CN115141812B - 一株阿卡斑病毒疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株阿卡斑病毒疫苗株及其应用，命名为阿卡斑（赤羽病）病毒CX‑1，本发明同时公开了一种阿卡斑病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：病毒培养及处理、制备0.2M的BEI灭活剂、灭活病毒、添加质量比2～10%的蔗糖，2～10%的海藻糖，0.5%～2%的左旋咪唑、加入佐剂，佐剂:复合物混合液体积比为1:1～3，混匀搅拌乳化，定量分装密封后即得所述赤羽病病毒灭活疫苗。本发明公开的阿卡斑病毒疫苗株对西南地区流行的阿卡斑病毒的防疫有较为显著的效果。本发明公开的疫苗制备方法，是在本发明的疫苗株基础上，结合佐剂、赋形剂与灭活抗原悬液的组合，价格低廉，容易获得，可显著提高免疫效果。

Description

一株阿卡斑病毒疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，具体为一株阿卡斑病毒疫苗株及其应用。

技术背景

阿卡斑病(Akabane Disease)又名赤羽病，是由阿卡斑(赤羽病)病毒 (AkabaneVirus)引起的主要感染牛羊的一种病毒病，以流产、早产、死胎、胎儿畸形、木乃伊胎、新生胎儿发生关节弯曲和积水性无脑综合症(简称AH综合症)为特征，主要传播媒介为吸血昆虫。阿卡斑(赤羽病)病毒属布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)，辛波血清群(Simbu)，是单股负链RNA病毒。该病毒最早于1959年在日本群马县赤羽村的金色库蚊和三带喙库蚊体内分离出。2002年～2006年间在日本发生14次疫情, 给日本牛羊养殖业造成严重的损失，2007年韩国也爆发该病疫情。我国在云南、广西、陕西、内蒙古、湖南、河北、山东、上海、吉林等地区检测或分离到该病毒。随着阿卡斑(赤羽病)病在世界许多地区的不断暴发和流行,阿卡斑(赤羽病)病毒也在不断进化变异株,其对犊牛和成年牛的致病性增强,并可引起脑炎症状。2016年在广西发现可以感染竹鼠的致病性毒株， 2021年9月-2022年1月，我国东北地区多地发生疑似阿卡斑(赤羽病)病毒致病的疫情。云南省畜牧兽医科学院应用cELISA方法对2017-2018年在云南省1860份牛血清样品进行阿卡斑(赤羽病)病毒抗体监测，检出阳性样品108份，阳性率为5.8％。

阿卡斑(赤羽病)病毒与其它多数病毒病一样，无特效治疗药物，主要靠易感动物接种疫苗进行防控。目前，国外已开发出多种弱毒疫苗和灭活苗，其中韩国开发出来的用Vero和BHK-21细胞培养病毒的灭活疫苗(参见 Biologicals,39(2011)152-157；Korean JVet Res(2015)55(4):227-232)，日本开发出来应用HmLu-1细胞致弱的弱毒疫苗，但是这些疫苗仅限用其本国毒株制备，对中国流行毒株的免疫效果无评价结果。中国农业科学院特产研究所2019 年提供了一种可用于制备赤羽病灭活疫苗的赤羽病病毒疫苗株及由该疫苗株制备得到的灭活疫苗，授权专利“一株适应Vero细胞培养的赤羽病病毒疫苗株及其用途”(授权公告号CN 105969739 B)，应用Vero细胞培养病毒，0.2～0.4％甲醛在37℃下灭活24小时后加入氢氧化铝胶佐剂配制成疫苗。但该专利所用毒株是从送检样品中分离获得，只适用于在Vero细胞上进行培养扩繁，生产效率低且对云南流行的阿卡斑(赤羽病)病毒的防疫效果并不理想。另外，现有技术制备赤羽病病毒疫苗的方法常见的是使用甲醛在37℃条件下灭活24小时，这对热稳定性差的阿卡斑(赤羽病)病毒会有显著的影响，而且现有的赤羽病病毒疫苗制备过程中除了病毒液和佐剂外没有其他成分，也对免疫效果有不利影响。

