CN114989269A - 一种牛赤羽免疫原性抗原及疫苗 - Google Patents

一种牛赤羽免疫原性抗原及疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牛赤羽免疫原性抗原及疫苗，应用悬浮培养的BHK‑21细胞培养牛赤羽病病毒抗原，通过添加氨基肽酶、单磷酸脂质A、硫酸乙酰肝素缩短牛赤羽病病毒在悬浮细胞的适应周期，缩短病毒在悬浮细胞的适应性和病毒培养滴度。有利于在该病流行时快速制备有效产品，及时控制疫病的流行和爆发。本发明提供的牛赤羽病病毒疫苗，提高单位体积的病毒培养滴度，抗原含量与常规制备方法提高100倍以上，制备高效价的产品，从而革新原有的贴壁培养抗原的生产方式，降本增效，低碳生产。

Description

一种牛赤羽免疫原性抗原及疫苗
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种牛赤羽免疫原性抗原及疫苗。
背景技术
赤羽病又名阿卡斑病（Akabane disease），是由赤羽病病毒（Akabane virus,AKAV）所引起的牛、绵羊和山羊的一种多型性传染病，以牛、羊的流产、早产、死产及先天性关节弯曲和积水性无脑症（Arthrogryposis–Hydraencephaly,AH 综合症）为特征，是危害反刍动物最重要的传染性病毒之一。目前的牛赤羽病病毒疫苗主要有以下形式：1、活疫苗为30℃下在Hmlu-1细胞上致弱的弱毒疫苗；2、灭活疫苗是将OBE-1株AKAV接种Hmlu-1细胞，出现细胞病变时收集细胞培养液，3000rpm离心10min，取上清应用或置于8℃低温保存备用，制备疫苗时加入0.1%福尔马林。上述两种方法均为常规方法，生产工艺复杂，需要耗费较多的人力物力，且病毒滴度达不高，造成疫苗品质批间差异大等问题。目前国内该疫病流行广泛，造成了重大的经济损失。尚无该产品上市，有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种应用悬浮培养细胞进行牛赤羽病病毒抗原的培养，以提高病毒滴度。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种牛赤羽免疫原性抗原，通过如下步骤制备：
（1）用细胞分离病毒，获得原始种毒；
（2）应用悬浮培养细胞对种毒进行培养，培养过程中，通过添加细胞配体进行悬浮种毒的驯化培养，获得牛赤羽病病毒，最后经灭活即得；
其中，所述的细胞配体选自氨基肽酶、单磷酸脂质A、硫酸乙酰肝素中的任意一种。
优选地，步骤（1）中，采用贴壁的BHK-21细胞或者MDBK细胞分离病毒，获得原始种毒；步骤（2）中，对应采用悬浮培养的BHK-21细胞或者MDBK细胞对种毒进行培养；进一步优选为BHK-21细胞。
具体地，步骤（2）中，所述的细胞配体的添加浓度为20~40ng/mL。
优选地，步骤（2）中，所述的细胞配体为单磷酸脂质A。
优选地，步骤（2）中，牛赤羽病病毒灭活前抗原含量为108.0TICD50 -108.5TICD50/ml以上。
进一步地，本发明还提供一种牛赤羽疫苗，包括上述制备得到的免疫原性抗原，以及佐剂。
优选地，所述的佐剂选自氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel01、Gel02、纳米佐剂、蜂胶、ISA206或ISA760VG中的任意一种或两种以上的组合物。
优选地，所述免疫原性组合物与所述佐剂的质量比为1:1。
具体地，本发明提供牛赤羽病病毒疫苗通过如下步骤制备：
（1）用除细胞碎片且病毒含量108.0TICD50/ml以上的抗原用0.1mol的BEI灭活28小时，灭活检验合格；
（2）将抗原液与佐剂按质量比1:1配苗，在31±1℃条件下，以150-350r/min搅拌30-60分钟，乳化成水包油包水型疫苗。
