CN109735564B - 一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用 - Google Patents

一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109735564B
CN109735564B CN201811596652.0A CN201811596652A CN109735564B CN 109735564 B CN109735564 B CN 109735564B CN 201811596652 A CN201811596652 A CN 201811596652A CN 109735564 B CN109735564 B CN 109735564B
Authority
CN
China
Prior art keywords
qyy
virus
plasmid
variant
egfp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811596652.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109735564A (zh
Inventor
陈陆
王永生
常洪涛
石昂
王新卫
王川庆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Agricultural University
Original Assignee
Henan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Agricultural University filed Critical Henan Agricultural University
Priority to CN201811596652.0A priority Critical patent/CN109735564B/zh
Publication of CN109735564A publication Critical patent/CN109735564A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109735564B publication Critical patent/CN109735564B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于猪伪狂犬病病毒技术领域,公开一种猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE/TK的构建方法和应用。以HN‑QYY为亲本毒株,依次缺失gE基因和TK基因,获得猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE/TK;所述猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE/TK在制备猪伪狂犬病活疫苗中的应用。本发明猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE/TK缺失了gE基因和TK基因,能够在后期的抗体检测中有效地区分野毒和疫苗毒,为猪伪狂犬病的预防和净化提供了有效的方法。

Description

一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用
技术领域
本发明属于猪伪狂犬病病毒技术领域,具体涉及一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用。
背景技术
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的猪的急性,高度接触性传染病。该病在猪群呈暴发性流行,可引起妊娠母猪流产、死胎,公猪不育,新生仔猪大量死亡,育肥猪呼吸困难、生长停滞等,是危害全球养猪业的重大传染病之一。猪是伪狂犬病毒的贮存宿主,并且病毒可以潜伏感染在猪体内,严重我国和世界养殖业的发展。2011年之前,我国主要使用活疫苗Bartha-K61株,但是,随着猪伪狂犬病在我国再次暴发,表明传统的活疫苗Bartha-K61株不能够提供良好的保护。通过对新分离到的猪伪狂犬病病毒进行测序分析,结果表明猪伪狂犬病病毒已经发生了变异,而且被感染的动物临床症状复杂,包括高烧,厌食,咳嗽,发抖,腹泻,和全身性神经症状。感染的猪憔悴,外表薄弱,最终死亡,育肥猪也在这个疫情期间发生死亡。因此,需要开发符合猪伪狂犬病病毒变异株的疫苗,才能有效的防制本病。目前,预防本病的灭活疫苗有猪伪狂犬病病毒灭活疫苗(鄂A株);活疫苗有HB98株、SA215株和Bartha-K61株,这些疫苗都在不同程度上控制了本病的发生。许多欧洲国家对猪伪狂犬病采取了活疫苗、灭活疫苗和血清学诊断相结合的方法对伪狂犬进行了净化,取得了显著的成效。因此,需要针对当前猪伪狂犬病病毒的变异情况,分离新的流行毒株,开发更有效的活疫苗,才能更好的防制猪伪狂犬病。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案如下:
一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法,步骤如下:
S1、缺失gE基因:
S1.1、将猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY(保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期:2017年12月22日,保藏编号:CGMCC No.15192)接种至长满单层的vero细胞,当细胞出现80%以上病变的时候,收获病毒液,反复冻融,离心,取上清,酚氯仿方法提取变异株HN-QYY病毒基因组DNA,保存备用;
S1.2、以变异株HN-QYY病毒基因组DNA为模板,利用引物gEL-f/gEL-r和gER-f/gER-r分别PCR扩增gE基因上下游同源臂gEL和gER,琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物,测定DNA含量,保存备用;
其中,引物序列分别为:
gEL-f:如SEQ ID No.1所示;gEL-r:如SEQ ID No.2所示;
gER-f:如SEQ ID No.3所示;gER-r:如SEQ ID No.4所示;
S1.3、EcoR I和Spe I双酶切gEL,Spe I和Hind III双酶切gER,EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体,回收酶切后的gEL、gER、pMD18-T;
S1.4、将回收后的gEL和gER连接到回收后的pMD18-T上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pgE;
S1.5、Spe I单酶切质粒pgE,纯化后去磷酸化,再次纯化;
