，及/或PRV之免疫有效量為至少103.0 TCID50、103.5TCID50、104.0TCID50、104.5TCID50、105.0TCID50、105.5 TCID50或106.0 TCID50。
在某些實施例中，混合疫苗中PRRSV疫苗與CSFV疫苗之TCID50比率在10000：1至1：1範圍內。在某些實施例中，混合疫苗中PRRSV疫苗與PRV疫苗之TCID50比率在1：1至 1：30範圍內。在某些實施例中，混合疫苗中PRRSV疫苗：CSFV疫苗：PRV疫苗之TCID50比率在約104：1：105至約5：1：6範圍內。
在某些實施例中，疫苗組合物另外包含佐劑。在某些實施例中，疫苗組合物另外包含低溫保護劑。在某些實施例中，低溫保護劑包含蔗糖、L-麩胺酸鈉及/或乳白蛋白水解產物。
在另一態樣中，本發明提供製備本文中提供之疫苗組合物之方法，其包含：(a)收集PRRSV疫苗株、CSFV疫苗株及/或PRV疫苗株，其在其各別易感細胞中培養，及(b)以合適TCID50比率混合兩種或兩種以上病毒株。
在某些實施例中，PRRSV疫苗株之易感細胞為選自由Marc-145、MA-104、Vero及CL-2621組成之群的細胞株，或為PAM細胞之初代細胞。在某些實施例中，CSFV疫苗株之易感細胞為選自由BT、Vero、MPK、SK6、PK2a、CPK、RKC、MDBK、MDCK、CRFK、ST及PT組成之群的細胞株，或為BT細胞之初代細胞。在某些實施例中，PRV疫苗株之易感細胞為選自由ST、PK-15、Marc-145、MDBK、BT、Vero、BHK-21、豬腎細胞株(IBRS-2)、兔腎細胞株(RK)及雞胚胎纖維母細胞株組成之群的細胞株，或為豬腎初代細胞之初代細胞。
在某些實施例中，培養包含將各疫苗株接種至滾瓶培養物中細胞密度在1×106/ml至5×106/ml範圍內之其易感細胞，或生物反應器中引入有黏著載體之懸浮培養物中細胞 密度在5×106/ml至1×107/ml範圍內之其易感細胞。
在某些實施例中，在以0.01-0.5之感染倍率(MOI)接種PRRSV疫苗株，以0.1-0.5之MOI接種CSFV疫苗株及/或以0.005-0.5之MOI接種PRV疫苗株。
在某些實施例中，步驟(b)包含以10000：1至1：1之TCID50比率混合所收集之PRRSV疫苗病毒與CSFV疫苗病毒。在某些實施例中，步驟(b)包含以1：1至1：30之TCID50比率混合所收集之PRRSV疫苗病毒與PRV疫苗病毒。在某些實施例中，步驟(b)包含以104：1：105至約5：1：6之TCID50比率混合所收集之PRRSV疫苗病毒、CSFV疫苗病毒及PRV疫苗病毒。
在某些實施例中，步驟(b)另外包含混合所收集病毒溶液之混合物與低溫保護劑。在某些實施例中，以75-80：25-20之體積比混合所收集病毒溶液之混合物與低溫保護劑。
在另一態樣中，本發明提供使用本文中提供之方法製備之疫苗組合物。
在另一態樣中，本發明提供本文中提供之疫苗組合物之用途，其係用於製造用以預防或治療PRRS、CSF及/或PR之藥劑。
在另一態樣中，本發明提供對豬進行免疫之方法，其包含向豬投與本文中提供之疫苗組合物。
在另一態樣中，本發明提供CSFV疫苗株，其係於選自由ST、PK-15、Marc-145、MDBK、BT、Vero、BHK-21、豬腎細胞株(IBRS-2)、兔腎細胞株(RK)及雞胚胎纖維母細 胞株組成之群的細胞株或為豬腎初代細胞之初代細胞中培養。在另一態樣中，本發明提供該等細胞株在培養CSFV疫苗株中之用途。
以下描述僅意欲說明本發明之各種實施例。因此，所論述之特定修改不意欲具限制性。熟習此項技術者將顯而易見可在不偏離本文中呈現之標的物之精神或範疇下產生各種等效物、改變及修改，且應理解本文中包括該等等效實施例。本文中引用之所有公開案、專利或專利申請案均以全文引用的方式併入本文中。
本發明之一個態樣係關於疫苗組合物，其包含豬生殖及呼吸症候群病毒(PRRSV)疫苗及第二豬病毒疫苗，其中PRRSV疫苗及第二疫苗實質上不具有針對彼此之免疫抑制作用。
PRRSV為正股RNA病毒，當前已發現其兩種基因型：歐洲基因型及美國基因型。PRRSV之基因組含有多個開放閱讀框架，其中第一開放閱讀框架(ORF1a及ORF1b)含有80% PRRSV基因組序列且編碼PRRSV複製所需的RNA複製酶(Straw等人，Diseases of Swine，第9版，第24章(2006))。ORF1a且ORF1b轉譯為聚合蛋白質，其由其中所含之蛋白酶域分解為若干非結構蛋白質，包括Nsp1-Nsp12(參見例如Vries等人，Seminars in Virology,8：33-47(1997)；Allende等人，Journal of General Virology,80：307-315(1999))。
PRRSV疫苗及第二豬病毒疫苗實質上不具有針對彼此之免疫抑制作用。
如本文中所用之術語「實質上不具有免疫抑制作用」意謂兩種或兩種以上單一疫苗之組合不會引起宿主中對一種單一疫苗或所有單一疫苗之保護性免疫反應實質性降低。如本文中所用之術語「實質性降低」係指降低20%(例如降低30%、40%、50%或60%)。
在某些實施例中，兩種或兩種以上單一疫苗之組合能夠引起與由單一疫苗引起之保護性免疫反應程度相當之對各單一疫苗之保護性免疫反應。舉例而言，PRRSV疫苗及第二豬病毒疫苗之組合可引起與由PRRSV單一疫苗引起之免疫反應程度相當之對PRRSV之免疫反應，及/或可引起與由第二豬病毒單一疫苗引起之免疫反應程度相當之對第二豬病毒疫苗之免疫反應。
保護性免疫反應通常包括體液、細胞及/或黏膜免疫反應，且可使用此項技術中已知的方法表徵。體液免疫反應係藉由血清中產生針對抗原之抗體(例如IgG)而產生。可使用諸如ELISA(酶聯免疫吸附劑分析法)之分析法容易地量測抗體效價。舉例而言，可將病毒抗原塗於固體載體上，接著與疑似含有抗體之樣品接觸，接著測定抗原-抗體複合物之形成。細胞免疫反應通常由產生細胞毒性T淋巴細胞引起，且可經由使用諸如流動式細胞測量術之方法量測T細胞之某些亞群(諸如CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞及CD4+CD8+ T細胞)表徵。簡言之，T細胞用 針對某些表面標記之抗體染色，且根據表面標記之存在分類及定量為不同亞群。黏膜免疫反應通常由黏膜表面上產生之分泌性IgA引起。
在某些實施例中，當以混合疫苗組合物形式投與時，PRRSV疫苗及第二豬病毒疫苗不實質上降低宿主中回應於PRRSV疫苗及/或第二豬病毒疫苗之抗體產量。
在某些實施例中，當以混合疫苗組合物形式投與時，PRRSV疫苗及第二豬病毒疫苗不實質上降低宿主中回應於PRRSV疫苗及/或第二豬病毒疫苗之CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞及/或CD4+CD8+ T細胞含量。
在某些實施例中，PRRSV疫苗包含減毒PRRSV。在本發明中，如本文中所用之「減毒PRRSV」係指會感染宿主但不引起豬生殖及呼吸症候群或具有較少及/或較輕微症狀之PRRSV。減毒PRRSV包括活減毒PRRSV及其不活化產物。如本文中所用之「豬生殖及呼吸症候群」(PRRS)係指感染天然存在之PRRSV後的一系列生理學及病理學症狀。該等症狀尤其包括(但不限於)發熱、嗜眠、厭食、疲乏、呼吸困難、咳嗽、母豬繁殖障礙及小豬生長緩慢或死亡。
在某些實施例中，減毒PRRSV包含由DNA序列編碼之Nsp2核苷酸，該DNA序列與SEQ ID NO：4相比缺乏包含至少50個相連核苷酸之核苷酸片段，其中該片段與SEQ ID NQ：8之等長度部分具有至少約80%同源性。
如本文中所用之術語「由DNA序列編碼」係指可轉錄至相應RNA序列中之DNA序列。單股RNA病毒(諸如PRRSV 及CSFV)具有由單股RNA分子構成之基因組，該單股RNA分子可由基於華生-克立克鹼基配對(Watson Crick base pairing)之DNA分子編碼。該DNA分子在轉錄時可產生正股RNA分子，該正股RNA分子與病毒基因組中之RNA序列一致。
不受理論約束，但預期Nsp2序列中與SEQ ID NO：8同源之部分內缺乏該核苷酸片段可藉由(例如)產生無功能或功能性較低的Nsp2蛋白質及/或不利地影響其他PRRSV蛋白質之表現或功能及/或不利地影響PRRSV之生命週期而降低PRRSV之毒性以及免疫抑制潛力。
缺失片段可具有任何合適長度，只要其可降低PRRSV之毒性以及免疫抑制作用達到足以消除PRRSV毒性及誘導針對PRRSV之保護性免疫而不損害針對其他共同感染病毒或疫苗之免疫性即可。舉例而言，缺失DNA片段可包含至少100個、至少120個、至少150個、至少180個、至少200個、至少210個、至少220個、至少230個、至少240個、至少250個、至少260個、至少270個、至少280個、至少290個、至少300個、至少310個、至少320個、至少330個、至少340個、至少350個或至少360個相連核苷酸。缺失核苷酸片段之長度亦可在由上文提供之任何兩個值所界定之範圍內，如同該等範圍已在本文中明確列舉一般。在某些實施例中，缺失核苷酸片段包含約300個相連核苷酸、約310個、約320個、約330個、約340個、約350個或約360個相連核苷酸。
一般熟習此項技術者可使用此項技術中已知的方法及本發明中提供之方法容易地製備在Nsp2核苷酸序列中與SEQ ID NO：8同源之部分內具有各種缺失的重組病毒，且測試該等重組病毒之活力、毒性及免疫抑制潛力。舉例而言，關於製備在Nsp2中含有缺失之重組型PRRSV及測試其毒性，方法已描述於Kim,Dal-Young等人，Virus Genes,38：118-128(2009)中。關於測試重組PRRSV之免疫抑制作用，方法已描述於Suradhat,S.等人，Vaccine,24：2634-3642(2006)以及本發明之實例中。藉由去除與SEQ ID NO：8同源之部分內的片段(例如去除該部分中之第1個核苷酸至第50個核苷酸、第2個核苷酸至第60個核苷酸、第5個核苷酸至第100個核苷酸等)，可製備包含相關Nsp2核苷酸之重組PRRSV，且進一步測試活重組PRRSV病毒株形成細胞病變斑塊之能力，使得可選擇減毒重組PRRSV病毒株且在豬中進一步測試對於第二豬病毒疫苗的免疫抑制潛力。
在某些實施例中，缺失DNA片段與SEQ ID NO：8之等長度部分具有至少約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%同源性。在某些實施例中，缺失DNA片段包含SEQ ID NO：8。在某些實施例中，缺失DNA片段為SEQ ID NO：8(參見圖1)。
在某些實施例中，減毒PRRSV包含編碼Nsp2蛋白質序列之Nsp2核苷酸，該Nsp2蛋白質序列與SEQ ID NO：11相比 缺乏包含至少20個相連胺基酸之肽片段，其中該肽片段與SEQ ID NO：9之等長度部分具有至少約80%同源性。
如本文中所用之術語「編碼」意謂可根據遺傳密碼子轉譯成胺基酸序列之RNA序列。
不受理論約束，但預期缺乏該肽片段之Nsp2蛋白質之功能性較低或無功能，因此損害PRRSV之毒性且亦降低對第二豬病毒疫苗之免疫抑制。
在某些實施例中，缺失肽片段包含至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少105個、至少110個、至少115個或至少120個相連胺基酸。在某些實施例中，缺失肽片段與SEQ ID NO：9之等長度部分具有至少約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%同源性。在某些實施例中，缺失肽片段包含SEQ ID NO：9。在某些實施例中，缺失肽片段為SEQ ID NO：9(參見圖2)。