进一步地，本发明还要求进一步保护细胞配体在悬浮牛赤羽种毒驯化培养中，用于提高病毒对悬浮培养细胞的适应性和病毒滴度中的应用；其中，所述的细胞配体选自氨基肽酶、单磷酸脂质A、硫酸乙酰肝素中的任意一种。
优选地，上述应用中所述的细胞配体为单磷酸脂质A，其添加浓度为20~40ng/mL。
优选地，上述应用中所述悬浮培养细胞采用悬浮培养的BHK-21细胞。
具体地，先用贴壁的BHK-21细胞分离病毒，获得原始种毒，应用悬浮培养的BHK-21细胞培养牛赤羽病病毒抗原，通过添加氨基肽酶、单磷酸脂质A或者硫酸乙酰肝素缩短牛赤羽病病毒在悬浮细胞的适应周期，提高单位体积的病毒培养滴度，以制备高效价的产品，从而革新原有的贴壁培养抗原的生产方式，降本增效，低碳生产。
有益效果：
（1）本发明提供的应用悬浮培养的BHK-21细胞培养牛赤羽病病毒抗原，通过添加氨基肽酶、单磷酸脂质A、硫酸乙酰肝素缩短牛赤羽病病毒在悬浮细胞的适应周期，缩短病毒在悬浮细胞的适应性和病毒培养滴度。有利于在该病流行时快速制备有效产品，及时控制疫病的流行和爆发。
（2）本发明提供的牛赤羽病病毒疫苗，提高单位体积的病毒培养滴度，抗原含量与常规制备方法提高100倍以上，制备高效价的产品，从而革新原有的贴壁培养抗原的生产方式，降本增效，低碳生产。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1是PCR试剂盒鉴定结果图片。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和添加物、培养条件、培养参数、化学试剂、制备工艺等命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规实验条件和方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。悬浮培养方式和灭活工艺根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的病毒分离、病毒毒价测定以及灭活检验方法使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
本发明实施例中用到的主要试剂及仪器信息如表1。
表1 试剂及仪器信息表
试剂/仪器名称 型号规格 生产厂家 用途
氨基肽酶 250 UNITS/mg 默克公司 病毒驯化
单磷酸脂质A 1mg/支 默克公司 病毒驯化
硫酸乙酰肝素 0.1mg/支 默克公司 病毒驯化
NaOH 500/瓶 中国化学 灭活剂环化
BEA 500g/瓶 Sigma 灭活
BHK LSM 361 50L/袋 建顺生物 细胞悬浮培养
培养基BD004 10L/袋 建顺生物 细胞贴壁培养
血清 500ml/瓶 Hyclone 细胞培养
佐剂 25L/桶 Seppic 疫苗的乳化
卧式二氧化碳摇床 HZCo2-1211K 上海佐研 悬浮细胞培养
生物反应器 14L NBS 悬浮细胞培养
实施例1 应用悬浮BHK-21细胞培养牛赤羽病病毒抗原
1. 细胞毒在静置细胞中的分离培养
1.1 组织毒的获取
采集疑似牛赤羽病发病的新生牛脑/脾脏组织，应用市售牛赤羽病病毒PCR检测试剂盒经PCR检测鉴定为牛赤羽病阳性的病料，用研钵在生物安全柜内捣碎，加入适量的无血清BD004培养液置于15ml离心管中，放置2-8度冰箱中浸泡4个小时以上。
浸泡完毕后，置于离心机中以10000rpm离心10分钟，取上清置于另外一支无菌离心管中，以10000rpm离心10分钟，取上清置于无菌离心管中，用0.22μm的滤器除菌过滤，备用。
1.2 贴壁细胞毒的获取
取培养过夜的BHK-21贴壁细胞，弃去培养液，加入无血清BD004培养液后，取过滤除菌后的组织毒液接种于培养体系中感做，静置2小时。
