CN105018436A

CN105018436A - 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105018436A
Application number: CN201410174926.2A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 谭菲菲; 肖燕; 田克恭
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2014-04-28
Filing date: 2014-04-28
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2034-04-28
Also published as: CN105018436B

Abstract

本发明提供了一种猪伪狂犬病毒弱毒株，其中，该猪伪狂犬病毒弱毒株为缺失UL21基因的猪伪狂犬病毒变异株。本发明还提供了包含该猪伪狂犬病毒弱毒株抗原的疫苗组合物，及其制备方法和应用。经活疫苗免疫原性实验和致病性免疫原性试验证明，该猪伪狂犬活疫苗具有很好的保护力，基本没有临床症状，显示出很好的免疫保护。

Description

猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、及其制备的疫苗组合物，以及制备方法和应用，属于动物病毒学领域。

背景技术

伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒Ⅰ型(Suid herpesvirus1strain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻痹，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜伏感染特性，在外周神经系统可以长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒，被潜伏感染的宿主就会发病。

现在技术普遍使用gE缺失的伪狂犬弱毒疫苗防治猪伪狂犬病，使用采用自然缺失或者人工缺失某些毒性基因的毒株来预防猪伪狂犬病，例如BUK株是Bucharest株经过鸡胚和鸡胚成纤维细胞800次传代获得的弱毒疫苗株，其缺失了大部分gE基因。还有人工缺失的伪狂犬SA215毒株HB-98株等用于预防猪伪狂犬病。

最近的研究报道称猪伪狂犬病发生了新的特点，突出表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状。现有技术的疫苗免疫猪只后不能完全抵抗野毒攻击，依然会出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝等症状，感染率超过80％，发病率超过30％，死亡率在10％～20％之间。例如彭金美等.猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析.中国预防兽医学报，2013，35(1)：1-4；童武等.免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定.中国动物传染病学报，2013,21(3):1-7；Yu et al.,Pathogenic Pseudorabies Virus,China,2012.Emerging infectiousDiseases.2014,20(1):102-104；An et al.,Pseudorabies virus variant inBartha-K61-vaccinated pigs,China,Emerging infectious Diseases.2013.19(11)：1749-1755)，现有技术还没有疫苗能够解决针对猪伪狂犬变异株引起的伪狂犬病。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种活的减毒猪伪狂犬病毒株，用于防治变异伪狂犬病毒引起的猪狂犬病。其中，所述猪伪狂犬病病毒株缺失UL21基因。优选地，所述伪狂犬病毒株为伪狂犬变异株。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种缺失UL21基因的伪狂犬病毒基因工程弱毒株。

优选地，所述伪狂犬变异株为gE蛋白序列为SEQ ID NO.07或与其序列同源性为95％以上的的毒株；更优选地，所述的猪伪狂犬变异株为经分离的所述猪伪狂犬病毒变异株当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中基因缺失伪狂犬弱毒疫苗后依然会造成猪出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝症状的毒株；最优选地，所述的猪伪狂犬变异株为当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中缺失gE、TK和gI基因中的一个及一个以上基因的伪狂犬弱毒疫苗后依然感染猪伪狂犬病并具备具有使9-10日龄仔猪精神沉郁和食欲下降的毒株。

术语“猪伪狂犬变异株”也称为高致病性猪伪狂犬毒株，是指：表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状。优选地，所述的伪狂犬变异株为经分离的所述猪伪狂犬病毒变异株当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中基因缺失伪狂犬弱毒疫苗后依然会造成猪出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝等症状的毒株，优选地所述伪狂犬变异株为gE蛋白序列为SEQ ID NO.07或与其序列同源性为95％以上的蛋白序列的毒株。更优选地，所述的猪伪狂犬变异株为当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中缺失gE、TK和gI基因中的一个及一个以上基因的伪狂犬弱毒疫苗后依然感染猪伪狂犬病并具备具有使9-10日龄仔猪精神沉郁和食欲下降的毒株。