可經由Nsp2核苷酸序列測定Nsp2蛋白質中肽片段之缺失。舉例而言，可對Nsp2核苷酸進行定序且轉譯成胺基酸序列，接著與SEQ ID NO：11比對以鑑別缺失肽序列。
如本文中所用之「同源性」或「同源」係指兩個胺基酸序列或兩個核苷酸序列之間的相似性。胺基酸序列或核苷酸序列之間的同源性可使用此項技術中已知的任何合適方 法計算，例如，可將候選胺基酸(核苷酸)序列與參考胺基酸(核苷酸)序列比對(視需要引入間隙)以使得比對序列之間一致胺基酸殘基(核苷酸)之數目最大，由此可計算兩個胺基酸(核苷酸)序列之間一致胺基酸殘基(核苷酸)之百分比。胺基酸(核苷酸)序列之比對及其同源性計算可使用此項技術中已知的軟體實現，例如(但不限於)BLAST程式(可在National Center of Biotechnology Information(NCBI)：http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi網站獲得，或參見例如Altschul S.F.等人，J.Mol.Biol.,215：403-410(1990)；Stephen F.等人，Nucleic Acids Res.,25：3389-3402(1997))；ClustalW2軟體(可在European Bioinformatics Institute：http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/網站獲得，亦參見例如Higgins D.G.等人，Methods in Enzymology,266：383-402(1996)；Larkin M.A.等人，Bioinformatics (Oxford,England),23(21)：2947-8(2007))；及TCoffee軟體等(可在Sweden Bioinformatics Institute：http：//tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi網站獲得，或參見例如Poirot O.等人，Nucleic Acids Res.,31(13)：3503-6(2003)；Notredame C.等人，J.Mol.Boil.,302(1)：205-17(2000))。當使用軟體比對序列時，可根據實際情況使用或調整軟體提供之預設參數，且該等使用或調整處於一般熟習此項技術者之知識範疇內。
在某些實施例中，減毒PRRSV係自高病原性PRRSV減毒。
術語「高病原性PRRSV」係指包含由DNA序列編碼之Nsp2核苷酸的PRRSV，該DNA序列與SEQ ID NO：5相比缺乏SEQ ID NO：6之部分內的不連續的90個核苷酸(亦即SEQ ID NO：5之第1440個核苷酸至第1680個核苷酸之片段)。發現缺乏該90個不連續核苷酸之PRRSV分離株(參見圖3)與PRRSV VR-2332病毒株相比具有較高病原性(參見例如Tian等人，PLoS ONE 2(6)：e526,(2007)doi：10.1371)。在某些實施例中，不連續的90個核苷酸包括SEQ ID NO：5之第1440個核苷酸至第1442個核苷酸之「TTT」及如SEQ ID NO：7所示之序列(參見例如圖4)。
在某些實施例中，高病原性PRRSV包含由包含SED ID NO：4之核苷酸序列(亦即PRRSV TJ病毒株之Nsp2核苷酸序列)之序列編碼的Nsp2核苷酸。在某些實施例中，高病原性PRRSV為PRRSV TJ病毒株，其基因組由GenBank寄存編號為EU860248之序列編碼。
在某些實施例中，減毒PRRSV係自高病原性PRRSV減毒且包含與SEQ ID NO：5相比缺乏不連續的90個核苷酸的Nsp2核苷酸序列，其中該不連續的90個核苷酸在SEQ ID NO：6內。
在某些實施例中，減毒PRRSV之Nsp2核苷酸係由與SEQ ID NO：2(亦即編碼PRRSV TJM病毒株之Nsp2核苷酸之序列)具有至少90%同源性之序列編碼。在某些實施例中，Nsp2核苷酸係由包含SEQ ID NO：2之序列編碼。
在某些實施例中，減毒PRRSV另外包含Nsp1核苷酸序 列，其由與SEQ ID NO：1(亦即編碼PRRSV TJM病毒株之Nsp1核苷酸之序列)具有至少90%同源性的序列編碼。在某些實施例中，減毒PRRSV包含由SEQ ID NO：1編碼之Nsp1核苷酸序列及由SEQ ID NO：2編碼之Nsp2核苷酸序列。
在某些實施例中，減毒PRRSV包含由與SEQ ID NO：3(亦即編碼PRRSV TJM病毒株之基因組之序列)具有至少90%同源性之序列編碼的PRRSV核苷酸序列。在某些實施例中，減毒PRRSV包含由SEQ ID NO：3編碼之PRRSV核苷酸序列。在某些實施例中，減毒PRRSV之微生物寄存編號為CGMCC第3121號(該減毒PRRSV病毒株在本文中亦稱為PRRSV TJM病毒株)。
本文中提供之PRRSV疫苗實質上不具有針對第二豬病毒疫苗之免疫抑制作用。在某些實施例中，第二豬病毒疫苗係選自豬瘟病毒(CSFV)疫苗及假性狂犬病毒(PRV)疫苗。
豬瘟(CSF)為由豬瘟病毒(CSFV)引起之高傳染性及致死性豬傳染病。世界動物衛生組織(World Organization for Animal Health/OIE)將該疾病列入OIE疾病清單作為依法需要報導之疾病。在中國，豬瘟為主要傳染病之一且在「I型、II型及III型動物疾病類別(Category of Type I,II and III Animal Diseases)」中列為I型動物疾病。CSF之爆發及流行對中國及全球養豬業造成極大經濟損失。
豬瘟病毒(CSFV)歸類為病毒之黃病毒科(Flaviviridae family)瘟病毒屬(Pestivirus genus)之成員。CSFV為包膜正股RNA病毒。病毒之基因組全長為12.5 kb，其包含僅一個 大型開放閱讀框架(ORF)，該開放閱讀框架編碼含有約4000個胺基酸且分子量為約438 kD之聚合蛋白質。聚合蛋白質由病毒及宿主蛋白酶進一步加工成12個成熟蛋白質。CSFV之所有結構及非結構蛋白質均由此大型開放閱讀框架編碼。
控制豬瘟之重要工具為疫苗，包括不活化疫苗及減毒疫苗。不活化CSFV疫苗之製備在1950-1960年代達到巔峰，在此期間廣泛使用福馬林(formalin)及結晶紫不活化CSFV疫苗。然而，其由於劑量較大、免疫持續時間短、免疫反應產生緩慢及成本較高之缺點而逐漸被減毒CSFV疫苗所替代。
在某些實施例中，CSFV疫苗為減毒CSFV疫苗。CSFV減毒疫苗株可藉由使CSFV野生株減毒來製備。其他國家之報導顯示可使用不同方法使CSF病毒適應於兔且製備減毒突變病毒株。舉例而言，3種減毒疫苗株被廣泛認可為安全有效且無殘餘病原性：1)中國兔化疫苗株(參見例如Qiu,H.J.等人，Scientia Agricultura Sinica,38(8)：1675-1685(2005))；2)日本GPE(-)細胞減毒疫苗株(參見例如Liu,C.等人，Chinese Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，第10卷，第50-51頁(2004))；及3)法國「Thiveosal」冷減毒疫苗株(參見例如Zhu,L.Q.等人，Chinese Veterinary Journal,39(2)：33-37(2005))。
在某些實施例中，減毒CSFV疫苗為中國兔化疫苗株(C病毒株)。CSFV C病毒株之基因組序列如SEQ ID NO：10所 示。由中國科學家研發之中國CSF兔化疫苗(亦稱為C病毒株)自1957年起已在中國廣泛使用且已引入許多其他國家用於控制或消滅該等國家之豬瘟。此疫苗已被公認為全球最有效的CSFV疫苗株之一。
CSF兔化疫苗(C病毒株)可根據不同製備方法進行分類。第一種方法涉及在兔中製備疫苗。對兔接種CSFV，且自該兔收集淋巴結、脾或組織以製備脾及淋巴組織起源之CSFV疫苗或兔起源之CSFV疫苗。此方法可有效防止外源病毒之污染且確保病毒之遺傳穩定性。然而，需要大量兔子但品質難以控制，且製造成本相對較高。第二種方法涉及使用牛或羊初代細胞或豬細胞株製備疫苗，亦即細胞起源之CSFV疫苗。舉例而言，可藉由使CSF兔化病毒(脾起源)在細胞中進行繼代且藉由連續稀釋進行兩輪純系純化來製備細胞起源之CSFV疫苗。此方法無需使用大量動物。在某些實施例中，CSFV C病毒株為脾及淋巴組織起源之CSFV C病毒株。在某些實施例中，CSFV C病毒株為細胞起源之CSFV C病毒株，其可來源於初代細胞或細胞株。
在某些實施例中，減毒CSFV由與SEQ ID NO：10(亦即編碼CSFV C病毒株之基因組的序列)具有至少80%同源性之序列編碼。在某些實施例中，減毒CSFV由SEQ ID NO：10編碼。
在某些實施例中，減毒CSFV之微生物寄存編號為CGMCC第3891號(該減毒CSFV病毒株在本文中亦稱為 CSFV C病毒株或F16或CSFV C病毒株(F16))。CSFV C病毒株(F16)為細胞起源之CSFV C病毒株。
在某些實施例中，第二豬病毒疫苗為假性狂犬病毒(PRV)疫苗。
PRV屬於疱疹病毒科(family of Herpesvirdae)及α-疱疹病毒亞科(subfamily of Alpherpesvirinae)。當前僅發現PRV之一個血清型。PRV之基因組為雙股DNA，其長度為約150 kb。病毒基因組由獨特的長(UL)區、獨特的短(US)區及側接US區及內部重複序列之末端重複序列構成。迄今為止，已在PRV基因組中定位65個基因且已功能性表徵其中大部分基因。已在UL區中定位56個基因，包括醣蛋白(諸如gB、gC、gH、gK、gL、gM、gN)、胸苷激酶(TK)、鹼性核酸酶(AN)、核糖核苷酸還原酶(RR)、DNA聚合酶(POL)、DBP基因、MCP基因、ICP18.5基因及早期蛋白質0(EP0)等。US區已完全定序，其中已定位7個基因，包括：醣蛋白gD、gE、gG、gI及蛋白激酶(PK)基因、11 kd及28 kd蛋白質基因。
在某些實施例中，PRV疫苗包含減毒PRV。術語「減毒PRV疫苗」係指能夠感染其宿主但不引起假性狂犬病或具有減輕或不太嚴重之症狀的PRV。減毒PRV包括活減毒PRV及其不活化產物。「假性狂犬病」係指由野生型PRV感染引起之一系列生理學及病理學症狀。該等症狀包括(但不限於)流產、死產、弱胎、木乃伊化胎兒、發熱、食慾不振、神經病學症狀、麻痹、系統功能衰竭及甚至死亡。
在某些實施例中，減毒PRV包含與NCBI參考編號為NC_006151之序列具有至少80%同源性的序列，例如具有至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源性。
在某些實施例中，減毒PRV具有與病原性有關的一或多種不活化基因。「不活化」基因係指由於缺乏或缺失完整或部分序列或由於基因中之插入物或突變而使得功能降低或消失之基因。與PRV病原性有關之基因之實例包括(但不限於)TK(例如NCBI基因編號：2952559)、PK(例如NCBI基因編號：2952530或2952561)、RR(例如NCBI基因編號：2952535或2952536)、dUTPase(例如NCBI基因編號：2952537)、gG(例如NCBI基因編號：2952520)、gC(例如NCBI基因編號：2952505)、gE(例如NCBI基因編號：2952517)、gD(例如NCBI基因編號：2952521)及gI(例如NCBI基因編號：2952516)。
