CN109735564B - 一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于猪伪狂犬病病毒技术领域,公开一种猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE‑/TK‑的构建方法和应用。以HN‑QYY为亲本毒株,依次缺失gE基因和TK基因,获得猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE‑/TK‑;所述猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE‑/TK‑在制备猪伪狂犬病活疫苗中的应用。本发明猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE‑/TK‑缺失了gE基因和TK基因,能够在后期的抗体检测中有效地区分野毒和疫苗毒,为猪伪狂犬病的预防和净化提供了有效的方法。
Description
技术领域
本发明属于猪伪狂犬病病毒技术领域,具体涉及一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用。
背景技术
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的猪的急性,高度接触性传染病。该病在猪群呈暴发性流行,可引起妊娠母猪流产、死胎,公猪不育,新生仔猪大量死亡,育肥猪呼吸困难、生长停滞等,是危害全球养猪业的重大传染病之一。猪是伪狂犬病毒的贮存宿主,并且病毒可以潜伏感染在猪体内,严重我国和世界养殖业的发展。2011年之前,我国主要使用活疫苗Bartha-K61株,但是,随着猪伪狂犬病在我国再次暴发,表明传统的活疫苗Bartha-K61株不能够提供良好的保护。通过对新分离到的猪伪狂犬病病毒进行测序分析,结果表明猪伪狂犬病病毒已经发生了变异,而且被感染的动物临床症状复杂,包括高烧,厌食,咳嗽,发抖,腹泻,和全身性神经症状。感染的猪憔悴,外表薄弱,最终死亡,育肥猪也在这个疫情期间发生死亡。因此,需要开发符合猪伪狂犬病病毒变异株的疫苗,才能有效的防制本病。目前,预防本病的灭活疫苗有猪伪狂犬病病毒灭活疫苗(鄂A株);活疫苗有HB98株、SA215株和Bartha-K61株,这些疫苗都在不同程度上控制了本病的发生。许多欧洲国家对猪伪狂犬病采取了活疫苗、灭活疫苗和血清学诊断相结合的方法对伪狂犬进行了净化,取得了显著的成效。因此,需要针对当前猪伪狂犬病病毒的变异情况,分离新的流行毒株,开发更有效的活疫苗,才能更好的防制猪伪狂犬病。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案如下:
一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法,步骤如下:
S1、缺失gE基因:
S1.1、将猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY(保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期:2017年12月22日,保藏编号:CGMCC No.15192)接种至长满单层的vero细胞,当细胞出现80%以上病变的时候,收获病毒液,反复冻融,离心,取上清,酚氯仿方法提取变异株HN-QYY病毒基因组DNA,保存备用;
S1.2、以变异株HN-QYY病毒基因组DNA为模板,利用引物gEL-f/gEL-r和gER-f/gER-r分别PCR扩增gE基因上下游同源臂gEL和gER,琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物,测定DNA含量,保存备用;
其中,引物序列分别为:
gEL-f:如SEQ ID No.1所示;gEL-r:如SEQ ID No.2所示;
gER-f:如SEQ ID No.3所示;gER-r:如SEQ ID No.4所示;
S1.3、EcoR I和Spe I双酶切gEL,Spe I和Hind III双酶切gER,EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体,回收酶切后的gEL、gER、pMD18-T;
S1.4、将回收后的gEL和gER连接到回收后的pMD18-T上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pgE;
S1.5、Spe I单酶切质粒pgE,纯化后去磷酸化,再次纯化;
S1.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体,回收酶切后的pEGFP-N1;将回收后的pEGFP-N1连接到去磷酸化后的pgE上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pgE-EGFP;
S1.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/EGFP+
将步骤S1.1所得变异株HN-QYY病毒基因组DNA、pgE-EGFP共转染至293T细胞,空斑纯化,直至所有细胞病变均出现绿色荧光,获得重组荧光病毒HN-QYY-gE-/EGFP+;
S1.8、去除绿色荧光基因
将HN-QYY-gE-/EGFP+和pcGlobin2-Cre质粒共转染至293T细胞,空斑纯化,直至所有细胞病变均不带荧光,获得猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-(保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期:2018年01月02日,保藏编号:CGMCC No.15200);
