具体实施方式
实验材料:
伪狂犬疫苗种毒毒液:伪狂犬疫苗种毒SA215株,是《中国兽用生物制品使用指南》收载生产伪狂犬疫苗用种毒毒株,购自四川农业大学。
鸡滑液支原体、猪鼻支原体:两株支原体阳性质控菌株,均为《中国兽药典》明文规定兽用生物制品质控使用的支原体阳性参照菌株,购自中国兽医药品监察所。
阳离子脂质体试剂盒,购自美国Invitrogen公司。
支原体PCR检测试剂盒,购自无锡博慧思公司。
营养液,MEM培养基。
支原体培养基购自中国兽医药品监察所,配制方法见《中华人民共和国兽用生物制品规程(2000年版)》。
Vero细胞:细胞为中国典型培养物保藏中心(CTCC)购入的非洲绿猴肾细胞-Vero细胞,经该单位系统鉴定无支原体及其它外源微生物污染。
实施例1用本发明方法除去伪狂犬疫苗种毒中的支原体
1、实验方法
(1)抽提基因组DNA:将经检测纯净的伪狂犬疫苗种毒毒液分别混入具有活性的支原体禽源(鸡滑液支原体)和非禽源(猪鼻支原体)阳性质控菌株,即人工模拟种毒遭受支原体污染,将此种毒液参照《分子克隆试验指南》一书中报道方法,抽提基因组DNA。
具体步骤为:将600μl病毒液(病毒液中伪狂犬病毒的滴度PFU需大于或者等于1×106个/ml,保证转染的效率)加到1.5mlEP管中,加入蛋白酶K(10μg/ml)25μl摇振混匀置37℃作用30min,其间摇匀数次,然后添加600μl Tris-饱和酚,手摇5min,13,000r/min离心5min;小心吸取上清再加酚600μl手摇5min后,13,000r/min离心5min,取上清用600μl酚∶氯仿(1∶1)抽提,手摇5min,13,000r/min离心5min(此步可反复进行以得到较纯的DNA),再用氯仿以同样的方法抽提一次;取上清加5μl RNase(100μg/ml),手摇5min混匀后37℃作用10min;加1倍量冰冻异丙醇混匀,沉淀1h后13,000r/min离心5min,弃去异丙醇再加入2倍量75%冰冻乙醇混匀5min,13,000r/min离心15min后弃去上清,待乙醇彻底挥发后加入40μlPBS,置于37℃温箱15min充分溶解,放入-20℃冰箱备用,此间避免反复冻融;
(2)按照阳离子脂质体试剂盒说明书操作,将抽提的DNA产物与阳离子脂质体混合:取2支Eppendorf离心管分别标记为1、2号。在1号管中加入5-6μg抽提的基因组DNA及250μl营养液(不含血清和抗生素)并轻轻混匀;2号管中加入10μl阳离子脂质体和250μl营养液(不含血清和抗生素)并轻轻混匀,5min内,将2号管内的悬液缓缓加入1号管内,使二者缓慢均匀混合,置室温作用20-30min,可见脂质体与DNA形成细小沉淀样颗粒;
(3)转染:按常规方法将预先培养在细胞瓶内的Vero细胞消化、吹散,细胞悬液加入到六孔盘中,每孔数量控制在24h-30h后细胞密度为70%-75%,将上述脂质体与DNA形成细小沉淀样颗粒加入密度为70%-75%的细胞之上作用6h左右,后弃去混合液换入新鲜生长液置于37℃培养箱继续培养,待5-6天出现明显病变后即可冻融收获毒液;
细胞密度:经目测,六孔盘每孔内细胞生长面积占六孔盘每孔总面积的百分比,其是本领域表示细胞生长程度的常用标准。
(4)处理结果检验
