CN101991849A - 一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤：用猪睾丸细胞培养病毒，当细胞长满单层时，接种猪伪狂犬病病毒，然后加入细胞维持液中，静止或旋转培养，当细胞有80％以上出现病变时，收获细胞培养物，反复冻融得到含上清液的细胞毒液，将毒价检测合格的细胞毒液与甲醛混合进行灭活，再与乳化剂混合乳化，得到猪伪狂犬病灭活疫苗。与现有技术相比，本发明配制疫苗用的毒株具有较强的毒力、毒株病毒效价高、猪伪狂犬病灭活疫苗的免疫原性好、免疫周期长、采用的制备方法工艺合理，价格较低，极大降低养殖业的成本负担。

Description

一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及一种疫苗的制备方法，尤其是涉及一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法。

背景技术

伪狂犬病(Pseudo rabies，PR)是一种发生于家畜及野生哺乳动物中以发热、奇痒(猪除外)以及脑脊髓炎为主要症状的一种传染病。该病是典型的自然疫源性疾病，猪是其主要宿主和传染源，给养猪业造成的经济损失仅次于猪瘟。在除猪以外的其他动物中，该病多以散发的形式发生，疾病发生以后，均以死亡而告终。

由于伪狂犬病所引起的损失仅次于口蹄疫及猪瘟，已成为欧洲一些国家重点防疫的猪病之一，PR分布具有世界性20世纪中期PR在东欧及巴尔干半岛的国家流行较广，60年代之前，猪被感染后其症状比较温和在养猪业中未造成重大经济损失；60-70年代由于强毒株的出现猪场爆发PR的数量显著增加而且各种日龄的猪均可感染其症状明显加剧，这种变化不仅存在于美国在西欧各国如德国法国意大利比利时爱尔兰等国家也同样存，在几年之后此病相继传入新西兰日本我国的台湾及南美的一些国家和地区。而国内的情况是：60年代以前猪被感染后症状比较温和，病例也比较少见，70年代本病只有零星散发，80年代以后出现地方流行和零星散发流行；90年代则表现地方流行和暴发的趋势，由于强毒株的出现，猪场爆发PR的数量显著增加，症状明显加剧，现在已有40多个国家报道40多种动物感染该病，在我国已有24个省市报道发生此病。近几年PR在我国许多省(市)种猪场呈爆发流行趋势。

虽然国内伪狂犬病病毒有许多分离株，但具有较强免疫原性伪狂犬病病毒的分离却不多，且不同的地区不同时间段分离的毒株也有些差异。具有较强免疫原性伪狂犬病病毒的分离，可以为研制伪狂犬病灭活疫苗打下良好基础，我们实验室分离到的猪伪狂犬病病毒(PRV-sh株)就具有毒力强、免疫原性好等特点。

由于PRV血清型单一、免疫原性高，使得疫苗接种成为控制PRV感染的一种行之有效的方法。目前研制PRV疫苗有灭活疫苗与弱毒活疫苗，两者在临床应用时均有缺陷。灭活疫苗虽然安全性好，但它具有免疫效力不佳、接种剂量较大，而且在接种24小时后偶尔出现过敏反应等缺陷。在弱毒苗方面，各国培育的弱毒苗品系很多，最常用的为Bartha株、Bucharest株。弱毒疫苗免疫原性好，在接种后虽然能预防临床症状的出现，但不能防止强毒在被感染动物体内复制、排出和形成潜伏感染，之外是否可造成毒力返强，还有待进一步研究。

我们研究的猪伪狂犬病灭活疫苗采用自己分离的具有较强免疫原性伪狂犬病病毒，免疫效果好；在工艺生产中使用了进口的油佐剂，避免了现有灭活疫苗在免疫后出现的不良反应；在疫苗的乳化中采用的是双相疫苗的配制方法，增强了疫苗的免疫效果，同时降低了疫苗的棉衣剂量。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种病毒效价高、免疫原性好的猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)将猪睾丸细胞培养在生长液中，当细胞长满单层时，在该细胞中接种猪伪狂犬病病毒，控制温度35-37℃，将猪睾丸细胞单层吸附猪伪狂犬病病毒1-2h；

(2)控制温度为35-37℃，将吸附了猪伪狂犬病病毒的猪睾丸细胞单层置于细胞维持液中，静止或旋转培养；

(3)当上述猪睾丸细胞有80％以上出现病变时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液；

(4)取上清液测定毒价，然后将检测合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入甲醛溶液，充分摇匀，细胞毒液与甲醛溶液的体积比为100∶(0.15-0.2)，控制温度在35-37℃灭活45-50h；

(5)将上述步骤中得到的毒液与乳化剂按体积比为1∶1进行混合乳化，得到猪伪狂犬病灭活疫苗。

所述的步骤(1)中的生长液包括重量百分浓度为5-8％的新生牛血清MEM。

所述的步骤(1)中的猪伪狂犬病病毒是从患有猪伪狂犬病的病猪分离得到的毒株，该毒株的毒价TCID₅₀≥10^8.0/ml，将该毒株的重量百分浓度稀释至0.05-0.2％。