S2、缺失TK基因:
S2.1、将步骤S1.8所得变异株HN-QYY-gE-接种至长满单层的vero细胞,当细胞出现80%以上病变的时候,收获病毒液,反复冻融,离心,取上清,酚氯仿方法提取变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA,保存备用;
S2.2、以变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA为模板,利用引物TKL-f/TKL-r和TKR-f/TKR-r分别PCR扩增TK基因上下游同源臂TKL和TKR,琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物,测定DNA含量,保存备用;
其中,引物序列分别为:
TKL-f:如SEQ ID No.5所示;TKL-r:如SEQ ID No.6所示;
TKR-f:如SEQ ID No.7所示;TKR-r:如SEQ ID No.8所示;
S2.3、EcoR I和Spe I双酶切TKL,Spe I和Hind III双酶切TKR,EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体,回收酶切后的TKL、TKR、pMD18-T;
S2.4、将回收后的TKL和TKR连接到回收后的pMD18-T上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pTK;
S2.5、Spe I单酶切质粒pTK,纯化后去磷酸化,再次纯化;
S2.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体,回收酶切后的pEGFP-N1;将回收后的pEGFP-N1连接到去磷酸化后的pTK上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pTK-EGFP;
S2.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+
将步骤S2.1所得变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA、pTK-EGFP共转染至293T细胞,空斑纯化,直至所有细胞病变均出现绿色荧光,获得重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+;
S2.8、去除绿色荧光基因
将HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+和pcGlobin2-Cre质粒共转染至293T细胞,空斑纯化,直至所有细胞病变均不带荧光,获得猪伪狂犬病病毒变异株 HN-QYY-gE-/TK-。
所述猪伪狂犬病病毒变异株 HN-QYY-gE-/TK-在制备猪伪狂犬病活疫苗中的应用。
本发明的有益效果:
(1)、本发明猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY为当前的流行毒株,能够有效预防猪伪狂犬病的发生;
(2)、本发明猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-具有良好的免疫原性,能够刺激机体产生较高的中和抗体;
(3)、本发明猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-缺失了gE基因和TK基因,能够在后期的抗体检测中有效地区分野毒和疫苗毒,为猪伪狂犬病的预防和净化提供了有效的方法。
附图说明
图1:猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY的gE基因PCR鉴定,M:2000 DNA marker;1:HN-QYY gE基因的PCR扩增;2:vero细胞对照;
图2:pgE和pgE-EGFP质粒的PCR鉴定,M:15000bp DNA marker;1:pgE的PCR扩增;2:pgE-EGFP的PCR扩增;
图3:猪伪狂犬病病毒gE缺失株HN-QYY-gE-的PCR鉴定,M:250bp DNA marker,1:gE-f/gE-r对HN-QYY-gE-gE基因的PCR扩增,2:gEL-f/gER-r对HN-QYY-gE-的PCR扩增;3:gEL-f/gER-r对HN-QYY-gE-/EGFP+的PCR扩增;
图4:pTK质粒和HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+重组病毒的PCR鉴定,M:15000bp DNAmarker;1:pTK的PCR扩增;2:HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+的PCR扩增;
图5:HN-QYY-gE-/TK-重组病毒的PCR鉴定,M:250bp DNA marker;1:TK-f/TK-r对HN-QYY-gE-TK基因的PCR扩增;2:TK-f/TK-r对HN-QYY-gE-/TK-TK基因的PCR扩增;
图6:HN-QYY-gE-/TK-株与亲本毒HN-QYY株在vero细胞上的生长曲线。
具体实施方式
实施例1--猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY的分离鉴定