最优选的是伪狂犬变异株包括但不限于猪伪狂犬病毒HN1201株(Pseudorabies virus,strain HN1201)(保藏号为CCTCC NO.V201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日)，JS-2012株(童武，张青占，郑浩等，免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定[J].中国动物传染病学报2013,21(3):1-7)；猪伪狂犬HeN1株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCCNO.6656，公开于专利申请CN102994458A；NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株(Xiuling Yu,Zhi Zhou,Dongmei Hu,et al.PathogenicPseudorabiesVirus,China,2012EmergingInfectious Diseases，www.cdc.gov/eid ol.20,No.1,January2014。猪伪狂犬病毒HN1202株(Pseudorabies virus,strain HN1202)(保藏号为CCTCC NO.V201335；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年8月26日)。

本发明术语“同源性”在本申请中是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计算得到，例如，可以将目标氨基酸(或核苷酸)序列与参比氨基酸(或核苷酸)序列进行序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸(或核苷酸)数目达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸(或核苷酸)序列之间相同氨基酸(或核苷酸)的百分比。氨基酸(或核苷酸)序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现，例如，但不限于，BLAST软件(在美国国立生物技术信息中心(NCBI)的网址上可获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者见，例如，Altschul S.F.et al，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；Stephen F.et al，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))，ClustalW2软件(在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://www.eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/，另见，例如，Higgins D.G.etal，Methods in Enzymology，266：383-402(1996)；Larkin M.A.et al，Bioinformatics(Oxford，England)，23(21)：2947-8(2007))；和TCoffee软件等(在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得：http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例如，Poirot O.et al，Nucleic Acids Res.，31(13)：3503-6(2003)；Notredame C.etal，J.Mol.Boil.，302(1)：205-17(2000))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。

NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株公开于Xiuling Yu,Zhi Zhou,Dongmei Hu,et al.Pathogenic PseudorabiesVirus,China,2012EmergingInfectious Diseases，www.cdc.gov/eid ol.20,No.1,January2014。

猪伪狂犬病毒HN1202株(Pseudorabies virus,strain HN1202)保藏号为CCTCC NO.V201335；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年8月26日。

优选地，所述的猪伪狂犬病毒弱毒株进一步缺失TK、gE、gI基因中的一个或多个。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明提供一种缺失gE、TK、gI、UL21基因的伪狂犬病毒基因工程弱毒株。

优选地，所述一种缺失gE、TK、gI和UL21基因的伪狂犬病毒基因工程弱毒株为猪伪狂犬HN1201株的缺失gE、TK和gI和UL21基因的基因工程弱毒株。

优选地，所述的猪伪狂犬病毒弱毒株基因组中TK基因位置核苷酸序列编码SEQ.NO.4的氨基酸序列；所述的猪伪狂犬病毒弱毒株基因组中gE和gI基因位置核苷酸序列为SEQ.NO.6的核苷酸序列。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明提供一种猪伪狂犬病毒弱毒株，其中，所述的猪伪狂犬病毒弱毒株包括不能表达UL21、TK、gE、gI蛋白的HN1201株、HN1202株、JS-2012株、猪伪狂犬HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株或NVDC-PRV-SD株。

作为本发明的一种优选实施方式，所述伪狂犬病毒弱毒株为利用基因工程缺失UL21基因的猪伪狂犬病毒HN1201株(Pseudorabies virus,strain HN1201)其中所述的猪伪狂犬HN1201株保藏号为CCTCC NO.V201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日。

作为本发明的一种优选实施方式，所述所述伪狂犬病毒弱毒株为利用基因工程手段缺失gE、TK、gI的猪伪狂犬HN1201株。

作为本发明的一种优选实施方式，所述伪狂犬病毒弱毒株为利用基因工程手段缺失gE、TK、gI和UL21基因的猪伪狂犬HN1201株。

本发明所用术语“减毒”是指：经基因缺失的猪伪狂犬病毒与未经修饰的亲本株相比毒力降低。表现在猪死亡头数、发烧头数的减少和和发烧维持时间的变短。如果病毒株的一种或多种确定疾病严重性的参数在统计学的差异显著性降低，则其“毒力更小”。