2小时后，弃去感做液，加入新鲜的含2%血清的BD004培养液后置于37℃含5% CO2培养箱中培养，观察细胞病变，到约80%细胞病变时收获，冻融2次后进行病毒含量的测定，获得病毒滴度后以MOI为0.01在BHK-21贴壁细胞继续传代，获得基础病毒库，应用PCR进行鉴定，扩增出约285bp的条带，鉴定结果如图1所示。其中，第一个泳道为DNA Mark，1、2号为组织样品，3号为阴性细胞培养液上清，4号为阳性病料培养上清。引物序列见SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，,并将PCR产物进行序列测定，测定序列见SEQ ID No.3所示。
2 应用悬浮BHK-21细胞培养牛赤羽病病毒抗原
2.1 BHK-21细胞在摇瓶中的悬浮培养 将细胞活率良好（95%以上）且增殖稳定的BHK-21 悬浮细胞置36～37.5℃含5% CO2恒温震荡培养箱中以160～180 r/min振荡培养培养3-5日，每日计数并测定细胞活率，细胞活率在95%以上的细胞，用BHK LSM 361细胞培养液将细胞密度调整到2×106个细胞/ml备用。
2.2 氨基肽酶、单磷酸脂质A、硫酸乙酰肝素（以下简称三种细胞配体）添加量的确定
2.2.1 三种细胞配体对细胞的毒性测定
将氨基肽酶、单磷酸脂质A、硫酸乙酰肝素配制成10μg/ml的浓缩液。在BHK-21细胞中的添加量设置三个终浓度梯度，分别为50ng/ml、100ng/ml、150 ng/ml，同时设不添加对照组，测定对悬浮BHK-21细胞的影响。连续应用5代后，终浓度100ng/ml、150 ng/ml，对细胞的增殖和活率有一定的影响，三种细胞配体在50ng/ml浓度对细胞的增殖和活率均无影响。
继而重新设置三个浓度梯度，60ng/ml、75ng/ml、90 ng/ml，同时设不添加对照组，测定对悬浮BHK-21细胞的影响。连续应用5代后，终浓度75ng/ml、90 ng/ml，对细胞的增殖和活率仍有一定的影响，三种细胞配体在60ng/ml浓度对细胞的活率无影响，但对细胞增殖有一定的影响。最终确定为最大添加浓度为50ng/ml。
2.2.2 应用三种细胞配体对病毒在悬浮细胞上的驯化增殖
三种细胞配体在培养体系中终浓度分别添加0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30 ng/ml、40ng/ml、50ng/ml，取细胞活率良好（95%以上）且增殖稳定的悬浮培养的BHK-21细胞，在细胞培养体系中添加上述量的物质后，继续置36～37.5℃含5% CO2恒温震荡培养箱中以160～180 r/min振荡培养培养4小时。4小时后，根据每个添加量组细胞数量，以0.01MOI进行接毒，接毒后，继续放置36～37.5℃含5% CO2恒温震荡培养，每日进行细胞活率的监测，当细胞活率在60%左右时，收获培养物，冻融两次，取样进行病毒含量的测定（TICD50）。
测定后的毒种为P1代，以上述同样的细胞起始密度、添加量、培养方式、测定方法，进行连续传代8代，悬浮培养的病毒传到第五代时，添加单磷酸脂质A组的20ng/ml、30ng/ml、40 ng/ml添加量时，病毒含量均超过108.5TICD50/ml，其他浓度的添加量培养出病毒含量均在107.9-108.3 TICD50/ml，且直到P8代病毒含量仍在108.5TICD50/ml以上。
硫酸乙酰肝素添加量在10ng/ml、20 ng/ml时，病毒含量最高为107.8TICD50/ml，其他浓度的添加量培养出病毒含量均在107.0-107.5 TICD50/ml，直到P8代病毒含量仍未超过108.0TICD50/ml以上。
氨基肽酶添加量在30ng/ml、40 ng/ml病毒含量最高为107.3TICD50/ml，其他浓度的添加量培养出病毒含量均在106.5-107.0 TICD50/ml，直到P8代病毒含量仍未超过107.5TICD50/ml以上。
对照组从P1到P8代病毒含量仍未超过106.5-107.0 TICD50/ml之间。
2.3 三种细胞配体培养最佳病毒含量进行抗原的培养