S1.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体,回收酶切后的pEGFP-N1;将回收后的pEGFP-N1连接到去磷酸化后的pgE上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pgE-EGFP;
S1.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/EGFP+
将步骤S1.1所得变异株HN-QYY病毒基因组DNA、pgE-EGFP共转染至293T细胞,空斑纯化,直至所有细胞病变均出现绿色荧光,获得重组荧光病毒HN-QYY-gE-/EGFP+
S1.8、去除绿色荧光基因
将HN-QYY-gE-/EGFP+和pcGlobin2-Cre质粒共转染至293T细胞,空斑纯化,直至所有细胞病变均不带荧光,获得猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-(保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期:2018年01月02日,保藏编号:CGMCC No.15200);
S2、缺失TK基因:
S2.1、将步骤S1.8所得变异株HN-QYY-gE-接种至长满单层的vero细胞,当细胞出现80%以上病变的时候,收获病毒液,反复冻融,离心,取上清,酚氯仿方法提取变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA,保存备用;
S2.2、以变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA为模板,利用引物TKL-f/TKL-r和TKR-f/TKR-r分别PCR扩增TK基因上下游同源臂TKL和TKR,琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物,测定DNA含量,保存备用;
其中,引物序列分别为:
TKL-f:如SEQ ID No.5所示;TKL-r:如SEQ ID No.6所示;
TKR-f:如SEQ ID No.7所示;TKR-r:如SEQ ID No.8所示;
S2.3、EcoR I和Spe I双酶切TKL,Spe I和Hind III双酶切TKR,EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体,回收酶切后的TKL、TKR、pMD18-T;
S2.4、将回收后的TKL和TKR连接到回收后的pMD18-T上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pTK;
S2.5、Spe I单酶切质粒pTK,纯化后去磷酸化,再次纯化;
S2.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体,回收酶切后的pEGFP-N1;将回收后的pEGFP-N1连接到去磷酸化后的pTK上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pTK-EGFP;
S2.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+
将步骤S2.1所得变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA、pTK-EGFP共转染至293T细胞,空斑纯化,直至所有细胞病变均出现绿色荧光,获得重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+
S2.8、去除绿色荧光基因
将HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+和pcGlobin2-Cre质粒共转染至293T细胞,空斑纯化,直至所有细胞病变均不带荧光,获得猪伪狂犬病病毒变异株 HN-QYY-gE-/TK-
所述猪伪狂犬病病毒变异株 HN-QYY-gE-/TK-在制备猪伪狂犬病活疫苗中的应用。
本发明的有益效果:
(1)、本发明猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY为当前的流行毒株,能够有效预防猪伪狂犬病的发生;
(2)、本发明猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-具有良好的免疫原性,能够刺激机体产生较高的中和抗体;
(3)、本发明猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-缺失了gE基因和TK基因,能够在后期的抗体检测中有效地区分野毒和疫苗毒,为猪伪狂犬病的预防和净化提供了有效的方法。
附图说明
图1:猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY的gE基因PCR鉴定,M:2000 DNA marker;1:HN-QYY gE基因的PCR扩增;2:vero细胞对照;
图2:pgE和pgE-EGFP质粒的PCR鉴定,M:15000bp DNA marker;1:pgE的PCR扩增;2:pgE-EGFP的PCR扩增;
图3:猪伪狂犬病病毒gE缺失株HN-QYY-gE-的PCR鉴定,M:250bp DNA marker,1:gE-f/gE-r对HN-QYY-gE-gE基因的PCR扩增,2:gEL-f/gER-r对HN-QYY-gE-的PCR扩增;3:gEL-f/gER-r对HN-QYY-gE-/EGFP+的PCR扩增;
图4:pTK质粒和HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+重组病毒的PCR鉴定,M:15000bp DNAmarker;1:pTK的PCR扩增;2:HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+的PCR扩增;
图5:HN-QYY-gE-/TK-重组病毒的PCR鉴定,M:250bp DNA marker;1:TK-f/TK-r对HN-QYY-gE-TK基因的PCR扩增;2:TK-f/TK-r对HN-QYY-gE-/TK-TK基因的PCR扩增;
图6:HN-QYY-gE-/TK-株与亲本毒HN-QYY株在vero细胞上的生长曲线。
具体实施方式
实施例1--猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY的分离鉴定
申请人在2012年从河南省洛阳市某猪场采集发病猪的脑组织,剪碎,按质量/体积比g/mL 1∶5加入灭菌PBS溶解,用组织匀浆机打碎,-70℃、室温反复冻融3次,8000rpm离心10min;取上清,用0.22μm一次性滤器过滤除菌,将所得的组织液按体积比1∶5接种到长满单层的vero细胞上,待病变达到80%时收获病毒液,-70℃、室温反复冻融3次,将病毒液8000rpm离心10min,取上清,重新接种长满单层的vero细胞,盲传5代(从出现病变的代次起),当病变稳定后,收获病毒,空斑纯化,即得猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY并-70℃保存。