由于阿卡斑(赤羽病)病毒感染动物后临床症状不明显，主要对怀孕母畜及胎儿造成致病性，因此极易造成误诊，被发现时往往已成大流行态势，经济损失和社会影响力均较大，疫苗接种等预防措施尤为重要。目前，国内未见有成品阿卡斑(赤羽病)疫苗销售，因此亟需针对我国流行毒株开发安全、高效的疫苗。

发明内容

为了解决以上问题，本发明公开了一株阿卡斑病毒疫苗株及其应用。

本发明公开了一株阿卡斑病毒疫苗株，命名为阿卡斑(赤羽病)病毒(AkabaneVirus)CX-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏日期为2022年6月7 日，保藏编号为：CGMCCNo.45207。

本发明同时公开了一种阿卡斑病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、病毒培养及处理：在细胞培养方瓶内培养传代细胞，待长满单层后倾倒干净细胞培养液，用无血清MEM培养液彻底洗瓶1次并倾弃干净，每瓶接种5％滴度为10^-5/0.1mL左右的赤羽病病毒CX-1疫苗株种毒和能覆盖住传代细胞的无血清MEM细胞维持液，37℃培养3～4天，待70～80％的传代细胞出现显著病变时置-20℃冻存，完全冰冻后置室温融化，用半融化的瓶内冰块刮下细胞层，剧烈震荡病毒培养液破碎细胞；然后将此病毒培养液置离心瓶内，5000rpm/min离心30分钟，上清液即为赤羽病病毒液，取赤羽病病毒液于-20℃或-80℃保存备用；

步骤2、制备0.2M的BEI灭活剂：在重量比1.6％的氢氧化钠溶液中加入重量比4.1％二乙烯亚胺(BEA)，充分溶解，此为0.2mol/L的二乙烯亚胺溶液，置37℃1.5 h进行环化，期间每15分钟剧烈晃动10秒，反应结束后即得到0.2M的BEI灭活剂，现用现配；

步骤3、灭活病毒操作：向步骤1获得的赤羽病病毒液中加入体积比为0.5～ 2％的步骤2获得的BEI灭活剂，充分混匀后置37℃持续搅拌灭活，灭活5小时后将容器内液体更换容器，继续置37℃搅拌灭活3小时，然后加入BEI 1～4倍摩尔量的硫代硫酸钠，混匀，终止灭活，得到灭活的赤羽病病毒液，置于4℃保存备用；

步骤4、在上述灭活的赤羽病病毒液内添加质量比2～10％的蔗糖，2～10％的海藻糖，0.5％～2％的左旋咪唑，置于4℃保存备用；

步骤5、在步骤4获得的复合物混合液中加入佐剂，佐剂:复合物混合液体积比为1:1～3，混匀搅拌乳化，定量分装密封后即得所述赤羽病病毒灭活疫苗。

进一步，所述传代细胞为HmLu-1细胞、Vero细胞、BHK-21细胞其中一种或数种。

进一步，所述佐剂包括铝佐剂、油乳佐剂、皂苷和聚羧乙烯的一种或多种的混合物。

进一步，所述阿卡斑病毒CX-1疫苗株种毒为所述阿卡斑病毒CX-1疫苗株传代至第7代的病毒。

进一步，所述佐剂为油乳佐剂ISA206时，与复合物混合液的体积比为1:1。

进一步，所述佐剂为铝佐剂时，与复合物混合液的体积比为1:1～3。

进一步，步骤1完成后，所述赤羽病病毒液滴度应≥10^-5/0.1mL。

进一步，步骤3里向步骤1获得的赤羽病病毒液中加入体积比为1％的步骤2获得的BEI灭活剂。

进一步，步骤3里加入BEI 2倍摩尔量的硫代硫酸钠，混匀，终止灭活。

进一步，步骤4里添加质量比5％蔗糖、5％海藻糖、1％左旋咪唑。

本发明的有益效果如下：

1、本发明公开一株阿卡斑(赤羽病)病毒疫苗株，是在云南楚雄州山羊血液中分离到的CX-1毒株，对西南地区流行的阿卡斑病毒的防疫有较为显著的效果。

2、本发明公开的疫苗制备方法，是在本发明的疫苗株基础上，结合佐剂、赋形剂与灭活抗原悬液的组合，用于易感动物免疫接种，实现高效诱导易感动物产生对阿卡斑病毒的免疫应答。小鼠单次接种疫苗后21天，80％以上的小鼠产生中和抗体。