a、将此毒液按照《中华人民共和国兽用生物制品规程(2000年版)》中所述培养法检测病毒液中是否存在支原体。步骤如下:将要检验的制品加入事先配制好的检测液体培养基(即支原体培养基)中,设阴阳性对照,置于37℃培养,如有支原体污染的制品,支原体在培养基中繁殖,造成pH值变化,从而使指示剂变色,由此根据颜色的变化来判定制品是否污染支原体,无支原体的培养基呈橙红色,而污染支原体的培养基呈黄色。
b、用无锡博慧斯公司产品支原体PCR检测试剂盒检测病毒液中是否存在支原体;
c、按照《猪伪狂犬病疫苗SA215株制造及检验规程》对复活出病毒的增殖能力、免疫原性及安全性进行检测并与未受污染前的种毒进行对比。
2、实验结果
(1)培养法检测结果:由图1和图2可知,猪鼻支原体、、鸡滑液支原体作为阳性对照和人工模拟的被猪鼻支原体、鸡滑液支原体污染的病毒液中含有支原体,而采用本发明方法清除支原体重新获得的病毒液与阴性对照中则无支原体,说明本发明提供的方法可清除杀灭支原体,且支原体DNA绝无可能复活出新的子代支原体,而复活出的新病毒按照《中国兽药典》规定的培养法未检出存活支原体;
PCR法检测结果:由图3可知,用商品化支原体PCR检测试剂盒检测采用本发明方法清除支原体重新获得的病毒液,未检出支原体特异性核酸片段(约250bp),同时禽源支原体及非禽源支原体阳性对照和阴性对照均成立,说明清除支原体是彻底的。
(2)按照《猪伪狂犬病疫苗SA215株制造及检验规程》对复活出病毒的增殖能力、免疫原性及安全性进行检测,并与未受污染前的种毒进行对比,结果见表1:
表1病毒的增殖能力、免疫原性及安全性检测结果
由表1可知,本发明制备方法很好地保持了伪狂犬种毒活性,通过DNA转染复活出了新的伪狂犬病毒,以此为种毒再经Vero细胞大量增殖两代以后,按照《猪伪狂犬病疫苗SA215株制造及检验规程》相关要求进行检测,结果显示用此发明方法处理后得到的种毒进一步繁殖出的子代病毒的增殖能力、免疫原性及安全性与污染前的病毒无明显区别,说明该方法未对该病毒生物学活性造成影响,可以用于后续疫苗生产。
(3)由图4可知,转染细胞后病毒复活的时间短,适用于产业化生产。
实验说明本发明提供的方法可以彻底除去混入伪狂犬疫苗种毒SA215株(伪狂犬疫苗种毒SA215株是《中国兽用生物制品使用指南》收载生产伪狂犬疫苗用种毒毒株)中的两株支原体阳性质控菌株(鸡滑液支原体、猪鼻支原体均为《中国兽药典》明文规定兽用生物制品质控使用的支原体阳性参照菌株),且伪狂犬疫苗种毒SA215株的增殖能力、免疫原性及安全性均未受到影响。实验证明本发明提供的方法可以彻底除去伪狂犬疫苗种毒中的支原体,且能保持伪狂犬种毒活性。
实施例2参数筛选实验
1、实验方法
(一)、DNA与脂质体的质量体积比筛选实验
(1)抽提基因组DNA:将经检测纯净的伪狂犬疫苗种毒毒液分别混入具有活性的支原体禽源(鸡滑液支原体)和非禽源(猪鼻支原体)阳性质控菌株,即人工模拟种毒遭受支原体污染,抽提病毒基因组DNA。
(2)按照阳离子脂质体试剂盒说明书操作,将抽提的DNA产物与阳离子脂质体混合:取2支Eppendorf离心管分别标记为1、2号。在1号管中加入5-6μg抽提的基因组DNA及250μl营养液(不含血清和抗生素)并轻轻混匀;2号管中加入5μl、10μl、15μl或者20μl阳离子脂质体和250μl营养液(不含血清和抗生素)并轻轻混匀,5min内,将2号管内的悬液缓缓加入1号管内,使二者缓慢均匀混合,置室温作用20-30min,可见脂质体与DNA形成细小沉淀样颗粒;