本发明的另一个方面涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物含有免疫量的所述的基因缺失毒株。

发明的再一个目的是提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的所述的猪伪狂犬病毒弱毒株抗原和载体。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物包括免疫量的所述缺失UL21基因的猪伪狂犬病病毒株变异株的减毒活疫苗和载体。

作为本发明的另一种实施方式，所述疫苗组合物包括免疫量的所述缺失gE、TK、gI基因的猪伪狂犬病病毒株变异株的减毒活疫苗和载体。

作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物包括免疫量的所述缺失gE、TK、gI和UL21基因的猪伪狂犬病病毒株变异株的减毒活疫苗和载体。

优选地，所述猪伪狂犬病毒弱毒株抗原为活的猪伪狂犬病毒弱毒株；所述疫苗组合物进一步包括冻干保护剂。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物为缺失UL21基因的猪伪狂犬病病毒株的减毒活疫苗。

作为本发明的另一种实施方式，本发明提供一种缺失gE、TK、gI基因的减毒活疫苗。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明提供一种缺失gE、TK、gI和UL21基因的伪狂犬变异株的减毒活疫苗。

任选地，可以向疫苗中加入具有佐剂活性的一种或多种化合物。根据本发明的活的减毒的猪伪狂犬病毒不一定需要这种佐剂来实现功效，但是特别对应包含根据本发明的活的减毒的猪伪狂犬病毒和来自另一致病病毒或微生物(见下文)的抗原性物质的组合疫苗，将值得加入佐剂。佐剂是免疫系统的非特异性刺激剂。它们增强宿主对疫苗的免疫应答.本领域中已知的佐剂的实例是弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、ISCOMs(免疫刺激复合体，参考例如欧洲专利EP109942)、皂苷、矿物油、植物油，和Carbopol。

因此，在该实施方案的优选形式中，根据本发明的活的减毒疫苗包含佐剂。

可用于本发明的可药用载体或者稀释剂的其他实例包括稳定剂，如SPGA、糖类(例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、蛋白质，如白蛋白或者酪蛋白、含有蛋白质的物质，如牛血清或者脱脂乳和缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。

特别当将这种稳定剂加入疫苗时，疫苗非常适于冷冻干燥。因此，在该实施方案的更优选的形式中，活的减毒疫苗是冷冻干燥的形式。

此外，本发明的猪伪狂犬疫苗可与其他失活病原体或抗原组合使用以制备抵抗包括猪伪狂犬病的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。本发明所用的术语“联合疫苗”用于指从本发明的猪伪狂犬病病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。术语“复合疫苗”指的是从病毒和细菌制备的疫苗。例如，本发明的猪伪狂犬病毒可与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒和/或副猪嗜血杆菌、支原体混合或组合。

作为本发明的一种实施方式，本发明的弱毒可以插入外源基因，所述的外源基因编码选自感染猪的多种病原中的一种或多种抗原，所述病原体由猪繁殖呼吸综合征(PRRS)病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪圆环病毒1型或者2型、大肠杆菌、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusi opathiae),支气管败血性博德特菌(Bordetella bronchiseptica),副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)和猪链球菌(Streptococcus suis)组成。

优选地，所述疫苗组合物还包括介质、佐剂、赋形剂。

本发明的疫苗组合物还可包含介质、佐剂和/或赋形剂。生理盐水或蒸馏水可用作介质。

本发明的又一个目的是提供一种制备所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：(1)扩增培养所述猪伪狂犬病毒弱毒株；以及(2)在所述扩增培养的猪伪狂犬病毒弱毒株中加入冻干保护剂。

本发明的还一个目的是提供所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪伪狂犬病的药物中的应用。

优选地，所述的猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒变异株导致的猪伪狂犬病。

本文所用的术语“猪伪狂犬病病毒相关疾病”可以用于指出表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状，但不限于此。上述症状与现有技术中感染了普通猪伪狂犬病病毒后产生的症状差异在于：感染了后会造成感染后成年猪(体重在50kg以上猪)可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死；新生及4周龄以内的仔猪突然发病，发生大批死亡，死亡率达90％以上；发病仔猪主要表现为体温上升达41℃以上，食欲废绝，伴有明显的神经症状和腹泻；断奶前后仔猪主要为呼吸系统症状，表现呼吸困难、咳嗽、流鼻涕等。