申请人在2012年从河南省洛阳市某猪场采集发病猪的脑组织,剪碎,按质量/体积比g/mL 1∶5加入灭菌PBS溶解,用组织匀浆机打碎,-70℃、室温反复冻融3次,8000rpm离心10min;取上清,用0.22μm一次性滤器过滤除菌,将所得的组织液按体积比1∶5接种到长满单层的vero细胞上,待病变达到80%时收获病毒液,-70℃、室温反复冻融3次,将病毒液8000rpm离心10min,取上清,重新接种长满单层的vero细胞,盲传5代(从出现病变的代次起),当病变稳定后,收获病毒,空斑纯化,即得猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY并-70℃保存。
用酚氯仿法抽提取猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY病毒基因组DNA,具体步骤为:
(1)、将空斑纯化后的病毒液-70℃、室温反复冻融3次;
(2)、取病毒液上清350μL加到1.5mL离心管,在管中加350 μL RIPA裂解液和10μL蛋白酶K于56℃水浴2 h;
(3)、加入700μL的Tris饱和酚,混匀3min,然后4℃离心机中12000rpm离心10min;
(4)、吸取上层液体加入新的离心管,再加入700μL 的Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的混合液(Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1,体积比),混匀3min, 4℃离心机中12000rpm离心10min;
(5)、吸取上清液加到新的离心管,加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液(氯仿∶异戊醇=24∶1,体积比),混匀3min,4℃离心机中12000rpm离心10min;
(6)、吸取上清液加入新的离心管,加入等体积的氯仿,混匀3min,4℃离心机中12000rpm离心10min;
(7)、吸取上清液400μL加入新的离心管,然后加入2.5体积倍的经过-20℃冷冻的无水乙醇,-20℃沉淀2h;
(8)、将样品取出,4℃离心机中12000rpm离心20min,弃上清,留白色沉淀,加1000μL经过-20℃冷冻的75v%乙醇,上下颠倒混匀,4℃离心机中12000rpm离心10min;
(9)、将酒精弃去,静止3min,待酒精挥发完毕,加入30μL的TE溶液,4℃溶解30min,即可得到DNA,-20℃保存备用。
猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY的鉴定采用gE基因PCR方法,引物如表1所示。gE基因PCR反应体系为:2xGC Buffer 25μL,dNTP(10 mmol/μL)1μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5μL,上下游引物(5 OD)各1μL,DNA模板(100 μg/mL)4μL,灭菌双蒸水补足至50 μL;反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃ 变性30 s,60℃退火30s,72℃延伸2min,30个循环;最后72℃10min;PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测,结果见图1,表明所分离的毒株为猪伪狂犬病病毒变异株。
实施例2--猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法
构建步骤如下:
S1、缺失gE基因:
S1.1、T25细胞瓶中vero细胞长满单层后,弃去营养液,用无菌PBS洗涤2次,接种30μL保藏编号为CGMCC No.15192的变异株HN-QYY,37℃ CO2培养箱中孵育1h,弃去病毒液,加入6mL的维持液(含2%胎牛血清的DMEM),继续37℃ CO2培养箱中培养,当细胞出现80%以上病变的时候,收获病毒液,-70℃、室温反复冻融3次,8000rpm离心10min,取上清,酚氯仿方法提取变异株HN-QYY病毒基因组DNA,-20℃保存备用;
S1.2、以变异株HN-QYY病毒基因组DNA为模板,利用引物gEL-f/gEL-r和gER-f/gER-r分别PCR扩增gE基因上下游同源臂gEL和gER,琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物,测定DNA含量,-20℃保存备用;
其中,引物序列如表2所示:
PCR扩增反应体系为:2xGC Buffer 25 μL,dNTP(10 mmol/μL)1 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL,上下游引物(5 OD)各1 μL,DNA模板(100 μg/mL)4 μL,补水至50 μL;PCR反应条件为:95 ℃预变性5 min;95 ℃ 变性30 s,60℃退火30s,72℃延伸80s,30个循环;最后72 ℃延伸10 min;
S1.3、EcoR I和Spe I双酶切gEL,Spe I和Hind III双酶切gER,EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体,回收酶切后的gEL、gER、pMD18-T,-20℃保存备用;;
其中,酶切体系分别为:EcoR I(15 U/μL) 1.5 μL,Spe I(15 U/μL) 1.5 μL,片段gEL 3 μg,10×buffer 5 μL,补水至50 μL;Spe I(15 U/μL) 1.5μL,Hind III(15 U/μL)1.5μL,片段gER 3 μg,10×buffer 5μL,补水至50 μL;EcoR I(15 U/μL) 1 μL,Hind III(15 U/μL) 1 μL,pMD18-T载体 2 μg,10×buffer 5 μL,补水至50 μL;酶切条件均为:37℃水浴锅中孵育4 h;
S1.4、将回收后的gEL和gER连接到回收后的pMD18-T上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pgE,-20℃保存备用;
其中,连接体系为:T4DNA连接酶(350 U/μL)1 μL,10×T4Ligase buffer 1 μL,基因片段与载体片段(以摩尔比计,gEL∶gER∶pMD18-T=5∶5∶1),补水至10 μL;连接条件为:16℃连接16h;
质粒转化的具体步骤为:取出大肠杆菌感受态细胞DH5α 100μL,置于冰水混合物中,将10μL连接产物全部加入感受态细胞中,轻轻震荡混匀,静置30 min;之后将感受态细胞置于42℃,热激90s,再置于冰水混合物中静置5 min,加入1mL不含抗性的LB培养基,37℃、200rpm摇床培养1h,然后离心,留200μL上清液,混合均匀,取100μL上清的菌液均匀涂在含有氨苄青霉素(Amp+)抗性的固体LB平板(氨苄青霉素含量100 μg/mL,下同)上,37℃恒温培养16 h,挑取菌落至1mL含有Amp+抗性的LB培养基中,37℃、200rpm摇床培养12h,制备成菌液,进行菌液PCR;
菌液PCR扩增体系:2xGC Buffer 25μL,dNTP(10 mmol/μL)1μL, Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL,引物gEL-f和gER-r(5 OD)各1μL,菌液4μL,补水至50 μL;PCR反应条件为:95℃预变性5 min;95 ℃ 变性30 s,60℃退火30s,72℃延伸150 s,30个循环;最后72 ℃延伸10 min;之后用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定(见图2),挑取电泳条带位置在2600bp的菌液为阳性菌液;
扩大培养步骤为:将阳性菌液按体积比1∶100接至15 mL LB培养基中,37 ℃摇床200 r/min 摇菌14 h;
S1.5、Spe I单酶切质粒pgE,纯化后去磷酸化,再用PCR产物试剂盒进行纯化,-20℃保存备用;
其中,酶切体系为:Spe I(15 U/μL)2 μL,质粒pgE 4 μg,10×buffer 5μL,补水至50 μL;酶切条件为:37℃水浴锅中孵育3h;
去磷酸化体系为:去磷酸化酶(1 U/μL) 2 μL,酶切后的质粒pgE 2 μg,10×buffer 5 μL,补水至50 μL;去磷酸化条件为:37℃水浴锅中孵育3h;
S1.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体(购自湖南丰晖生物科技有限公司),回收酶切后的EGFP-N1片段;将回收后的EGFP-N1片段连接到去磷酸化后的pgE上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pgE-EGFP;
其中,酶切体系为:Nhe I(15 U/μL)1 μL,Spe I(15 U/μL)1 μL,pEGFP-N1 2 μg,10×buffer 5 μL,补水至50 μL;酶切条件为:37℃水浴锅中孵育3h;
连接体系为:T4DNA连接酶(350 U/μL)1 μL,10×T4Ligase buffer 1 μL,基因片段与载体片段(以摩尔比计,EGFP-N1∶pgE=5∶1),补水至10 μL;连接条件为:16℃连接16h;
质粒转化、菌液PCR和扩大培养的步骤同步骤S1.4,只是菌液PCR在用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定(见图2)后,挑取电泳条带位置在4500bp左右的菌液为阳性菌液;
S1.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/EGFP+
采用脂质体LipofectamineTM2000将HN-QYY病毒基因组、pgE-EGFP按照1μg∶3μg的比例进行转染:首先将六孔板中生长至80%的293T细胞弃去营养液,每孔添加1mL的无血清DMEM,37℃ CO2培养箱中孵育1h;取两只离心管,每只加300μL无血清无双抗DMEM,然后第一管加步骤S1.1所得变异株HN-QYY病毒基因组DNA 1μg,脂质体3μL,第二管加质粒pgE-EGFP3μg,脂质体9μL,第一管和第二管全部震荡混匀,静置5min,之后将两管合并为一管,吹打混匀,静止30min,加入到293T细胞中,37℃ CO2培养箱中孵育6 h,弃去培养液,换成含2%胎牛血清的DMEM,37℃ CO2培养箱中继续培养,36h后收获,-70℃、室温反复冻融后,接种长满单层的vero细胞,待细胞出现80%的病变时收毒;
空斑纯化:取病毒液,离心,取上清将上清液按10倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板,每孔1000 μL,吸附1h后弃去病毒液,加入2%琼脂糖与2×DMEM(含2%胎牛血清)以体积比1∶1组成的混合物2 mL,待出现细胞病变时,在荧光显微镜下挑取最高稀释度中带荧光的空斑,并再次按照10倍倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板,待细胞出现绿色荧光病变时,选择稀释度最大的孔挑取带绿色荧光的空斑继续接种vero细胞,如此纯化至所有空斑均出现绿色荧光的病变,利用引物gEL-f/gER-r对其进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定(扩增体系及条件同步骤S1.4菌液PCR扩增体系及条件,见图3),将此代病毒保存,命名为HN-QYY-gE-/EGFP+;
