CN111073862A - 一种牛病毒性腹泻2型减毒毒株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株及其应用，其为牛病毒性腹泻病毒2型XJ120株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18875，保藏日期：2019年11月15日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编100101。本发明牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗应用安全，对牛病毒性腹泻病毒2型引起的牛病毒性腹泻有良好的免疫保护效果。免疫牛可获得至少8个月的保护。

Description

一种牛病毒性腹泻2型减毒毒株及应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体的，涉及一种牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株及其应用。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)，又名黏膜病病毒(Mucosal disease virus)是黄病毒科，瘟病毒属的代表之一。病毒粒子呈圆形，外有囊膜，直径50～80nm，核衣壳为非螺旋的20面体对称结构，直径约27～29 nm。在蔗糖中的浮密度为1.13～1.14g/cm3。该病毒对氯仿、乙醚、胰酶敏感；不耐酸、对碱具有较强的耐受性。在36～37℃条件下灭活较慢，在56℃30min 条件下较敏感，56℃70min完全灭活。该病毒对外界环境抵抗力较弱，常用消毒药能很快将其杀死，但5-碘脱氧尿核苷(5,-IUDR)不能抑制病毒的增殖。真空冻干病毒在60℃～70℃下可保存多年。

BVDV基因组为单股正链RNA，基因组大小约为12.5kb，分为5’端非翻译区、开放阅读框架区和3’端非翻译区。BVDV不同毒株之间存在较大的抗原变异，目前可将其分为三个基因型，即BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3，基因型又可进一步分为不同的基因亚型(BVDV-1a～1u；BVDV-2a，-2b)等。BVDV-1 是世界各地广泛流行的病毒基因型；BVDV-2最早被发现于北美，欧洲、亚洲、南美洲也有报道，在我国的新疆、青海、山东等省区也有发生；BVDV-3最早报道在巴西发现并且在欧洲牛群感染导致了严重的呼吸道疾病，近期在我国河南省也有报道。

牛病毒性腹泻病(bovine viral diarrhea，BVD)，又称牛病毒性腹泻/黏膜病(BVD/MD)，是由上述病原引起的主要发生于牛的一种急性、热性传染病，主要表现为腹泻、发热、黏膜糜烂溃疡、白细胞减少、咳嗽及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿。该病呈世界性分布，1946年Olatson等在美国纽约州首次报到本病， 1983年我国首次从国外引进牛的流产胎儿脾脏中分离并鉴定出医嘱牛病毒性腹泻病毒，随着养牛业的迅速发展，该病在我国西北、西南、华北、东北等20多个省市自治区均有发生、流行,个别地区阳性率在85％以上，给我国养牛业发展造成了巨大的经济损失。欧美国家已经制定并实施了控制和根除BVDV的计划，主要采用疫苗接种、加强监测、淘汰持续感染和免疫耐受的动物等综合措施控制本病。目前，由于我国对BVDV危害的重视程度不足，也没有系统开展全国范围的BVDV分子流行病学调查，对BVDV流行规律和主要流行基因型或基因亚型还不清楚，所以造成试制疫苗效果不理想，从而导致没有行之有效的BVDV疫苗投入生产，同时，BVDV为RNA病毒，容易发生基因变异，近几年我国BVDV毒株的基因型和基因亚型呈现逐渐增多的趋势，最终致使该病的流行在我国越来越严重。截止至2018年，全球商品化的BVD疫苗有将近200种，大多数疫苗都是针对BVDV1型毒株，专门针对预防BVDV2型毒株的疫苗尚未见报道。因此，迫切需要分离我国的流行毒株，筛选免疫原性强的BVDV2典型毒株，研制出对牛安全和有效的牛病毒性腹泻疫苗，减少牛病毒性腹泻对养牛业造成的损失。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种牛病毒性腹泻病毒2 型减毒毒株及其应用。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株，其分类命名为bovine viral diarrheavirus，其为牛病毒性腹泻病毒2型XJ120株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18875，保藏日期：2019年 11月15日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编100101。

优选的，所述牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株的结构蛋白E2基因序列为 SEQ ID.1所示的序列。

优选的，所述牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株由牛病毒性腹泻2型病毒在 MDBK细胞上连续加压传代120代，进行人工减毒致弱而得。

本发明还包括一种牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株的应用，用于制备牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗制剂。