用酚氯仿法抽提取猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY病毒基因组DNA,具体步骤为:
(1)、将空斑纯化后的病毒液-70℃、室温反复冻融3次;
(2)、取病毒液上清350μL加到1.5mL离心管,在管中加350 μL RIPA裂解液和10μL蛋白酶K于56℃水浴2 h;
(3)、加入700μL的Tris饱和酚,混匀3min,然后4℃离心机中12000rpm离心10min;
(4)、吸取上层液体加入新的离心管,再加入700μL 的Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的混合液(Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1,体积比),混匀3min, 4℃离心机中12000rpm离心10min;
(5)、吸取上清液加到新的离心管,加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液(氯仿∶异戊醇=24∶1,体积比),混匀3min,4℃离心机中12000rpm离心10min;
(6)、吸取上清液加入新的离心管,加入等体积的氯仿,混匀3min,4℃离心机中12000rpm离心10min;
(7)、吸取上清液400μL加入新的离心管,然后加入2.5体积倍的经过-20℃冷冻的无水乙醇,-20℃沉淀2h;
(8)、将样品取出,4℃离心机中12000rpm离心20min,弃上清,留白色沉淀,加1000μL经过-20℃冷冻的75v%乙醇,上下颠倒混匀,4℃离心机中12000rpm离心10min;
(9)、将酒精弃去,静止3min,待酒精挥发完毕,加入30μL的TE溶液,4℃溶解30min,即可得到DNA,-20℃保存备用。
猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY的鉴定采用gE基因PCR方法,引物如表1所示。gE基因PCR反应体系为:2xGC Buffer 25μL,dNTP(10 mmol/μL)1μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5μL,上下游引物(5 OD)各1μL,DNA模板(100 μg/mL)4μL,灭菌双蒸水补足至50 μL;反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃ 变性30 s,60℃退火30s,72℃延伸2min,30个循环;最后72℃10min;PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测,结果见图1,表明所分离的毒株为猪伪狂犬病病毒变异株。
实施例2--猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法
构建步骤如下:
S1、缺失gE基因:
S1.1、T25细胞瓶中vero细胞长满单层后,弃去营养液,用无菌PBS洗涤2次,接种30μL保藏编号为CGMCC No.15192的变异株HN-QYY,37℃ CO2培养箱中孵育1h,弃去病毒液,加入6mL的维持液(含2%胎牛血清的DMEM),继续37℃ CO2培养箱中培养,当细胞出现80%以上病变的时候,收获病毒液,-70℃、室温反复冻融3次,8000rpm离心10min,取上清,酚氯仿方法提取变异株HN-QYY病毒基因组DNA,-20℃保存备用;
S1.2、以变异株HN-QYY病毒基因组DNA为模板,利用引物gEL-f/gEL-r和gER-f/gER-r分别PCR扩增gE基因上下游同源臂gEL和gER,琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物,测定DNA含量,-20℃保存备用;
其中,引物序列如表2所示:
PCR扩增反应体系为:2xGC Buffer 25 μL,dNTP(10 mmol/μL)1 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL,上下游引物(5 OD)各1 μL,DNA模板(100 μg/mL)4 μL,补水至50 μL;PCR反应条件为:95 ℃预变性5 min;95 ℃ 变性30 s,60℃退火30s,72℃延伸80s,30个循环;最后72 ℃延伸10 min;
S1.3、EcoR I和Spe I双酶切gEL,Spe I和Hind III双酶切gER,EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体,回收酶切后的gEL、gER、pMD18-T,-20℃保存备用;;
其中,酶切体系分别为:EcoR I(15 U/μL) 1.5 μL,Spe I(15 U/μL) 1.5 μL,片段gEL 3 μg,10×buffer 5 μL,补水至50 μL;Spe I(15 U/μL) 1.5μL,Hind III(15 U/μL)1.5μL,片段gER 3 μg,10×buffer 5μL,补水至50 μL;EcoR I(15 U/μL) 1 μL,Hind III(15 U/μL) 1 μL,pMD18-T载体 2 μg,10×buffer 5 μL,补水至50 μL;酶切条件均为:37℃水浴锅中孵育4 h;
S1.4、将回收后的gEL和gER连接到回收后的pMD18-T上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pgE,-20℃保存备用;
其中,连接体系为:T4DNA连接酶(350 U/μL)1 μL,10×T4Ligase buffer 1 μL,基因片段与载体片段(以摩尔比计,gEL∶gER∶pMD18-T=5∶5∶1),补水至10 μL;连接条件为:16℃连接16h;
质粒转化的具体步骤为:取出大肠杆菌感受态细胞DH5α 100μL,置于冰水混合物中,将10μL连接产物全部加入感受态细胞中,轻轻震荡混匀,静置30 min;之后将感受态细胞置于42℃,热激90s,再置于冰水混合物中静置5 min,加入1mL不含抗性的LB培养基,37℃、200rpm摇床培养1h,然后离心,留200μL上清液,混合均匀,取100μL上清的菌液均匀涂在含有氨苄青霉素(Amp+)抗性的固体LB平板(氨苄青霉素含量100 μg/mL,下同)上,37℃恒温培养16 h,挑取菌落至1mL含有Amp+抗性的LB培养基中,37℃、200rpm摇床培养12h,制备成菌液,进行菌液PCR;
菌液PCR扩增体系:2xGC Buffer 25μL,dNTP(10 mmol/μL)1μL, Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL,引物gEL-f和gER-r(5 OD)各1μL,菌液4μL,补水至50 μL;PCR反应条件为:95℃预变性5 min;95 ℃ 变性30 s,60℃退火30s,72℃延伸150 s,30个循环;最后72 ℃延伸10 min;之后用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定(见图2),挑取电泳条带位置在2600bp的菌液为阳性菌液;