在某些實施例中，減毒PRV具有選自由TK、PK、RR、dUTPase、gG、gC、gE、gD及gI組成之群的一或多種不活化基因。在某些實施例中，減毒PRV具有不活化gE基因。在某些實施例中，減毒PRV中僅gE基因為不活化的。在某些實施例中，減毒PRV具有不活化gE基因且另外具有一或多種與病原性有關之不活化基因，例如TK、PK、RR、dUTPase、gG、gC、gD及/或gI。
可使用此項技術中已知的方法獲得減毒PRV疫苗。舉例而言，可藉由使病毒在非豬細胞中或在卵胚胎中繼代或藉 由在高溫下及/或在誘變劑存在下培養病毒來使PRV野生型病毒株之分離株減毒。此項技術中已知許多減毒PRV疫苗，例如Bartha K61病毒株(參見例如Bartha,A.Experiments to reduce the virulence of Aujeszky's virus.Magyar allatorvosok lapja 16,42-45(1961))、BUK病毒株、NIA4病毒株、Alfort病毒株及VGNKI病毒株等。該等減毒PRV疫苗可用於本發明中。舉例而言，野生型或減毒PRV病毒株可經進一步修飾使得與病原性有關的一或多種目標基因不活化但病毒仍能夠複製。此項技術中已知多種藉由遺傳工程改造獲得之減毒PRV疫苗，例如PRV-BUK-d13病毒株(參見例如Kit S.等人，Am.J.Vet.Res.,1985,46(6)：1359-1367)、PRV dlgC/dlTK病毒株(參見例如Kit S.等人，Am.J.Vet.Res.,1987,48(5)：780-793)、S-PRV-002(參見例如美國專利4,514,497)、PRV783病毒株(參見例如Van Oirschot J T等人，Am.J.Vet.Res.,1984,45(10)：2099-2103)、EL-001及PRV376等。
在某些實施例中，減毒PRV缺乏gE基因。在某些實施例中，減毒PRV之微生物寄存編號為CGMCC第5076號(該減毒PRV病毒株在本文中亦稱為PRV Bartha K61病毒株)。
在某些實施例中，減毒PRV另外包含一或多種不影響病毒複製或宿主感染之不活化基因。在某些實施例中，減毒PRV另外包含PRV基因組中不存在的一或多種異源基因。插入之異源基因適用於疫苗之偵測及/或診斷。
在某些實施例中，疫苗組合物另外包含第三豬病毒疫 苗，其中PRRSV疫苗、第二豬病毒疫苗及第三豬病毒疫苗實質上不具有針對彼此之免疫抑制作用。在某些實施例中，第三豬疫苗可選自CSFV疫苗及PRV疫苗，限制條件為第二疫苗與第三疫苗不同。
在某些實施例中，疫苗組合物包含PRRSV疫苗、CSFV疫苗及PRV疫苗，其中PRRSV疫苗、CSFV疫苗及PRV疫苗實質上不具有針對彼此之免疫抑制作用。當組合於疫苗組合物中時，3種疫苗不實質上降低宿主中回應於PRRSV疫苗、CSFV疫苗及/或PRV疫苗之抗體產量及/或T細胞亞群含量。在某些實施例中，PRRSV疫苗包含PRRSV TJM病毒株。CSFV疫苗包含本文中提供之任何減毒CSFV，包括(但不限於)CSFV C病毒株。PRV疫苗包含本文中提供之任何減毒PRV病毒株，例如(但不限於)PRV Bartha K61病毒株。
在某些實施例中，本發明提供疫苗組合物，其包含微生物寄存編號為CGMCC第3121號之PRRSV TJM病毒株及CSFV C病毒株。在某些實施例中，CSFV C病毒株為微生物寄存編號為CGMCC第3891號之CSFV F16。PRRSV TJM病毒株及CSFV C病毒株(F16)不顯示任何針對彼此之免疫抑制或免疫抑止作用。兩種疫苗株均具有優良安全性、免疫原性及特異性，且可提供針對高病原性豬生殖及呼吸症候群及豬瘟(其為豬群中兩種主要流行病)之有效保護。
在某些實施例中，本發明提供疫苗組合物，其包含微生物寄存編號為CGMCC第3121號之PRRSV TJM病毒株及微 生物寄存編號為CGMCC第5076號之PRV Bartha K61病毒株。PRRSV TJM病毒株及PRV Bartha K61病毒株彼此之間不顯示任何免疫抑制或免疫抑止作用。兩種疫苗株均具有優良安全性、免疫原性及特異性，且可提供針對高病原性豬生殖及呼吸症候群及假性狂犬病(其為豬群中兩種主要流行病)之有效保護。
在某些實施例中，本發明提供疫苗組合物，其包含PRRSV TJM病毒株、CSFV C病毒株(F16)及PRV Bartha K61病毒株。PRRSV TJM病毒株、CSFV C病毒株(F16)及PRV Bartha K61病毒株彼此間不顯示任何免疫抑制或免疫抑止作用。3種疫苗株均具有優良安全性、免疫原性及特異性，且可提供針對高病原性豬生殖及呼吸症候群、豬瘟及假性狂犬病(其為豬群中3種主要流行病)之有效保護。
PRRSV TJM病毒株之詳細寄存資訊如下：微生物寄存編號：CGMCC第3121號；分類學名稱：豬生殖及呼吸症候群病毒；寄存地址：中國北京市朝陽區北辰西路1號中國科學院微生物研究所(Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,NO.1 West Beichen Road,Chaoyang District,Beijing,China)；寄存單位：中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center)；及寄存日期：2009年6月15日。
CSFV C病毒株(F16)之詳細寄存資訊如下：微生物寄存編號：CGMCC第3891號；分類學名稱：豬瘟病毒；寄存地址：中國北京市朝陽區北辰西路1號中國科學院微生物 研究所；寄存單位：中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center)；及寄存日期：2010年5月27日。
PRV Bartha K61病毒株之詳細寄存資訊如下：微生物寄存編號：CGMCC第5076號；分類學名稱：假性狂犬病毒；寄存地址：中國北京市朝陽區北辰西路1號中國科學院微生物研究所；寄存單位：中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center)；及寄存日期：2011年7月21日。
在某些實施例中，本文中提供之疫苗組合物包含免疫有效量之PRRSV疫苗、CSFV疫苗及/或PRV疫苗。如本文中所用之術語「免疫有效量」係指足以誘導宿主中針對預期抗原或病原體之保護性免疫反應的疫苗量。舉例而言，免疫有效量可足以減輕或延緩一或多種感染症狀發作、降低受感染宿主之發病率及/或死亡率、誘導足夠量的針對病原體之抗體、增加T細胞亞群含量及其任何組合。保護性免疫反應之表徵及/或定量可使用此項技術中已知的方法進行，例如藉由如上文所描述量測針對病原體之抗體效價及/或T細胞亞群量或藉由觀測毒性病毒攻擊後接種疫苗之豬之臨床症狀。
病毒疫苗之免疫有效量可以病毒效價表徵，例如以50%組織培養物感染劑量(TCID50)表徵。在某些實施例中，PRRSV疫苗之免疫有效量為至少103.0 TCID50、103.5 TCID50、104.0 TCID50、104.5 TCID50、105.0 TCID50或105.5 TCID50。在某些實施例中，PRRSV疫苗之免疫有效量為至少104.5 TCID50、至少105.0 TCID50或至少105.5 TCID50。在某些實施例中，本文中提供之疫苗組合物包含約104.5 TCID50至約106.0 TCID50，或約105.0 TCID50至約106.0 TCID50 PRRSV疫苗。
在某些實施例中，CSFV疫苗之免疫有效量為至少100.5 FA-TCID50(螢光抗體-TCID50)、101.0 FA-TCID50、101.5 FA-TCID50、102.0 FA-TCID50、102.5 FA-TCID50、103.0 FA-TCID50、103.5 FA-TCID50、104.0 FA-TCID50、104.5 FA-TCID50或105.0 FA-TCID50。在某些實施例中，CSFV疫苗之免疫有效量為至少104.0 FA-TCID50/ml。在某些實施例中，本文中提供之疫苗組合物包含約100.5 FA-TCID50至約105.0 FA-TCID50，或約104.0 FA-TCID50至約105.0 FA-TCID50 CSFV疫苗。術語「FA-TCID50」係指由基於螢光抗體之方法測定之TCID50值。
在某些實施例中，CSFV疫苗之免疫有效量為至少2.5 RID、3 RID、5 RID、10 RID、30 RID、100 RID、150 RID、300 RID、750 RID、1000 RID、3000 RID或7500 RID。
在某些實施例中，PRV疫苗之免疫有效量為至少103.0 TCID50、103.5 TCID50、104.0 TCID50、104.5 TCID50、105.0 TCID50、105.5 TCID50或106.0 TCID50。在某些實施例中，PRV疫苗之免疫有效量為至少105.5 TCID50或至少106.0 TCID50。在某些實施例中，本文中提供之疫苗組合物包含 約105.0 TCID50至約106.5 TCID50，或約105.5 TCID50至約106.5 TCID50 PRV疫苗。
可使用此項技術中已知的任何合適方法測定病毒疫苗之TCID50。舉例而言，病毒疫苗(PRRSV疫苗及/或PRV疫苗)可製備為病毒溶液，且可製備病毒溶液之10倍連續稀釋物且接種至種有易感細胞之96孔培養板。可在8個孔中以100微升/孔接種各病毒溶液稀釋物。培養板可置放於培育箱中37℃及5% CO2下且培養4-5天。觀測細胞之細胞病變效應，且依50%組織培養物顯示細胞病變效應時之病毒濃度計算TCID50。該方法之詳細描述可見於Reed LJ,Muench H,A simple method of estimating fifty percent end points.Am J Hyg 1938；27：493-97中。
CSFV為不引起顯著細胞病變效應之病毒，且因此藉由免疫螢光法或兔感染研究測定TCID50。在某些實施例中，藉由免疫螢光法測定CSFV疫苗之FA-TCID50。簡言之，CSFV疫苗株製備為每毫升含1劑量CSFV疫苗株之溶液，且用補充有3.5%血清之DMEM培養基製備10倍連續稀釋物。含有10-1、10-2、10-3、10-4及10-5原始病毒樣品之稀釋物以0.1毫升/孔分別接種至單層BT細胞。培養3-4天後，固定細胞且與CSFV之螢光單株抗體接觸(對於直接免疫螢光法)。反應45-60分鐘後，觀測細胞中螢光之存在，螢光之存在指示病毒之存在。或者，固定細胞可與未經標記之CSFV之單株抗體接觸(對於間接免疫螢光法)，且在反應45-60分鐘後，細胞與螢光標記之二次抗體再反應45-60分 鐘。觀測細胞中螢光之存在，螢光之存在指示病毒之存在。根據里得-明奇法(Reed-Muench method)(參見例如Reed LJ,Muench H,A simple method of estimating fifty percent end points.Am J Hyg 1938；27：493-97)計算FA-TCID50。
在某些實施例中，由兔感染劑量測定CSFV疫苗量。簡言之，CSFV疫苗株製備為每毫升含1劑量CSFV疫苗株之溶液，接著稀釋7500倍以製備測試樣品。向2隻體重為1.5-3 kg的兔子各注射1 ml測試樣品且在最初48小時內每天兩次量測體溫，隨後每6小時量測一次。根據以下準則監測體溫反應且進行分級：1)典型發熱反應(++)：潛伏期為約48-96小時，體溫顯著升高，其中至少3次體溫上升超過正常體溫至少1℃且持續18-36小時；2)輕微發熱反應(+)：潛伏期為約48-96小時，體溫顯著升高，其中至少2次體溫上升超過正常體溫至少0.5℃且持續12-36小時；3)疑似發熱反應(±)：潛伏期為約48-96小時，體溫波動，高溫持續小於12小時或潛伏期為至少24小時，且在48小時內或96至120小時後顯示發熱反應；及4)無發熱反應(-)：體溫正常。若兩隻測試兔子均顯示典型發熱反應(++)，或一隻兔子顯示典型發熱反應(++)而另一隻顯示輕微發熱反應(+)，則確定疫苗量為7500 RID。在兔子顯示難以表徵之其他反應的情況下，可重複測試，但不應重複超過3次。
