CN102094064A - 一种新的伪狂犬病活疫苗的效力检验方法 - Google Patents

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杜久斌
李延涛
刘淑梅
黄炯
赵钦
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Abstract

本发明的一种新的伪狂犬病活疫苗的效力检验方法，其中Vero细胞的制备：抽取密度为2.0×106的Vero细胞1.5ml，置于37℃水浴中，快速晃动溶解4-5分钟，在2000rmp/min条件下，离心5分钟，弃去上清，加入1-3ml细胞培养液，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，培养48小时后，用浓度0.25%的EDTA-胰酶消化液消化细胞后再用细胞营养液稀释成2.0×106的Vero细胞悬液，铺到细胞板上，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，培养24小时后长成致密单层备用；抽取1头份伪狂犬病毒活疫苗，用细胞维持液作10倍的梯度稀释，取样分别加入上述的致密单层的96孔细胞板中，每孔加细胞维持液，放入37℃、5％的CO2培养箱中培养，观察3-5天细胞病变，采用Reed-Muench法计算TCID50/0.1ml效价，每头份病毒含量应不低于5×103.0TCID50。

Description

一种新的伪狂犬病活疫苗的效力检验方法
技术领域
 本研究采用Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）测定伪狂犬病活疫苗TCID50（半数组织培养物感染量）的方法，与CEP（单层鸡胚成纤维细胞）测定伪狂犬病活疫苗TCID50的方法相比省时、省力。
背景技术
伪狂犬病活疫苗效力检验方法是使用鸡胚成纤维细胞进行效力检验，但是使用SPF鸡胚制备成纤维细胞时，需要将鸡胚孵化至9-10日龄，时间较长，此外制备过程中批次间差异大，接毒培养数日后，由于对照细胞部分脱落，观察病变时往往受到空白对照的影响，尤其是倍比稀释度高的接种瓶的细胞病变与空白对照瓶中老化脱落细胞难以判断，影响了最终判定结果。
文献检索披露：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所刘景利等人进行了伪狂犬强毒S株TCID50与LD50毒价对比试验研究方法：取伪狂犬强毒S株45代以Hank's液10倍递增稀释至10-8倍，分两组；一组以10-5～10-8等4个稀释度接种已培养好的鸡胚成纤维单层细胞(20m培养瓶)，每个滴度接种4个小瓶，每瓶接种O.1ml,然后每小瓶加维持液4ml，设4瓶细胞为对照组；37℃培养，接毒24h后观察产生病变情况，观察96h结束。另一组以同样稀释度范围(10-5～10-8)接种兔，每个稀释度接种兔，每只兔腿部肌肉接种1ml，每日观察兔发病死亡情况，观察7天结束；根据初步实验结果得出，S株45代毒的毒价在兔体上与在鸡胚成纤维细胞上基本一致；结论：伪狂犬强毒毒价可用TCID50与LD50两种方法测定，但由于在测定LD50过程中，需接种实验动物，一方面过程相对比较繁琐，另一方面实验动物的个体差异及饲养条件等因素均可能会对结果有所影响；而在测定TCID50过程中，由于使用10日龄SPF鸡胚培养的鸡胚成纤维单层细胞的稳定性较好，且试验全过程均在实验室中进行，试验较容易进行，结果受外界因素影响较小。本研究与上述的相关文献对比分析，两者伪狂犬病毒疫苗效力的检验方法截然不同。
本发明构思是将疫苗接种在VERO细胞、PK-15细胞和CEF三种细胞上，测定的毒价,其结果表明,采用VERO细胞代替鸡胚成纤维细胞测定伪狂犬病活疫苗的效价是可行的, 准确的，有应用价值的。
发明内容
本发明的目的在于：提供的伪狂犬病活疫苗效力检验方法，替代了单层鸡胚成纤维细胞测定伪狂犬病活疫苗的方法，使效力检验更准确、便于操作。
本发明是这样实现的：一种新的伪狂犬病活疫苗的效力检验方法，采用Vero细胞测定伪狂犬病毒活疫苗TCID50的方法，分步如下；
其中Vero细胞的制备： 
抽取密度为2.0×106的Vero冻存细胞1.5ml，置于37℃水浴中，晃动溶解4-5分钟，在2000rmp/min条件下，离心5分钟，弃去上清，加入1-3ml细胞培养液，转入培养瓶中，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，培养48小时后，用浓度0.25%的EDTA-胰酶消化细胞，再用细胞营养液稀释成2.0×106的Vero细胞悬液，铺到细胞板上，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，培养24小时成致密单层备用；
其中伪狂犬病活疫苗的接种：
抽取1头份伪狂犬病活疫苗，用细胞维持液作10倍的梯度稀释，取10-3-10-7的滴度样，分别加入上述的致密单层中，每孔100ul，同时设对照每孔加细胞维持液100ul，放入37℃、5％的CO2培养箱中培养，观察3-5天细胞病变，计算TCID50/0.1ml效价，每头份病毒含量应不低于5×103.0TCID50。
所述的检验方法，所用细胞培养液由5gMEM干粉培养基，90ml注射用水，胎牛血清10ml配制而成。
所述的检验方法，所用细胞维持液由5gMEM干粉培养基，98ml注射用水，胎牛血清2ml配制而成。
所述的检验方法，使用Vero细胞进行伪狂犬病活疫苗效力检验的周期为8天，比CEP细胞检验缩短7天。
本方法选取3个生产批次的伪狂犬病活疫苗同时接种已经制备好的Vero细胞与鸡胚成纤维细胞（CEP）中，进行TCID50测定的对比实验，测定的结果通过T检验三者的差异性，鸡胚成纤维细胞和Vero细胞的T值为T1=0.08，鸡胚成纤维细胞和PK-15细胞的T值为T2=0.11值。计算得T1和T2所对应的P1，P2值均﹥0.05，则说明两组数据差异均不显著，由于T1﹤T2，鸡胚成纤维细胞和Vero细胞的差异呈极不显著，这说明用鸡胚成纤维细胞和Vero细胞测定伪狂犬弱毒的TCID50结果是相同的，与国家规定标准相符。
本发明采用Vero细胞测定伪狂犬病毒致病变作用比对CEP细胞的致病变作用快，病变特点明显，并不再需要孵化SPF鸡胚和制作CEP细胞；同时该方法简化了程序，缩短时间，降低了污染几率，彰显技术进步。
 