扩大培养步骤为:将阳性菌液按体积比1∶100接至15 mL LB培养基中,37 ℃摇床200 r/min 摇菌14 h;
S1.5、Spe I单酶切质粒pgE,纯化后去磷酸化,再用PCR产物试剂盒进行纯化,-20℃保存备用;
其中,酶切体系为:Spe I(15 U/μL)2 μL,质粒pgE 4 μg,10×buffer 5μL,补水至50 μL;酶切条件为:37℃水浴锅中孵育3h;
去磷酸化体系为:去磷酸化酶(1 U/μL) 2 μL,酶切后的质粒pgE 2 μg,10×buffer 5 μL,补水至50 μL;去磷酸化条件为:37℃水浴锅中孵育3h;
S1.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体(购自湖南丰晖生物科技有限公司),回收酶切后的EGFP-N1片段;将回收后的EGFP-N1片段连接到去磷酸化后的pgE上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pgE-EGFP;
其中,酶切体系为:Nhe I(15 U/μL)1 μL,Spe I(15 U/μL)1 μL,pEGFP-N1 2 μg,10×buffer 5 μL,补水至50 μL;酶切条件为:37℃水浴锅中孵育3h;
连接体系为:T4DNA连接酶(350 U/μL)1 μL,10×T4Ligase buffer 1 μL,基因片段与载体片段(以摩尔比计,EGFP-N1∶pgE=5∶1),补水至10 μL;连接条件为:16℃连接16h;
质粒转化、菌液PCR和扩大培养的步骤同步骤S1.4,只是菌液PCR在用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定(见图2)后,挑取电泳条带位置在4500bp左右的菌液为阳性菌液;
S1.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/EGFP+
采用脂质体LipofectamineTM2000将HN-QYY病毒基因组、pgE-EGFP按照1μg∶3μg的比例进行转染:首先将六孔板中生长至80%的293T细胞弃去营养液,每孔添加1mL的无血清DMEM,37℃ CO2培养箱中孵育1h;取两只离心管,每只加300μL无血清无双抗DMEM,然后第一管加步骤S1.1所得变异株HN-QYY病毒基因组DNA 1μg,脂质体3μL,第二管加质粒pgE-EGFP3μg,脂质体9μL,第一管和第二管全部震荡混匀,静置5min,之后将两管合并为一管,吹打混匀,静止30min,加入到293T细胞中,37℃ CO2培养箱中孵育6 h,弃去培养液,换成含2%胎牛血清的DMEM,37℃ CO2培养箱中继续培养,36h后收获,-70℃、室温反复冻融后,接种长满单层的vero细胞,待细胞出现80%的病变时收毒;
空斑纯化:取病毒液,离心,取上清将上清液按10倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板,每孔1000 μL,吸附1h后弃去病毒液,加入2%琼脂糖与2×DMEM(含2%胎牛血清)以体积比1∶1组成的混合物2 mL,待出现细胞病变时,在荧光显微镜下挑取最高稀释度中带荧光的空斑,并再次按照10倍倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板,待细胞出现绿色荧光病变时,选择稀释度最大的孔挑取带绿色荧光的空斑继续接种vero细胞,如此纯化至所有空斑均出现绿色荧光的病变,利用引物gEL-f/gER-r对其进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定(扩增体系及条件同步骤S1.4菌液PCR扩增体系及条件,见图3),将此代病毒保存,命名为HN-QYY-gE-/EGFP+
在vero细胞上扩增病毒,具体步骤为:当T25细胞瓶中vero细胞生长至单层,弃去旧的培养液,用无血清的DMEM 2mL将20μL的病毒液稀释,加入到细胞瓶中,37℃ CO2培养箱中孵育1h,换成含2%胎牛血清的DMEM,37℃ CO2培养箱中继续培养,细胞病变80%时后收获,-70℃、室温反复冻融,取适量病毒液,酚氯仿抽提DNA,测定含量,-20℃保存备用;
S1.8、去除绿色荧光基因
将HN-QYY-gE-/EGFP+和pcGlobin2-Cre质粒按照1μg∶3μg的比例按照步骤S1.7的方法转染至80%的293T细胞,36h后收获,-70℃、室温反复冻融3次后,接种长满单层的vero细胞,待细胞出现80%的病变时收获病毒液;按照步骤S1.7的方法空斑纯化病毒,直至所有的细胞病变均不带荧光,利用引物gEL-f/gER-r对其进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定(扩增体系及条件同步骤S1.4菌液PCR扩增体系及条件,见图3),将此代病毒保存,命名为猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-
用酚氯仿法抽提猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA,利用引物gE-f和gE-r对其gE基因进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定(扩增体系及条件同实施例1中HN-QYY的gE基因PCR扩增体系及条件,见图3),结果表明:HN-QYY-gE-成功缺失了gE基因;
S2、缺失TK基因:
S2.1、T25细胞瓶中vero细胞长满单层后,弃去营养液,用无菌PBS洗涤2次,接种30μL 步骤S1.8所得变异株HN-QYY-gE-,37℃ CO2培养箱中孵育1h,弃去病毒液,加入6mL的维持液(含2%胎牛血清的DMEM),继续37℃ CO2培养箱中培养,当细胞出现80%以上病变的时候,收获病毒液,-70℃、室温反复冻融3次,8000rpm离心10min,取上清,酚氯仿方法提取变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA,-20℃保存备用;
S2.2、以变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA为模板,利用引物TKL-f/TKL-r和TKR-f/TKR-r分别PCR扩增TK基因上下游同源臂TKL和TKR,琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物,测定DNA含量,保存备用;
其中,引物序列如表3所示:
PCR扩增反应体系及条件同步骤S1.2;