3、本发明提供的毒株可分别在HmLu-1细胞、Vero细胞、BHK-21细胞三种不同的传代细胞上培养扩繁病毒，与现有技术的仅可在一种传代细胞上培养相比，可选择余地更大。而且本研究使用的毒株对HmLu-1细胞更加敏感，培养病毒滴度是Vero细胞培养的3～5倍，更适合工业化生产，能大幅降低疫苗的生产成本。

4、本发明选择用BEI灭活剂灭活，直接破坏病毒核酸，使病毒丧失活性，制成灭活疫苗，灭活时间大幅缩短，仅8个小时，减少病毒在37℃条件下的降解，可保持病毒表面免疫原性。而现有技术常应用甲醛灭活，需要在37℃条件下灭活24小时，由于赤羽病病毒热稳定性较差，时间过长会出现完整病毒颗粒大量降解的情况，影响疫苗成品内有效抗原含量，减低免疫效果。

5、本发明在疫苗制备过程中添加了可有效促进抗原稳定的蔗糖、海藻糖，有效增强免疫效果的左旋咪唑(LMS)，并给出了有效的剂量，这些试剂价格低廉，容易获得，可显著提高免疫效果。

附图说明

图1为左旋咪唑结构式；

图2为阿卡斑病毒在HmLu-1、Vero、BHK-21细胞上扩繁规律(TCID₅₀)；

图3为阿卡斑病毒在HmLu-1、Vero、BHK-21细胞上扩繁规律(Ct值)。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提出一株阿卡斑(赤羽病)病毒疫苗株及其在制备灭活疫苗上的用途，本发明公开的阿卡斑(赤羽病)病毒疫苗株结合佐剂、赋形剂与灭活抗原悬液的组合，实现高效诱导易感动物产生对阿卡斑(赤羽病)病毒的免疫应答。

本发明所阐述的方法，应理解为不限于本发明所述的具体方法和实验条件，因为该方法和条件可改变。进一步，本文使用的术语仅是用于描述具体实施方案，而不是用来限制，下面对部分术语进行说明：

灭活：本发明所述“灭活”是指使感染性微生物丧失感染性，但同时保持其免疫原性，是本领域专业技术人员能够理解的。

免疫原性：抗原进入体内能刺激机体特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生针对该抗原的免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性。

易感动物：是指任何可感染阿卡斑(赤羽病)病毒的哺乳动物，这些动物包括牛、绵羊、山羊等。

接种：本发明所述“接种”指将灭活疫苗用注射器注射到动物的皮下或肌肉，为本领域一般专业技术人员能理解的。

左旋咪唑(LMS)：左旋-6-苯基-2,3,5,6-四氢咪唑并[2,1-b]噻唑，分子式C₁₁H₁₂N₂S，可促进抗体的产生，增强T细胞的活化和增殖，增强单核巨噬细胞的吞噬功能。结构式见附图1。

本发明所述的TCID₅₀、中和试验检测方法均为为本领域一般专业技术人员能理解的病毒检测通用方法。

实施例1阿卡斑病毒疫苗株的分离、鉴定和传代培养

1、阿卡斑病毒疫苗株的分离

2019年9月本发明人团队在对云南省楚雄州一羊场进行常规血液病毒监测时发现部分山羊赤羽病病毒抗体呈阳性，随即将该羊场的赤羽病病毒抗体阳性羊的血液接种BHK-21细胞进行病毒扩繁培养。首先将BHK-21细胞在25cm²的细胞培养瓶内培养，培养液是含有抗生素(100IU/mL青霉素和10μg/mL链霉素)和5％热灭活胎牛血清的MEM培养液，长满单层细胞后，接种1ml的赤羽病病毒抗体阳性羊的血液，37℃下感作4小时后完全倾倒培养液，然后用无血清MEM培养液洗涤1次，再补加5mL无血清MEM培养液到细胞培养瓶。将细胞培养瓶在37℃、 5％CO₂的温箱中培养3天。当观察到细胞病变效应(CPE)时，将病毒收获并接种到新BHK-21细胞中进行第二次传代。将第二次传代观察到细胞病变效应 (CPE)的病毒液采用极限稀释法在BHK-21细胞上进行噬斑挑选和鉴定，获得对 BHK-21细胞感染力强、无其它潜在病毒污染的单一株病毒扩繁培养物，命名为阿卡斑(赤羽病)病毒(Akabane Virus)CX-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏日期为2022年6月7日，保藏编号为：CGMCC No.45207。