优选的，所述牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗制剂包含牛病毒性腹泻病毒2 型减毒毒株及冻干保护剂。

优选的，所述牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗制剂由牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株和与冻干保护剂混合后，经真空冷冻干燥制备而成。

优选的，所述牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗制剂对牛施用单剂，免疫剂量为2ml/头份。

优选的，所述牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗制剂每头份剂量中至少含有 10^6.5TCID₅₀的牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗应用安全，对牛病毒性腹泻病毒2型引起的牛病毒性腹泻有良好的免疫保护效果；免疫牛可获得至少8个月的保护。

附图说明

图1为本发明牛病毒性腹泻2型病毒XJ120株致MDBK细胞病变；其中，左边：产生细胞病变的MDBK细胞；右边：正常MDBK细胞；

图2为本发明牛病毒性腹泻病毒XJ120株RT-PCR检测；其中，凝胶电泳加样顺序依次为：泳道1：阴性对照；泳道2：牛病毒性腹泻病毒XJ120株；泳道3：阳性对照；M：2000bpMarker，由上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp、100bp；

图3为牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗免疫犊牛抗体消长规律。

具体实施方式

以下实施方案仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或者替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明所应用的方法可以采用病毒研究领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所用试剂和材料如下：CO₂培养箱购自Thermo公司；高速台式离心机购自上海安亭科学仪器厂；凝胶成像系统Tanon 1600R购自北京原平皓生物技术有限公司；PCR仪购自Eppendorf；核酸蛋白电泳仪购自北京市六一仪器厂；DNA MarkerⅡ、PrimeScript^TMRT试剂盒购自大连宝生物工程有限公司； MDBK(Madin-Darby Bobine Kidneycell)细胞购自中国兽医药品监察所；DMEM 培养基和0.25％Trypsin-EDTA(1×)胰酶购自Gibco公司；胎牛血清购自内蒙古金源康生物工程有限公司。

实施例1牛病毒性腹泻2型病毒的分离鉴定

1.1牛病毒性腹泻病毒的分离

采集疑似发生病毒性腹泻牛的鼻拭子，将拭子深入鼻腔来回擦拭2～3次并旋转，取分泌物。将采集的鼻拭子放入盛有2.0ml PBS的采样管中，编号备用。

用含1000U/ml青霉素和链霉素的细胞培养液4倍稀释后，2000r/min离心 15min，取上清液，编号备用。

将鼻拭子处理液接种于6孔细胞培养板上生长旺盛的单层MDBK细胞，每孔接种0.5ml，同时设立阴性对照孔，于37℃含5％CO₂培养箱内吸附2～3h，补加细胞维持液。对照孔不接种样品，弃去培养液后加入等量细胞维持液。均置于37℃含5％CO₂培养箱内培养。

鼻拭子处理液接种MDBK单层细胞后，第1代未出现牛病毒性腹泻病毒典型的CPE(细胞病变)。将第1代无CPE的细胞培养物冻融3次后混合，3000r/min 离心10min，取上清液，再次接种MDBK单层细胞。

按照该方法盲传至第6代，鼻拭子处理液接种MDBK单层细胞开始出现局部CPE，收获细胞培养物，再次接种MDBK单层细胞36h后产生了典型的牛病毒性腹泻病毒典型的CPE，主要表现为：细胞变圆，细胞间距变大，胞质内出现大小不等、边缘整齐的空泡，细胞逐渐脱落，并出现细长或网状的胞质性突起物，最后细胞完全脱离瓶壁，出现空斑，而对照组细胞生长良好(图1)。

1.2牛病毒性腹泻病毒的RT-PCR鉴定

1.2.1病毒RT-PCR检测

参照文献中已发表的BVDV检测引物，并送至上海生工生物技术有限公司合成，引物序列如下表1：

表1 BVDV E2基因检测引物

取200ul病毒细胞培养物，加入800ul TransZol Up，震荡混匀，室温静置 5min。加入200ul氯仿，剧烈震荡30s，室温静置3min。12000r/min，4℃离心 15min。转移上层水相于新的离心管中，加入等体积(700ul)的异丙醇充分颠倒混匀，室温静置30min。12000r/min，4℃离心15min。弃上清，加无水乙醇洗涤，12000r/min，4℃离心5min。弃上清，室温干燥10min。用15μL经过DEPC处理过的无菌水溶解沉淀，置-80℃冰箱备用。