可以合適比率混合單一病毒疫苗以提供本文中所描述之疫苗組合物。舉例而言，單一病毒疫苗可製備為含有某一 病毒效價(例如某一TCID50)之疫苗株的病毒溶液，且以合適比率混合兩種或兩種以上單一病毒疫苗以得到含有預定量(例如TCID50)或比率之各單一疫苗的混合疫苗。
在某些實施例中，在包含PRRSV疫苗及CSFV疫苗之混合疫苗組合物中，PRRSV疫苗與CSFV疫苗之TCID50比率在10000：1至1：1、1000：1至1：1、100：1至1：1、10：1至1：1或5：1至1：1範圍內。舉例而言，疫苗組合物可包含104.5 TCID50 PRRSV疫苗及100.5 FA-TCID50 CSFV疫苗，或104.5 TCID50 PRRSV疫苗及103.5 FA-TCID50 CSFV疫苗，或105.0 TCID50 PRRSV疫苗及104.0 FA-TCID50 CSFV疫苗。
在某些實施例中，在包含PRRSV疫苗及PRV疫苗之混合疫苗組合物中，PRRSV疫苗與PRV疫苗之TCID50比率在1：1至1：30、1：1至1：25、1：1至1：20、1：1至1：15、1：1至1：10、1：1至1：9、1：1至1：8、1：1至1：7、1：1至1：6、1：1至1：5、1：2至1：10、1：3至1：10、1：4至1：10或1：5至1：10範圍內。舉例而言，疫苗組合物可包含104.5 TCID50 PRRSV疫苗及105.5 TCID50 PRV疫苗，或105.0 TCID50 PRRSV疫苗及105.5 TCID50 PRV疫苗，或105.0 TCID50 PRRSV疫苗及106.5 TCID50 PRV疫苗。
在某些實施例中，在包含PRRSV疫苗、CSFV疫苗及PRV疫苗之混合疫苗組合物中，PRRSV疫苗：CSFV疫苗：PRV疫苗之TCID50比率為約104：1：105至約5：1：6。舉例而言，疫苗組合物可包含104.5 TCID50 PRRSV疫苗、100.5 FA-TCID50 CSFV疫苗及105.5 TCID50 PRV疫苗。作為另一 實例，疫苗組合物可包含104.5 TCID50 PRRSV疫苗、104.0 FA-TCID50 CSFV疫苗及105.5 TCID50 PRV疫苗。作為另一實例，疫苗組合物可包含105.7 TCID50 PRRSV疫苗、105.0 FA-TCID50 CSFV疫苗及105.8 TCID50 PRV疫苗。作為另一實例，疫苗組合物可包含106.0 TCID50 PRRSV疫苗、105.0 FA-TCID50 CSFV疫苗及106.5 TCID50 PRV疫苗。
本文中提供之疫苗組合物可另外包含佐劑。佐劑可保護疫苗免於活體內降解及/或可非特異性地刺激免疫系統，藉此可有助於增強對疫苗之免疫反應。佐劑之實例包括(但不限於)無機鹽(例如氫氧化鋁、磷酸鋁、氫氧化鈣)、油包水乳液(例如傅氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant)、傅氏不完全佐劑(incomplete Freund's adjuvant)等)、皂素佐劑(例如StimulonTM等)、細菌或微生物之衍生物(例如LPS、脂質A衍生物等)及微粒子(例如聚-α-羥基酸等)。
本文中提供之疫苗組合物可另外包含低溫保護劑。低溫保護劑可在凍乾製程期間保持生物製品之優良穩定性且降低對疫苗之生物活性之損害。低溫保護劑之實例包括蔗糖、L-麩胺酸鈉或乳白蛋白水解產物等。
製備方法
在另一態樣中，本發明提供製備本文中提供之疫苗組合物之方法，其包含：(a)收集PRRSV疫苗株、CSFV疫苗株及/或PRV疫苗株，其在其各別易感細胞中培養，及(b)以合適TCID50比率混合兩種或兩種以上病毒株。
在某些實施例中，步驟(a)包含：將PRRSV疫苗株、CSFV疫苗株及/或PRV疫苗株接種至其各別易感細胞，培養細胞以製備用於產生疫苗之種病毒，將種病毒接種至其各別易感細胞，使細胞繁殖以獲得含有各別病毒之抗原溶液。
在某些實施例中，PRRSV疫苗株為高病原性PRRSV之減毒疫苗株。在某些實施例中，PRRSV疫苗株為PRRSV TJM病毒株。
在某些實施例中，CSFV疫苗株為減毒CSFV。在某些實施例中，CSFV疫苗株為CSFV C病毒株(F16)。
在某些實施例中，PRV疫苗株為減毒PRV。在某些實施例中，PRV疫苗株為Bartha K61病毒株。
在某些實施例中，PRRSV疫苗株之易感細胞包括(但不限於)諸如Marc-145細胞株、MA-104細胞株、Vero細胞株或CL-2621細胞株之細胞株，或諸如PAM細胞之初代細胞。
在某些實施例中，CSFV疫苗株之易感細胞包括(但不限於)諸如BT細胞株、Vero細胞株、MPK細胞株、SK6細胞株、PK2a細胞株、CPK細胞株、RKC細胞株、MDBK細胞株、MDCK細胞株、CRFK細胞株、PT細胞株及ST細胞株之細胞株，或諸如BT細胞之初代細胞。PT細胞株及ST細胞株均為豬睪丸細胞株。
在某些實施例中，PRV疫苗株之易感細胞包括(但不限於)繼代細胞株，諸如ST細胞株(ATCC編號CRL-1746)、 PK-15細胞株(ATCC編號CCL-33)、Marc-145細胞株(ATCC編號CRL-12219)、牛腎MDBK細胞株(ATCC編號CCL-22)、牛鼻甲骨BT細胞株(ATCC編號CRL-1390)、Vero細胞株(ATCC編號CCL-81)、BHK-21細胞株(ATCC編號CCL-10)、豬腎細胞株(參見IBRS-2，例如DECASTRO,M.P.1964.Behavior of foot and mouth disease virus in cell culture：susceptibility of the IB-RS-2 swine cell line.Arquivos Instituto Biologica 31：63-78)及兔腎RK細胞株(ATCC編號CCL-106)；或初代細胞，諸如雞胚胎纖維母細胞及豬腎細胞。初代細胞可使用此項技術中已知的方法製備，例如藉由自動物分離組織且製備細胞。
在某些實施例中，易感細胞較佳在33℃-37℃下在5% CO2存在下培養。培養易感細胞之方法可包含：在用EDTA-胰蛋白酶溶液消化後使細胞株繼代，繼續在生長培養基中培養細胞株，當細胞達到90%-100%融合時，其可進一步繼代或接種種病毒。培養細胞株之方法較佳為以下方法中之任一者：在滾瓶中培養細胞且使細胞密度達到1×106個/毫升-5×106個/毫升；或將黏著載體引入生物反應器中進行懸浮培養且使細胞密度達到5×106個/毫升-1×107個/毫升，其中黏著載體較佳為微載體或紙。
在某些實施例中，PRRSV疫苗株以0.01-0.5之感染倍率(MOI)接種至其易感細胞，CSFV疫苗株以0.1-0.5之MOI接種至其易感細胞，或接種量為3%-5%細胞起源病毒，及/或PRV疫苗株以0.005-0.5之MOI接種至其易感細胞。
在某些實施例中，接種各別病毒疫苗株之細胞在接種後培養3-5天且可收集用於產生疫苗之種病毒。對於PRRSV病毒株，在細胞病變效應達到70%時收集種病毒。對於CSFV病毒株，藉由在接種後第5天改變培養基進行第一次收集，且藉由以4天時間間隔改變培養基進行後續收集，限制條件為進行不超過5次收集。對於PRV病毒株，在接種後2-3天收集含有病毒之細胞培養基。
在某些實施例中，用於產生疫苗之種病毒具有合適病毒效價。舉例而言，PRRSV TJM病毒株之種病毒可不少於107.0 TCID50病毒/毫升，CSFV C病毒株(F16)之種病毒可大於100,000倍兔感染劑量/毫升或不少於106.0 FA-TCID50病毒/毫升(如藉由基於免疫螢光之分析法量測)及/或PRV Bartha K61病毒株之種病毒可不少於108.0 TCID50病毒/毫升。
在某些實施例中，將種病毒接種至其各別易感細胞且使其繁殖以獲得含有各別病毒之抗原溶液。在某些實施例中，所得抗原溶液具有合適病毒含量，例如對於PRRSV TJM病毒株，不少於107.0 TCID50病毒/毫升；對於CSFV C病毒株(F16)，大於100,000 RID/毫升或不少於106.0 FA-TCID50病毒/毫升，如由基於免疫螢光之分析法量測；及/或對於PRV Bartha K61病毒株，不少於108.0 TCID50病毒/毫升。
在某些實施例中，步驟(b)包含以10000：1至1：1之TCID50比率收集PRRSV疫苗株及CSFV疫苗株。在某些實施例 中，步驟(b)包含以1：1至1：30之TCID50比率混合所收集之PRRSV疫苗病毒與PRV疫苗病毒。在某些實施例中，步驟(b)包含以約104：1：105至約5：1：6之TCID50比率混合所收集之PRRSV疫苗病毒、CSFV疫苗病毒及PRV疫苗病毒。
在某些實施例中，步驟(b)另外包含混合所收集病毒溶液之混合物與低溫保護劑。在某些實施例中，以75-80：25-20之體積比混合所收集病毒溶液之混合物與低溫保護劑。
在另一態樣中，本發明提供使用本文中提供之方法製備之疫苗組合物。
在另一態樣中，本發明提供本文中提供之疫苗組合物之用途，其係用於製造用以預防或治療PRRS、CSF及/或PR之藥劑。
在另一態樣中，本發明提供對豬進行免疫之方法，其包含向豬投與本文中提供之疫苗組合物。
在另一態樣中，本發明提供CSFV疫苗株，其係於選自由ST、PK-15、Marc-145、MDBK、BT、Vero、BHK-21、豬腎細胞株(IBRS-2)、兔腎細胞株(RK)及雞胚胎纖維母細胞株組成之群的細胞株或為豬腎初代細胞之初代細胞中培養。在另一態樣中，本發明提供該等細胞株在培養CSFV疫苗株中之用途。
本發明亦提供使用上述製備方法製備之疫苗組合物，其包含PRRSV疫苗及CSFV疫苗。
本發明亦提供疫苗組合物之用途，其係用於製造用以預防或治療豬生殖及呼吸症候群及豬瘟之生物製品。
本文中提供之混合疫苗顯示預防高病原性豬生殖及呼吸症候群及豬瘟之顯著功效。本文中提供之高病原性PRRSV病毒株及CSFV疫苗株不顯示任何免疫抑止作用，且由其製得之混合疫苗在安全性、免疫原性、免疫持續時間、免疫保護及穩定性方面與其各單價疫苗無差異。安全性研究結果表明，接受單次劑量、重複劑量、過劑量疫苗接種之動物顯示正常體溫及精神狀態且無任何臨床症狀。功效研究結果表明，本文中提供之疫苗可向動物提供針對高病原性PRRSV及CSFV之毒性菌株之攻擊之顯著保護，且可有效預防高病原性PRRSV及CSFV之感染。免疫持續時間研究結果表明，免疫持續時間為6個月，由此可確保免疫週期內對豬之有效保護。穩定性研究結果表明，疫苗可在2℃-8℃下儲存18個月，由此表明其可長期存放及穩定儲存之優點。本文中提供之疫苗可用於以一次注射來接種動物且預防兩種疾病，藉此降低疫苗接種工作量及免疫頻率，使對豬群之壓力最小，且防止由頻繁疫苗接種引起之免疫耐受性及失效。
本發明亦提供對豬進行免疫之方法，其包含向豬投與本文中提供之疫苗組合物。可藉由例如注射對豬進行免疫。免疫可為單次投藥或多劑量重複投藥。免疫或給藥方法可由有經驗的執業獸醫根據實際情況調整。
實例
以下實例意欲進一步說明本發明。本發明之優點及特徵將經由說明而變得顯而易見。然而，該等說明僅為例示性 的且不應視為限制本發明之範疇。
通則
藉由注射入豬頸部肌肉來進行疫苗接種。藉由將病毒滴入測試豬鼻子及/或將病毒注射至測試豬之肌肉中來進行病毒攻擊。藉由基於免疫螢光之方法來量測CSFV病毒量FA-TCID50。