所述的步骤(2)中的细胞维持液包括重量百分浓度为0.5-2％的新生牛血清MEM。

所述的步骤(3)中冻融后的细胞毒液置于-20℃以下保存。保存时间不超过30天。

所述的步骤(4)中检测合格的细胞毒液的每头份病毒含量10^7.5TCID₅₀。

所述的步骤(4)中甲醛溶液的重量百分浓度为35-38％。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)配制疫苗用的毒株具有较强的毒力：猪伪狂犬病病毒株接种单层细胞后，一般可在18-24h出现细胞病变，细胞病变最明显的时期为接种后32-48h，开始呈散在的灶状，随后逐渐扩展，直至全部细胞圆缩、脱落；猪伪狂犬病病毒株接种兔子后三十多小时兔子开始死亡，将毒株稀释10⁷倍后接种兔子仍有半数以上死亡；

(2)配制疫苗用的毒株病毒效价高：猪伪狂犬病病毒株接种单层细胞后，其他毒株的病毒效价仅为10^7.0/ml而分离出的毒株(PRV-sh株)的病毒效价可以达到10^8.0/ml；

(5)猪伪狂犬病灭活疫苗的免疫原性好：将繁殖的病毒灭活配制成双相灭活疫苗，优于市场上现有的单相灭活疫苗。免疫仔猪1.5ml后可抗强毒攻击；两次免疫母猪2ml或一次免疫母猪5ml后可抗强毒攻击。比现行伪狂犬病灭活疫苗的剂量仔猪2ml、两次免疫母猪3ml要低；

(6)免疫周期长：免疫仔猪后抗体可持续6个月，一次免疫母猪后抗体可持续4个月；

(7)采用的制备方法工艺合理，价格较低，极大降低养殖业的成本负担。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将猪睾丸(ST)细胞置于重量百分浓度为8％的新生牛血清MEM的生长液中，制备ST细胞，当细胞长满单层时接毒；

(2)从患有猪伪狂犬病的病猪体内分离出猪伪狂犬病病毒(PRV-sh株)，其毒价TCID₅₀≥10^8.0/ml，将该毒株稀释至重量百分浓度为0.1％，接种到步骤(1)得到的长势良好的猪睾丸细胞单层，在37℃控制猪睾丸细胞吸附猪伪狂犬病病毒1h，然后将该置于重量百分浓度为2％的新生牛血清MEM的细胞维持液，控制温度为37℃静止培养；

(3)每日观察2次，记录细胞病变情况，当80％以上细胞出现细胞病变时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液，将该细胞毒液置于-20℃以下保存，保存期限不超过30天；

(4)取上清液测定毒价，每头份病毒含量≥10^7.5TCID₅₀为合格，将合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入重量百分浓度为36％的甲醛，细胞毒液与甲醛的体积比为100∶0.2，充分摇匀，37℃灭活48h；

(5)将检验合格的细胞毒液与市售的Montanide ISA206佐剂按照1∶1混合乳化后，配制成猪伪狂犬病灭活疫苗。

应用本发明研制的猪伪狂犬病灭活疫苗，每头份病毒含量应≥10^7.5TCID₅₀。仔猪免疫后7个月攻毒仍能抵抗PRV强毒的攻击，免疫持续期至少可维持6个月；母猪免疫后5个月攻毒仍能抵抗PRV强毒的攻击，2～8℃保存期为12个月。

猪体接种疫苗后基本上无不良临床反应，个别猪可能会出现过敏反应，可使用抗过敏药物进行脱敏治疗。免疫猪食欲、体温正常，精神状态良好，安全性好。接种母猪的生产性能得到了提高，产生了良好的社会和经济效益，对于预防猪伪狂犬病引起的母猪繁殖障碍起到了积极的作用。

本发明制得的疫苗的使用及注意事项：

1.作用与用途

用于预防猪伪狂犬病。

2.用法与用量

颈部肌肉注射。仔猪，断奶时每头2ml，种猪每头2ml，间隔28天后加强免疫接种1次以后每隔半年加强免疫一次。怀孕母猪产前一个月加强免疫一次。

3.注意事项

3.1疫苗应避光保存，切忌冻结。

3.2使用前应先将疫苗恢复至室温，并充分摇匀。

3.3启封后应当天用完。

3.4应对注射部位进行严格消毒。

3.5剩余的疫苗及用具，应经无害化处理后废弃。

4.贮藏

2～8℃保存，有效期为12个月。

实施例2

一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)猪睾丸(ST)细胞置于重量百分浓度为5％的新生牛血清MEM的生长液中，制备ST细胞，当细胞长满单层时接毒；

(2)从患有猪伪狂犬病的病猪体内分离出猪伪狂犬病病毒(PRV-sh株)，其毒价TCID₅₀≥10^8.0/ml，将该毒株稀释至重量百分浓度为0.1％，接种到步骤(1)得到的长势良好的猪睾丸细胞单层，在37℃控制猪睾丸细胞吸附猪伪狂犬病病毒1h，然后将该置于重量百分浓度为2％的新生牛血清MEM的细胞维持液，控制温度为37℃旋转培养；