2、病毒鉴定

阿卡斑(赤羽病)病毒CX-1株由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室保存，应用阿卡斑(赤羽病)病毒CX-1株M基因部分片段引物进行RT-PCR检测，验证阿卡斑(赤羽病)病毒CX-1株，引物来自参考文献Genetic analysis of Akabane virus isolates fromcattle in Korea(Dong-Jun An等，Veterinary Microbiology 140(2010)49–55)，扩增片段长度1224bp，引物1序列： GTTGATGAGTATTGTCTAAG，引物2序列：ATAAACACCATTTGAAGTCA。扩增片段进行基因序列测定，共2个重复分别标记为AKAV V1、AKAV V2，经比对确定该毒株为阿卡斑(赤羽病)病毒Ⅲ型基因群。

3、阿卡斑(赤羽病)病毒在不同细胞上的扩繁曲线试验

应用已经分别适应HmLu-1、Vero、BHK-21细胞的阿卡斑(赤羽病)病毒CX-1 种毒，分部接种HmLu-1、Vero、BHK-21细胞进行病毒扩繁曲线试验，以验证该病毒疫苗株在不同传代细胞上的敏感性和效率。将上述3种细胞培养的种毒分别作滴度(TCID₅₀)检测，并用无血清MEM维持液进行稀释，使接种病毒后病毒培养液内的终浓度为10^-3.5TCID₅₀/0.1mL，分别加入到对应长满单层细胞的HmLu-1、Vero、 BHK-21细胞培养瓶中，置37℃温箱中培养。分别在培养0、12、24、36、48、60、 72、84、96、108、120小时取样，每次取样0.5mL，同时补加0.5mL的无血清细胞培养液。取样完成后分别用HmLu-1、Vero、BHK-21细胞对该细胞培养的病毒样品进行滴度(TCID₅₀)检测，同时应用磁珠法核酸提取技术对每个样品提取核酸，进行探针法荧光qRT-PCR检测。

阿卡斑(赤羽病)病毒滴度(TCID₅₀/0.1mL)检测结果见表1、附图2，结果显示，HmLu-1、Vero、BHK-21细胞均在84～96个小时时滴度最高，其中HmLu-1 细胞培养病毒滴度最高为10^-5.75。荧光定量RT-PCR检测结果见表2、附图3，培养液中RNA含量在检测期内呈逐渐增加态势。

表1 HmLu-1、Vero、BHK-21细胞扩繁病毒TCID₅₀/0.1mL检测结果(-lg)

时间(h)	0	12	24	36	48	60	72	84	96	108	120
												HmLu-1	3.5	3.0	3.5	3.75	4.25	4.75	5.5	5.75	5.75	5.5	5.0
Vero	3.5	3.0	3.0	3.5	3.75	4.25	4.5	4.75	4.75	4.25	4.0
												BHK-21	3.5	3.25	3.75	3.75	3.75	4.0	4.25	4.5	4.5	4.25	4.0

表2 HmLu-1、Vero、BHK-21细胞扩繁病毒荧光定量RT-PCR检测结果(Ct值)

时间(h)	0	12	24	36	48	60	72	84	96	108
											HmLu-1	24.45	28.57	24.1	24.58	20.36	19.78	16.8	16.94	16.32	16.26
Vero	25.22	28.36	28.25	25.85	23.72	22.09	21.59	18.38	18.81	17.28
											BHK-21	26.99	27.23	23.24	22.36	23.43	22.31	21.14	20.76	16.99	16.54

注：Ct值越低病毒核酸含量越高。

4、病毒传代培养

将阿卡斑(赤羽病)病毒CX-1种毒在HmLu-1细胞上连续传代至第12代，应用上述TCID₅₀测定方法对第3、4、5、6、7、8、9、10、11、12代进行病毒滴度测定。检测结果见表3，病毒在3～12可稳定传代培养，但是优选第7代病毒作为灭活疫苗用种毒。