具体实施方式
下面将结合实施例对发明作进一步说明。
检测流程：复苏、培养Vero细胞步骤；疫苗稀释、接种、计算TCID50步骤；
(1)Vero细胞的制备： 
抽取密度为2.0×106的Vero细胞1.5ml，置于37℃水浴中，快速晃动溶解5分钟，在2000rmp/min条件下，离心5分钟，弃去上清，加入3ml细胞培养液，将细胞轻吹散，转入培养瓶中，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，培养48小时后，用浓度0.25%的EDTA-胰酶消化液消化细胞，再用细胞营养液稀释成2.0×106的Vero细胞悬液，铺到96孔细胞板上，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，培养24小时后成致密单层备用；
(2)伪狂犬病活疫苗的接种：
抽取1头份伪狂犬病毒活疫苗，用2%FBS细胞维持液作10倍的梯度稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的滴度样，分别加入上述的致密单层中，每个滴度加4孔，每孔100ul，同时设正常细胞对照孔4孔，每孔加细胞维持液，放入37℃、5％的CO2培养箱中培养，观察4天细胞病变，采用Reed-Muench法计算TCID50/0.1ml效价，每头份病毒含量应不低于5×103.0TCID50。
上述细胞培养液由5gMEM干粉培养基，90ml注射用水，胎牛血清10ml配制而成。
上述细胞维持液由5gMEM干粉培养基，98ml注射用水，胎牛血清2ml配制而成
选用的Vero细胞购自中国兽医药品监察所；MEM培养基为Hyclone公司生产，货号：SH30024.01B；胎牛血清为Hyclone公司生产，货号：SV30087.02；EDTA-胰酶消化液为兰州百灵公司生产。
试验结果见下表1。
⑴ 三种细胞接种伪狂犬病毒后的病变结果见表1。
表1. CEP、Vero细胞和PK-15细胞接种伪狂犬病毒后病变统计
Figure 2010105883224100002DEST_PATH_IMAGE002
注：“+”代表该细胞孔病变 ‘-’ 代表该细胞孔未发生病变
由上表细胞病变数据得知：在病毒稀释度较高的情况下，Vero细胞的病变比PK-15细胞和CEP细胞明显。
⑵  三种细胞毒价通过按reed—Muench法计算见表2。
 