RT-PCR扩增体系如下：2XR-Mix buffer 10ul，引物各0.5ul(10mol/L)， E-Mix0.4ul，RNA 4ul，灭菌双蒸水4.6ul。反应程序如下：45℃反转录30min， 94℃预变性5min，94℃30s，54℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸10min。取扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示分离株得到一条大小约为1336bp的特异性条带，并将RT-PCR产物送至上海生工生物技术有限公司进行测序分析，测序结果与NCBI已发表的BVDV序列进行基因进化树分型分析，结果显示该分离株属于BVDV-2a亚型。

实施例2牛病毒性腹泻2型病毒的致弱

2.1病毒传代将分离的BVDV-2型病毒接种于生长良好单层的MDBK细胞，接种比例为5％。吸附1h后，加入DMEM维持液，置37℃、CO2培养箱培养 48～72小时，待细胞病变(CPE)达70％以上收获，-40℃以下反复冻融2次，将培养液转入离心管中，在4℃的温度下，3000r/min离心30min，除去细胞碎片，收集上清液并分装成小管，保存于-70℃冰箱中备用。以后按照相同的方法继续传代培养至120代。

2.2蚀斑试验选择F₉₀、F₁₀₀、F₁₁₀和F₁₂₀进行蚀斑试验。挑取同一大小的蚀斑放入50μlDMEM中，反复冻融3次；4℃、4000×g离心10分钟；取上清液接种于长满MDBK细胞的细胞瓶，继续传代。如此进行多次蚀斑纯化，至90％以上蚀斑直径小于1mm。

2.3感染试验取不同传代病毒，F₉₀、F₁₀₀、F₁₁₀和F₁₂₀喷雾感染2月龄犊牛各5头，2ml/头，观察14日，记录临床表现及病理变化，观察犊牛临床表现及病变，并于感染后28日采血测定血清中BVDV-2中和抗体，结果如表2所示，F90 有轻微的症状，传代至F100代和F110代时无BVDV感染症状发生，传至第120代平均抗体效价最高，免疫原性最强。通过毒力返强试验研究表明，第120代毒株对易感牛无任何毒力，未出现毒力返强。因此优选120代毒株作为减毒活疫苗候选株，命名为XJ120株。

表2 牛病毒性腹泻病毒2型不同代次感染试验

2.4序列分析提取不同代次的病毒RNA作为模板，以BVDV-F和BVDV-R 作为上下游引物进行RT-PCR扩增。反应条件同前，产物交上海生工公司测序。

2.5将无致病性但具有免疫原性的牛病毒性腹泻2型病毒XJ120株分装，冻干保存。

实施例3牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗的制备及检验

3.1病毒的繁殖将牛病毒性腹泻病毒2型XJ120株基础种子用DMEM细胞维持液进行1:10稀释，然后将稀释的病毒液按0.1MOI接种于生长良好的 MDBK单层细胞，置37℃含5％CO₂细胞培养箱中培养5日至80％以上细胞出现典型CPE收获，作为制备疫苗用病毒。

3.2牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗的制备将上述BVDV-2型疫苗候选株 XJ120株与冻干保护剂按体积比1:1的比例充分混匀，定量分装。分装后迅速进行冷冻真空干燥。

3.3牛病毒性腹泻弱毒疫苗的安全性

将疫苗用灭菌生理盐水稀释为每毫升含10头份，颈部肌肉注射1～3月龄BVDV抗原、抗体阴性健康犊牛5头，每头2ml，连续观察15日，未出现牛病毒性腹泻临床症状或明显的因注射疫苗引起的不良反应。

3.4牛病毒性腹泻弱毒疫苗的效力性

如表3所示，用BVDV抗原、抗体阴性健康犊牛10头，其中5头牛分别颈部肌肉注射牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗(XJ120株)1头份，另外5头牛作为对照组，颈部肌肉注射接种MDBK细胞冻融物。免疫后28日，采血，微量血清中和试验检测BVDV抗体效价。同时，将实验牛用牛病毒性腹泻病毒XJ株强毒经鼻内喷雾接种攻击，接种4.0ml，2ml/鼻孔(效价为10^7.5TCID₅₀/ml)。