病毒对细胞需要一个适应的过程，前面几代往往病毒滴度偏低，种毒量也较少，不适合作为大批量生产时的种毒，另外，作为一个疫苗用种毒，病毒在持续的扩繁过程中会发生基因变异，为保证疫苗用病毒的尽可能维持原有毒株的特征，代次过高也不行。因此要选择合适的代次作为种毒。本次试验中发现，第7代病毒滴度较高，而由其再次传代获得的第8代、第9代病毒滴度未出现下降趋势，而此时前面已有6个代次足以保证种毒的量，因此第7代比较适合作为种毒。

表3赤羽病病毒CX-1毒株在HmLu-1细胞病毒传代培养代次和滴度比对表(-lg)

细胞培养方瓶内HmLu-1细胞长满单层后倾倒干净细胞培养液，适量无血清 MEM培养液彻底洗瓶1次并倾弃干净，每瓶接种5％(v/v)滴度为10^-5/0.1mL左右的阿卡斑(赤羽病)病毒第7代种毒和适量无血清MEM细胞维持液，37℃培养3～4 天，待70～80％细胞出现显著病变时置-20℃冻存，完全冰冻后置室温融化，用半融化的瓶内冰块刮下细胞层，剧烈震荡病毒培养液破碎细胞。病毒培养液置离心瓶内，5000rpm/min离心30分钟，上清液即为阿卡斑(赤羽病)病毒液，-20℃或-80℃保存备用。取少量病毒液进行滴度测定，滴度≥10^-5/0.1mL方可使用； 3批次病毒滴度(TCID₅₀)分别为10^-5.5/0.1mL、10^-5.75/0.1mL、10^-5.5/0.1mL，说明本发明的赤羽病病毒CX-1毒株传至第7代时即可以用做种毒制备灭活疫苗。

实施例2病毒灭活、组合物筛选和免疫效果评估

1、病毒灭活和组合物配制免疫比较试验

制备3批次0.2M的BEI灭活剂，具体方法为：在重量比1.6％氢氧化钠溶液(4N) 中加入重量比4.1％二乙烯亚胺(BEA)，充分溶解，此为0.2mol/L的BEA溶液，置 37℃1.5h进行环化，期间每15分钟剧烈晃动10秒，反应结束后即得到0.2M的BEI 灭活剂。3批次灭活剂均照此方法制备，现用现配；将病毒滴度为10^-5.75/0.1mL 的病毒液分为3份，每份100mL，每份用1个批次BEI的灭活剂进行灭活。首先将待灭活的病毒悬液置37℃水浴锅中，使病毒液温度达到37℃，然后将0.2M BEI 灭活剂按照1％的量加到病毒液中，置37℃温箱中搅拌灭活。分别在灭活0、1、2、 3、4、5、6、7、8h时取样5mL，并添加2M的硫代硫酸钠溶液10μL到样品内，终止灭活反应，4℃保存待检。所有样品用无血清MEM培养液分别作10^-1～10^-6 10 倍比梯度稀释，并加入到提前准备好的长满HmLu-1细胞的96孔培养板孔内，每个稀释度4孔，每孔0.1mL，然后每孔补加0.1mL无血清MEM培养液，置5％二氧化碳 37℃温箱中反应。5天后读取结果，计算病毒半数感染量(TCID₅₀)，本次实验检测结果见表4。结果显示，3批次灭活剂均在灭活病毒液5小时后TCID₅₀为0，即病毒液不再感染细胞，灭活完成。

为确保对阿卡斑(赤羽病)病毒的灭活完全彻底，在BEI灭活剂用量不变的前提下，本发明最优的选择灭活8个小时，其中第5个小时后更换灭活用容器(瓶) 1次。

表4 1％的0.2M BEI灭活阿卡斑(赤羽病)病毒滴度检测结果(TCID₅₀/0.1mL，-lg)

灭活时间(h)	0	1	2	3	4	5	6	7	8
										第1批次	5.75	4.25	2.25	1.25	0.5	0	0	0	0
第2批次	5.75	4.5	2.5	1.25	0.25	0	0	0	0
										第3批次	5.75	4.25	2	1	0.25	0	0	0	0