S2.3、EcoR I和Spe I双酶切TKL,Spe I和Hind III双酶切TKR,EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体,回收酶切后的TKL、TKR、pMD18-T,-20℃保存备用;;
其中,酶切体系及条件同步骤S1.3;
S2.4、将回收后的TKL和TKR连接到回收后的pMD18-T上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pTK,-20℃保存备用;
其中,连接体系及条件、质粒转化步骤、菌液PCR扩增体系及条件、扩大培养步骤同步骤S1.4,只是菌液PCR时的引物为TKL-f 和TKR-r,琼脂糖凝胶电泳鉴定结果见图4;
S2.5、Spe I单酶切质粒pTK,纯化后去磷酸化,再用PCR产物试剂盒进行纯化,-20℃保存备用;
其中,酶切体系及条件、去磷酸化体系及条件同步骤S1.5;
S2.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体(购自湖南丰晖生物科技有限公司),回收酶切后的EGFP-N1片段;将回收后的EGFP-N1片段连接到去磷酸化后的pTK上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pTK-EGFP;
其中,连接体系及条件、质粒转化步骤、菌液PCR扩增体系及条件、扩大培养步骤同步骤S1.4;
S2.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+
采用脂质体LipofectamineTM2000进行转染:首先将六孔板中生长至80%的293T细胞弃去营养液,每孔添加1mL的无血清DMEM,37℃ CO2培养箱中孵育1h;取两只离心管,每只加300μL无血清无双抗DMEM,然后第一管加步骤S2.1所得变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA1μg,脂质体3μL,第二管加质粒pTK-EGFP 3μg,脂质体9μL,第一管和第二管全部震荡混匀,静置5min,之后将两管合并为一管,吹打混匀,静止30min,加入到293T细胞中,37℃ CO2培养箱中孵育6 h,弃去培养液,换成含2%胎牛血清的DMEM,37℃ CO2培养箱中继续培养,36h后收获,-70℃、室温反复冻融后,接种长满单层的vero细胞,待细胞出现80%的病变时收毒;
空斑纯化:取病毒液,离心,取上清将上清液按10倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板,每孔1000 μL,吸附1h后弃去病毒液,加入2%琼脂糖与2×DMEM(含2%胎牛血清)以体积比1∶1的混合物2 mL,待出现细胞病变时,在荧光显微镜下挑取最高稀释度中带荧光的空斑,并再次按照10倍倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板,待细胞出现绿色荧光病变时,选择稀释度最大的孔挑取带绿色荧光的空斑继续接种vero细胞,如此纯化至所有空斑均出现绿色荧光的病变,利用引物TKL-f/TKR-r对其进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定(扩增体系及条件同步骤S1.4菌液PCR扩增体系及条件,见图4),将此代病毒保存,命名为HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+
在vero细胞上扩增病毒,具体步骤为:当T25细胞瓶中vero细胞生长至单层,弃去旧的培养液,用无血清的DMEM 2mL将20μL的病毒液稀释,加入到细胞瓶中,37℃ CO2培养箱中孵育1h,换成含2%胎牛血清的DMEM,37℃ CO2培养箱中继续培养,细胞病变80%时后收获,-70℃、室温反复冻融,取适量病毒液,酚氯仿抽提DNA,测定含量,-20℃保存备用;
S2.8、去除绿色荧光基因
将HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+和pcGlobin2-Cre质粒按照1μg∶3μg的比例按照步骤S2.7的方法转染至80%的293T细胞,36h后收获,-70℃、室温反复冻融3次后,接种长满单层的vero细胞,待细胞出现80%的病变时收获病毒液;按照步骤S2.7的方法空斑纯化病毒,直至所有的细胞病变均不带荧光,利用引物TKL-f/TKR-r对其进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定(扩增体系及条件同步骤S1.4菌液PCR扩增体系及条件),将此代病毒保存,命名为猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-
用酚氯仿法抽提猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-病毒基因组DNA。利用引物TK-f(如SEQ ID No.11)和TK-r(如SEQ ID No.12)分别对HN-QYY-gE-和HN-QYY-gE-/TK-中的TK基因进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定(扩增体系及条件同实施例1中HN-QYY的gE基因PCR扩增体系及条件,见图5),结果表明:HN-QYY-gE-/TK-成功缺失了TK基因。
实施例3--猪伪狂犬病病毒活疫苗的制备
将HN-QYY-gE-/TK-接种至长满单层的vero细胞,待细胞达到80%以上的病变时收毒,-70℃、室温反复冻融三次,测定TCID50。将病毒液8000rpm离心10min,取上清,制得猪伪狂犬病活疫苗,病毒含量应≧105TCID50/mL,制备的活疫苗按照《中国兽药典》附录进行检验,合格后4℃备用。
其中,病毒含量TCID50的测定按下述方法进行:
TCID50测定在96孔微量细胞培养板上进行,将HN-QYY-gE-/TK-病毒液用不含血清的DMEM作10-1~10-8倍比系列稀释,取10-4~10-85个稀释度,每个稀释度分别接种已长成良好单层的vero细胞各6个孔,每个孔加100μL的病毒液,置37℃孵育1h,直接补加100μL的维持液(含2%胎牛血清的DMEM),置37℃培养,经72h观察每孔细胞的病变情况,以细胞圆缩变形、脱落的病变达到50℅以上判为阳性孔,按Reed-Muench氏法计算病毒在vero细胞的TCID50
实施例4-- HN-QYY-gE-/TK-株的稳定性鉴定
1、材料:实施例2所得HN-QYY-gE-/TK-,vero细胞。
2、方法: 将HN-QYY-gE-/TK-接种至长满单层的vero细胞,待细胞达到80%以上的病变时收毒,-70℃、室温反复冻融三次,测定TCID50,并连续传15代。
3、结果:稳定性鉴定结果见表4,HN-QYY-gE-/TK-在vero细胞上连续传15代,对1、5、10和15代病毒液进行TCID50测定,表明各代次病毒液能够很好的适应vero细胞,并能够再vero细胞上稳定增殖。
实施例5-- HN-QYY-gE-/TK-株与亲本毒株HN-QYY生长曲线的测定