表3 牛病毒性腹泻XJ120株弱毒疫苗效力研究牛免疫分组

攻毒后连续观察14日，每日测量体温，观察记录临床症状并采集鼻拭子进行病毒分离，隔日采血用于病毒分离和白细胞计数，于攻毒后14日结束。免疫实验结果如下表4所示，牛病毒性腹泻病毒XJ120株可诱导产生高水平的抗体，可以作为疫苗研制的候选毒株。

表4 牛病毒性腹泻XJ120株弱毒疫苗效力研究结果

实施例4牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗抗体持续期研究

4.1研究所用实验动物为8～12周龄BVDV抗原、抗体阴性犊牛，如表5 所示，分为2组。组1为本发明所述疫苗免疫组，在该研究的第0天接种，皮下接种2ml。

表5 牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗抗体持续期研究免疫分组

4.2分别于免后14日、免后28日、免后2个月、免后4个月、免后6个月、免后8个月采血测定抗体效价。结果如图3所示，结果表明，牛病毒性腹泻抗体免后14日开始产生，但抗体水平较低。免后28日，抗体水平迅速提升，免后2个月抗体水平达到最高，至免后8个月抗体仍可维持较高水平。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京华夏兴洋生物科技有限公司

北京生泰尔科技股份有限公司

<120> 一种牛病毒性腹泻2型减毒毒株及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1140

<212> DNA

<213> 牛病毒性腹泻病毒2型(bovine viral diarrhea virus,type2 E2蛋白序列)

<400> 1

atgctaataa caggggcaca gggcttccct gaatgcaaag agggcttcca atatgccata 60

tcaaaagtca aaaagatggg gttattgggg ccagagagtt taactacgac atggcacctt 120

cccaccaaaa aattagtgga ctccatgata caggtatggt gtgaaggaga aaacttgaaa 180

atattaaaga cgtgcacaaa agaagagagg tacttagtgg ctgtgcacga aagagcccta 240

tcaactagtg ctgaatttat gaagatcagt gatggggcaa taggtccaga cgtaatagat 300

atgcctgatg actttgagtt tggactctgc ccctgcgact caaaacctat aataaagggc 360

aaattcaatg ctagcctgct gaatggacca gctttccaga tggtatgccc acaggggtgg 420

actggtacaa tagaatgcac cctggcgaac caagaaacat tggacacaac cgttgttagg 480

atatatagaa gaactattcc atttcagcag agaaaatggt gtgcctatga aaaaataata 540

ggggaagata tctatgaatg catcctaggt ggaaactgga catgcatagc aggtgaccat 600

agtaagttga aagatgggcc tatcaagaag tgtaagtggt gtggctacga ttttttcagc 660

tcagagggac tgccacacta cccaataggt aagtgcatgc tcagtaatga gagtgggtac 720

aggtatgtag atgacactcc ttgtgatagg ggtggtgtag ccatagttcc aacaggcacc 780

gtaaagtgta gaataggtaa tgtcacggtg caggttatcg ccactaacaa ggacctggga 840

cccatgccct gcagcccaaa tgaagtgata gctagtgaag gaccagtgga aaagacggct 900

tgcacattca attattcaaa gacactacca aacaagtatt acgagccaag ggatcggtac 960

ttccagcaat atatgttgaa aggggagtgg caatactggt ttgacctgga ctctgtagac 1020

caccacaaag attacttttc agagttcata atcatagcag tggttgcctt gctgggcggt 1080

aagtatgtac tgtggctatt agtaacttat atgatactgt ctgagcagat ggctatgggt 1140

Claims (8)

1.一种牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株，其为牛病毒性腹泻病毒2型XJ120株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18875。

2.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株，其特征在于：所述牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株的结构蛋白E2基因序列为SEQ ID.1所示的序列。

3.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株，其特征在于：所述牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株由牛病毒性腹泻2型病毒在MDBK细胞上连续加压传代120代，进行人工减毒致弱而得。

4.权利要求1所述牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株的应用，其特征在于：用于制备牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗制剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗制剂包含牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株及冻干保护剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗制剂由牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株和与冻干保护剂混合后，经真空冷冻干燥制备而成。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗制剂对牛施用单剂，免疫剂量为2ml/头份。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述牛病毒性腹泻2型减毒活疫苗制剂每头份剂量中至少含有10 ^6.5TCID₅₀的牛病毒性腹泻病毒2型减毒毒株。

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