将上述制备好的灭活病毒液分为4份，按照表4的方法进行添加试剂配制，分别命名为1～4组，第5组为对照组为HmLu-1细胞上清液。然后按照1:1的量加入ISA 206佐剂同上搅拌乳化，4～6℃放置30天后进行疫苗免疫试验。每种疫苗接种5 只小鼠，每只小鼠皮下接种0.2mL，21天后心脏采血分离血清，进行中和抗体检测(SNT)。在96孔细胞培养板上将待检血清作1:4～1:512倍比稀释，应用100 TCID₅₀的病毒液在5％二氧化碳37℃温箱中进行中和反应1小时，然后以HmLu-1细胞作为感作细胞，每孔加100μL细胞生长液约含1×10⁴个细胞，5％二氧化碳37℃温箱反应5天后读取结果，结果见表5。结果显示，添加5％蔗糖、5％海藻糖、1％左旋咪唑的疫苗组免疫效果最好，平均中和抗体滴度为18。

因此可见，阿卡斑(赤羽病)病毒灭活后需添加蔗糖、海藻糖、左旋咪唑(LMS) 稳定抗原、提高机体对抗原的免疫应答反应，优选的，质量比为5％蔗糖、5％海藻糖、1％左旋咪唑。

表5阿卡斑(赤羽病)病毒灭活疫苗不同添加剂免疫效果比较

实施例3疫苗佐剂和免疫接种及保护力试验

用于组合物的生物学可接受的佐剂包括油乳佐剂、铝佐剂、皂苷类佐剂、聚羧乙烯佐剂的一种或多种的混合物佐剂。

在一个实施方案中，以ISA206为佐剂时，与灭活病毒悬液按照体积比1:1混合，容器置冰上或在4～6℃及更低的温度空间内进行，普通乳化器械3000 rpm/min搅拌5min，乳化后的疫苗应在室温下静置48小时无可见分层现象。

按本发明公开的阿卡斑(赤羽病)病毒灭活疫苗的制备方法制备疫苗，包括以下步骤：

(1)病毒培养及处理：在细胞培养方瓶内培养HmLu-1细胞，待长满单层后倾倒干净细胞培养液，用无血清MEM培养液彻底洗瓶1次并倾弃干净，每瓶接种5％(v/v)滴度为10^-5/0.1mL左右的赤羽病病毒CX-1 疫苗株第7代种毒和能覆盖住传代细胞的无血清MEM细胞维持液，37℃培养3天，待70～80％的传代细胞出现显著病变时置-20℃冻存，完全冰冻后置室温融化，用半融化的瓶内冰块刮下细胞层，剧烈震荡病毒培养液破碎细胞；然后将此病毒培养液置离心瓶内，5000 rpm/min离心30分钟，上清液即为赤羽病病毒液，取赤羽病病毒液于-20℃或-80℃保存备用；

(2)制备0.2M的BEI灭活剂：在重量比1.6％的氢氧化钠溶液中加入重量比4.1％二乙烯亚胺，充分溶解，此为0.2mol/L的二乙烯亚胺溶液，置37℃1.5h进行环化，期间每15分钟剧烈晃动10秒，反应结束后即得到0.2M的BEI灭活剂，现用现配；

(3)灭活病毒操作：向步骤(1)获得的赤羽病病毒液中加入体积比为 1％的步骤(2)获得的BEI灭活剂，充分混匀后置37℃持续搅拌灭活，灭活5小时后将容器内液体更换容器，继续置37℃搅拌灭活3小时，然后加入BEI 2倍摩尔量的硫代硫酸钠，混匀，终止灭活，得到灭活的赤羽病病毒液，置于4℃保存备用；

(4)在上述灭活的赤羽病病毒液内添加质量比5％蔗糖、5％海藻糖、1％左旋咪唑，置于4℃保存备用；

(5)在步骤(4)获得的复合物混合液中加入ISA206，ISA206:复合物混合液体积比为1:1，混匀搅拌乳化，定量分装密封后即得所述赤羽病病毒灭活疫苗。

随机选用2～3月龄小鼠15只，其中10只用于疫苗接种试验组，5只作为对照组。疫苗接种试验组每只皮下接种疫苗0.2mL，对照组每只皮下接种同样乳化处理的MEM细胞培养液0.2mL。首次免疫后第14天断尾采血，每只采集约0.2mL，分离血清。首次免疫后21天进行第二次免疫，每只皮下同上接种0.2mL疫苗，二次免疫后14天同上断尾采血。第21天用第3代细胞毒攻毒，将第3代阿卡斑(赤羽病)病毒细胞培养液用生理盐水稀释至1000TCID₅₀，每只脑内接种50微升，每日观察临床症状至攻毒后15天。检测和观察结果见表6，结果显示，首次免疫后平均抗体效价为19.1，二次免疫后平均抗体效价为76.4，脑部攻毒后疫苗免疫组0只小鼠死亡，对照组100％死亡。说明本发明制备的阿卡斑(赤羽病)灭活疫苗具有良好的免疫保护效果。