1、材料:实施例1所得HN-QYY株、实施例2所得HN-QYY-gE-/TK-株。
2、方法:将HN-QYY-gE-/TK-株和HN-QYY株分别以0.5MOI接种至长满单层的vero细胞,在接毒后12h、24h、36h、48h、60h和72h收毒,-70℃、室温反复冻融三次,测定TCID50
3、结果:将HN-QYY-gE-/TK-株和HN-QYY株以0.5MOI接种于vero细胞,绘制病毒的生长曲线,结果见图6。HN-QYY-gE-/TK-株的最高滴度为107.3TCID50/mL,HN-QYY株的最高滴度为107.5TCID50/mL。表明HN-QYY-gE-/TK-株与HN-QYY株的最高滴度相差不大。
实施例6-- HN-QYY-gE-/TK-株安全性实验
1、材料:1日龄仔猪。
2、方法:取4头1日龄仔猪,每头滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE-/TK-株1mL(病毒含量为107TCID50),连续观察7天。
3、结果: 4头1日龄仔猪在免疫HN-QYY-gE-/TK-株后,采食量正常,体温正常,证明HN-QYY-gE-/TK-株安全性好。
实施例7-- HN-QYY-gE-/TK-株对1日龄仔猪的免疫效力试验
1、材料:1日龄仔猪。
2、方法:取一日龄仔猪15头,分成三组、每组5头,第一组滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE-/TK-株1mL(病毒含量为105TCID50),第二组滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE-/TK-株1mL(病毒含量为106TCID50),第三组为不免疫的对照组。免疫后观察仔猪的发病情况。在免疫后4周进行攻毒,毒株为实施例1所得HN-QYY株,攻毒剂量为106TCID50/头,观察仔猪的发病情况。
3、结果:HN-QYY-gE-/TK-株以不同的剂量免疫1日龄仔猪,免疫后连续观察4周,第一组、第二组仔猪采食和精神均正常,无发热症状,生长状况良好;免疫后4周攻毒,连续观察2周,结果见表5,第一组仔猪有一头出现发热,精神沉郁等症状,其他各组仔猪精神状况良好,无发热症状,证明HN-QYY-gE-/TK-株对一日龄仔猪安全有效。
实施例8-- HN-QYY-gE-/TK-株对4周龄仔猪的免疫效力试验
1、材料:4周龄仔猪。
2、方法:取4周龄仔猪20头,随机分成四组,第一组滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE-/TK-株1mL(病毒含量为104TCID50),第二组滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE-/TK-株1mL(病毒含量为105TCID50),第三组滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE-/TK-株1mL(病毒含量为106TCID50),第四组为不免疫的对照组。免疫后观察仔猪的发病情况。并在免疫后4周攻毒,攻毒毒株为实施例1所得HN-QYY株,攻毒剂量为106TCID50/头,观察仔猪的发病情况。
3、结果:HN-QYY-gE-/TK-株以不同的剂量免疫4周龄仔猪,免疫后连续观察4周,第一组、第二组和第三组仔猪采食和精神均正常,无发热症状,生长状况良好。4周后攻毒,攻毒之前采血,分离血清,并连续观察2周,观察各组仔猪精神状况。结果见表6,第一组有2头出现发热,精神沉郁,食欲废绝等症状,其他免疫组仔猪均无明显症状,对照组仔猪全部有发热,呕吐,精神沉郁,神经症状等症状。表明HN-QYY-gE-/TK-株对4周龄仔猪安全有效。
序列表
<110> 河南农业大学
<120> 一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccggaattcc tcctcctcgc cgccctgacc ctgg 34
<210> 2
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggactagtat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atcggacgga gataaaacgc 60
cacccac 67
<210> 3
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggactagtat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atcctccgtc gacatggaca 60
cgtttga 67
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccaagcttc gtccagggcg tcggcgtccg tcag 34
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggaattcc ggcgagcacg ctgtggccct ccag 34
<210> 6
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggactagtat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt attccgctgc cacaaccgct 60
tctacga 67
<210> 7
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggactagtat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atgatggaga ccgcgacgga 60
ggcaacg 67
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cccaagcttc agcgagacgg cgcacggcga gagg 34
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttggatccct ttccgccgag acgaccc 27
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cggaagcttc ggcgggtggt agatgcag 28
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcgtactggc gcactctg 18
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acgccgtcgt cgttgc 16

Claims (1)

1.一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法,其特征在于,步骤如下:
S1、缺失gE基因:
S1.1、将保藏编号为CGMCC No.15192的变异株HN-QYY接种至长满单层的vero细胞,当细胞出现80%以上病变的时候,收获病毒液,反复冻融,离心,取上清,酚氯仿方法提取变异株HN-QYY病毒基因组DNA,保存备用;
S1.2、以变异株HN-QYY病毒基因组DNA为模板,利用引物gEL-f/gEL-r和gER-f/gER-r分别PCR扩增gE基因上下游同源臂gEL和gER,琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物,测定DNA含量,保存备用;
其中,引物序列分别为:
gEL-f:如SEQ ID No.1所示;gEL-r:如SEQ ID No.2所示;
gER-f:如SEQ ID No.3所示;gER-r:如SEQ ID No.4所示;
S1.3、EcoR I和Spe I双酶切gEL,Spe I和Hind III双酶切gER,EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体,回收酶切后的gEL、gER、pMD18-T;
S1.4、将回收后的gEL和gER连接到回收后的pMD18-T上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pgE;
S1.5、Spe I单酶切质粒pgE,纯化后去磷酸化,再次纯化;
S1.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体,回收酶切后的pEGFP-N1;将回收后的pEGFP-N1连接到去磷酸化后的pgE上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pgE-EGFP;
S1.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/EGFP+
将步骤S1.1所得变异株HN-QYY病毒基因组DNA、pgE-EGFP共转染至293T细胞,空斑纯化,直至所有细胞病变均出现绿色荧光,获得重组荧光病毒HN-QYY-gE-/EGFP+
S1.8、去除绿色荧光基因
将HN-QYY-gE-/EGFP+和pcGlobin2-Cre质粒共转染至293T细胞,空斑纯化,直至所有细胞病变均不带荧光,获得猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-
S2、缺失TK基因:
S2.1、将步骤S1.8所得变异株HN-QYY-gE-接种至长满单层的vero细胞,当细胞出现80%以上病变的时候,收获病毒液,反复冻融,离心,取上清,酚氯仿方法提取变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA,保存备用;
S2.2、以变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA为模板,利用引物TKL-f/TKL-r和TKR-f/TKR-r分别PCR扩增TK基因上下游同源臂TKL和TKR,琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物,测定DNA含量,保存备用;
其中,引物序列分别为:
TKL-f:如SEQ ID No.5所示;TKL-r:如SEQ ID No.6所示;
TKR-f:如SEQ ID No.7所示;TKR-r:如SEQ ID No.8所示;
S2.3、EcoR I和Spe I双酶切TKL,Spe I和Hind III双酶切TKR,EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体,回收酶切后的TKL、TKR、pMD18-T;
S2.4、将回收后的TKL和TKR连接到回收后的pMD18-T上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pTK;
S2.5、Spe I单酶切质粒pTK,纯化后去磷酸化,再次纯化;
S2.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体,回收酶切后的pEGFP-N1;将回收后的pEGFP-N1连接到去磷酸化后的pTK上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pTK-EGFP;
S2.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+
将步骤S2.1所得变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA、pTK-EGFP共转染至293T细胞,空斑纯化,直至所有细胞病变均出现绿色荧光,获得重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+
S2.8、去除绿色荧光基因
将HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+和pcGlobin2-Cre质粒共转染至293T细胞,空斑纯化,直至所有细胞病变均不带荧光,获得猪伪狂犬病病毒变异株 HN-QYY-gE-/TK-
CN201811596652.0A 2018-12-26 2018-12-26 一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用 Active CN109735564B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811596652.0A CN109735564B (zh) 2018-12-26 2018-12-26 一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811596652.0A CN109735564B (zh) 2018-12-26 2018-12-26 一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109735564A CN109735564A (zh) 2019-05-10
CN109735564B true CN109735564B (zh) 2023-04-21

Family

ID=66361224

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811596652.0A Active CN109735564B (zh) 2018-12-26 2018-12-26 一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109735564B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102888383A (zh) * 2012-04-27 2013-01-23 肇庆大华农生物药品有限公司 一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株