針對T細胞之FACS分析法。藉由流動式細胞測量方法量測T細胞。簡言之，用抗凝劑處理血液樣品，接著使紅血球溶解。經處理之樣品分別用FITC-CD8單株抗體(mAb)、PE-CD4 mAb、PECy5-CD3 mAb染色(所有抗體均購自51AB Biotech,Beijing)。培育45分鐘後，移除未反應之抗體，且用PBS使細胞懸浮且用流式細胞儀(BD FACSAria)進行分析。
ELISA分析法。藉由ELISA，使用購自Beijing IDEXX Yuanheng Laboratories Co.,Ltd之各別偵測套組量測針對PRRSV抗原之抗體、針對CSFV抗原之抗體。
部分I：製備疫苗 實例1：製備PRRSV疫苗 細胞繼代及培養
用於培養PRRSV疫苗株TJM之Marc-145細胞用胰蛋白酶處理且以1：3進行分裂。細胞在培養基中37℃下培養。在細胞形成單層後，使細胞繼代或接種病毒株。
細胞中種病毒之繁殖
以0.01-0.5之MOI將高毒性PRRSV之疫苗株TJM接種至 Marc-145細胞。培養接種之細胞3-5天，且在細胞病變效應(CPE)達到70%時收集病毒溶液。所收集之病毒溶液用作PRRSV TJM病毒株之種病毒。
根據中華人民共和國獸藥典(Veterinary Pharmacopoeia of People's Republic of China)表徵種病毒。種病毒不含細菌、黴菌或黴漿菌。PRRSV種病毒溶液對豬不顯示不良反應。每毫升PRRSV TJM病毒株之種病毒溶液含有不少於107.0 TCID50病毒。
用於產生疫苗之病毒溶液之繁殖
將Marc-145細胞培養至90%-100%融合單層。棄去細胞培養基且細胞用PBS洗滌2次。以0.01-0.5之MOI接種PRRSV TJM病毒株之種病毒溶液。培養接種之細胞3-5天，且在CPE達到70%時收集病毒溶液。所收集之病毒溶液用作用於產生疫苗之病毒溶液。表徵該病毒溶液且其不含細菌、黴菌或黴漿菌，且每毫升PRRSV TJM病毒株之病毒溶液含有不少於107.0 TCID50病毒。適當稀釋病毒溶液以製備PRRSV單一疫苗，或與其他疫苗混合以製備混合疫苗。
實例2：製備CSFV疫苗 細胞繼代及培養
用於培養CSFV疫苗株之BT細胞用胰蛋白酶處理且以1：5進行分裂。細胞在培養基中37℃下培養。在細胞形成單層後，使細胞繼代或接種病毒株。
將CSFV C病毒株(F16)製備成0.3%病毒溶液且接種至BT 細胞之單層。培養接種之細胞5天，且收集病毒溶液作為CSFV疫苗株之種病毒。
種病毒之表徵
根據中華人民共和國獸藥典表徵種病毒。種病毒不含細菌、黴菌或黴漿菌。CSFV C病毒株(F16)經測試為合格種病毒溶液且對豬不顯示不良反應。CSFV C病毒株(F16)之種病毒溶液每毫升病毒溶液含有大於100,000倍兔感染劑量(RID)或不少於106.0 FA-TCID50病毒，如由基於免疫螢光之方法量測。
用於產生疫苗之病毒溶液之繁殖
將BT細胞培養至90%-100%融合單層。棄去細胞培養基且細胞用PBS洗滌2次。以0.1-0.5之MOI或以3%-5%之量接種CSFV C病毒株(F16)之種病毒溶液。在接種後第5天，藉由改變培養基進行第一次收集，且以4天時間間隔進行後續收集，限制條件為進行不超過5次收集。所收集之病毒溶液在-20℃下儲存且用作用於產生疫苗之病毒溶液。表徵該病毒溶液，且CSFV C病毒株(F16)之種病毒溶液每毫升病毒溶液含有大於100,000倍RID或不少於106.0 FA-TCID50病毒，如由基於免疫螢光之方法量測。適當稀釋病毒溶液以製備CSFV單一疫苗，或與其他疫苗混合以製備混合疫苗。
實例3：製備PRV疫苗 細胞繼代及培養
用於培養PRV疫苗株Bartha K61之Marc-145細胞、 MDBK細胞及BT細胞用胰蛋白酶處理且分別在細胞生長培養基中繼代。細胞在培養基中37℃下培養。在細胞形成單層後，使細胞繼代或分別接種病毒株。
細胞中種病毒之繁殖
PRV疫苗株Bartha K61在含有2%-4%牛血清之MEM培養基中接種至Marc-145細胞、MDBK細胞或BT細胞之單層。接種之細胞分別培養2-3天，且收集病毒溶液作為PRV疫苗株之種病毒。
種病毒之表徵
表徵種病毒。PRV種病毒經測試為合格接種溶液且對豬中不顯示不良反應。每毫升PRV病毒株之種病毒溶液含有不少於108.0 TCID50病毒。
PRV疫苗株之病毒溶液之繁殖
以0.005-0.5之MOI將PRV著色劑接種至Marc-145細胞、MDBK細胞或BT細胞之融合單層同時添加維持培養基。在36℃-37℃下培養接種之細胞且在CPE達到70%時收集病毒溶液。
在2次凍融循環後量測病毒溶液量。每毫升種病毒溶液含有不少於108.0 TCID50病毒。根據中華人民共和國獸藥典表徵病毒溶液且其不含細菌、黴菌或黴漿菌。合格病毒溶液在-15℃下儲存且用作用於產生疫苗之病毒溶液。適當稀釋病毒溶液以製備PRV單一疫苗，或與其他疫苗混合以製備混合疫苗。
實例4. 製備PRRSV及CSFV之混合疫苗組合物
藉由組合PRRSV TJM病毒株之病毒溶液(根據實例1製備)及CSFV C病毒株(F16)之病毒溶液(根據實例2製備)來製備抗原溶液。
藉由以合適比率混合蔗糖、L-麩胺酸鈉及乳白蛋白水解物接著進行熱壓處理來製備耐熱低溫保護劑。
將75-80體積份抗原溶液與25-20體積份低溫保護劑混合且將預定量混合物裝入安瓿。對安瓿進行封蓋且經低溫及乾燥處理以獲得冷凍乾燥之疫苗組合物。測試疫苗組合物之無菌性、安全性及功效。
在所製備之各劑量之PRRSV及CSFV混合疫苗中，PRRSV TJM病毒株量105.0 TCID50，且CSFV C病毒株(F16)量7500 RID(或750 RID或150 RID)，或不少於104.0 FA-TCID50病毒，如由基於免疫螢光之方法量測。
根據中華人民共和國獸藥典附錄第15頁、第19頁及第20頁表徵混合疫苗。混合疫苗不含細菌、黴菌、黴漿菌及外源性病毒。
實例5. 製備PRRSV及PRV之混合疫苗組合物
藉由組合PRRSV TJM病毒株之病毒溶液(根據實例1製備)及PRV Bartha K61病毒株之病毒溶液(根據實例3製備)來製備抗原溶液。
藉由以合適比率混合蔗糖、L-麩胺酸鈉及乳白蛋白水解物接著進行熱壓處理來製備耐熱低溫保護劑。
將6-8體積份抗原溶液與2-4體積份低溫保護劑混合且將預定量混合物裝入安瓿。對安瓿進行封蓋且經低溫及乾燥 處理以獲得冷凍乾燥之疫苗組合物。
在所製備之各劑量之PRRSV及PRV混合疫苗中，PRRSV TJM病毒株量105.0 TCID50且PRV Bartha K61病毒株量105.5 TCID50。
根據中華人民共和國獸藥典附錄第15頁、第19頁及第20頁表徵混合疫苗。混合疫苗不含細菌、黴菌、黴漿菌及外源性病毒。
實例6.製備PRRSV、CSFV及PRV之混合疫苗組合物
藉由組合PRRSV TJM病毒株之病毒溶液(根據實例1製備)、CSFV C病毒株(F16)之病毒溶液(根據實例2製備)及PRV Bartha K61病毒株之病毒溶液(根據實例3製備)來製備抗原溶液。
藉由以合適比率混合蔗糖、L-麩胺酸鈉及乳白蛋白水解物接著進行熱壓處理來製備耐熱低溫保護劑。
將75-80體積份抗原溶液與25-20體積份低溫保護劑混合且將預定量混合物裝入安瓿。冷凍乾燥安瓿得到疫苗組合物。測試疫苗組合物之無菌性、安全性及功效。
在所製備之各劑量之PRRSV、CSFV及PRV混合疫苗中，PRRSV TJM病毒株量105.0 TCID50，CSFV C病毒株病毒量7500 RID(或750 RID、150 RID)或不少於104.0 FA-TCID50病毒(如由基於免疫螢光之方法量測)且PRV Bartha K61病毒株病毒量105.5 TCID50。
根據中華人民共和國獸藥典附錄第15頁、第19頁及第20頁表徵混合疫苗。混合疫苗不含細菌、黴菌、黴漿菌及外 源性病毒。
實例7. PRRSV TJM病毒株之基因表徵
藉由PCR，使用對PRRSV之nsp2具有特異性之引子(正向引子：5'-GGCAAGAAGTTGAGGAAGT-3'；反向引子：5'-TGGCAGGTTGGTCACAGA-3')表徵根據實例1製備之病毒溶液及根據實例4-6製備之混合疫苗中所含之PRRSV TJM病毒株。PRRSV TJ病毒株為陽性對照且水為陰性對照。
結果表明與含有PRRSV TJ病毒株之陽性對照中之567 bp色帶相比，含有PRRSV TJM病毒株之樣品中存在特異性207 bp色帶(圖5)。該等結果證實PRRSV TJM病毒株在nsp2基因中缺乏360個核苷酸且亦證實製備之疫苗未受PRRSV TJ病毒株污染。
實例8. PRV Bartha K61病毒株之基因表徵
藉由PCR，使用對PRV之gE具有特異性之引子(正向引子：5'-CGTCACGGTCACCAAGGAGC-3'；反向引子：5'-GCACAGCACGCAGAGCCAG-3')表徵根據實例3製備之病毒溶液及根據實例5-6製備之混合疫苗組合物中所含之PRV Bartha K61病毒株。PRV毒性菌株(JL1病毒株)為陽性對照且水為陰性對照。
根據結果，與PRV毒性菌株中之232 bp色帶相比，在含有PRV Bartha K61病毒株之樣品中未發現色帶(圖6)。
該等結果證實PRV Bartha K61病毒株含有gE基因缺失且亦證實所製備之疫苗未受PRV毒性菌株污染。
部分II：功效研究 實例9：測定PRRSV TJM病毒株之最小免疫有效劑量
使用25隻健康斷乳豬進行研究。根據抗原及抗體，豬對高病原性PRRSV呈陰性。將豬隨機分為5組。第I組至第VI組接種不同劑量之PRRSV TJM病毒株，而第V組保持作為陰性對照(表1)。用毒性PRRSV TJ病毒株對豬進行攻擊且在研究後計算保護率。根據表1，104.5 TCID50或更高量的PRRSV TJM病毒株足以在豬中誘導保護性免疫且保護率為4/5。
實例10：測定CSFV C病毒株(F16)之最小免疫有效劑量
使用28隻健康斷乳豬進行研究。根據抗原及抗體，豬對CSFV呈陰性。將豬隨機分為6組。第I組至第V組接種不同劑量之CSFV C病毒株(F16)，而第VI組保持作為陰性對照(表2)。用毒性CSFV Shimen病毒株對豬進行攻擊且在研究後計算保護率。根據表2，100.5 TCID50或更高量的CSFV C病毒株(F16)足以在豬中誘導保護性免疫且保護率為5/5。
實例11：測定PRRSV TJM病毒株及CSFV C病毒株(F16)之混合疫苗之最小免疫有效劑量
使用40隻健康仔豬進行研究。根據抗原及抗體，豬對高病原性PRRSV及CSFV呈陰性。將豬隨機分為4組。第I組至第III組接種不同劑量之PRRSV TJM病毒株及CSFV C病毒株(F16)之混合疫苗，而第IV組保持作為陰性對照。各組中之一半數目之豬用PRRSV TJ病毒株進行攻擊且另一半用CSFV Shimen病毒株進行攻擊。在研究後計算保護率。
根據表3，含有104.5 TCID50 PRRSV TJM及103.5 FA-TCID50 CSFV C病毒株(F16)之混合疫苗足以在豬中誘導保護性免疫(表3及表4)。詳言之，在混合疫苗中測試之所有劑量下，CSFV C病毒株(F16)均顯示100%保護，表明對CSFV C病毒株(F16)之免疫反應未受PRRSV TJM病毒株抑止。此外，鑒於實例10中顯示之CSFV C病毒株(F16)之極低免疫有效劑量，混合疫苗中可使用較低劑量之CSFV C病毒株(F16)而不降低保護率。
實例12：PRRSV TJM病毒株及CSFV C病毒株(F16)混合物不具有免疫抑制作用
使用30隻年齡為21-28天之健康豬進行研究。根據抗原及抗體，豬對高病原性PRRSV及CSFV呈陰性。將豬隨機分為7組，第I組至第V組每組5隻豬，第VI組3隻豬且第VII組2隻豬(表5)。根據表5中顯示之研究設計，每隻豬均用1 ml測試樣品接種或完全不接種(亦即第VII組)。