取细胞活率良好（95%以上）且增殖稳定的悬浮培养的BHK-21细胞，用BHK LSM 361细胞培养液将细胞密度调整到2×106个细胞/ml，以MOI为0.01接种2.2.2中应用三种细胞配体驯化培养的病毒，连续做6个批次进行抗原培养的比对。结果显示：单磷酸脂质A驯化的病毒在悬浮细胞上培养出的病毒含量在108.3-108.8 TICD50/ml；硫酸乙酰肝素驯化的病毒在悬浮细胞上培养出的病毒含量在106.8-107.4 TICD50/ml；氨基肽酶驯化的病毒在悬浮细胞上培养出的病毒含量在106.6-107.4 TICD50/ml；对照组的病毒在悬浮细胞上培养出的病毒含量在106.8-107.4 TICD50/ml。最终确定由单磷酸脂质A驯化的病毒应用于悬浮细胞生产牛赤羽病病毒抗原。
实施例2 悬浮培养的BHK-21细胞进行牛赤羽病病毒疫苗的生产。
1 应用生物反应器进行BHK-21细胞培养和抗原的制备
细胞活率良好（95%以上）且增殖稳定BHK-21 悬浮注入生物反应器中，将生物反应器的溶氧（DO）设定为40±5%，CO2设置为5±1%，温度设定为37℃±1，转速设定为80-160rpm参数做健康培养。接毒前将细胞密度调整到2×106个细胞/ml，将溶解氧参数设定为45±5%，其他参数设定不变。
用单磷酸脂质A驯化的病毒以MOI为0.01接种于生物反应器内，定期进行细胞活率的监测，当胞活率在60%左右时，收获培养物，冻融两次，取样进行病毒含量的测定（TICD50）。测得病毒含量为108.6 TICD50/ml。
非驯化对照组常规培养病毒滴度为107.0 TICD50/ml.
2 牛赤羽病疫苗的制备
上述抗原分别做离心处理，去除细胞碎片。将0.1mol/L的BEI溶液加入抗原液中，终浓度为1mmol/L，置37℃中灭活28小时，每隔2小时均匀搅拌10分钟。灭活完毕后加入1mol/L的硫代硫酸钠，终浓度为10mmol/L，均匀搅拌10分钟，37℃反应1小时。分别与适宜的佐剂混合制备成疫苗。命名为驯化培养疫苗组和常规培养对照组。
实施例3 疫苗的免疫保护效力
用健康3~4月龄犊牛（健康易感，AKAV抗体阴性）10只，其中5头犊牛免疫2ml/头的疫苗，另5头犊牛免疫相同剂量的生理盐水作为对照组。免疫后7日、14日、21日，攻毒后7日、14日采集免疫组、对照组血液，分别测定牛赤羽病病毒中和抗体，试验结果见表2、表3。
免疫后同时进行攻毒，检测攻毒后采集口拭子和肛拭子监测排毒情况，结果见表4。
表2 疫苗免疫后中和抗体滴度（SN）
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表3 疫苗免疫攻毒后中和抗体滴度（SN）
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表4 攻毒后试验动物排毒情况
Figure 49566DEST_PATH_IMAGE004
注：“-”AKA核酸阴性； “+” AKA核酸阳性
结果显示，驯化培养组免疫后21天中和抗体均不低于1:128，攻毒后14日中和抗体均不低于1: 512；常规培养对照组免疫后21天中和抗体均不低于1:32，攻毒后14日中和抗体均不低于1: 128；对照组在攻毒后7日抗体逐步转阳，感染抗体不高于1:32（见表2、3）。攻毒结果显示：驯化培养组攻毒后从口腔、肛门拭子中均未检测出排毒；常规培养对照组，有一头在攻毒后3、5天检测到排毒，另一头在第3天检测出排毒，其他时间均未检测到排毒；而对照组在攻毒结束时有两头显示停止排毒，其他时间均排毒。该发明从贴壁细胞毒、三种细胞配体对悬浮BHK-21细胞毒性验证、病毒在悬浮细胞上的驯化增殖、三种细胞配体培养最佳病毒含量进行抗原的培养、应用生物反应器进行BHK-21细胞培养和抗原的制备、疫苗制备、产品的效力检验一系列环节后，通过添加单磷酸脂质A后，制备出的毒种再进行抗原培养时，与不添加组相比显著提高病毒滴度100倍以上。缩短了病毒驯化时间，提升了抗原的质量、简化了产品的生产。证明了该发明制备的疫苗具有良好的免疫原性，免疫动物感染后能阻止排毒（见表4）。