由上表数据所述：CEP细胞和Vero细胞测定伪狂犬病活疫苗病毒TCID50结果差异极不显著，结果相当，批次间差异小。比PK-15细胞相对准确。
⑶ 三种细胞从制备到接毒按照检验周期计算结果见表3。
表3  CEP、Vero细胞和PK-15细胞检验伪狂犬活疫苗周期
由上表数据所述：使用Vero细胞和PK-15细胞进行伪狂犬病活疫苗效力检验的周期为8天，比CEP细胞检验缩短7天。
本发明采用伪狂犬病毒对Vero细胞的致病变效应比对CEP细胞的致病变效应快，病变特点明显.虽然用PK-15细胞也可以代替鸡胚成纤维细胞检测猪伪狂犬弱毒的效价检验，但从以上数据看没有Vero细胞更相似于CEP细胞检测伪狂犬弱毒TCIE50，而且没有Vero细胞判断CPE明显，所以用Vero细胞代替CEP细胞检测伪狂犬病活疫苗TCID50作为效力判定的方法，省时、省力、准确。

Claims (5)

1.一种新的伪狂犬病活疫苗的效力检验方法，其特征在于：采用Vero细胞测定伪狂犬病毒活疫苗TCID50的方法，分步如下；
其中Vero细胞的制备： 
抽取密度为2.0×106的Vero冻存细胞1.5ml，置于37℃水浴中，晃动溶解4-5分钟，在2000rmp/min条件下，离心5分钟，弃去上清，加入1-3ml细胞培养液，转入培养瓶中，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，培养48小时后，用浓度0.25%的EDTA-胰酶消化细胞，再用细胞营养液稀释成2.0×106的Vero细胞悬液，铺到细胞板上，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，培养24小时成致密单层备用；
其中伪狂犬病活疫苗的接种：
抽取1头份伪狂犬病活疫苗，用细胞维持液作10倍的梯度稀释，取10-3-10-7的滴度样，分别加入上述的致密单层中，每孔100ul，同时设对照每孔加细胞维持液100ul，放入37℃、5％的CO2培养箱中培养，观察3-5天细胞病变，计算TCID50/0.1ml效价，每头份病毒含量应不低于5×103.0TCID50。
2.按照权利要求1所述的检验方法，其特征在于：所用细胞培养液由5gMEM干粉培养基，90ml注射用水，胎牛血清10ml配制而成。
3. 按照权利要求1所述的检验方法，其特征在于：所用细胞维持液由5gMEM干粉培养基，98ml注射用水，胎牛血清2ml配制而成。
4. 按照权利要求1所述的检验方法，其特征在于：使用Vero细胞进行伪狂犬病活疫苗效力检验的周期为8天，比CEP细胞检验缩短7天。
5. 按照权利要求1所述的检验方法，其特征在于：选用的Vero细胞购自中国兽医药品监察所；MEM培养基为Hyclone公司生产，货号：SH30024.01B；胎牛血清为Hyclone公司生产，货号：SV30087.02；EDTA-胰酶消化液为兰州百灵公司生产。
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