本文所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪伪狂犬感染或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪伪狂犬病病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。

附图说明

图1为pUCUL21A-GFP-B质粒的构建示意图；

图2为UL21基因缺失位置及UL21A和UL21B同源臂在基因组上所在位置示意图；

图3为通过PCR方法确认猪伪狂犬病病毒HN1201株UL21基因缺失前后的PCR片段电泳对比图；

图4为TK基因缺失位置及TKA和TKB同源臂在基因组上所在位置示意图；

图5为通过PCR方法确认猪伪狂犬病病毒HN1201株TK基因缺失前后的PCR片段电泳对比图；

图6为gE/gI缺失位置及gEIA和gEIB同源臂在基因组上所在位置示意图；

图7为通过PCR方法确认猪伪狂犬病病毒HN1201株gE/gI基因缺失前后的对比图。

序列表中：

序列1为猪伪狂犬病病毒HN1201株毒株UL21基因核苷酸序列；

序列2为猪伪狂犬病病毒HN1201株毒株TK基因核苷酸序列；

序列3为猪伪狂犬病病毒HN1201株毒株TK基因缺失后该位置核苷酸序列；

序列4为猪伪狂犬病病毒HN1201株毒株TK基因缺失后该位置氨基酸序列；

序列5为猪伪狂犬病病毒HN1201株毒株gE/gI全基因核苷酸序列；

序列6为猪伪狂犬病病毒HN1201株毒株gE/gI全基因缺失后该位置核苷酸序列。

序列7为猪伪狂犬病病毒HN1201株的gE氨基酸序列。

序列8为猪伪狂犬病病毒HN1201株的UL21基因缺失后改为的核苷酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明中的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量。

本发明中所述的“TCID50”(50％tissue culture infective dose)是指半数细胞培养物感染量，是表示病毒感染力的一种表示方式。

MEM液体培养基(液)用购自美国Life Technologies公司的MEM干粉培养基按照其说明书配制。

本发明的DMEM培养基参照GB/T18641-2002附录A配制方法配制。

本发明中所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline)的英文缩写，本发明中使用的是0.01mM的pH7.4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。

本实施例所用的猪伪狂犬病毒HN1201株(Pseudorabies virus,strainHN1201)保藏号为CCTCC NO.V201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日。

本实施例所用的猪伪狂犬病毒HN1202株(Pseudorabies virus,strainHN1202)保藏号为CCTCC NO.V201335；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年8月26日。

PRV是术语猪伪狂犬病毒Pseudorabies virus的英文简写。

实施例1、PRV HN1201株UL21缺失毒株的制备

1.1PRV HN1201GFP重组病毒转移载体的构建

根据要缺失的UL21基因的序列，在其两端设计同源臂，分别为UL21A和UL21B。将UL21A和UL21B克隆到pUC19载体上，命名为pUCUL21AB。然后将GFP基因克隆至pUCUL21AB上，获得重组病毒转移载体，命名pUCUL21A-GFP-B。转移载体中同源臂为UL21两侧序列，所以重组后得到的重组病毒即为UL21基因缺失的。重组转移载体构建示意图见图1，图2为UL21A和UL21B同源臂在基因组上所在位置。

1.1.1、同源重组臂的扩增及克隆

1.1.1.1引物设计和模板制备

根据HN1201病毒的基因序列设计两对引物，用于扩增UL21基因两侧的同源臂：

左侧同源臂UL21A的上下游引物分别为：

UL21AF:CCGGAATTCTCTCCCACAGCCAGACTCCC(下划线为EcoR I酶切位点)

UL21AR:CTAGTCTAGAataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatAACCAAACACCACGTCCGC(下划线为Xba I酶切位点，小写字母为loxp位点)

右侧同源臂UL21B的上下游引物分别为：

UL21BF:ACATGCATGCataacttcgtatagcatacattatacgaagttatATGGCGGCGGGCACACGCGG(下划线为Sph I酶切位点，小写字母为loxp位点)