(3)转染:按常规方法将预先培养在细胞瓶内的Vero细胞消化、吹散,细胞悬液加入到六孔盘中,每孔数量控制在24h-30h后细胞密度为80-85%,将上述脂质体与DNA形成细小沉淀样颗粒加入密度为80-85%的细胞之上作用6h左右,后弃去混合液换入新鲜生长液置于37℃培养箱继续培养,待5-6天出现明显病变后即可冻融收获毒液。
(4)观察细胞产生病变的明显程度和病变数,确定转染成功率。
(二)、细胞密度筛选实验
(1)抽提基因组DNA:将经检测纯净的伪狂犬疫苗种毒毒液分别混入具有活性的支原体禽源(鸡滑液支原体)和非禽源(猪鼻支原体)阳性质控菌株,即人工模拟种毒遭受支原体污染,抽提病毒基因组DNA。
(2)按照阳离子脂质体试剂盒说明书操作,将抽提的DNA产物与阳离子脂质体混合:取2支Eppendorf离心管分别标记为1、2号。在1号管中加入5-6μg抽提的基因组DNA及250μl营养液(不含血清和抗生素)并轻轻混匀;2号管中加入10μl阳离子脂质体和250μl营养液(不含血清和抗生素)并轻轻混匀,5min内,将2号管内的悬液缓缓加入1号管内,使二者缓慢均匀混合,置室温作用20-30min,可见脂质体与DNA形成细小沉淀样颗粒;
(3)转染:按常规方法将预先培养在细胞瓶内的Vero细胞消化、吹散,细胞悬液加入到六孔盘中,每孔数量控制在24h-30h后细胞密度为65%-70%、70%-75%或者80-85%,将上述脂质体与DNA形成细小沉淀样颗粒加入密度为65%-70%、70%-75%或者80-85%的细胞之上作用6h左右,后弃去混合液换入新鲜生长液置于37℃培养箱继续培养,待5-6天出现明显病变后即可冻融收获毒液。
(4)观察细胞产生病变的明显程度和病变数,确定转染成功率。
2、实验结果
(一)、DNA与脂质体的质量体积比筛选实验
经检测,DNA与脂质体的质量体积比为5-6μg∶10μl使用比例转染的成功率最高。
(二)、细胞密度筛选实验
经检测,细胞密度为70%-75%时转染的效率最高。
实施例3用本发明提供的方法处理受支原体污染的伪狂犬疫苗种毒
1、实验材料
生产过程中受支原体污染的伪狂犬病疫苗种毒(经《中华人民共和国兽用生物制品规程(2000年版)》中所述培养法及无锡博慧斯公司产品支原体PCR检测试剂盒所述方法检测确定该病毒液中确实存在支原体)
2、试验方法
(1)抽提基因组DNA:取生产过程中受支原体污染的伪狂犬病疫苗种毒,抽提病毒基因组DNA。
具体步骤为:将600μl病毒液加到1.5mlEP管中,加入蛋白酶K(10μg/ml)25μl摇振混匀置37℃作用30min,其间摇匀数次,然后添加600μl Tris-饱和酚,手摇5min,13,000r/min离心5min;小心吸取上清再加酚600μl手摇5min后,13,000r/min离心5min,取上清用600μl酚∶氯仿(1∶1)抽提,手摇5min,13,000r/min离心5min(此步可反复进行以得到较纯的DNA),再用氯仿以同样的方法抽提一次;取上清加5μl RNase(100μg/ml),手摇5min混匀后37℃作用10min;加1倍量冰冻异丙醇混匀,沉淀1h后13,000r/min离心5min,弃去异丙醇再加入2倍量75%冰冻乙醇混匀5min,13,000r/min离心15min后弃去上清,待乙醇彻底挥发后加入40μlPBS,置于37℃温箱15min充分溶解,放入-20℃冰箱备用,此间避免反复冻融。
