CN115015549B - 一种狂犬病疫苗灭活验证的试验方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种狂犬病疫苗灭活验证的试验方法，其包括以下步骤：稀释：用含病毒分散剂的缓冲液将灭活水解工序完成的病毒液稀释至适合蛋白浓度，所述适合浓度为500‑1500μg/ml；吸附前处理：向稀释后的病毒灭活液加入活病毒指示再用助染剂进行处理，接种至被细胞保护剂处理的Vero细胞；接着进行重复吸附培养和传代培养，最后用免疫荧光法验证疫苗灭活情况。本发明检测灵敏度提高了5倍以上，验证周期缩短了至少5天，增加了细胞免疫荧光法的灵敏度，免疫荧光检测结果变异率控制在16％以内，大大降低了假阴性结果的出现。

Description

一种狂犬病疫苗灭活验证的试验方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及了一种狂犬病疫苗灭活验证的试验方法。
背景技术
目前，国内的狂犬病毒灭活验证常用方法主要有动物法和细胞法两种。动物法常因为动物自身免疫系统、动物个体差以及实验员技术水平的不稳定而影响验证结果，且动物试验结果存在50％的误差。而细胞法虽然克服以上缺点，但细胞试验结果仍存在30％误差，因在传代培养中常出现细胞状态不佳的现象，导致细胞对病毒的敏感性下降，降低了病毒感染易感细胞的效率。以上原因易导致灭活验证结果呈假阴性，增加了疫苗风险的不确定性。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种狂犬病疫苗灭活验证的试验方法。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种狂犬病疫苗灭活验证的试验方法，其包括以下步骤：稀释：用含病毒分散剂的缓冲液将灭活水解工序完成的病毒液稀释至适合蛋白浓度，所述适合浓度为500-1500μg/ml；吸附前处理：向稀释后的病毒灭活液加入活病毒指示再用助染剂进行处理，接种至被细胞保护剂处理的Vero细胞；接着进行重复吸附培养和传代培养，最后用免疫荧光法验证疫苗灭活情况。
所述方法具体包括以下步骤：
(1)稀释：取含病毒分散剂的PBS缓冲液稀释灭活水解工序完成的病毒液至适合浓度，并用0.5mol/L的PB缓冲液将pH调至7.4-7.8；
(2)吸附前处理：吸附病毒液前向Vero细胞加入细胞保护剂处理；向病毒灭活液加入活病毒指示并用助染剂处理，再将其接种至被细胞保护剂处理的Vero细胞；
(3)重复吸附培养：进行重复两次以下操作：33-35℃吸附90分钟，于33-35℃，5％CO2静置培养24-36小时，更换新鲜培养基；
(4)传代培养：于33-35℃，5％CO2进行传代培养，14天后收获细胞和培养液；
(5)免疫荧光法验证：取细胞冻融并离心，取离心上清和培养液混合后取样接种至经预处理的BSR细胞，离心，于37℃，5％CO2培养箱培养22-24小时，用细胞免疫荧光法进行验证。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的狂犬病疫苗灭活验证的试验方法运用病毒分散剂打散聚合成团的病毒颗粒和减少杂蛋白对病毒外壳蛋白的封闭，增加了病毒和细胞的接触面积，在此基础上利用助染试剂抑制细胞膜与病毒之间的电荷排斥进而提高病毒对细胞的感染效率；另一方面，通过控制病毒灭活液的蛋白浓度和吸附前用细胞保护剂处理细胞，降低了外源蛋白对细胞的毒性和维持细胞表面活性，提高了细胞对病毒的敏感度；采用重复感染，增加了病毒感染细胞的效率；盲传时间缩短至14天即可收获。采用助染剂和离心法相结合感染BSR细胞，增加了细胞免疫荧光法的灵敏度，大大降低了假阴性结果的出现。与传统的病毒灭活验证方法相比，验证周期缩短了至少5天，灵敏度提高5倍以上，该试验方法重复性高，变异率控制在16％以内，不易出现假阴性。
附图说明
图1a-f依次为本发明实施例一中不同含量狂犬病毒活病毒指示(FFU/ml)：0、0.02、0.05、 0.1、1.0、10的细胞免疫荧光灶图；
图2a-f依次为本发明实施例三中不同总蛋白含量(吸附前、500μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml、3000μg/ml)的病毒灭活液对Vero细胞影响结果对比图；
图3为本发明实施例四聚凝胺不同添加方式对病毒感染效率影响结果对比图；
图4为本发明实施例五不同浓度聚凝胺对病毒感染效率影响结果对比图。
具体实施方式
如背景技术描述的，现有技术中常用验证方法有动物法和细胞法。动物法常因自带免疫系统或者病毒颗粒受到机械损伤的原因，机体可能会通过少量活病毒，加上动物的个体差异以及实验员的技术水平不稳定进一步增加了验证结果呈假阴性的风险，且试验结果存在50％的误差；细胞法虽然克服以上缺点，但试验结果仍存在30％误差，细胞传代培养中常常出现细胞状态不佳的现象，导致细胞对病毒的敏感性下降，易导致灭活验证结果呈假阴性，增加了疫苗风险的不确定性。
为了解决上述技术问题，本发明提出了一种狂犬病疫苗灭活验证的试验方法，其包括以下步骤：稀释：用含病毒分散剂的缓冲液将灭活水解工序完成的病毒液稀释至适合蛋白浓度，所述适合浓度为500-1500μg/ml；吸附前处理：向稀释后的病毒灭活液加入活病毒指示再用助染剂进行处理，接种至被细胞保护剂处理的Vero细胞；接着进行重复吸附培养和传代培养，最后用免疫荧光法验证疫苗灭活情况。
所述方法具体包括以下步骤：
(1)稀释：取含病毒分散剂的PBS缓冲液稀释灭活水解工序完成的病毒液至适合浓度，并用0.5mol/L的PB缓冲液将pH调至7.4-7.8。
具体地，所述病毒分散剂选自以下任意一种：①吐温-20、②EDTA、③EDTA和EDTA-2Na 的混合物。进一步地，所述吐温-20的质量浓度为0.01-0.05％(W/V)，EDTA、EDTA和EDTA-2Na的混合物质量浓度均为0.01-0.02％(W/V)。
(2)吸附前处理：吸附病毒液前向Vero细胞加入细胞保护剂处理；向病毒灭活液加入活病毒指示并用助染剂处理，再将其接种至被细胞保护剂处理的Vero细胞。
细胞瓶里的细胞保护剂为1×HiTransG A；所述助染剂为聚凝胺、HiTransG P，进一步地，所述聚凝胺终浓度为2-10μg/ml，HiTransG P终浓度为1×。
(3)重复吸附培养：进行重复两次以下操作：33-35℃吸附90分钟，于33-35℃，5％CO2静置培养24-36小时，更换新鲜培养基；
(4)传代培养：于33-35℃，5％CO2进行传代培养，14天后收获细胞和培养液。
具体地，经33-35℃吸附90分钟后加入新鲜培养基，于33-35℃培养24-36小时；弃掉瓶中液体，再次加入病毒灭活液，33-35℃吸附90分钟后加入新鲜培养基，于33-35℃培养24-36 小时；更换新鲜培养基，于33-35℃，5％CO2传代培养，14天后收获细胞和培养液。
(5)免疫荧光法验证：取细胞冻融并离心，取离心上清和培养液混合后取样接种至经预处理的BSR细胞，离心，于37℃，5％CO2培养箱培养22-24小时，用细胞免疫荧光法进行验证。
具体地，冻融参数为：-30℃冷冻10-15分钟，室温放置15-30分钟，重复3次；离心参数为：6000-8000rpm离心10-15分钟。预处理BSR细胞是指向BSR细胞细胞悬液加入助染剂，室温放置5-10分钟，期间轻柔颠倒3-5次。
取样接种优选为混种法。其中，接种体积为125μl/孔。
细胞免疫荧光法使用FITC标记抗狂犬病病毒特异性单克隆抗体，来源于Millipore，型号为5100或5500。
本发明的狂犬病疫苗灭活验证的试验方法通过病毒分散剂和助染剂处理适合蛋白浓度的病毒灭活液，并同时采用重复感染法感染被细胞保护剂处理后的Vero细胞，极大的增加了病毒感染细胞的效率；盲传后病毒收获液采用助染剂和离心法相结合感染BSR细胞，提高了细胞免疫荧光法的灵敏度，大大降低了假阴性结果的出现。验证周期缩短了至少5天，检测灵敏度可达0.02FFU/ml，比常规方法提高5倍以上，细胞免疫荧光法误差控制在16％以内，检测结果重复性较好。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明将通过以下实施例作进一步说明。本发明方法中狂犬病病毒活病毒指示为CTNCEC25株(40代，批号2013032402)；HiTransG P和HiTransG A来源于上海吉凯基因化学技术有限公司。
检测细胞为Vero和BSR，均来源于申请人药物研发中心实验室；吐温-20和EDTA来源于生工生物工程(上海)股份有限公司，为药用级别；聚凝胺来源于上海碧云天生物技术有限公司；新生牛血清(FBS)来源于四季青，浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM来源于Gibco，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；FITC标记抗狂犬病病毒特异性单克隆抗体来源于Millipore，默克有限公司。可以理解的是，上述试剂的来源并不局限于此。
实施例一
本实施例示出了一种狂犬病疫苗灭活验证的试验方法，具体包含以下步骤：
(1)Vero细胞预处理：准备12瓶T75瓶长满单层Vero细胞，按顺序标记1号至12号。
对照组细胞：取1-6号瓶不作任何处理，作为对照组细胞；
试验组细胞：取7-12号瓶，于吸附病毒灭活液前一天加入25×HitransG A至终浓度为 1×HitransG A，轻轻摇匀，于37℃，5％CO2孵育过夜，作为试验组细胞；
(2)病毒灭活液准备：取一批病毒灭活液，测定蛋白含量后分成12等份，25ml/份。
(3)对照组病毒灭活液：取其中6份病毒灭活液不作任何处理，分别加入不同含量狂犬病毒活病毒指示(FFU/ml)：0、0.02、0.05、0.1、1.0、10，共6组，记为对照组病毒灭活液，置冰面备用；
试验组病毒灭活液：另外6份病毒灭活液用含0.03％吐温-20的PBS缓冲液稀释至蛋白含量1000μg/ml，并用0.5mol/L的PB缓冲液将pH调至7.4-7.8。分别加入不同含量狂犬病毒活病毒指示(FFU/ml)：0、0.02、0.05、0.1、1.0、10，再分别加入聚凝胺调至终浓度为6μg/ml，轻轻吹打均匀，共6组，置冰面备用。
(4)传代培养：
对照组：取对照组病毒灭活液分别接种至1-6号瓶，37℃吸附60分钟后加入DMEM(含 10％FBS)，传代培养21天，收获二代和三代培养液待检。
试验组：取试验组病毒灭活液分别接种至7-12号瓶，经34℃吸附90分钟后加入DMEM (含10％FBS)，于34℃培养24小时，弃掉瓶中液体，用PBS缓冲液(pH7.4)洗2-3遍。同法操作再次加入试验组病毒灭活液并进行吸附培养。最后加入DMEM(含10％FBS)于34℃， 5％CO2传代培养21天，分别于14天和21天收获细胞和培养上清。细胞于-30℃冷冻10-15 分钟，取出室温放置15-30分钟，重复3次，于6000-8000rpm离心10-15分钟，取离心上清与培养上清混合后待检。
(5)检测：
对照组(乳鼠法)：取0.6ml收获液脑内接种乳鼠20只，每只0.03ml，3天内死亡的不计(动物死亡数量应不超过试验动物总数的20％)，观察14天。
对照组(细胞法)：采用吸附法，取1ml对照组病毒培养物接种96孔板BSR单层贴壁细胞上，125ul/孔，共8孔，于37℃、5％CO2培养箱吸附60分钟，弃上清，加入DMEM(含 10％FBS)，200ul/孔。于37℃，5％CO2培养22-24小时后进行细胞免疫荧光染色。
试验组(细胞法)：采用混种法，取1ml试验组病毒培养物接种96孔板BSR单细胞悬液中，125ul/孔，共8孔，于96孔板离心机500-1000rpm离心30分钟，再于37℃，5％CO2培养22-24小时后进行细胞免疫荧光染色。BSR细胞悬液先加入聚凝胺至终浓度6μg/ml，室温放置5-10分钟，期间轻柔颠倒3-5次，再接种病毒培养物。
本实施例结果见表1及图1a-f，所述一种狂犬病疫苗灭活验证的试验方法的检测灵敏度可达0.02FFU/ml，传代培养14天和21天的结果一致，说明传代培养14天后即可进行细胞免疫荧光法验证。与常规验证方法相比，整个检验周期缩短了至少5天，灵敏度提高了至少 5倍。
由此可知，通过用0.03％吐温和6μg/ml聚凝胺对病毒灭活液处理，重复感染被HitransG A 作用后的Vero细胞，再以离心法和6μg/ml聚凝胺相结合，大大降低了假阴性结果的出现。
表1实施例一数据
Figure BDA0003747237390000051
实施例二
本实施例示出了一种狂犬病疫苗灭活验证的试验方法，具体包含以下步骤：
(1)病毒灭活液制备：取一批病毒灭活液，用PBS缓冲液稀释至蛋白含量为1000μg/ml，用0.5mol/L的PB缓冲液将pH调至7.4-7.8，制备2份，其中1份不含聚凝胺，记为试验组1，另1份含6μg/ml聚凝胺，记为试验组2(P)；取同批病毒灭活液分别用含0.03％吐温-20的PBS缓冲液和含0.015％EDTA的PBS缓冲液按同法稀释，分别加入聚凝胺至6μg/ml，分别标记试验组3(吐温+P)、试验组4(EDTA+P)；分别向上述4组病毒灭活液加入狂犬病毒 (CTNCEC25株40代，批号2013032402)活病毒指示，约5FFU/ml；
(2)Vero细胞处理：准备2块6孔板Vero贴壁细胞，向8孔加入25×HitransG A至终浓度1×，于37℃，5％CO2共同孵育过夜；另取两孔不加HitransG A；
(3)病毒灭活液吸附：向处理后的8孔细胞分别加入试验组1、2、3、4的病毒液，向无处理的2孔细胞加入试验组1病毒液，3.2ml/孔，每组2孔，经34℃吸附90分钟后用PBS 缓冲液(pH7.4)洗2-3次，加入DMEM(含10％FBS)，于34℃培养24小时；按常规狂犬病毒滴度检测方法测定每孔的荧光灶个数。
本实施例结果见表2，与试验组1相比，HitransG A、6μg/ml聚凝胺以及0.03％吐温(或 0.015％EDTA)的协同作用能大大提高活病毒检出率。
表2实施例二数据
Figure BDA0003747237390000061
实施例三
本实施例示出了狂犬病疫苗灭活验证的试验方法，具体包含以下步骤：
(1)病毒灭活液稀释：取含0.03％吐温-20的PBS缓冲液稀释病毒灭活液至蛋白浓度分别为500μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml、3000μg/ml，并用0.5mol/L的PB缓冲液将pH调至7.4-7.8；
(2)Vero细胞预处理：取5瓶T25的Vero单层贴壁细胞，加入25×HitransG A至终浓度1×，于37℃，5％CO2共同孵育过夜；
(3)病毒灭活液吸附细胞：按蛋白含量低到高顺序分别向瓶1、瓶2、瓶3、瓶4、瓶5瓶加入病毒灭活液，8.3ml/瓶。病毒灭活液经34℃吸附90分钟后加入DMEM(含10％FBS)，于34℃，5％CO2静置培养24-36小时。弃掉瓶中液体，同法操作再次加入病毒灭活液并进行吸附培养，更换新鲜DMEM(含10％FBS)。显微镜下观察Vero细胞的生长状态。
本实施例结果见图2，不同总蛋白含量的病毒灭活液对Vero细胞进行两次吸附后，细胞状态有所改变，病毒灭活液蛋白浓度越高，细胞生长状态越差。病毒灭活液吸附Vero细胞最佳的蛋白浓度为500-1500μg/ml。
实施例四
本实施例示出了一种狂犬病疫苗灭活验证的试验方法，具体包含以下步骤：
(1)取一支狂犬病毒(CTNCEC25株40代，批号2013032402)适当稀释制备2份病毒液，一份含6μg/ml聚凝胺，另一份不含聚凝胺。均冰浴备用；
(2)制备3份BSR细胞悬液，一份含6μg/ml聚凝胺，常温放置5-10分钟，期间轻柔颠倒3-5次，再接种病毒；一份含6μg/ml聚凝胺，冰浴放置5-10分钟，期间轻柔颠倒3-5次，再接种病毒；最后一份不加聚凝胺，制备后立刻接种病毒；
(3)无聚凝胺病毒液接种至无聚凝胺细胞悬液，为对照组；
含聚凝胺病毒液接种至无聚凝胺细胞悬液，为试验组1；
无聚凝胺病毒液接种至冰浴的含聚凝胺细胞悬液，为试验组2；
无聚凝胺病毒液接种至常温的含聚凝胺细胞悬液，为试验组3。
每组重复10孔，试验组1、2和3经500-1000rpm离心30分钟，对照组不离心。按常规狂犬病毒滴度检测方法进行检测。
本实施例结果见表3，通过聚凝胺添加方式的对比试验发现，聚凝胺能显著促进狂犬病毒感染细胞，且最好先与细胞进行混合，冰浴处理的细胞对病毒的感染能力会有所下降，这也提示，消化后的细胞不宜4℃存放。
表3实施例四数据
Figure BDA0003747237390000071
备注：“P+RV”为聚凝胺先与病毒混合；“P+Ice-Cell”为聚凝胺先与细胞混合后冰浴；
“P+Rt-Cell”为聚凝胺先与细胞混合后常温放置。
实施例五
本实施例示出了一种狂犬病疫苗灭活验证的试验方法，具体包含以下步骤：
(1)稀释狂犬病毒(CTNCEC25株40代，批号2013032402)病毒液至适合倍数，接种至96孔板，每孔50μl，置冰面待用；
(2)制备6组密度为1×106/ml的BSR细胞悬液，分别向6组细胞悬液加入聚凝胺，浓度依次为0μg/ml(组1)、2μg/ml(组2)、4μg/ml(组3)、6μg/ml(组4)、8μg/ml(组5)、 10μg/ml(组6)，常温放置5-10分钟，期间轻柔颠倒3-5次；
(3)向96孔板上的病毒液接种细胞悬液，50μl/孔，每组细胞悬液重复10孔；
(4)按常规狂犬病毒滴度检测方法进行检测。
本实施例结果见表4，通过不同浓度聚凝胺作用细胞后进行细胞免疫荧光检测，发现在 0-10μg/ml浓度范围内，细胞荧光灶个数与聚凝胺浓度呈正比关系，聚凝胺的浓度宜在 6～10μg/ml范围，且检测结果重复性比组1好，基本控制在16％以内。
表4实施例五数据
Figure BDA0003747237390000081
现有验证方法中，动物法因小鼠自带的免疫系统或者病毒颗粒受到机械损伤的原因，机体可能会通过少量活病毒，加上动物的个体差异以及实验员的技术水平不稳定进一步增加了验证结果呈假阴性的风险；细胞法虽然克服以上缺点，但在细胞传代培养中常常出现细胞状态不佳的现象，细胞膜的流动性下降，导致细胞对病毒的敏感性下降，降低了病毒感染易感细胞的效率，易导致灭活验证结果呈假阴性，增加了疫苗风险的不确定性。本发明人进行大量的实验提出了本发明的狂犬病疫苗灭活验证的试验方法，具体地，其通过运用病毒分散剂打散聚合成团的病毒颗粒和减少杂蛋白对病毒外壳蛋白的封闭，增加了病毒和细胞的接触面积，在此基础上利用助染试剂抑制细胞膜与病毒之间的电荷排斥进而提高病毒对细胞的感染效率；另一方面，通过控制病毒灭活液总蛋白含量和添加细胞保护剂，降低外源蛋白对细胞的毒性并维持细胞表面活性，提高了细胞对病毒的敏感度；采用重复感染，极大地增加了病毒感染细胞的效率，细胞免疫荧光法采用聚凝胺与离心相结合进一步提高了检测灵敏度。
需要说明的是，本发明的技术效果是各个步骤技术特征协同作用的总和，各步骤之间具有一定的内在相关性，并非单个技术特征效果的简单叠加。从表1、表2和表3可见，本发明通过①控制病毒灭活液的总蛋白浓度来降低对细胞的毒性，并同时②采用病毒分散剂打散已聚合成团的病毒颗粒和降低杂蛋白对病毒外壳蛋白的封闭，吸附前③加入细胞保护剂来提高细胞表面活性，协同④助染剂和重复吸附提高病毒感染细胞的效率，免疫荧光检测采用⑤聚凝胺与离心相结合可有效提高灵敏度，降低假阴性风险；最终该方法的灵敏度可达0.02FFU/ml，提高了5倍以上，且检验周期缩短了至少5天。本发明产生的上述效果是相互协同所得到的，是不可分割的。而且本发明检测结果重复性较好，免疫荧光检测结果变异率控制在16％以内。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种狂犬病疫苗灭活验证的试验方法，其特征在于，其包括以下步骤：稀释：用含病毒分散剂的缓冲液将灭活水解工序完成的病毒液稀释至适合蛋白浓度，所述适合蛋白浓度为500-1500μg/ml；吸附前处理：向稀释后的病毒灭活液加入活病毒指示再用助染剂进行处理，接种至被细胞保护剂处理的Vero细胞；接着进行重复吸附培养和传代培养，最后用免疫荧光法验证疫苗灭活情况；
所述病毒分散剂选自以下任意一种：①吐温-20、②EDTA、③EDTA和EDTA-2Na的混合物；所述吐温-20的质量浓度为0.01-0.05%（W/V），EDTA或EDTA及其二钠盐混合物质量浓度为0.01-0.02%（W/V）；细胞保护剂为1×HiTransG A；所述助染剂为聚凝胺和HiTransG P中任意一种；所述聚凝胺终浓度为2-10μg/ml，HiTransG P终浓度为1×。
2.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗灭活验证的试验方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
（1）稀释：取含病毒分散剂的PBS缓冲液稀释灭活水解工序完成的病毒液至适合浓度，并用0.5mol/L的PB缓冲液将pH调至7.4-7.8；
（2）吸附前处理：吸附病毒液前向Vero细胞加入细胞保护剂处理；向病毒灭活液加入活病毒指示并用助染剂处理，再将其接种至被细胞保护剂处理的Vero细胞；
（3）重复吸附培养：进行重复两次以下操作：33-35℃吸附90分钟，于33-35℃，5%CO2静置培养24-36小时，更换新鲜培养基；
（4）传代培养：于33-35℃，5%CO2进行传代培养，14天后收获细胞和培养液；
（5）免疫荧光法验证：取细胞冻融并离心，取离心上清和培养液混合后取样接种至经预处理的BSR细胞，离心，于37℃，5%CO2培养箱培养22-24小时，用细胞免疫荧光法进行验证。
3.根据权利要求2所述的狂犬病疫苗灭活验证的试验方法，其特征在于，在步骤（5）中，冻融参数为：-30℃冷冻10-15分钟，室温放置15-30分钟，重复3次；离心参数为：6000-8000rpm离心10-15分钟。
4.根据权利要求2所述的狂犬病疫苗灭活验证的试验方法，其特征在于，在所述（5）中，所述预处理BSR细胞是指向BSR细胞细胞悬液加入助染剂，室温放置5-10分钟，期间轻柔颠倒3-5次。
5.根据权利要求2所述的狂犬病疫苗灭活验证的试验方法，其特征在于，所述细胞免疫荧光法使用FITC标记抗狂犬病病毒特异性单克隆抗体，来源于Millipore，型号为5100或5500。
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