UL21BR:CCCAAGCTTGGCGTTGAGGGAGCGGCGAT(下划线为Hind III酶切位点)

取PRV HN1201感染vero细胞，待细胞80％以上发生病变后，取部分上清，采用UL21neaid Viral Nucleic Acid Extraction试剂盒提取病毒基因组DNA，作为同源臂扩增的模板。

1.1.1.2同源臂UL21A、UL21B的扩增及克隆

利用TAKARA的PrimeSTAR进行PCR扩增UL21A、UL21B，体系及条件如下：

PCR扩增出的UL21A和UL21B片段通过琼脂糖凝胶电泳分离后，用天根胶回收试剂盒回收目的片段。将UL21A片段和pUC19载体分别用EcoR I和XbaI双酶切后，回收目的片段，T4DNA ligase连接后转化DH5α，涂布氨苄板37℃培养过夜。挑取单克隆酶切鉴定正确后，鉴定正确的质粒命名为pUCUL21A。将pUCUL21A和UL21B分别用SphI和HindIII双酶切后回收目的片段，T4DNA ligase连接后，转化DH5α，涂布氨苄板37℃培养过夜。挑取单克隆提取质粒，经酶切和测序鉴定正确的质粒命名为pUCUL21AB。

..1.2标记基因GFP的扩增

1.1.2.1GFP载体pAcGFP-C1多克隆位点的去除

将pAcGFP-C1质粒(购自Clontech，货号632470)用Bgl II和SmaI双酶切后，回收线性化的载体，经DNA Polymerase I Large(Klenow)Fragment补平，T4DNA Ligase连接后，转化感受态细胞DH5α获得删除MCS的GFP质粒，命名为：pAcGFPΔMCS。

1.1.2.2GFP基因的扩增

根据pAcGFP-C1载体序列设计扩增GFP的引物：

上游引物

CMVU:ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG(下划线为SalI酶切位点)

下游引物

SV40R:ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC(下划线为Sph I酶切位点)

以质粒pAcGFPΔMCS为模板扩增GFP基因，体系及条件如下：

电泳回收目的条带进行下一步的连接。

1.1.3GFP标记基因与pUCUL21AB的连接

将GFP用Sal I和Sph I双酶切后，回收目的片段，和经过同样双酶切的pUCUL21AB质粒连接，转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆提取质粒，酶切和测序鉴定正确的质粒命名为pUCUL21A-GFP-B。

1.2含有GFP的重组病毒的获得

1.2.1转移载体和HN1201DNA共转染Vero细胞获得重组病毒

以脂质体法共转染Vero细胞，将3ug PRV-HN1201病毒基因组DNA和5ug转移载体pUCUL21A-GFP-B，按照Lipofectamine2000(Invitrogen，货号11668030)说明书上的步骤进行转染。在37℃含5％CO2的培养箱中培养。转染后36-48h，待出现细胞病变，且病变处有荧光后，收获细胞上清，即为P0代重组病毒，命名为rPRV-GFP-UL21^-。

1.2.2重组病毒的噬斑纯化

将获得的P0代重组病毒rPRV-GFP-UL21^-感染Vero细胞后，铺上2％的低熔点琼脂糖，48h后待细胞出现明显的病变和荧光后，挑取带有绿色荧光的噬斑于-70℃冻融3次后，10倍倍比稀释接种到预先铺好的Vero细胞六孔板中，继续挑取绿色荧光噬斑进行纯化，经过8轮的噬斑纯化，得到纯化的不含野生型病毒HN1201的UL21缺失的重组病毒rPRV-GFP-UL21^-。

1.3UL21缺失重组病毒中GFP标记基因的删除

将表达Cre酶的pBS185质粒(购买自addgene，Cre酶识别同源臂UL21A下游和UL21B上游的loxP位点，将两个loxp位点中间的序列删除)和重组病毒rPRV-GFP-UL21^-基因组DNA共转染vero细胞，结果转染后24h出现比较明显的病变，而且单个荧光比较多。收获的P0代病毒倍比稀释后接种进行空斑筛选，挑取没有荧光的噬斑进行下一轮纯化。经过2轮筛选纯化，得到没有荧光的病毒，命名为vPRV-UL21^-。提取纯化病毒基因组DNA，PCR鉴定表明UL21基因缺失，且GFP标记基因也已经删除。说明不含GFP标记基因的UL21缺失病毒纯化成功。将缺失UL21基因的病毒株命名为PRV HN1201UL21^-株。