表6阿卡斑(赤羽病)病毒灭活疫苗免疫接种抗体及保护力试验结果

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一株阿卡斑病毒疫苗株，命名为阿卡斑（赤羽病）病毒CX-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏日期为2022年6月7日，保藏编号为：CGMCC No.45207。

2.一种阿卡斑病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、病毒培养及处理：在细胞培养方瓶内培养传代细胞，待长满单层后倾倒干净细胞培养液，用无血清MEM培养液彻底洗瓶1次并倾弃干净，每瓶接种5%毒价为10^-5/0.1mL的权利要求1所述的阿卡斑病毒CX-1疫苗株种毒和能覆盖住传代细胞的无血清MEM细胞维持液，37℃培养3～4天，待70～80%的传代细胞出现显著病变时置-20℃冻存，完全冰冻后置室温融化，用半融化的瓶内冰块刮下细胞层，剧烈震荡病毒培养液破碎细胞；然后将此病毒培养液置离心瓶内，5000 rpm/min离心30分钟，上清液即为阿卡斑病毒液，取阿卡斑病毒液于-20℃或-80℃保存备用；

步骤2、制备0.2M的BEI灭活剂：在重量比1.6%的氢氧化钠溶液中加入重量比4.1%二乙烯亚胺，充分溶解，此为0.2mol/L的二乙烯亚胺溶液，置37℃1.5 h进行环化，期间每15分钟剧烈晃动10秒，反应结束后即得到0.2M的BEI灭活剂，现用现配；

步骤3、灭活病毒操作：向步骤1获得的阿卡斑病毒液中加入体积比为0.5～2%的步骤2获得的BEI灭活剂，充分混匀后置37℃持续搅拌灭活，灭活5小时后将容器内液体更换容器，继续置37℃搅拌灭活3小时，然后加入BEI 1～4倍摩尔量的硫代硫酸钠，混匀，终止灭活，得到灭活的阿卡斑病毒液，置于4℃保存备用；

步骤4、在上述灭活的阿卡斑病毒液内添加质量比2～10%的蔗糖，2～10%的海藻糖，0.5%～2%的左旋咪唑，置于4℃保存备用；

步骤5、在步骤4获得的复合物混合液中加入佐剂，佐剂: 复合物混合液体积比为1:1～3，混匀搅拌乳化，定量分装密封后即得所述阿卡斑病毒灭活疫苗。

3.根据权利要求2所述阿卡斑病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述传代细胞为HmLu-1细胞、Vero细胞、BHK-21细胞其中一种或数种。

4.根据权利要求2所述阿卡斑病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述佐剂包括铝佐剂、油乳佐剂、皂苷和聚羧乙烯的一种或多种的混合物，所述佐剂与复合物混合液的体积比为1:1～3。

5.根据权利要求2所述阿卡斑病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述阿卡斑病毒CX-1疫苗株种毒为所述阿卡斑病毒CX-1疫苗株传代至第7代的病毒。

6.根据权利要求4所述阿卡斑病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述佐剂为油乳佐剂ISA206时，与复合物混合液的体积比为1:1。

7.根据权利要求2所述阿卡斑病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1完成后，所述阿卡斑病毒液滴度应≥10^-5/0.1mL。

8.根据权利要求2所述阿卡斑病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤3里向步骤1获得的阿卡斑病毒液中加入体积比为1%的步骤2获得的BEI灭活剂。

9.根据权利要求2所述阿卡斑病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤3里加入BEI2倍摩尔量的硫代硫酸钠，混匀，终止灭活。

10.根据权利要求2所述阿卡斑病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤4里添加质量比5%蔗糖、5%海藻糖、1%左旋咪唑。

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