自疫苗接種前第3天至疫苗接種後第14天每天量取豬之直腸溫度。每7天量測一次體重。豬亦處於密切臨床觀察下。在研究中分別在疫苗接種前第3天以及疫苗接種後第0天、第3天、第7天、第10天、第14天、第21天及第28天自每隻豬獲取血液樣品。將各血液樣品分為兩部分。一部分用抗凝劑處理且用於偵測CD3+、CD4+、CD8+及CD4+CD8+ T細胞。另一部分用凝結劑處理且用於抗體效價分析法。
結果表明經接種之豬中CD3+、CD4+、CD8+及CD4+CD8+ T細胞之變化與在對照組之豬中所觀測類似(圖7-10)。在接種混合疫苗後，第III組及第IV組中之豬產生針對兩種病毒之抗體，且該等抗體產生不對彼此產生干擾(圖11-12)。第III組及第IV組中之豬之PRRSV抗體產生動力學與第I組中之豬類似，且第III組及第IV組中之豬之CSFV抗體產生動力學與第II組中之豬類似。結果表明PRRSV TJM病毒株之疫苗接種未抑制針對CSFV C病毒株(F16)之免疫反應且CSFV C病毒株(F16)之疫苗接種未抑制針對PRRSV TJM病毒株之免疫反應。
各組中豬之直腸溫度及體重未顯示顯著差異(圖13)。
在疫苗接種後第28天，根據表6中顯示之研究設計用毒 性病毒對豬進行攻擊。在病毒攻擊後，每天量取豬之直腸溫度且觀測豬之臨床表現，包括食慾、呼吸及精神狀態。分別在病毒攻擊後第0天、第3天、第7天、第10天及第14天自各豬獲取血液樣品，且用抗凝劑處理以偵測CD3+、CD4+、CD8+及CD4+CD8+ T細胞。亦在病毒攻擊當天及攻擊後每隔一天獲取血液樣品以用於分離PRRSV病毒及CSFV病毒及測定病毒血症之存在。在病毒攻擊研究後14天計算各組動物之臨床保護率、發病率(亦即患病豬數目/測試豬數目)及死亡率(亦即死亡豬數目/測試豬數目)且結果顯示於表6中。
結果表明在病毒攻擊後，第V組及第VI組中未經接種之豬之體溫升高，但第I組-第IV組中經接種之豬中不存在此現象(圖14-15)。第V組中之豬顯示高病原性PRRS之臨床症狀，諸如精神萎靡、呼吸窘迫、皮膚發紅等。第VI組中之 豬顯示豬瘟之顯著症狀，包括精神萎靡、便秘繼而腹瀉、皮膚發紅等。經接種之組中之豬均未顯示該等臨床症狀(圖16-17)。
在病毒攻擊後，第V組及第VI組中未經接種之豬顯示CD3+、CD4+、CD8+及CD4+CD8+ T細胞顯著減少且自病毒攻擊後第7天開始死亡。另一方面，接種混合疫苗或單一疫苗之豬未顯示該T細胞顯著減少，且T細胞概況與空白對照組中之健康豬相當。此表明疫苗有效引發細胞免疫反應。此外，接種混合疫苗之豬與接種單一疫苗之豬顯示類似的CD3+、CD4+、CD8+及CD4+CD8+ T細胞變化，由此表明混合疫苗不具有針對彼此之免疫抑制作用(圖18-25)。
在用高毒性PRRSV攻擊後，第V組中未經接種之豬自第2天起顯現病毒血症，其持續長達11天。然而，接種混合疫苗或PRRSV單一疫苗之豬直至第4天亦不顯現病毒血症，其持續長達5天。此表明混合疫苗及單一疫苗均提供針對高病原性PRRSV之感染之有效保護，且混合疫苗不具有針對彼此之免疫抑制作用。
在用毒性CSFV攻擊後，第VI組中之所有豬均顯現病毒血症，但經接種之豬均不顯現病毒血症。此表明混合疫苗及單一疫苗均提供針對毒性CSFV之感染之有效保護，且混合疫苗不均有針對彼此之免疫抑制作用。
實例13：PRRSV及CSFV之二合一疫苗之功效研究
使用三批實驗室製備之PRRSV及CSFV之二合一疫苗(批號：200904、200905及200906，根據實例4製備)進行功效 研究。
對於每一批二合一疫苗樣品，使用28隻健康豬進行研究，根據抗原及抗體，該等豬對高毒性PRRSV及CSFV呈陰性。將豬隨機分為6組，第I組至第IV組及第VI組每組5隻豬，且第V組3隻豬。每組豬用其各別測試樣品進行接種，且在疫苗接種後第28天，根據表7中顯示之研究設計用毒性病毒對豬進行攻擊。
CSFV病毒攻擊研究在攻擊後第16天結束，且PRRSV病毒攻擊研究在攻擊後第21天結束。計算保護率且結果顯示 於表7中。所有3批PRRSV及CSFV之二合一疫苗均顯示針對高毒性PRRSV或CSFV之攻擊之優良保護。二合一疫苗之保護作用與單一疫苗對照物之保護作用無顯著差異。未經接種之豬均顯示明顯的感染臨床症狀。
實例14：PRRSV及CSFV之二合一疫苗之免疫持續時間研究
使用PRRSV及CSFV之二合一疫苗(如根據實例4製備)進行免疫持續時間研究。PRRSV單一疫苗(如根據實例1製備)及CSFV單一疫苗(如根據實例2製備)用作對照。
使用56隻健康豬進行免疫持續時間研究。根據抗原及抗體，所有豬均對PRRSV及CSFV呈陰性。將豬隨機分為6組且用如表8所示之各別測試樣品進行接種。在疫苗接種後第1個月、第2個月、第3個月、第4個月、第5個月或第6個月收集血液樣品用於測定抗體效價。
分別在疫苗接種後第3個月及第6個月自各研究組取用一半數目之動物。該等動物用各別毒性病毒進行攻擊，如表8所示。
結果表明(參見表8)在疫苗接種後6個月，二合一疫苗仍向豬提供針對病毒攻擊之有效保護，且因此支持6個月的免疫持續期。發現二合一疫苗之免疫持續時間與單一疫苗相當。
實例15：PRRSV TJM病毒株及PRV Bartha K61病毒株混合物不具有免疫抑制作用
使用PRRSV TJM及PRV Bartha K61之二合一疫苗(根據實例5製備)進行研究。將4-5週齡豬隨機分為4組，每組4隻豬。根據抗原及抗體，所有豬均對PRRSV及PRV呈陰性。
根據表9中顯示之研究設計用各別測試樣品對豬進行接種。在第1次疫苗接種後1週進行第2次疫苗接種。
在疫苗接種後，每週收集豬之血液樣品直至疫苗接種後第28天。處理血液樣品且偵測針對PRV之抗體效價。
結果表明(圖26)第I組至第III組之間PRV抗體效價無顯著不同。此表明PRRSV TJM病毒株不具有針對PRV疫苗之免疫抑制作用。當單獨投與或以與PRV之混合疫苗投與時，PRRSV TJM病毒株均不影響PRV抗體效價。PRRSV及PRV之二合一疫苗之功效與PRV單一疫苗之功效相當。
實例16：PRRSV及PRV混合疫苗之功效研究
使用3批PRRSV及PRV之二合一疫苗(根據實例5製備)進行功效研究。
將4-5週齡豬隨機分為4組，每組10隻豬。第I組至第III組注射1劑量各別批次之二合一疫苗。每一劑量疫苗含有105.0 TCID50/ml PRRSV TJM病毒株及105.5 TCID50/ml PRV Bartha K61病毒株。第IV組為對照組且注射1 ml MEM培養基。
在疫苗接種後，觀測豬之臨床表現及不良反應。每週收集豬血液且分離血清用於表徵抗體效價。每週量測豬體 重。
疫苗接種後4週，用2×104.0-2×104.5 TCID50劑量之PRRSV TJ病毒株對各組中之5隻豬進行攻擊，且用103.0-103.5 TCID50劑量之PRV毒性菌株(JL1病毒株)對另5隻豬進行攻擊。在病毒攻擊後，觀測豬之臨床表現，包括食慾及精神狀態。每天量取豬之直腸溫度。收集血液樣品及鼻拭子(nasal swab)用於病毒表徵。
結果表明第I組至第III組中經接種之豬在疫苗接種後顯示正常溫度且精神狀態良好且食慾良好。在病毒攻擊後，經接種之豬在保護率高於4/5之情況下受到保護，而對照組中所有未經接種之豬均顯示感染，且毒性PRRSV攻擊之死亡率為2/5且毒性PRV攻擊之死亡率為3/5。結果表明PRRSV及PRV之二合一疫苗具有針對兩種病毒攻擊之優良功效且有效防止PRRSV及PRV之感染。
實例17：PRRSV TJM病毒株、CSFV C病毒株及PRV Bartha K61病毒株混合物不具有免疫抑制作用
使用46隻年齡為21-28天之健康豬進行研究。根據抗原及抗體，豬對高毒性PRRSV、CSFV及PRV呈陰性。將豬隨機分為10組，第I組至第VII組及第IX組每組5隻豬，且第VIII組及第X組每組3隻豬。根據表10中顯示之研究設計，豬用1 ml指定測試樣品進行接種或完全不接種(亦即第X組)。
自疫苗接種前第3天至疫苗接種後第7天每天量取豬之直腸溫度。豬亦處於密切臨床觀察下。在研究中分別在疫苗接種前第3天、疫苗接種後第0天、第3天、第7天、第10天、第14天、第21天、第28天、第31天、第35天、第38天及第42天自各豬獲取血液樣品。將各血液樣品分為兩部分。一部分用抗凝劑處理且用於偵測CD3+、CD4+及CD8+ T細胞。另一部分用凝結劑處理且用於抗體效價分析法。
在疫苗接種後第28天，根據表11中顯示之研究設計用毒性病毒對豬進行攻擊。在病毒攻擊後，每天量取豬之直腸溫度且觀測豬之臨床表現，包括食慾、呼吸及精神狀態。 PRRSV攻擊研究在病毒攻擊後第21天結束，且CSFV攻擊研究在病毒攻擊後第16天結束。在病毒攻擊研究後計算各組之臨床保護率、發病率(亦即患病豬數目/測試豬數目)及死亡率(亦即死亡豬數目/測試豬數目)且結果顯示於表11中。
結果表明PRRSV TJM病毒株在與CSFV C病毒株及PRV Bartha K61病毒株混合時提供針對所有3種毒性病毒之攻擊之有效保護。混合疫苗之功效與各單一疫苗之功效相當，表明混合疫苗不具有針對彼此之免疫抑制作用。
實例18：PRRSV TJM病毒株、CSFV C病毒株及PRV Bartha K61病毒株混合物之功效研究
使用三批實驗室製備之三合一疫苗(批號：031-01、031-02及031-03，根據實例6製備)進行功效研究。
使用43隻健康豬進行研究，根據抗原及抗體，該等豬對高毒性PRRSV、CSFV及PRV呈陰性。將豬隨機分為9組， 第I組至第VI組、第VIII組及第IX組每組5隻豬且第VII組3隻豬。每組豬用其各別測試樣品進行接種，且在疫苗接種後第28天，根據表12中顯示之研究設計用各別毒性病毒對豬進行攻擊。PRRSV攻擊研究在病毒攻擊後第21天結束，CSFV攻擊研究在病毒攻擊後第16天結束且PRV攻擊研究在病毒攻擊後第14天結束。在病毒攻擊研究後計算各組動物之臨床保護率、發病率及死亡率且結果顯示於表12中。
3批PRRSV、CSFV及PRV之三合一疫苗均顯示針對高毒性PRRSV、CSFV或PRV之攻擊之良好保護，而陰性對照均顯示明顯的感染臨床症狀。三合一疫苗之保護作用與單一疫苗對照物之保護作用無顯著差異。
實例19：PRRSV TJM病毒株、CSFV C病毒株及PRV Bartha K61病毒株混合物之免疫持續時間研究
使用三批實驗室製備之三合一疫苗(批號：031-01、031-02及031-03，根據實例6製備)進行免疫持續時間研究。
使用86隻健康豬進行免疫持續時間研究。根據抗原及抗體，豬對高毒性PRRSV、CSFV及PRV呈陰性。將豬隨機分為9組，第VII組6隻豬且其餘各組每組10隻豬。根據表13中顯示之研究設計，豬接受疫苗接種或不進行疫苗接種。在疫苗接種後第1個月、第2個月、第3個月、第4個月、第5個月或第6個月收集血液樣品用於測定抗體效價。
分別在疫苗接種後第3個月及第6個月取用各研究組中一半數目之動物且用各別毒性病毒進行攻擊，如表13所示。
結果表明(參見表13)在疫苗接種後6個月，三合一疫苗仍向豬提供針對病毒攻擊之有效保護，且因此支持6個月免疫持續期。發現三合一疫苗之免疫持續時間與各單一疫苗相當。
部分III：安全性研究 實例20：PRRSV及PRV混合疫苗之安全性研究
使用三批實驗室製備之PRRSV及CSFV之二合一疫苗(批號：200904、200905及200906，根據實例4製備)進行安全性研究。
研究包括對目標年齡豬之單一劑量安全性研究、重複劑量安全性研究、過劑量安全性研究，對未成年豬之過劑量安全性研究及對不同品種豬之過劑量安全性研究。
結果表明在疫苗接種後，各研究組中之豬均顯示正常溫度，精神狀態良好且食慾良好。未觀測到全身或局部不良反應。證實混合疫苗之過劑量投藥對未成年豬及不同品種豬為安全的。
實例21：PRRSV及PRV混合疫苗之安全性研究