1.5PRV HN1201株UL21缺失毒株确认

提取UL21缺失病毒和野生型病毒的病毒基因组，进行PCR鉴定，引物如下：

UL21DCF：gaatggttggtatgtgcgaatt

UL21DCR：gcgggtttaaaggagtggtc

野生型病毒扩增的PCR产物大小为2312bp,UL21缺失病毒扩增的PCR片段大小为692bp，PCR鉴定结果见图3。

实施例2、PRV HN1201株TK/gE/gI/缺失毒株的制备

1.TK缺失毒株的制备

1.1PRV HN1201TK缺失所需的GFP中间转移载体的构建

根据要缺失的TK基因的序列，在其两端设计同源臂，分别为TKA和TKB。将TKA和TKB克隆到pUC19载体上，命名为pUCTKAB。然后将GFP基因克隆至pUCTKAB上，获得重组病毒转移载体，命名pUCTKA-GFP-B。转移载体中同源臂为TK两侧序列，所以重组后得到的重组病毒即为TK基因缺失的病毒。图4为TK基因缺失位置及TKA和TKB同源臂在基因组上所在位置示意图。

1.1.1、同源重组臂的扩增及克隆

1.1.1.1引物设计和模板制备

根据HN1201病毒的基因序列设计两对引物，用于扩增TK基因两侧的同源臂：

左侧同源臂TKA的上下游引物分别为：

TKAF:CCGGAATTCGTAGTGCCGGTTGCCCACGTACA(下划线为EcoR I酶切位点)

TKAR:CTAGTCTAGAataacttcgtatagcatacattatacgaagttatCGCTCAGGCTGCCGTTCTGC(下划线为Xba I酶切位点，小写字母为loxp位点)

右侧同源臂TKB的上下游引物分别为：

TKBF:ACATGCATGCataacttcgtatagcatacattatacgaagttatAACGACGACGGCGTGGGAGG(下划线为Sph I酶切位点，小写字母为loxp位点)

TKBR:CCCAAGCTTAGGGCGACGGCGAAGAAGAGC(下划线为Hind III酶切位点)

取PRV HN1201感染vero细胞，待细胞80％以上发生病变后，取部分上清，采用Geneaid Viral Nucleic Acid Extraction试剂盒提取病毒基因组DNA，作为同源臂扩增的模板。

1.1.1.2同源臂TKA、TKB的扩增及克隆

利用TAKARA的PrimeSTAR进行PCR扩增TKA、TKB，体系及条件如下：

PRV HN1201DNA	1μL
		primSTAR	0.5μL
2*primSTAR GC buffer	25μL
		dNTP(25mM)	4μL
上游引物	0.5μL
		下游引物	0.5μL
水	补足50μL

PCR扩增出的TKA和TKB片段通过琼脂糖凝胶电泳分离后，用天根胶回收试剂盒回收目的片段。将TKA片段和pUC19载体分别用EcoRI和XbaI双酶切后，回收目的片段，T4DNA ligase连接后转化DH5α，涂布氨苄板37℃培养过夜。挑取单克隆酶切鉴定正确后，鉴定正确的质粒命名为pUCTKA。将pUCTKA和TKB分别用SphI和HindIII双酶切后回收目的片段，T4DNA ligase连接后，转化DH5α，涂布氨苄板37℃培养过夜。挑取单克隆提取质粒，经酶切和测序鉴定正确的质粒命名为pUCTKAB。

1.1.2标记基因GFP的扩增

1.1.2.1GFP载体pAcGFP-C1多克隆位点的去除

1.1.2.2GFP基因的扩增

根据pAcGFP-C1载体序列设计扩增GFP的引物：

上游引物

CMVU:ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG(下划线为SalI酶切位点)