本发明提供了一种牛赤羽免疫原性抗原及疫苗的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 天康制药（苏州）有限公司
<120> 一种牛赤羽免疫原性抗原及疫苗
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacacaacca agtgtcgatc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatggtgctg agatgtttct 20
<210> 3
<211> 285
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cacaaccaag tgtcgatctt acttttgcag gggtcaaatt tacagtggtt aataaccatt 60
tcccccagta cactgcaaat ccagtgtcag acactgcctt tacgctccat cgcatctcgg 120
gctacttagc tcgctgggtt gctgagcagt gcaaggctaa tcagatcaaa tttgcagagg 180
cagctgccac aattgtgatg ccgctggctg aggtgaaggg ttgcacctgg agtgacgggt 240
atgcaatgta cctgggattt gcccctggtg ctgagatgtt tctgg 285

Claims (10)

1.一种牛赤羽免疫原性抗原，其特征在于，通过如下步骤制备：
（1）用细胞分离病毒，获得原始种毒；
（2）应用悬浮培养细胞对种毒进行培养，培养过程中，通过添加细胞配体进行悬浮种毒的驯化培养，获得牛赤羽病病毒，最后经灭活即得；
其中，所述的细胞配体选自氨基肽酶、单磷酸脂质A、硫酸乙酰肝素中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的牛赤羽免疫原性抗原，其特征在于，步骤（1）中，采用贴壁的BHK-21细胞或者MDBK细胞分离病毒，获得原始种毒；步骤（2）中，对应采用悬浮培养的BHK-21细胞或者MDBK细胞对种毒进行培养。
3.根据权利要求1所述的牛赤羽免疫原性抗原，其特征在于，步骤（2）中，所述的细胞配体的添加浓度为20~40ng/mL。
4.根据权利要求1所述的牛赤羽免疫原性抗原，其特征在于，所述细胞配体为单磷酸脂质A。
5.根据权利要求1所述的牛赤羽免疫原性抗原，其特征在于，牛赤羽病病毒灭活前抗原含量为108.0TICD50 -108.5TICD50/ml以上。
6.一种牛赤羽疫苗，其特征在于，包括权利要求1所制备得到的免疫原性抗原，以及佐剂。
7.根据权利要求6所述的牛赤羽疫苗，其特征在于，所述的佐剂选自氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel01、Gel02、纳米佐剂、蜂胶、ISA206或ISA760VG中的任意一种或两种以上的组合物；所述免疫原性组合物与所述佐剂的质量比为1:1。
8.细胞配体在悬浮牛赤羽种毒驯化培养中用于提高病毒对悬浮培养细胞的适应性和病毒滴度中的应用，其特征在于，所述的细胞配体选自氨基肽酶、单磷酸脂质A、硫酸乙酰肝素中的任意一种。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的细胞配体为单磷酸脂质A，其添加浓度为20~40ng/mL。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述悬浮培养细胞采用悬浮培养的BHK-21细胞。
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