使用3批PRRSV及PRV之二合一疫苗(根據實例5製備)進行安全性研究。
將4-5週齡豬隨機分為3組，每組15隻豬，根據抗原及抗體，該等豬對PRRS及PR呈陰性。各組用單一劑量(105.0-105.5TCID50病毒/毫升)、重複劑量或10倍過劑量二合一疫苗進行接種。5隻豬用作對照組且完全不接受接種。
直至疫苗接種後第21天為止每天量取豬之直腸溫度。豬亦處於密切臨床觀察下。
結果表明各組中之豬在疫苗接種後均顯示正常溫度且無病理變化。二合一疫苗對豬為安全的。
實例22：PRRSV、CSFV及PRV混合疫苗之安全性研究
使用三批實驗室製備之PRRSV、CSFV及PRV之三合一 疫苗(批號：031-01、031-02及031-03，根據實例6製備)進行安全性研究。研究包括對目標年齡豬之單一劑量安全性研究、重複劑量安全性研究、過劑量安全性研究，對未成年豬之過劑量安全性研究及對不同品種豬之過劑量安全性研究。
結果表明在疫苗接種後，各研究組中之豬均顯示正常溫度，精神狀態良好且食慾良好。未觀測到全身或局部不良反應。證實混合疫苗之過劑量投藥對未成年豬及不同品種豬為安全的。
部分IV：穩定性研究 實例23：PRRSV及CSFV之二合一疫苗之穩定性研究
測試實驗室製備之PRRSV及CSFV混合疫苗(批號：200904、200905及200906)之穩定性，且與三批PRRSV單一疫苗及CSFV單一疫苗(批號：200901、200902、200903、200907、200908及200909)平行比較。
三批各疫苗組合物均保持在2℃-8℃下。分別在研究期間第3個月、第6個月、第9個月、第12個月及第18個月收集樣品。測試樣品之生理化學性質、真空度、殘餘水含量、效能及在37℃下之老化。
在2℃-8℃下儲存18個月後，三批二合一疫苗組合物呈白色鬆散團塊狀，其在添加稀釋緩衝液後快速溶解。在測試真空度時，疫苗顯現白光或紫光。測試疫苗之平均殘餘水含量滿足中國獸藥典(Chinese Veterinary Pharmacopoeia)之要求。
測定疫苗組合物之病毒效價且結果顯示於圖27-30中。在2℃-8℃下儲存18個月後，二合一疫苗之病毒效價與各單一疫苗之病毒效價無顯著不同。在37℃下保持14天後，二合一疫苗仍含有較高位準之病毒效價，其與平行研究中之各單一疫苗無顯著不同。疫苗組合物之病毒效價滿足合格疫苗之要求。此表明耐熱低溫保護劑在冷凍乾燥程序期間對PRRSV疫苗株及CSFV疫苗株提供良好保護。
如此項技術中已知，習知疫苗通常保持在低於0℃之溫度(-20℃)下，由此使得疫苗儲存複雜化。此實例之結果表明藉由新穎低溫保護劑，可在較高溫度下裝運及儲存疫苗組合物，藉此提供較高疫苗穩定性。
實例24：PRRSV及PRV之二合一疫苗之穩定性研究
三批實驗室製備之PRRSV及PRV之二合一疫苗保持在2℃-8℃下。分別在研究期間第3個月、第6個月、第9個月、第12個月、第18個月、第21個月及第24個月收集樣品。測試樣品之生理化學性質、真空度、殘餘水含量、效能及在37℃下之老化。
在2℃-8℃下儲存24個月後，三批疫苗組合物呈白色鬆散團塊狀，其在添加稀釋緩衝液後快速溶解。在測試真空度時，疫苗顯現白光或紫光。測定疫苗組合物之病毒效價且結果顯示於圖31-34中。混合疫苗在2℃-8℃下儲存24個月後仍穩定，且病毒效價與儲存前無顯著不同。
實例25：PRRSV、CSFV及PRV之三合一疫苗之穩定性研究
測試實驗室製備之PRRSV、CSFV及PRV之三合一疫苗(批號：031-01、031-02及031-03)之穩定性，且與三批PRRSV單一疫苗(批號：031-04、031-05、031-06)、CSFV單一疫苗(批號：031-07、031-08、031-09)及PRV單一疫苗(批號：031-10、031-11及031-12)平行比較。
疫苗組合物保持在2℃-8℃下。分別在研究期間第3個月、第6個月、第9個月、第12個月及第18個月收集樣品。測試樣品之生理化學性質、真空度、殘餘水含量、效能及在37℃下之老化。
在2℃-8℃下儲存18個月後，三批疫苗組合物呈白色鬆散團塊狀，其在添加稀釋緩衝液後快速溶解。在測試真空度時，疫苗顯現白光或紫光。測試疫苗之平均殘餘水含量滿足中國獸藥典要求。
測定疫苗組合物之病毒效價且結果顯示於圖35-40中。在2℃-8℃下儲存18個月後，混合疫苗之病毒效價與單一疫苗之病毒效價無顯著不同。在37℃下保持14天後，混合疫苗仍顯示較高位準之病毒效價，其與平行研究中之單一疫苗之病毒效價無顯著不同。此表明耐熱低溫保護劑在冷凍乾燥程序期間對PRRSV疫苗株、CSFV疫苗株及PRV疫苗株提供良好保護。
圖1顯示PRRSV TJM病毒株之Nsp2編碼序列中缺乏但存在於PRRSV TJ病毒株之Nsp2核苷酸序列中的360個連續核苷酸。
圖2顯示由PRRSV TJM病毒株編碼之Nsp2蛋白質中缺乏但存在於PRRSV TJ病毒株之Nsp2蛋白質中的120個胺基酸的序列。
圖3為顯示高病原性PRRSV病毒株之Nsp2編碼序列中缺失之90個核苷酸及減毒PRRSV TJM病毒株中缺失之90個核苷酸及缺失之360個核苷酸之示意圖。
圖4顯示高病原性PRRSV TJ病毒株中缺乏但存在於PRRSV VR-2332病毒株中之不連續的90個核苷酸的序列。
圖5分別顯示PRRSV TJM疫苗株(泳道2)、高病原性PRRSV TJ毒性病毒株(泳道1)及水(泳道3，作為陰性對照)之電泳影像。M係指分子量標記。
圖6分別顯示PRV疫苗株(泳道1)、毒性病毒株(泳道2)及水(泳道3，作為陰性對照)之電泳影像。M係指分子量標記。
圖7顯示接種PRRSV TJM單一疫苗、CSFV C病毒株(F16)單一疫苗及混合疫苗或陰性對照之測試豬中CD3+ T細胞之變化(%)。
圖8顯示接種PRRSV TJM單一疫苗、CSFV C病毒株(F16)單一疫苗及混合疫苗或陰性對照之測試豬中CD4+ T細胞之變化(%)。
圖9顯示接種PRRSV TJM單一疫苗、CSFV C病毒株(F16)單一疫苗及混合疫苗或陰性對照之測試豬中CD8+ T細胞之變化(%)。
圖10顯示接種PRRSV TJM單一疫苗、CSFV C病毒株 (F16)單一疫苗及PRRSV及CSFV之混合疫苗或陰性對照之測試豬中CD4+CD8+ T細胞之變化(%)。
圖11顯示接種PRRSV TJM單一疫苗、PRRSV TJM及CSFV C病毒株(F16)之混合疫苗或陰性對照之豬中之PRRSV抗體效價(由ELISA測定)。
圖12顯示接種CSFV C病毒株(F16)單一疫苗、PRRSV TJM及CSFV C病毒株(F16)之混合疫苗或陰性對照之豬中之CSFV抗體效價(由ELISA測定)。
圖13顯示在接種PRRSV TJM單一疫苗、CSFV C病毒株(F16)單一疫苗、PRRSV TJM及CSFV C病毒株(F16)之混合疫苗或陰性對照後豬之直腸溫度。
圖14顯示用PRRSV毒性病毒攻擊後豬之直腸溫度，該等豬接種PRRSV TJM單一疫苗、PRRSV TJM及CSFV C病毒株(F16)之混合疫苗或陰性對照。
圖15顯示用CSFV毒性病毒攻擊後豬之直腸溫度，該等豬接種CSFV C病毒株(F16)單一疫苗、PRRSV TJM及CSFV C病毒株(F16)之混合疫苗或陰性對照。
圖16顯示用PRRSV毒性病毒攻擊後豬之臨床症狀分數，該等豬接種PRRSV TJM單一疫苗、PRRSV TJM及CSFV C病毒株(F16)之混合疫苗或陰性對照。
圖17顯示用CSFV毒性病毒攻擊後豬之臨床症狀分數，該等豬接種CSFV C病毒株(F16)單一疫苗、PRRSV TJM及CSFV C病毒株(F16)之混合疫苗或陰性對照。
圖18顯示用PRRSV毒性病毒攻擊後豬中CD3+ T細胞之變 化(%)，該等豬接種PRRSV TJM單一疫苗、PRRSV TJM及CSFV C病毒株(F16)之混合疫苗或陰性對照。
圖19顯示用PRRSV毒性病毒攻擊後CD4+ T細胞之變化(%)。
圖20顯示用PRRSV毒性病毒攻擊後CD8+ T細胞之變化(%)。
圖21顯示用PRRSV毒性病毒攻擊後CD4+CD8+ T細胞之變化(%)。
圖22顯示用CSFV毒性病毒攻擊後CD3+ T細胞之變化(%)，該等豬接種CSFV C病毒株(F16)單一疫苗、PRRSV及CSFV之混合疫苗或陰性對照。
圖23顯示用CSFV毒性病毒攻擊後CD4+ T細胞之變化(%)。
圖24顯示用CSFV毒性病毒攻擊後CD8+ T細胞之變化(%)。
圖25顯示用CSFV毒性病毒攻擊後CD4+CD8+ T細胞之變化(%)。
圖26顯示接種PRRSV及PRV後抗PRV中和抗體之效價。第I組相繼接種PRRSV TJM單一疫苗及PRV Bartha K61單一疫苗，第II組接種二合一活疫苗(2-combo live vaccine)，第III組接種PRV Bartha K61單一疫苗，第IV組僅接種無菌PBS。
圖27顯示在37℃下儲存14天後CSFV單一疫苗及二合一疫苗(PRRSV及CSFV)中CSFV C病毒株(F16)之病毒效價。 200904、200905及200906表示3批二合一疫苗，且200901、200902及200903表示3批PRRSV TJM單一疫苗。
圖28顯示在37℃下儲存14天後PRRSV單一疫苗及二合一疫苗(PRRSV及CSFV)中PRRSV TJM病毒株之病毒效價。200904、200905及200906表示3批二合一疫苗，且200907、200908及200909表示3批CSFV C病毒株(F16)。
圖29顯示在2℃-8℃下儲存18個月後CSFV單一疫苗及二合一疫苗(PRRSV及CSFV)中CSFV C病毒株(F16)之病毒效價。200904、200905及200906表示3批二合一疫苗，且200901、200902及200903表示3批PRRSV TJM單一疫苗。
圖30顯示在2℃-8℃下儲存18個月後PRRSV單一疫苗及二合一疫苗(PRRSV及CSFV)中PRRSV TJM病毒株之病毒效價。200904、200905及200906表示3批二合一疫苗，且200907、200908及200909表示3批CSFV C病毒株(F16)。
圖31顯示在2℃-8℃下儲存24個月後二合一疫苗(PRRSV及PRV)中PRRSV TJM病毒株之病毒效價。SD001、SD002及SD003分別表示3個不同批次的二合一活疫苗。
圖32顯示在2℃-8℃下儲存24個月後二合一疫苗(PRRSV及PRV)中PRV Bartha K61病毒株之病毒效價。SD001、SD002及SD003分別表示3個不同批次的二合一活疫苗。
圖33顯示在37℃下儲存14天後二合一疫苗(PRRSV及PRV)中PRRSV TJM病毒株之病毒效價。SD001、SD002及SD003分別表示3個不同批次的二合一活疫苗。
圖34顯示在37℃下儲存14天後二合一疫苗(PRRSV及 PRV)中PRV Bartha K61病毒株之病毒效價。SD001、SD002及SD003分別表示3個不同批次的二合一活疫苗。
圖35顯示在2℃-8℃下儲存18個月後三合一活疫苗(PRRSV TJM+CSFV C病毒株(F16)+PRV Bartha K61)中PRRSV TJM病毒株之病毒效價。031-01、031-02及031-03表示3批三合一活疫苗，且031-04、031-05及031-06表示3批PRRSV TJM單一疫苗。
圖36顯示在2℃-8℃下儲存18個月後三合一活疫苗(PRRSV TJM+CSFV C病毒株(F16)+PRV Bartha K61)中CSFV C病毒株(F16)之病毒效價。031-01、031-02及031-03表示3批三合一活疫苗，且031-07、031-08及031-09表示3批CSFV C病毒株(F16)單一疫苗。