CN105018436A (zh) * 2014-04-28 2015-11-04 普莱柯生物工程股份有限公司 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CN107815441A (zh) * 2017-08-31 2018-03-20 浙江大学 一种ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112013030321A2 (pt) * 2011-05-27 2017-07-11 Sinovet Beijing Biotechnology Co Ltd composição de vacina, método para preparar a composição de vacina, uso da composição de vacina, método para imunizar um porco, cepa de vacina contra csfv e uso de uma célula no cultivo de uma cepa de vacina contra csfv.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102888383A (zh) * 2012-04-27 2013-01-23 肇庆大华农生物药品有限公司 一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株
CN105018436A (zh) * 2014-04-28 2015-11-04 普莱柯生物工程股份有限公司 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CN107815441A (zh) * 2017-08-31 2018-03-20 浙江大学 一种ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Growth properties and vaccine efficacy of recombinant pseudorabiesvirus defective in glycoprotein E and thymidine kinase genes;Ching-Ying Wu等;《Journal of Biotechnology》;20160507;第229卷;摘要,第63-64页结果部分 *
Safety and immunogenicity of an attenuated Chinese pseudorabies variant by dual deletion of TK&gE genes;Jichun Wang等;《BMC Veterinary Research》;20180921;第14卷(第1期);摘要,第6-8页结果部分 *
应用Cre-loxP系统构建伪狂犬病病毒gE/TK双缺失株;梁苑燕等;《畜牧兽医学报》;20121231;第43卷(第11期);第1802-1809页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109735564A (zh) 2019-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107513524B (zh) 一株猪塞内加谷病毒毒株及其应用
CN103756977B (zh) 猪伪狂犬病变异株gE和gI基因缺失病毒株及其应用
CN109439634B (zh) 伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其应用
CN111632137A (zh) 猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗及其制备方法和应用
WO2020258757A1 (zh) 一种突变株3型鸭甲肝病毒ch-p60-117c株及构建方法
CN114854697B (zh) 一种猪轮状病毒g4-g5-g9型三价灭活疫苗及其制备方法和用途
CN114774372B (zh) 柯萨奇病毒a10型毒株及其疫苗和应用
CN113491767A (zh) 鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗及其制备方法
CN113736750B (zh) 一株盖他病毒毒株及其应用
CN105400745B (zh) 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程毒株及其灭活疫苗和疫苗制备方法
CN112500458B (zh) 鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株亚单位疫苗、其制备方法及应用
CN109207438A (zh) 猪伪狂犬病病毒强毒株及其在制备灭活疫苗中的应用
CN111073862B (zh) 一种牛病毒性腹泻2型减毒毒株及应用
CN105903011B (zh) 一种猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法
CN105802921B (zh) 表达猪瘟病毒e2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株及其构建方法和应用
CN109867713B (zh) 一种犬瘟热基因工程亚单位疫苗
CN111647568A (zh) 鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株反向遗传疫苗株及其应用
CN114807223B (zh) 一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法
CN109735564B (zh) 一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用
CN109943576A (zh) 一种嵌合犬瘟热病毒主要免疫基因的重组狂犬病病毒及其应用
CN110974951B (zh) 一种二联灭活疫苗及其制备方法
CN109735510B (zh) 一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY、HN-QYY-gE-及其构建方法和应用
CN110484515B (zh) 一种预防FAdV-4和NDV的疫苗载体及其制备方法及应用
CN113637648A (zh) 同时表达pedv变异株s1基因cs区和猪il-18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用
CN108707589B (zh) 一种牛病毒性腹泻病毒SMU-Z6/1a/SC/2016分离株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant