CN109735564B - 一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪伪狂犬病病毒技术领域，公开一种猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE^‑/TK^‑的构建方法和应用。以HN‑QYY为亲本毒株，依次缺失gE基因和TK基因，获得猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE^‑/TK^‑；所述猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE^‑/TK^‑在制备猪伪狂犬病活疫苗中的应用。本发明猪伪狂犬病病毒变异株HN‑QYY‑gE^‑/TK^‑缺失了gE基因和TK基因，能够在后期的抗体检测中有效地区分野毒和疫苗毒，为猪伪狂犬病的预防和净化提供了有效的方法。

Description

一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用

技术领域

本发明属于猪伪狂犬病病毒技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE^-/TK^-的构建方法和应用。

背景技术

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的猪的急性，高度接触性传染病。该病在猪群呈暴发性流行，可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。猪是伪狂犬病毒的贮存宿主，并且病毒可以潜伏感染在猪体内，严重我国和世界养殖业的发展。2011年之前，我国主要使用活疫苗Bartha-K61株，但是，随着猪伪狂犬病在我国再次暴发，表明传统的活疫苗Bartha-K61株不能够提供良好的保护。通过对新分离到的猪伪狂犬病病毒进行测序分析，结果表明猪伪狂犬病病毒已经发生了变异，而且被感染的动物临床症状复杂，包括高烧，厌食，咳嗽，发抖，腹泻，和全身性神经症状。感染的猪憔悴，外表薄弱，最终死亡，育肥猪也在这个疫情期间发生死亡。因此，需要开发符合猪伪狂犬病病毒变异株的疫苗，才能有效的防制本病。目前，预防本病的灭活疫苗有猪伪狂犬病病毒灭活疫苗（鄂A株）；活疫苗有HB98株、SA215株和Bartha-K61株，这些疫苗都在不同程度上控制了本病的发生。许多欧洲国家对猪伪狂犬病采取了活疫苗、灭活疫苗和血清学诊断相结合的方法对伪狂犬进行了净化，取得了显著的成效。因此，需要针对当前猪伪狂犬病病毒的变异情况，分离新的流行毒株，开发更有效的活疫苗，才能更好的防制猪伪狂犬病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE^-/TK^-的构建方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE^-/TK^-的构建方法，步骤如下：

S1、缺失gE基因：

S1.1、将猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY（保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2017年12月22日，保藏编号：CGMCC No.15192）接种至长满单层的vero细胞，当细胞出现80%以上病变的时候，收获病毒液，反复冻融，离心，取上清，酚氯仿方法提取变异株HN-QYY病毒基因组DNA，保存备用；

S1.2、以变异株HN-QYY病毒基因组DNA为模板，利用引物gEL-f/gEL-r和gER-f/gER-r分别PCR扩增gE基因上下游同源臂gEL和gER，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物，测定DNA含量，保存备用；

其中，引物序列分别为：

gEL-f：如SEQ ID No.1所示；gEL-r：如SEQ ID No.2所示；

gER-f：如SEQ ID No.3所示；gER-r：如SEQ ID No.4所示；

S1.3、EcoR I和Spe I双酶切gEL，Spe I和Hind III双酶切gER，EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的gEL、gER、pMD18-T；

S1.4、将回收后的gEL和gER连接到回收后的pMD18-T上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pgE；

S1.5、Spe I单酶切质粒pgE，纯化后去磷酸化，再次纯化；

S1.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体，回收酶切后的pEGFP-N1；将回收后的pEGFP-N1连接到去磷酸化后的pgE上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pgE-EGFP；

S1.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE^-/EGFP⁺

将步骤S1.1所得变异株HN-QYY病毒基因组DNA、pgE-EGFP共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均出现绿色荧光，获得重组荧光病毒HN-QYY-gE^-/EGFP⁺；

S1.8、去除绿色荧光基因

将HN-QYY-gE^-/EGFP⁺和pcGlobin2-Cre质粒共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均不带荧光，获得猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE^-（保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年01月02日，保藏编号：CGMCC No.15200）；

S2、缺失TK基因：

S2.1、将步骤S1.8所得变异株HN-QYY-gE^-接种至长满单层的vero细胞，当细胞出现80%以上病变的时候，收获病毒液，反复冻融，离心，取上清，酚氯仿方法提取变异株HN-QYY-gE^-病毒基因组DNA，保存备用；

S2.2、以变异株HN-QYY-gE^-病毒基因组DNA为模板，利用引物TKL-f/TKL-r和TKR-f/TKR-r分别PCR扩增TK基因上下游同源臂TKL和TKR，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物，测定DNA含量，保存备用；

其中，引物序列分别为：

TKL-f：如SEQ ID No.5所示；TKL-r：如SEQ ID No.6所示；

TKR-f：如SEQ ID No.7所示；TKR-r：如SEQ ID No.8所示；

S2.3、EcoR I和Spe I双酶切TKL，Spe I和Hind III双酶切TKR，EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的TKL、TKR、pMD18-T；

S2.4、将回收后的TKL和TKR连接到回收后的pMD18-T上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pTK；

S2.5、Spe I单酶切质粒pTK，纯化后去磷酸化，再次纯化；

S2.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体，回收酶切后的pEGFP-N1；将回收后的pEGFP-N1连接到去磷酸化后的pTK上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pTK-EGFP；

S2.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE^-/TK^-/EGFP⁺

将步骤S2.1所得变异株HN-QYY-gE^-病毒基因组DNA、pTK-EGFP共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均出现绿色荧光，获得重组荧光病毒HN-QYY-gE^-/TK^-/EGFP⁺；

S2.8、去除绿色荧光基因

将HN-QYY-gE^-/TK^-/EGFP⁺和pcGlobin2-Cre质粒共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均不带荧光，获得猪伪狂犬病病毒变异株 HN-QYY-gE^-/TK^-。

所述猪伪狂犬病病毒变异株 HN-QYY-gE^-/TK^-在制备猪伪狂犬病活疫苗中的应用。

本发明的有益效果：

（1）、本发明猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY为当前的流行毒株，能够有效预防猪伪狂犬病的发生；

（2）、本发明猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE^-/TK^-具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生较高的中和抗体；

（3）、本发明猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE^-/TK^-缺失了gE基因和TK基因，能够在后期的抗体检测中有效地区分野毒和疫苗毒，为猪伪狂犬病的预防和净化提供了有效的方法。

附图说明

图1：猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY的gE基因PCR鉴定，M：2000 DNA marker；1：HN-QYY gE基因的PCR扩增；2：vero细胞对照；

图2：pgE和pgE-EGFP质粒的PCR鉴定，M：15000bp DNA marker；1：pgE的PCR扩增；2：pgE-EGFP的PCR扩增；

图3：猪伪狂犬病病毒gE缺失株HN-QYY-gE^-的PCR鉴定，M：250bp DNA marker，1：gE-f/gE-r对HN-QYY-gE^-gE基因的PCR扩增，2：gEL-f/gER-r对HN-QYY-gE^-的PCR扩增；3：gEL-f/gER-r对HN-QYY-gE^-/EGFP⁺的PCR扩增；

图4：pTK质粒和HN-QYY-gE^-/TK^-/EGFP⁺重组病毒的PCR鉴定，M：15000bp DNAmarker；1：pTK的PCR扩增；2：HN-QYY-gE^-/TK^-/EGFP⁺的PCR扩增；

图5：HN-QYY-gE^-/TK^-重组病毒的PCR鉴定，M：250bp DNA marker；1：TK-f/TK-r对HN-QYY-gE^-TK基因的PCR扩增；2：TK-f/TK-r对HN-QYY-gE^-/TK^-TK基因的PCR扩增；

图6：HN-QYY-gE^-/TK^-株与亲本毒HN-QYY株在vero细胞上的生长曲线。

具体实施方式

实施例1--猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY的分离鉴定

申请人在2012年从河南省洛阳市某猪场采集发病猪的脑组织，剪碎，按质量/体积比g/mL 1∶5加入灭菌PBS溶解，用组织匀浆机打碎，-70℃、室温反复冻融3次，8000rpm离心10min；取上清，用0.22μm一次性滤器过滤除菌，将所得的组织液按体积比1∶5接种到长满单层的vero细胞上，待病变达到80%时收获病毒液，-70℃、室温反复冻融3次，将病毒液8000rpm离心10min，取上清，重新接种长满单层的vero细胞，盲传5代（从出现病变的代次起），当病变稳定后，收获病毒，空斑纯化，即得猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY并-70℃保存。

用酚氯仿法抽提取猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY病毒基因组DNA，具体步骤为：

（1）、将空斑纯化后的病毒液-70℃、室温反复冻融3次；

（2）、取病毒液上清350μL加到1.5mL离心管，在管中加350 μL RIPA裂解液和10μL蛋白酶K于56℃水浴2 h；

（3）、加入700μL的Tris饱和酚，混匀3min，然后4℃离心机中12000rpm离心10min；

（4）、吸取上层液体加入新的离心管，再加入700μL 的Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的混合液（Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1，体积比），混匀3min， 4℃离心机中12000rpm离心10min；

（5）、吸取上清液加到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液（氯仿∶异戊醇=24∶1，体积比），混匀3min，4℃离心机中12000rpm离心10min；

（6）、吸取上清液加入新的离心管，加入等体积的氯仿，混匀3min，4℃离心机中12000rpm离心10min；

（7）、吸取上清液400μL加入新的离心管，然后加入2.5体积倍的经过-20℃冷冻的无水乙醇，-20℃沉淀2h；

（8）、将样品取出，4℃离心机中12000rpm离心20min，弃上清，留白色沉淀，加1000μL经过-20℃冷冻的75v%乙醇，上下颠倒混匀，4℃离心机中12000rpm离心10min；

（9）、将酒精弃去，静止3min，待酒精挥发完毕，加入30μL的TE溶液，4℃溶解30min，即可得到DNA，-20℃保存备用。

猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY的鉴定采用gE基因PCR方法，引物如表1所示。gE基因PCR反应体系为：2xGC Buffer 25μL，dNTP(10 mmol/μL)1μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5μL，上下游引物（5 OD）各1μL，DNA模板（100 μg/mL）4μL，灭菌双蒸水补足至50 μL；反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃10min；PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图1，表明所分离的毒株为猪伪狂犬病病毒变异株。

实施例2--猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE^-/TK^-的构建方法

构建步骤如下：

S1、缺失gE基因：

S1.1、T25细胞瓶中vero细胞长满单层后，弃去营养液，用无菌PBS洗涤2次，接种30μL保藏编号为CGMCC No.15192的变异株HN-QYY，37℃ CO₂培养箱中孵育1h，弃去病毒液，加入6mL的维持液（含2%胎牛血清的DMEM），继续37℃ CO₂培养箱中培养，当细胞出现80%以上病变的时候，收获病毒液，-70℃、室温反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清，酚氯仿方法提取变异株HN-QYY病毒基因组DNA，-20℃保存备用；

S1.2、以变异株HN-QYY病毒基因组DNA为模板，利用引物gEL-f/gEL-r和gER-f/gER-r分别PCR扩增gE基因上下游同源臂gEL和gER，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物，测定DNA含量，-20℃保存备用；

其中，引物序列如表2所示：

PCR扩增反应体系为：2xGC Buffer 25 μL，dNTP（10 mmol/μL）1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，上下游引物（5 OD）各1 μL，DNA模板（100 μg/mL）4 μL，补水至50 μL；PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸80s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min；

S1.3、EcoR I和Spe I双酶切gEL，Spe I和Hind III双酶切gER，EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的gEL、gER、pMD18-T，-20℃保存备用；；

其中，酶切体系分别为：EcoR I（15 U/μL） 1.5 μL，Spe I（15 U/μL） 1.5 μL，片段gEL 3 μg，10×buffer 5 μL，补水至50 μL；Spe I（15 U/μL） 1.5μL，Hind III（15 U/μL）1.5μL，片段gER 3 μg，10×buffer 5μL，补水至50 μL；EcoR I（15 U/μL） 1 μL，Hind III（15 U/μL） 1 μL，pMD18-T载体 2 μg，10×buffer 5 μL，补水至50 μL；酶切条件均为：37℃水浴锅中孵育4 h；

S1.4、将回收后的gEL和gER连接到回收后的pMD18-T上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pgE，-20℃保存备用；

其中，连接体系为：T₄DNA连接酶（350 U/μL）1 μL，10×T₄Ligase buffer 1 μL，基因片段与载体片段（以摩尔比计，gEL∶gER∶pMD18-T=5∶5∶1），补水至10 μL；连接条件为：16℃连接16h；

质粒转化的具体步骤为：取出大肠杆菌感受态细胞DH5α 100μL，置于冰水混合物中，将10μL连接产物全部加入感受态细胞中，轻轻震荡混匀，静置30 min；之后将感受态细胞置于42℃，热激90s，再置于冰水混合物中静置5 min，加入1mL不含抗性的LB培养基，37℃、200rpm摇床培养1h，然后离心，留200μL上清液，混合均匀，取100μL上清的菌液均匀涂在含有氨苄青霉素（Amp+）抗性的固体LB平板（氨苄青霉素含量100 μg/mL，下同）上，37℃恒温培养16 h，挑取菌落至1mL含有Amp+抗性的LB培养基中，37℃、200rpm摇床培养12h，制备成菌液，进行菌液PCR；

菌液PCR扩增体系：2xGC Buffer 25μL，dNTP（10 mmol/μL）1μL， Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，引物gEL-f和gER-r（5 OD）各1μL，菌液4μL，补水至50 μL；PCR反应条件为：95℃预变性5 min；95 ℃ 变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸150 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min；之后用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定（见图2），挑取电泳条带位置在2600bp的菌液为阳性菌液；

扩大培养步骤为：将阳性菌液按体积比1∶100接至15 mL LB培养基中，37 ℃摇床200 r/min 摇菌14 h；

S1.5、Spe I单酶切质粒pgE，纯化后去磷酸化，再用PCR产物试剂盒进行纯化，-20℃保存备用；

其中，酶切体系为：Spe I（15 U/μL）2 μL，质粒pgE 4 μg，10×buffer 5μL，补水至50 μL；酶切条件为：37℃水浴锅中孵育3h；

去磷酸化体系为：去磷酸化酶（1 U/μL） 2 μL，酶切后的质粒pgE 2 μg，10×buffer 5 μL，补水至50 μL；去磷酸化条件为：37℃水浴锅中孵育3h；

S1.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体（购自湖南丰晖生物科技有限公司），回收酶切后的EGFP-N1片段；将回收后的EGFP-N1片段连接到去磷酸化后的pgE上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pgE-EGFP；

其中，酶切体系为：Nhe I（15 U/μL）1 μL，Spe I（15 U/μL）1 μL，pEGFP-N1 2 μg，10×buffer 5 μL，补水至50 μL；酶切条件为：37℃水浴锅中孵育3h；

连接体系为：T₄DNA连接酶（350 U/μL）1 μL，10×T₄Ligase buffer 1 μL，基因片段与载体片段（以摩尔比计，EGFP-N1∶pgE=5∶1），补水至10 μL；连接条件为：16℃连接16h；

质粒转化、菌液PCR和扩大培养的步骤同步骤S1.4，只是菌液PCR在用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定（见图2）后，挑取电泳条带位置在4500bp左右的菌液为阳性菌液；

S1.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE^-/EGFP⁺

采用脂质体LipofectamineTM2000将HN-QYY病毒基因组、pgE-EGFP按照1μg∶3μg的比例进行转染：首先将六孔板中生长至80%的293T细胞弃去营养液，每孔添加1mL的无血清DMEM，37℃ CO₂培养箱中孵育1h；取两只离心管，每只加300μL无血清无双抗DMEM，然后第一管加步骤S1.1所得变异株HN-QYY病毒基因组DNA 1μg，脂质体3μL，第二管加质粒pgE-EGFP3μg，脂质体9μL，第一管和第二管全部震荡混匀，静置5min，之后将两管合并为一管，吹打混匀，静止30min，加入到293T细胞中，37℃ CO₂培养箱中孵育6 h，弃去培养液，换成含2%胎牛血清的DMEM，37℃ CO₂培养箱中继续培养，36h后收获，-70℃、室温反复冻融后，接种长满单层的vero细胞，待细胞出现80%的病变时收毒；

空斑纯化：取病毒液，离心，取上清将上清液按10倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板，每孔1000 μL，吸附1h后弃去病毒液，加入2%琼脂糖与2×DMEM（含2%胎牛血清）以体积比1∶1组成的混合物2 mL，待出现细胞病变时，在荧光显微镜下挑取最高稀释度中带荧光的空斑，并再次按照10倍倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板，待细胞出现绿色荧光病变时，选择稀释度最大的孔挑取带绿色荧光的空斑继续接种vero细胞，如此纯化至所有空斑均出现绿色荧光的病变，利用引物gEL-f/gER-r对其进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定（扩增体系及条件同步骤S1.4菌液PCR扩增体系及条件，见图3），将此代病毒保存，命名为HN-QYY-gE^-/EGFP⁺；

在vero细胞上扩增病毒，具体步骤为：当T25细胞瓶中vero细胞生长至单层，弃去旧的培养液，用无血清的DMEM 2mL将20μL的病毒液稀释，加入到细胞瓶中，37℃ CO₂培养箱中孵育1h，换成含2%胎牛血清的DMEM，37℃ CO₂培养箱中继续培养，细胞病变80%时后收获，-70℃、室温反复冻融，取适量病毒液，酚氯仿抽提DNA，测定含量，-20℃保存备用；

S1.8、去除绿色荧光基因

将HN-QYY-gE^-/EGFP⁺和pcGlobin2-Cre质粒按照1μg∶3μg的比例按照步骤S1.7的方法转染至80%的293T细胞，36h后收获，-70℃、室温反复冻融3次后，接种长满单层的vero细胞，待细胞出现80%的病变时收获病毒液；按照步骤S1.7的方法空斑纯化病毒，直至所有的细胞病变均不带荧光，利用引物gEL-f/gER-r对其进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定（扩增体系及条件同步骤S1.4菌液PCR扩增体系及条件，见图3），将此代病毒保存，命名为猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE^-；

用酚氯仿法抽提猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE^-病毒基因组DNA，利用引物gE-f和gE-r对其gE基因进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定（扩增体系及条件同实施例1中HN-QYY的gE基因PCR扩增体系及条件，见图3），结果表明：HN-QYY-gE^-成功缺失了gE基因；

S2、缺失TK基因：

S2.1、T25细胞瓶中vero细胞长满单层后，弃去营养液，用无菌PBS洗涤2次，接种30μL 步骤S1.8所得变异株HN-QYY-gE^-，37℃ CO₂培养箱中孵育1h，弃去病毒液，加入6mL的维持液（含2%胎牛血清的DMEM），继续37℃ CO₂培养箱中培养，当细胞出现80%以上病变的时候，收获病毒液，-70℃、室温反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清，酚氯仿方法提取变异株HN-QYY-gE^-病毒基因组DNA，-20℃保存备用；

S2.2、以变异株HN-QYY-gE^-病毒基因组DNA为模板，利用引物TKL-f/TKL-r和TKR-f/TKR-r分别PCR扩增TK基因上下游同源臂TKL和TKR，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物，测定DNA含量，保存备用；

其中，引物序列如表3所示：

PCR扩增反应体系及条件同步骤S1.2；

S2.3、EcoR I和Spe I双酶切TKL，Spe I和Hind III双酶切TKR，EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的TKL、TKR、pMD18-T，-20℃保存备用；；

其中，酶切体系及条件同步骤S1.3；

S2.4、将回收后的TKL和TKR连接到回收后的pMD18-T上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pTK，-20℃保存备用；

其中，连接体系及条件、质粒转化步骤、菌液PCR扩增体系及条件、扩大培养步骤同步骤S1.4，只是菌液PCR时的引物为TKL-f 和TKR-r，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果见图4；

S2.5、Spe I单酶切质粒pTK，纯化后去磷酸化，再用PCR产物试剂盒进行纯化，-20℃保存备用；

其中，酶切体系及条件、去磷酸化体系及条件同步骤S1.5；

S2.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体（购自湖南丰晖生物科技有限公司），回收酶切后的EGFP-N1片段；将回收后的EGFP-N1片段连接到去磷酸化后的pTK上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pTK-EGFP；

其中，连接体系及条件、质粒转化步骤、菌液PCR扩增体系及条件、扩大培养步骤同步骤S1.4；

S2.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE^-/TK^-/EGFP⁺

采用脂质体LipofectamineTM2000进行转染：首先将六孔板中生长至80%的293T细胞弃去营养液，每孔添加1mL的无血清DMEM，37℃ CO₂培养箱中孵育1h；取两只离心管，每只加300μL无血清无双抗DMEM，然后第一管加步骤S2.1所得变异株HN-QYY-gE^-病毒基因组DNA1μg，脂质体3μL，第二管加质粒pTK-EGFP 3μg，脂质体9μL，第一管和第二管全部震荡混匀，静置5min，之后将两管合并为一管，吹打混匀，静止30min，加入到293T细胞中，37℃ CO₂培养箱中孵育6 h，弃去培养液，换成含2%胎牛血清的DMEM，37℃ CO₂培养箱中继续培养，36h后收获，-70℃、室温反复冻融后，接种长满单层的vero细胞，待细胞出现80%的病变时收毒；

空斑纯化：取病毒液，离心，取上清将上清液按10倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板，每孔1000 μL，吸附1h后弃去病毒液，加入2%琼脂糖与2×DMEM（含2%胎牛血清）以体积比1∶1的混合物2 mL，待出现细胞病变时，在荧光显微镜下挑取最高稀释度中带荧光的空斑，并再次按照10倍倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板，待细胞出现绿色荧光病变时，选择稀释度最大的孔挑取带绿色荧光的空斑继续接种vero细胞，如此纯化至所有空斑均出现绿色荧光的病变，利用引物TKL-f/TKR-r对其进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定（扩增体系及条件同步骤S1.4菌液PCR扩增体系及条件，见图4），将此代病毒保存，命名为HN-QYY-gE^-/TK^-/EGFP⁺；

在vero细胞上扩增病毒，具体步骤为：当T25细胞瓶中vero细胞生长至单层，弃去旧的培养液，用无血清的DMEM 2mL将20μL的病毒液稀释，加入到细胞瓶中，37℃ CO₂培养箱中孵育1h，换成含2%胎牛血清的DMEM，37℃ CO₂培养箱中继续培养，细胞病变80%时后收获，-70℃、室温反复冻融，取适量病毒液，酚氯仿抽提DNA，测定含量，-20℃保存备用；

S2.8、去除绿色荧光基因

将HN-QYY-gE^-/TK^-/EGFP⁺和pcGlobin2-Cre质粒按照1μg∶3μg的比例按照步骤S2.7的方法转染至80%的293T细胞，36h后收获，-70℃、室温反复冻融3次后，接种长满单层的vero细胞，待细胞出现80%的病变时收获病毒液；按照步骤S2.7的方法空斑纯化病毒，直至所有的细胞病变均不带荧光，利用引物TKL-f/TKR-r对其进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定（扩增体系及条件同步骤S1.4菌液PCR扩增体系及条件），将此代病毒保存，命名为猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE^-/TK^-；

用酚氯仿法抽提猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE^-/TK^-病毒基因组DNA。利用引物TK-f（如SEQ ID No.11）和TK-r（如SEQ ID No.12）分别对HN-QYY-gE^-和HN-QYY-gE^-/TK^-中的TK基因进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定（扩增体系及条件同实施例1中HN-QYY的gE基因PCR扩增体系及条件，见图5），结果表明：HN-QYY-gE^-/TK^-成功缺失了TK基因。

实施例3--猪伪狂犬病病毒活疫苗的制备

将HN-QYY-gE^-/TK^-接种至长满单层的vero细胞，待细胞达到80%以上的病变时收毒，-70℃、室温反复冻融三次，测定TCID₅₀。将病毒液8000rpm离心10min，取上清，制得猪伪狂犬病活疫苗，病毒含量应≧10⁵TCID₅₀/mL，制备的活疫苗按照《中国兽药典》附录进行检验，合格后4℃备用。

其中，病毒含量TCID₅₀的测定按下述方法进行：

TCID₅₀测定在96孔微量细胞培养板上进行，将HN-QYY-gE^-/TK^-病毒液用不含血清的DMEM作10^-1～10^-8倍比系列稀释，取10^-4～10^-85个稀释度，每个稀释度分别接种已长成良好单层的vero细胞各6个孔，每个孔加100μL的病毒液，置37℃孵育1h，直接补加100μL的维持液（含2%胎牛血清的DMEM），置37℃培养，经72h观察每孔细胞的病变情况，以细胞圆缩变形、脱落的病变达到50℅以上判为阳性孔，按Reed-Muench氏法计算病毒在vero细胞的TCID₅₀。

实施例4-- HN-QYY-gE^-/TK^-株的稳定性鉴定

1、材料：实施例2所得HN-QYY-gE^-/TK^-，vero细胞。

2、方法： 将HN-QYY-gE^-/TK^-接种至长满单层的vero细胞，待细胞达到80%以上的病变时收毒，-70℃、室温反复冻融三次，测定TCID₅₀，并连续传15代。

3、结果：稳定性鉴定结果见表4，HN-QYY-gE^-/TK^-在vero细胞上连续传15代，对1、5、10和15代病毒液进行TCID₅₀测定，表明各代次病毒液能够很好的适应vero细胞，并能够再vero细胞上稳定增殖。

实施例5-- HN-QYY-gE^-/TK^-株与亲本毒株HN-QYY生长曲线的测定

1、材料：实施例1所得HN-QYY株、实施例2所得HN-QYY-gE^-/TK^-株。

2、方法：将HN-QYY-gE^-/TK^-株和HN-QYY株分别以0.5MOI接种至长满单层的vero细胞，在接毒后12h、24h、36h、48h、60h和72h收毒，-70℃、室温反复冻融三次，测定TCID₅₀。

3、结果：将HN-QYY-gE^-/TK^-株和HN-QYY株以0.5MOI接种于vero细胞，绘制病毒的生长曲线，结果见图6。HN-QYY-gE^-/TK^-株的最高滴度为10^7.3TCID₅₀/mL，HN-QYY株的最高滴度为10^7.5TCID₅₀/mL。表明HN-QYY-gE^-/TK^-株与HN-QYY株的最高滴度相差不大。

实施例6-- HN-QYY-gE^-/TK^-株安全性实验

1、材料：1日龄仔猪。

2、方法：取4头1日龄仔猪，每头滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE^-/TK^-株1mL（病毒含量为10⁷TCID₅₀），连续观察7天。

3、结果： 4头1日龄仔猪在免疫HN-QYY-gE^-/TK^-株后，采食量正常，体温正常，证明HN-QYY-gE^-/TK^-株安全性好。

实施例7-- HN-QYY-gE^-/TK^-株对1日龄仔猪的免疫效力试验

1、材料：1日龄仔猪。

2、方法：取一日龄仔猪15头，分成三组、每组5头，第一组滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE^-/TK^-株1mL（病毒含量为10⁵TCID₅₀），第二组滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE^-/TK^-株1mL（病毒含量为10⁶TCID₅₀），第三组为不免疫的对照组。免疫后观察仔猪的发病情况。在免疫后4周进行攻毒，毒株为实施例1所得HN-QYY株，攻毒剂量为10⁶TCID₅₀/头，观察仔猪的发病情况。

3、结果：HN-QYY-gE^-/TK^-株以不同的剂量免疫1日龄仔猪，免疫后连续观察4周，第一组、第二组仔猪采食和精神均正常，无发热症状，生长状况良好；免疫后4周攻毒，连续观察2周，结果见表5，第一组仔猪有一头出现发热，精神沉郁等症状，其他各组仔猪精神状况良好，无发热症状，证明HN-QYY-gE^-/TK^-株对一日龄仔猪安全有效。

实施例8-- HN-QYY-gE^-/TK^-株对4周龄仔猪的免疫效力试验

1、材料：4周龄仔猪。

2、方法：取4周龄仔猪20头，随机分成四组，第一组滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE^-/TK^-株1mL（病毒含量为10⁴TCID₅₀），第二组滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE^-/TK^-株1mL（病毒含量为10⁵TCID₅₀），第三组滴鼻免疫实施例2所得HN-QYY-gE^-/TK^-株1mL（病毒含量为10⁶TCID₅₀），第四组为不免疫的对照组。免疫后观察仔猪的发病情况。并在免疫后4周攻毒，攻毒毒株为实施例1所得HN-QYY株，攻毒剂量为10⁶TCID₅₀/头，观察仔猪的发病情况。

3、结果：HN-QYY-gE^-/TK^-株以不同的剂量免疫4周龄仔猪，免疫后连续观察4周，第一组、第二组和第三组仔猪采食和精神均正常，无发热症状，生长状况良好。4周后攻毒，攻毒之前采血，分离血清，并连续观察2周，观察各组仔猪精神状况。结果见表6，第一组有2头出现发热，精神沉郁，食欲废绝等症状，其他免疫组仔猪均无明显症状，对照组仔猪全部有发热，呕吐，精神沉郁，神经症状等症状。表明HN-QYY-gE^-/TK^-株对4周龄仔猪安全有效。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccggaattcc tcctcctcgc cgccctgacc ctgg 34

<210> 2

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggactagtat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atcggacgga gataaaacgc 60

cacccac 67

<210> 3

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggactagtat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atcctccgtc gacatggaca 60

cgtttga 67

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagcttc gtccagggcg tcggcgtccg tcag 34

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccggaattcc ggcgagcacg ctgtggccct ccag 34

<210> 6

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggactagtat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt attccgctgc cacaaccgct 60

tctacga 67

<210> 7

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggactagtat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atgatggaga ccgcgacgga 60

ggcaacg 67

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cccaagcttc agcgagacgg cgcacggcga gagg 34

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttggatccct ttccgccgag acgaccc 27

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cggaagcttc ggcgggtggt agatgcag 28

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcgtactggc gcactctg 18

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acgccgtcgt cgttgc 16

Claims (1)

1.一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE^-/TK^-的构建方法，其特征在于，步骤如下：

S1、缺失gE基因：

S1.1、将保藏编号为CGMCC No.15192的变异株HN-QYY接种至长满单层的vero细胞，当细胞出现80%以上病变的时候，收获病毒液，反复冻融，离心，取上清，酚氯仿方法提取变异株HN-QYY病毒基因组DNA，保存备用；

S1.2、以变异株HN-QYY病毒基因组DNA为模板，利用引物gEL-f/gEL-r和gER-f/gER-r分别PCR扩增gE基因上下游同源臂gEL和gER，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物，测定DNA含量，保存备用；

其中，引物序列分别为：

gEL-f：如SEQ ID No.1所示；gEL-r：如SEQ ID No.2所示；

gER-f：如SEQ ID No.3所示；gER-r：如SEQ ID No.4所示；

S1.3、EcoR I和Spe I双酶切gEL，Spe I和Hind III双酶切gER，EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的gEL、gER、pMD18-T；

S1.4、将回收后的gEL和gER连接到回收后的pMD18-T上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pgE；

S1.5、Spe I单酶切质粒pgE，纯化后去磷酸化，再次纯化；

S1.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体，回收酶切后的pEGFP-N1；将回收后的pEGFP-N1连接到去磷酸化后的pgE上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pgE-EGFP；

S1.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE^-/EGFP⁺

将步骤S1.1所得变异株HN-QYY病毒基因组DNA、pgE-EGFP共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均出现绿色荧光，获得重组荧光病毒HN-QYY-gE^-/EGFP⁺；

S1.8、去除绿色荧光基因

将HN-QYY-gE^-/EGFP⁺和pcGlobin2-Cre质粒共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均不带荧光，获得猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE^-；

S2、缺失TK基因：

S2.1、将步骤S1.8所得变异株HN-QYY-gE^-接种至长满单层的vero细胞，当细胞出现80%以上病变的时候，收获病毒液，反复冻融，离心，取上清，酚氯仿方法提取变异株HN-QYY-gE^-病毒基因组DNA，保存备用；

S2.2、以变异株HN-QYY-gE^-病毒基因组DNA为模板，利用引物TKL-f/TKL-r和TKR-f/TKR-r分别PCR扩增TK基因上下游同源臂TKL和TKR，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物，测定DNA含量，保存备用；

其中，引物序列分别为：

TKL-f：如SEQ ID No.5所示；TKL-r：如SEQ ID No.6所示；

TKR-f：如SEQ ID No.7所示；TKR-r：如SEQ ID No.8所示；

S2.3、EcoR I和Spe I双酶切TKL，Spe I和Hind III双酶切TKR，EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的TKL、TKR、pMD18-T；

S2.4、将回收后的TKL和TKR连接到回收后的pMD18-T上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pTK；

S2.5、Spe I单酶切质粒pTK，纯化后去磷酸化，再次纯化；

S2.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体，回收酶切后的pEGFP-N1；将回收后的pEGFP-N1连接到去磷酸化后的pTK上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pTK-EGFP；

S2.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE^-/TK^-/EGFP⁺

将步骤S2.1所得变异株HN-QYY-gE^-病毒基因组DNA、pTK-EGFP共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均出现绿色荧光，获得重组荧光病毒HN-QYY-gE^-/TK^-/EGFP⁺；

S2.8、去除绿色荧光基因

将HN-QYY-gE^-/TK^-/EGFP⁺和pcGlobin2-Cre质粒共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均不带荧光，获得猪伪狂犬病病毒变异株 HN-QYY-gE^-/TK^-。

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