(3)每日观察2次，记录细胞病变情况，当80％以上细胞出现细胞病变时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液，将该细胞毒液置于-20℃以下保存，保存期限不超过30天；

(4)取上清液测定毒价，每头份病毒含量≥10^7.5TCID₅₀为合格，将合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入重量百分浓度为36％的甲醛，细胞毒液与甲醛的体积比为100∶0.2，充分摇匀，37℃灭活48h；

(5)将检验合格的细胞毒液与市售的Montanide ISA206佐剂按照1∶1混合乳化后，配制成猪伪狂犬病灭活疫苗。

应用本发明研制的猪伪狂犬病灭活疫苗，每头份病毒含量应≥10^7.5TCID₅₀。仔猪免疫后7个月攻毒仍能抵抗PRV强毒的攻击，免疫持续期至少可维持6个月；母猪免疫后5个月攻毒仍能抵抗PRV强毒的攻击，2～8℃保存期为12个月。

实施例3

一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将猪睾丸(ST)细胞置于重量百分浓度为5％的新生牛血清MEM的生长液中，制备ST细胞，当细胞长满单层时接毒；

(2)从患有猪伪狂犬病的病猪体内分离出猪伪狂犬病病毒(PRV-sh株)，其毒价TCID₅₀≥10^8.0/ml，将该毒株稀释至重量百分浓度为0.05％，接种到步骤(1)得到的长势良好的猪睾丸细胞单层，在35℃控制猪睾丸细胞吸附猪伪狂犬病病毒0.5h，然后将该置于重量百分浓度为0.5％的新生牛血清MEM的细胞维持液，控制温度为35℃静止培养；

(3)每日观察2次，记录细胞病变情况，当80％以上细胞出现细胞病变时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液，将该细胞毒液置于-20℃以下保存，保存期限不超过30天；

(4)取上清液测定毒价，每头份病毒含量≥10^7.5TCID₅₀为合格，将合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入重量百分浓度为35％的甲醛，细胞毒液与甲醛的体积比为100∶0.15，充分摇匀，35℃灭活48h；

(5)将检验合格的细胞毒液与市售的Montanide ISA206佐剂按照1∶1混合乳化后，配制成猪伪狂犬病灭活疫苗。

实施例4

一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)按照常规方法将猪睾丸(ST)细胞置于重量百分浓度为8％的新生牛血清MEM的生长液中，制备ST细胞，当细胞长满单层时接毒；

(2)从患有猪伪狂犬病的病猪体内分离出猪伪狂犬病病毒(PRV-sh株)，其毒价TCID₅₀≥10^8.0/ml，将该毒株稀释至重量百分浓度为0.2％，接种到步骤(1)得到的长势良好的猪睾丸细胞单层，在36℃控制猪睾丸细胞吸附猪伪狂犬病病毒0.5h，然后将该置于重量百分浓度为1.5％的新生牛血清MEM的细胞维持液，控制温度为36℃静止培养；

(3)每日观察1次，记录细胞病变情况，当80％以上细胞出现细胞病变时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液，将该细胞毒液置于-20℃以下保存，保存期限不超过30天；

(4)取上清液测定毒价，每头份病毒含量≥10^7.5TCID₅₀为合格，将合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入重量百分浓度为38％的甲醛，细胞毒液与甲醛的体积比为100∶0.2，充分摇匀，37℃灭活48h；

(5)将检验合格的细胞毒液与市售的Montanide ISA206佐剂按照1∶1混合乳化后，配制成猪伪狂犬病灭活疫苗。

Claims (7)

1.一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)将猪睾丸细胞培养在生长液中，当细胞长满单层时，在该细胞中接种猪伪狂犬病病毒，控制温度35-37℃，将猪睾丸细胞单层吸附猪伪狂犬病病毒1-2h；

(2)控制温度为35-37℃，将吸附了猪伪狂犬病病毒的猪睾丸细胞单层置于细胞维持液中，静止或旋转培养；

(3)当上述猪睾丸细胞有80％以上出现病变时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液；

(4)取上清液测定毒价，然后将检测合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入甲醛溶液，充分摇匀，细胞毒液与甲醛溶液的体积比为100∶(0.15-0.2)，控制温度在35-37℃灭活45-50h；

(5)将上述步骤中得到的毒液与乳化剂按体积比为1∶1进行混合乳化，得到猪伪狂犬病灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的生长液包括重量百分浓度为5-8％的新生牛血清MEM。

3.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的猪伪狂犬病病毒是从患有猪伪狂犬病的病猪分离得到的毒株，该毒株的毒价TCID₅₀≥10^8.0/ml，将该毒株的重量百分浓度稀释至0.05-0.2％。

4.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的细胞维持液包括重量百分浓度为0.5-2％的新生牛血清MEM。

5.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中冻融后的细胞毒液置于-20℃以下保存，保存时间不超过30天。

6.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中检测合格的细胞毒液的每头份病毒含量≥10^7.5TCID₅₀。

7.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中甲醛溶液的重量百分浓度为35-38％。