下游引物

SV40R:ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC(下划线为Sph I酶切位点)

以质粒pAcGFPΔMCS为模板扩增GFP基因，体系及条件如下：

pAcGFPΔMCS	1μL
		primSTAR	0.5μL
2*primSTAR GC buffer	25μL
		dNTP(25mM)	4μL
上游引物CMVU	0.5μL
		下游引物SV40R	0.5μL
水	补足50μL

电泳回收目的条带进行下一步的连接。

1.1.3GFP标记基因与pUCTKAB的连接

将GFP用Sal I和Sph I双酶切后，回收目的片段，和经过同样双酶切的pUCTKAB质粒连接，转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆提取质粒，酶切和测序鉴定正确的质粒命名为pUCTKA-GFP-B。

1.2含有GFP的TK缺失重组病毒的获得

1.2.1转移载体pUCTKA-GFP-B和HN1201DNA共转染Vero细胞获得重组病毒

以脂质体法共转染Vero细胞，将3μg PRV-HN1201病毒基因组DNA和5μg转移载体pUCTKA-GFP-B，按照Lipofectamine2000(Invitrogen，货号11668030)说明书上的步骤进行转染。在37℃含5％CO2的培养箱中培养。转染后36-48h，待出现细胞病变，且病变处有荧光后，收获细胞上清，即为P0代重组病毒，命名为rPRV-GFP-TK^-。

1.2.2重组病毒rPRV-GFP-TK^-的噬斑纯化

将获得的P0代重组病毒rPRV-GFP-TK-感染Vero细胞后，铺上2％的低熔点琼脂糖，48h后待细胞出现明显的病变和荧光后，挑取带有绿色荧光的噬斑于-70℃冻融3次后，10倍倍比稀释接种到预先铺好的Vero细胞六孔板中，继续挑取绿色荧光噬斑进行纯化，经过8轮的噬斑纯化，得到纯化的不含野生型病毒HN1201的TK缺失的重组病毒rPRV-GFP-TK^-。

1.3TK缺失重组病毒中GFP标记基因的删除

将表达Cre酶的pBS185质粒(购买自addgene，Cre酶识别同源臂TKA下游和TKB上游的loxP位点，将两个loxp位点中间的序列删除)和重组病毒rPRV-GFP-TK^-基因组DNA共转染vero细胞，结果转染后24h出现比较明显的病变，而且单个荧光比较多。收获的P0代病毒倍比稀释后接种进行空斑筛选，挑取没有荧光的噬斑进行下一轮纯化。经过2轮筛选纯化，得到没有荧光的病毒，命名为vPRV-TK^-。提取纯化病毒基因组DNA，PCR鉴定表明TK基因缺失，且GFP标记基因也已经删除。说明不含GFP标记基因的TK缺失病毒纯化成功。将缺失TK基因的病毒株命名为PRV HN1201TK^-株。

1.4PRV HN1201TK缺失毒株基因鉴定

提取TK缺失病毒vPRV-TK^-和野生型病毒的病毒基因组，进行PCR鉴定，引物如下：

TKDCF：cctacggcaccggcaagagca

TKDCR：cgcccagcgtcacgttgaagac

野生型病毒扩增的PCR产物大小为1123bp,TK缺失病毒扩增的PCR片段大小为742bp，见图5。

2.TK/gE/gI缺失毒株的制备

2.1PRV HN1201缺失gI/gE所需的GFP中间转移载体的构建

gI/gE基因位于PRV基因组上相邻的US7/US8区域，可以设计同源臂同时将gI/gE缺失掉。根据要缺失的gE/gI基因的序列，在其两端设计同源臂，分别为gEIA和gEIB。将gEIA和gEIB克隆到pUC19载体上，命名为pUCgEIAB。然后将GFP基因克隆至pUCgEIAB上，获得重组病毒转移载体，命名pUCgEIA-GFP-B。转移载体中同源臂为gE/gI两侧序列，所以与TK缺失病毒HN1201TK^-重组后得到的重组病毒即为TK、gE、gI基因缺失的。图6为gEIA和gEIB同源臂在基因组上所在位置。