(2)按照阳离子脂质体试剂盒说明书操作,将抽提的DNA产物与阳离子脂质体混合:取2支Eppendorf离心管分别标记为1、2号。在1号管中加入5-6μg抽提的基因组DNA及250μl营养液(不含血清和抗生素)并轻轻混匀;2号管中加入10μl阳离子脂质体和250μl营养液(不含血清和抗生素)并轻轻混匀,5min内,将2号管内的悬液缓缓加入1号管内,使二者缓慢均匀混合,置室温作用20-30min,可见脂质体与DNA形成细小沉淀样颗粒;
(3)转染:按常规方法将预先培养在细胞瓶内的Vero细胞消化、吹散,细胞悬液加入到六孔盘中,每孔数量控制在24h-30h后细胞密度为70%-75%,将上述脂质体与DNA形成细小沉淀样颗粒加入密度为70%-75%的细胞之上作用6h左右,后弃去混合液换入新鲜生长液置于37℃培养箱继续培养,待5-6天出现明显病变后即可冻融收获毒液。
(4)处理结果检验
a、将此毒液按照《中华人民共和国兽用生物制品规程(2000年版)》中所述培养法检测病毒液中是否存在支原体。步骤如下:将要检验的制品加入事先配制好的检测液体培养基(即支原体培养基)中,设阴阳性对照,置于37℃培养,如有支原体污染的制品,支原体在培养基中繁殖,造成pH值变化,从而使指示剂变色,由此根据颜色的变化来判定制品是否污染支原体,无支原体的培养基呈橙红色,而污染支原体的培养基呈黄色。
b、用无锡博慧斯公司产品支原体PCR检测试剂盒检测病毒液中是否存在支原体;
c、按照《猪伪狂犬病疫苗SA215株制造及检验规程》对复活出病毒的增殖能力、免疫原性及安全性进行检测并与未受污染前的种毒进行对比。
3、实验结果
(1)培养法检测结果:由图5可知,含有猪鼻支原体和鸡滑液支原体的种毒液作为阳性对照含有支原体,而采用本发明方法处理后的种毒液与阴性对照中则无支原体;
PCR法检测结果:由图6可知,用商品化支原体PCR检测试剂盒检测采用本发明方法清除支原体重新获得的病毒液,未检出支原体特异性核酸片段(约250bp),同时禽源支原体及非禽源支原体阳性对照和阴性对照均成立,说明清除支原体是彻底的。
(2)由图7可知,本发明方法处理后的种毒转染后6天即出现大量噬菌斑,说明种毒的增殖能力未受影响。
按照《猪伪狂犬病疫苗SA215株制造及检验规程》对复活出病毒的增殖能力、免疫原性及安全性进行检测,并与未受污染前的种毒进行对比,结果见表2:
表2病毒的增殖能力、免疫原性及安全性检测结果
由表2可知,本发明制备方法能很好地保持伪狂犬种毒活性,通过DNA转染复活出了新的伪狂犬病毒,以此为种毒再经Vero细胞大量增殖两代以后,按照《猪伪狂犬病疫苗SA215株制造及检验规程》相关要求进行检测,结果显示用此发明方法处理后得到的种毒进一步繁殖出的子代病毒的增殖能力、免疫原性及安全性与污染前的病毒相当,说明该方法未对该病毒生物学活性造成影响,可以用于后续疫苗生产。
综上,本发明提供的方法可以彻底除去伪狂犬疫苗种毒中的支原体,且能保持种毒的活性,容易制得效果好、安全性高的伪狂犬疫苗,克服了人们一直渴望解决但始终未能取得成功的技术难题,且操作简便,耗时短,具有较强的工业应用价值。