圖37顯示在2℃-8℃下儲存18個月後三合一活疫苗(PRRSV TJM+CSFV C病毒株(F16)+PRV Bartha K61)中PRV Bartha K61病毒株之病毒效價。031-01、031-02及031-03表示3批三合一活疫苗，且031-10、031-11及031-12表示3批PRV Bartha K61單一疫苗。
圖38顯示在37℃下儲存14天後三合一活疫苗(PRRSV TJM+CSFV C病毒株(F16)+PRV Bartha K61)中PRRSV TJM病毒株之病毒效價。031-01、031-02及031-03表示3批三合一活疫苗，且031-04、031-05及031-06表示3批PRRSV TJM單一疫苗。
圖39顯示在37℃下儲存14天後三合一活疫苗(PRRSV TJM+CSFV C病毒株(F16)+PRV Bartha K61)中CSFV C病毒 株(F16)之病毒效價。031-01、031-02及031-03表示3批三合一活疫苗，且031-07、031-08及031-09表示3批CSFV C病毒株(F16)單一疫苗。
圖40顯示在37℃下儲存14天後三合一活疫苗(PRRSV TJM+CSFV C病毒株(F16)+PRV Bartha K61)中PRV Bartha K61病毒株之病毒效價。031-01、031-02及031-03表示3批三合一活疫苗，且031-10、031-11及031-12表示3批PRV Bartha K61單一疫苗。
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<212> PRT
<213> 豬生殖及呼吸症候群病毒
<400> 11

Claims (48)

  1. 一種疫苗組合物，其包含豬生殖及呼吸症候群病毒(PRRSV)疫苗及第二豬病毒疫苗，其中該第二豬病毒疫苗係選自由豬瘟病毒(CSFV)疫苗及假性狂犬病毒(PRV)疫苗組成之群，且其中該PRRSV疫苗包含含有由DNA序列編碼之Nsp2核苷酸序列之減毒PRRSV，其中該DNA序列與SEQ ID NO：4相比缺乏含有SEQ ID NO：8內至少50個相連核苷酸之DNA片段，其中該PRRSV疫苗及該第二疫苗實質上不具有針對彼此之免疫抑制作用。
  2. 如請求項1之疫苗組合物，其另外包含第三豬病毒疫苗，其中該第三豬病毒疫苗係選自由豬瘟病毒(CSFV)疫苗及假性狂犬病毒(PRV)疫苗組成之群，且其中該第三疫苗與該第二疫苗不同，其中該PRRSV疫苗、該第二疫苗及該第三疫苗實質上不具有針對彼此之免疫抑制作用。
  3. 如請求項1之疫苗組合物，其中該DNA片段包含至少100個、至少120個、至少150個、至少180個、至少200個、至少210個、至少220個、至少230個、至少240個、至少250個、至少260個、至少270個、至少280個、至少290個、至少300個、至少310個、至少320個、至少330個、至少340個、至少350個或至少360個相連核苷酸。
  4. 如請求項1之疫苗組合物，其中該DNA片段包含SEQ ID NO：8。
  5. 一種疫苗組合物，其包含豬生殖及呼吸症候群病毒 (PRRSV)疫苗及第二豬病毒疫苗，其中該第二豬病毒疫苗係選自由豬瘟病毒(CSFV)疫苗及假性狂犬病毒(PRV)疫苗組成之群，且其中該PRRSV疫苗包含含有編碼Nsp2蛋白質序列之Nsp2核苷酸序列之減毒PRRSV，其中該Nsp2蛋白質序列與SEQ ID NO：11相比缺乏含有SEQ ID NO：9內至少20個相連胺基酸之肽片段，其中該PRRSV疫苗及該第二疫苗實質上不具有針對彼此之免疫抑制作用。
  6. 如請求項5之疫苗組合物，其中該肽片段包含至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少105個、至少110個、至少115個或至少120個相連胺基酸。
  7. 如請求項5之疫苗組合物，其中該肽片段包含SEQ ID NO：9。
  8. 如請求項1之疫苗組合物，其中該減毒PRRSV係自高病原性PRRSV減毒。
  9. 一種疫苗組合物，其包含豬生殖及呼吸症候群病毒(PRRSV)疫苗及第二豬病毒疫苗，其中該第二豬病毒疫苗係選自由豬瘟病毒(CSFV)疫苗及假性狂犬病毒(PRV)疫苗組成之群，且其中該PRRSV疫苗包含自高病原性PRRSV減毒之減毒PRRSV，且其中該減毒PRRSV包含由DNA序列編碼之Nsp2核苷酸序列，其中該DNA序列與SEQ ID NO：5相比缺乏SEQ ID NO：6內的不連續的90個 核苷酸，其中該PRRSV疫苗及該第二疫苗實質上不具有針對彼此之免疫抑制作用。
  10. 如請求項9之疫苗組合物，其中該Nsp2核苷酸係由與SEQ ID NO：2具有至少90%同源性之序列編碼。
  11. 如請求項10之疫苗組合物，其中該Nsp2核苷酸係由包含SEQ ID NO：2之序列編碼。
  12. 如請求項1之疫苗組合物，其中該減毒PRRSV另外包含由與SEQ ID NO：1具有至少90%同源性之序列編碼的Nsp1核苷酸序列。
  13. 如請求項12之疫苗組合物，其中該減毒PRRSV包含由SEQ ID NO：1編碼之Nsp1核苷酸序列及由SEQ ID NO：2編碼之Nsp2核苷酸序列。
  14. 如請求項1之疫苗組合物，其中該減毒PRRSV包含由與SEQ ID NO：3具有至少90%同源性之序列編碼之PRRSV核苷酸序列。
  15. 如請求項14之疫苗組合物，其中該減毒PRRSV包含由SEQ ID NO：3編碼之PRRSV核苷酸序列。
  16. 如請求項14之疫苗組合物，其中該減毒PRRSV之微生物寄存編號為CGMCC第3121號。
  17. 如請求項1之疫苗組合物，其中該CSFV疫苗包含減毒CSFV。
  18. 如請求項17之疫苗組合物，其中該減毒CSFV係由與SEQ ID NO：10具有至少80%同源性之序列編碼。
  19. 如請求項18之疫苗組合物，其中該減毒CSFV係由SEQ ID NO：10編碼。
  20. 如請求項18之疫苗組合物，其中該減毒CSFV之微生物寄存編號為CGMCC第3891號。
  21. 如請求項1之疫苗組合物，其中該PRV疫苗包含減毒PRV。
  22. 如請求項21之疫苗組合物，其中該減毒PRV包含與NCBI參考編號為NC_006151之序列具有至少80%同源性之序列。
  23. 如請求項22之疫苗組合物，其中該減毒PRV具有選自由TK、PK、RR、dUTPase、gG、gC、gE、gD及gI組成之群的一或多種不活化基因。
  24. 如請求項23之疫苗組合物，其中該減毒PRV具有不活化gE基因。
  25. 如請求項21之疫苗組合物，其中該減毒PRV之微生物寄存編號為CGMCC第5076號。
  26. 如請求項1之疫苗組合物，其中本文中提供之該疫苗組合物包含免疫有效量之該PRRSV疫苗、該CSFV疫苗及/或該PRV疫苗。
  27. 如請求項26之疫苗組合物，其中該PRRSV疫苗之免疫有效量為至少104.5TCID50、105.0TCID50或105.5TCID50，該CSFV疫苗之免疫有效量為至少100.5FA-TCID50(螢光抗體-TCID50)、101.0FA-TCID50、101.5FA-TCID50、102.0FA-TCID50、102.5FA-TCID50、103.0TCID50、103.5 FA-TCID50、104.0FA-TCID50、104.5FA-TCID50或105.0FA-TCID50，或為至少2.5RID、3RID、5RID、10RID、30RID、100RID、150RID、300RID、750RID、1000RID、3000RID或7500RID，及/或該PRV疫苗之免疫有效量為至少103.0TCID50、103.5TCID50、104.0TCID50、104.5TCID50、105.0TCID50、105.5TCID50或106.0TCID50。
  28. 如請求項26之疫苗組合物，其中該PRRSV疫苗與該CSFV疫苗之TCID50比率在10000：1至1：1範圍內。
  29. 如請求項26之疫苗組合物，其中該PRRSV疫苗與該PRV疫苗之TCID50比率在1：1至1：30範圍內。
  30. 如請求項26之疫苗組合物，其中該PRRSV疫苗：該CSFV疫苗：該PRV疫苗之TCID50比率在約104：1：105至約5：1：6範圍內。
  31. 如請求項1之疫苗組合物，其另外包含佐劑。
  32. 如請求項1之疫苗組合物，其另外包含低溫保護劑(cryoprotectant)。
  33. 如請求項32之疫苗組合物，其中該低溫保護劑包含蔗糖、L-麩胺酸鈉及/或乳白蛋白水解產物。
  34. 一種製備如請求項1至33中任一項之疫苗組合物之方法，其包含：(a)收集PRRSV疫苗株、CSFV疫苗株及/或PRV疫苗株，其係在其各別易感細胞中培養，及(b)以合適TCID50比率混合兩種或兩種以上該等病毒 株。
  35. 如請求項34之方法，其中該PRRSV疫苗株之易感細胞為選自由Marc-145、MA-104、Vero及CL-2621組成之群的細胞株，或為PAM細胞之初代細胞。
  36. 如請求項34之方法，其中該CSFV疫苗株之易感細胞為選自由BT、Vero、MPK、SK6、PK2a、CPK、RKC、MDBK、MDCK、CRFK、ST及PT組成之群的細胞株，或為BT細胞之初代細胞。
  37. 如請求項34之方法，其中該PRV疫苗株之易感細胞為選自由ST、PK-15、Marc-145、MDBK、BT、Vero、BHK-21、豬腎細胞株(IBRS-2)、兔腎細胞株(RK)及雞胚胎纖維母細胞株組成之群的細胞株，或為豬腎初代細胞之初代細胞。
  38. 如請求項34之方法，其中該培養包含將各疫苗株接種至滾瓶培養物中細胞密度在1×106個/毫升至5×106個/毫升範圍內之其易感細胞，或生物反應器中引入有黏著載體之懸浮培養物中細胞密度在5×106個/毫升至1×107個/毫升範圍內之其易感細胞。
  39. 如請求項38之方法，其中該PRRSV疫苗係以0.01-0.5之感染倍率(MOI)接種，該CSFV疫苗株係以0.1-0.5之MOI接種，及/或該PRV疫苗株係以0.005-0.5之MOI接種。
  40. 如請求項34之方法，其中該步驟(b)包含以10000：1至1：1之TCID50比率混合該所收集之PRRSV疫苗病毒及該CSFV疫苗病毒。
  41. 如請求項34之方法，其中該步驟(b)包含以1：1至1：30之TCID50比率混合該所收集之PRRSV疫苗病毒及該PRV疫苗病毒。
  42. 如請求項34之方法，其中該步驟(b)包含以104：1：105至約5：1：6之TCID50比率混合該所收集之PRRSV疫苗病毒、該CSFV疫苗病毒及該PRV疫苗病毒。
  43. 如請求項34之方法，其中該步驟(b)另外包含混合所收集病毒溶液之混合物與低溫保護劑。
  44. 如請求項43之方法，其中該所收集病毒溶液之混合物與該低溫保護劑係以75至80：25至20之體積比混合。
  45. 一種疫苗組合物，其係使用如請求項34至44中任一項之方法製備。
  46. 一種如請求項1至33及45中任一項之疫苗組合物之用途，其係用於製造用以預防或治療豬生殖及呼吸症候群、豬瘟及/或假性狂犬病之藥劑。
  47. 一種如請求項1至33及45中任一項之疫苗組合物之用途，其係用於製造用以對豬進行免疫之藥劑。
  48. 如請求項1之疫苗組合物，其中該CSFV係以選自由ST、PK-15、Marc-145、MDBK、BT、PT、Vero、BHK-21、豬腎細胞株(IBRS-2)、兔腎細胞株(RK)及雞胚胎纖維母細胞株組成之群的細胞株或為豬腎初代細胞之初代細胞培養。
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