在vero细胞上扩增病毒,具体步骤为:当T25细胞瓶中vero细胞生长至单层,弃去旧的培养液,用无血清的DMEM 2mL将20μL的病毒液稀释,加入到细胞瓶中,37℃ CO2培养箱中孵育1h,换成含2%胎牛血清的DMEM,37℃ CO2培养箱中继续培养,细胞病变80%时后收获,-70℃、室温反复冻融,取适量病毒液,酚氯仿抽提DNA,测定含量,-20℃保存备用;
S1.8、去除绿色荧光基因
将HN-QYY-gE-/EGFP+和pcGlobin2-Cre质粒按照1μg∶3μg的比例按照步骤S1.7的方法转染至80%的293T细胞,36h后收获,-70℃、室温反复冻融3次后,接种长满单层的vero细胞,待细胞出现80%的病变时收获病毒液;按照步骤S1.7的方法空斑纯化病毒,直至所有的细胞病变均不带荧光,利用引物gEL-f/gER-r对其进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定(扩增体系及条件同步骤S1.4菌液PCR扩增体系及条件,见图3),将此代病毒保存,命名为猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-;
用酚氯仿法抽提猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA,利用引物gE-f和gE-r对其gE基因进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定(扩增体系及条件同实施例1中HN-QYY的gE基因PCR扩增体系及条件,见图3),结果表明:HN-QYY-gE-成功缺失了gE基因;
S2、缺失TK基因:
S2.1、T25细胞瓶中vero细胞长满单层后,弃去营养液,用无菌PBS洗涤2次,接种30μL 步骤S1.8所得变异株HN-QYY-gE-,37℃ CO2培养箱中孵育1h,弃去病毒液,加入6mL的维持液(含2%胎牛血清的DMEM),继续37℃ CO2培养箱中培养,当细胞出现80%以上病变的时候,收获病毒液,-70℃、室温反复冻融3次,8000rpm离心10min,取上清,酚氯仿方法提取变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA,-20℃保存备用;
S2.2、以变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA为模板,利用引物TKL-f/TKL-r和TKR-f/TKR-r分别PCR扩增TK基因上下游同源臂TKL和TKR,琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物,测定DNA含量,保存备用;
其中,引物序列如表3所示:
PCR扩增反应体系及条件同步骤S1.2;
S2.3、EcoR I和Spe I双酶切TKL,Spe I和Hind III双酶切TKR,EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体,回收酶切后的TKL、TKR、pMD18-T,-20℃保存备用;;
其中,酶切体系及条件同步骤S1.3;
S2.4、将回收后的TKL和TKR连接到回收后的pMD18-T上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pTK,-20℃保存备用;
其中,连接体系及条件、质粒转化步骤、菌液PCR扩增体系及条件、扩大培养步骤同步骤S1.4,只是菌液PCR时的引物为TKL-f 和TKR-r,琼脂糖凝胶电泳鉴定结果见图4;
S2.5、Spe I单酶切质粒pTK,纯化后去磷酸化,再用PCR产物试剂盒进行纯化,-20℃保存备用;
其中,酶切体系及条件、去磷酸化体系及条件同步骤S1.5;
S2.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体(购自湖南丰晖生物科技有限公司),回收酶切后的EGFP-N1片段;将回收后的EGFP-N1片段连接到去磷酸化后的pTK上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pTK-EGFP;
其中,连接体系及条件、质粒转化步骤、菌液PCR扩增体系及条件、扩大培养步骤同步骤S1.4;
S2.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+
采用脂质体LipofectamineTM2000进行转染:首先将六孔板中生长至80%的293T细胞弃去营养液,每孔添加1mL的无血清DMEM,37℃ CO2培养箱中孵育1h;取两只离心管,每只加300μL无血清无双抗DMEM,然后第一管加步骤S2.1所得变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA1μg,脂质体3μL,第二管加质粒pTK-EGFP 3μg,脂质体9μL,第一管和第二管全部震荡混匀,静置5min,之后将两管合并为一管,吹打混匀,静止30min,加入到293T细胞中,37℃ CO2培养箱中孵育6 h,弃去培养液,换成含2%胎牛血清的DMEM,37℃ CO2培养箱中继续培养,36h后收获,-70℃、室温反复冻融后,接种长满单层的vero细胞,待细胞出现80%的病变时收毒;
空斑纯化:取病毒液,离心,取上清将上清液按10倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板,每孔1000 μL,吸附1h后弃去病毒液,加入2%琼脂糖与2×DMEM(含2%胎牛血清)以体积比1∶1的混合物2 mL,待出现细胞病变时,在荧光显微镜下挑取最高稀释度中带荧光的空斑,并再次按照10倍倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板,待细胞出现绿色荧光病变时,选择稀释度最大的孔挑取带绿色荧光的空斑继续接种vero细胞,如此纯化至所有空斑均出现绿色荧光的病变,利用引物TKL-f/TKR-r对其进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定(扩增体系及条件同步骤S1.4菌液PCR扩增体系及条件,见图4),将此代病毒保存,命名为HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+;
在vero细胞上扩增病毒,具体步骤为:当T25细胞瓶中vero细胞生长至单层,弃去旧的培养液,用无血清的DMEM 2mL将20μL的病毒液稀释,加入到细胞瓶中,37℃ CO2培养箱中孵育1h,换成含2%胎牛血清的DMEM,37℃ CO2培养箱中继续培养,细胞病变80%时后收获,-70℃、室温反复冻融,取适量病毒液,酚氯仿抽提DNA,测定含量,-20℃保存备用;
S2.8、去除绿色荧光基因
将HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+和pcGlobin2-Cre质粒按照1μg∶3μg的比例按照步骤S2.7的方法转染至80%的293T细胞,36h后收获,-70℃、室温反复冻融3次后,接种长满单层的vero细胞,待细胞出现80%的病变时收获病毒液;按照步骤S2.7的方法空斑纯化病毒,直至所有的细胞病变均不带荧光,利用引物TKL-f/TKR-r对其进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定(扩增体系及条件同步骤S1.4菌液PCR扩增体系及条件),将此代病毒保存,命名为猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-;
用酚氯仿法抽提猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-病毒基因组DNA。利用引物TK-f(如SEQ ID No.11)和TK-r(如SEQ ID No.12)分别对HN-QYY-gE-和HN-QYY-gE-/TK-中的TK基因进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定(扩增体系及条件同实施例1中HN-QYY的gE基因PCR扩增体系及条件,见图5),结果表明:HN-QYY-gE-/TK-成功缺失了TK基因。
实施例3--猪伪狂犬病病毒活疫苗的制备
将HN-QYY-gE-/TK-接种至长满单层的vero细胞,待细胞达到80%以上的病变时收毒,-70℃、室温反复冻融三次,测定TCID50。将病毒液8000rpm离心10min,取上清,制得猪伪狂犬病活疫苗,病毒含量应≧105TCID50/mL,制备的活疫苗按照《中国兽药典》附录进行检验,合格后4℃备用。
其中,病毒含量TCID50的测定按下述方法进行:
TCID50测定在96孔微量细胞培养板上进行,将HN-QYY-gE-/TK-病毒液用不含血清的DMEM作10-1~10-8倍比系列稀释,取10-4~10-85个稀释度,每个稀释度分别接种已长成良好单层的vero细胞各6个孔,每个孔加100μL的病毒液,置37℃孵育1h,直接补加100μL的维持液(含2%胎牛血清的DMEM),置37℃培养,经72h观察每孔细胞的病变情况,以细胞圆缩变形、脱落的病变达到50℅以上判为阳性孔,按Reed-Muench氏法计算病毒在vero细胞的TCID50。
实施例4-- HN-QYY-gE-/TK-株的稳定性鉴定
1、材料:实施例2所得HN-QYY-gE-/TK-,vero细胞。
2、方法: 将HN-QYY-gE-/TK-接种至长满单层的vero细胞,待细胞达到80%以上的病变时收毒,-70℃、室温反复冻融三次,测定TCID50,并连续传15代。
3、结果:稳定性鉴定结果见表4,HN-QYY-gE-/TK-在vero细胞上连续传15代,对1、5、10和15代病毒液进行TCID50测定,表明各代次病毒液能够很好的适应vero细胞,并能够再vero细胞上稳定增殖。
实施例5-- HN-QYY-gE-/TK-株与亲本毒株HN-QYY生长曲线的测定
1、材料:实施例1所得HN-QYY株、实施例2所得HN-QYY-gE-/TK-株。
2、方法:将HN-QYY-gE-/TK-株和HN-QYY株分别以0.5MOI接种至长满单层的vero细胞,在接毒后12h、24h、36h、48h、60h和72h收毒,-70℃、室温反复冻融三次,测定TCID50。
3、结果:将HN-QYY-gE-/TK-株和HN-QYY株以0.5MOI接种于vero细胞,绘制病毒的生长曲线,结果见图6。HN-QYY-gE-/TK-株的最高滴度为107.3TCID50/mL,HN-QYY株的最高滴度为107.5TCID50/mL。表明HN-QYY-gE-/TK-株与HN-QYY株的最高滴度相差不大。
实施例6-- HN-QYY-gE-/TK-株安全性实验
1、材料:1日龄仔猪。
2、方法:取4头1日龄仔猪,每头滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE-/TK-株1mL(病毒含量为107TCID50),连续观察7天。
3、结果: 4头1日龄仔猪在免疫HN-QYY-gE-/TK-株后,采食量正常,体温正常,证明HN-QYY-gE-/TK-株安全性好。
实施例7-- HN-QYY-gE-/TK-株对1日龄仔猪的免疫效力试验
1、材料:1日龄仔猪。
2、方法:取一日龄仔猪15头,分成三组、每组5头,第一组滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE-/TK-株1mL(病毒含量为105TCID50),第二组滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE-/TK-株1mL(病毒含量为106TCID50),第三组为不免疫的对照组。免疫后观察仔猪的发病情况。在免疫后4周进行攻毒,毒株为实施例1所得HN-QYY株,攻毒剂量为106TCID50/头,观察仔猪的发病情况。
3、结果:HN-QYY-gE-/TK-株以不同的剂量免疫1日龄仔猪,免疫后连续观察4周,第一组、第二组仔猪采食和精神均正常,无发热症状,生长状况良好;免疫后4周攻毒,连续观察2周,结果见表5,第一组仔猪有一头出现发热,精神沉郁等症状,其他各组仔猪精神状况良好,无发热症状,证明HN-QYY-gE-/TK-株对一日龄仔猪安全有效。
实施例8-- HN-QYY-gE-/TK-株对4周龄仔猪的免疫效力试验
1、材料:4周龄仔猪。
2、方法:取4周龄仔猪20头,随机分成四组,第一组滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE-/TK-株1mL(病毒含量为104TCID50),第二组滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE-/TK-株1mL(病毒含量为105TCID50),第三组滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE-/TK-株1mL(病毒含量为106TCID50),第四组为不免疫的对照组。免疫后观察仔猪的发病情况。并在免疫后4周攻毒,攻毒毒株为实施例1所得HN-QYY株,攻毒剂量为106TCID50/头,观察仔猪的发病情况。
3、结果:HN-QYY-gE-/TK-株以不同的剂量免疫4周龄仔猪,免疫后连续观察4周,第一组、第二组和第三组仔猪采食和精神均正常,无发热症状,生长状况良好。4周后攻毒,攻毒之前采血,分离血清,并连续观察2周,观察各组仔猪精神状况。结果见表6,第一组有2头出现发热,精神沉郁,食欲废绝等症状,其他免疫组仔猪均无明显症状,对照组仔猪全部有发热,呕吐,精神沉郁,神经症状等症状。表明HN-QYY-gE-/TK-株对4周龄仔猪安全有效。
序列表
<110> 河南农业大学
<120> 一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccggaattcc tcctcctcgc cgccctgacc ctgg 34
<210> 2
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggactagtat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atcggacgga gataaaacgc 60
cacccac 67
<210> 3
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggactagtat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atcctccgtc gacatggaca 60
cgtttga 67
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccaagcttc gtccagggcg tcggcgtccg tcag 34
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggaattcc ggcgagcacg ctgtggccct ccag 34
<210> 6
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggactagtat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt attccgctgc cacaaccgct 60
tctacga 67
<210> 7
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggactagtat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atgatggaga ccgcgacgga 60
ggcaacg 67
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cccaagcttc agcgagacgg cgcacggcga gagg 34
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttggatccct ttccgccgag acgaccc 27
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cggaagcttc ggcgggtggt agatgcag 28
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcgtactggc gcactctg 18
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acgccgtcgt cgttgc 16
Claims (1)
1.一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法,其特征在于,步骤如下:
S1、缺失gE基因:
S1.1、将保藏编号为CGMCC No.15192的变异株HN-QYY接种至长满单层的vero细胞,当细胞出现80%以上病变的时候,收获病毒液,反复冻融,离心,取上清,酚氯仿方法提取变异株HN-QYY病毒基因组DNA,保存备用;
S1.2、以变异株HN-QYY病毒基因组DNA为模板,利用引物gEL-f/gEL-r和gER-f/gER-r分别PCR扩增gE基因上下游同源臂gEL和gER,琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物,测定DNA含量,保存备用;
其中,引物序列分别为:
gEL-f:如SEQ ID No.1所示;gEL-r:如SEQ ID No.2所示;
gER-f:如SEQ ID No.3所示;gER-r:如SEQ ID No.4所示;
S1.3、EcoR I和Spe I双酶切gEL,Spe I和Hind III双酶切gER,EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体,回收酶切后的gEL、gER、pMD18-T;
S1.4、将回收后的gEL和gER连接到回收后的pMD18-T上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pgE;
S1.5、Spe I单酶切质粒pgE,纯化后去磷酸化,再次纯化;
S1.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体,回收酶切后的pEGFP-N1;将回收后的pEGFP-N1连接到去磷酸化后的pgE上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pgE-EGFP;
S1.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/EGFP+
将步骤S1.1所得变异株HN-QYY病毒基因组DNA、pgE-EGFP共转染至293T细胞,空斑纯化,直至所有细胞病变均出现绿色荧光,获得重组荧光病毒HN-QYY-gE-/EGFP+;
S1.8、去除绿色荧光基因
将HN-QYY-gE-/EGFP+和pcGlobin2-Cre质粒共转染至293T细胞,空斑纯化,直至所有细胞病变均不带荧光,获得猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-;
S2、缺失TK基因:
S2.1、将步骤S1.8所得变异株HN-QYY-gE-接种至长满单层的vero细胞,当细胞出现80%以上病变的时候,收获病毒液,反复冻融,离心,取上清,酚氯仿方法提取变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA,保存备用;
S2.2、以变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA为模板,利用引物TKL-f/TKL-r和TKR-f/TKR-r分别PCR扩增TK基因上下游同源臂TKL和TKR,琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物,测定DNA含量,保存备用;
其中,引物序列分别为:
TKL-f:如SEQ ID No.5所示;TKL-r:如SEQ ID No.6所示;
TKR-f:如SEQ ID No.7所示;TKR-r:如SEQ ID No.8所示;
S2.3、EcoR I和Spe I双酶切TKL,Spe I和Hind III双酶切TKR,EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体,回收酶切后的TKL、TKR、pMD18-T;
S2.4、将回收后的TKL和TKR连接到回收后的pMD18-T上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pTK;
S2.5、Spe I单酶切质粒pTK,纯化后去磷酸化,再次纯化;
S2.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体,回收酶切后的pEGFP-N1;将回收后的pEGFP-N1连接到去磷酸化后的pTK上,之后进行质粒转化,菌液PCR筛选阳性克隆,将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养,提取质粒,该质粒命名为pTK-EGFP;
S2.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+
将步骤S2.1所得变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA、pTK-EGFP共转染至293T细胞,空斑纯化,直至所有细胞病变均出现绿色荧光,获得重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+;
S2.8、去除绿色荧光基因
将HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+和pcGlobin2-Cre质粒共转染至293T细胞,空斑纯化,直至所有细胞病变均不带荧光,获得猪伪狂犬病病毒变异株 HN-QYY-gE-/TK-。
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