2.1.1同源重组臂的扩增及克隆

2.1.1.1引物设计和模板制备

根据HN1201-TK^-病毒的基因序列设计两对引物，用于扩增gE/gI基因两侧的同源臂：

左侧同源臂gEIA的上下游引物分别为：

gEIAF:CCGGAATTCGGTCGTCGTGGGCATCGTCATC(下划线为EcoR I酶切位点)

gEIAR:CTAGTCTAGAataacttcgtataatgtatgctatacgaagttat

TACGGACCGGGCTGCGCTTT(下划线为Xba I酶切位点，小写字母为Loxp位点)

右侧同源臂gEIB的上下游引物分别为：

gEIBF:ACATGCATGCataacttcgtatagcatacattatacgaagttatCCCGCCCCGCTTAAATACCG(下划线为Sph I酶切位点)

gEIBR:CCCAAGCTTCCAGGAGCACCTGGTCGCAGA(下划线为Hind III酶切位点)

取PRV HN1201-TK^-病毒感染vero细胞，待细胞80％以上发生病变后，取部分上清，采用Geneaid Viral Nucleic Acid Extraction试剂盒提取病毒基因组DNA，作为同源臂扩增的模板。

2.1.1.2同源臂gEIA、gEIB的扩增及克隆

利用TAKARA的PrimeSTAR进行PCR扩增gEIA、gEIB，体系及条件如下：

PRV HN1201-TK^-DNA	1μL
		primSTAR	0.5μL
2*primSTAR GC buffer	25μL
		dNTP(25mM)	4μL
上游引物	0.5μL
		下游引物	0.5μL
水	补足50μL

PCR扩增出的gEIA和gEIB片段通过琼脂糖凝胶电泳分离后，用天根胶回收试剂盒回收目的片段。将gEIA片段和pUC19载体分别用EcoR I和XbaI双酶切后，回收目的片段，T4DNA ligase连接后转化DH5α，涂布氨苄板37℃培养过夜。挑取单克隆酶切鉴定正确后，鉴定正确的质粒命名为pUCgEIA。将pUCgEIA和gEIB分别用SphI和HindIII双酶切后回收目的片段，T4DNA ligase连接后，转化DH5α，涂布氨苄板37℃培养过夜。挑取单克隆提取质粒，经酶切和测序鉴定正确的质粒命名为pUCgEIAB。

2.1.2标记基因GFP的扩增

2.1.2.1GFP载体pAcGFP-C1多克隆位点的去除

2.1.2.2GFP基因的扩增

根据pAcGFP-C1载体序列设计扩增GFP的引物：

上游引物

CMVU:ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG(下划线为SalI酶切位点)

下游引物

SV40R:ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC(下划线为Sph I酶切位点)

以质粒pAcGFPΔMCS为模板扩增GFP基因，体系及条件如下：

电泳回收目的条带进行下一步的连接。

2.1.3GFP标记基因与pUCgEIAB的连接

将GFP用SalI和SphI双酶切后，回收目的片段，和经过同样双酶切的pUCgEIAB质粒连接，转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆提取质粒，酶切和测序鉴定正确的质粒命名为pUCgEIA-GFP-B。

2.2含有GFP的重组病毒的获得

2.2.1转移载体pUCgEIA-GFP-B和vPRV-TK^-DNA共转染Vero细胞获得重组病毒

以脂质体法共转染Vero细胞，将3μg PRV-TK^-病毒基因组DNA和5μg转移载体pUCgEIA-GFP-B，按照Lipofectamine2000(Invitrogen，货号11668030)说明书上的步骤进行转染。在37℃含5％CO2的培养箱中培养。转染后36-48h，待出现细胞病变，且病变处有荧光后，收获细胞上清，即为P0代重组病毒，命名为rPRV-GFP-TK^-gE^-gI^-。

2.2.2重组病毒rPRV-GFP-TK^-gE^-gI^-的噬斑纯化

将获得的P0代重组病毒rPRV-GFP-TK^-gE^-gI^-感染Vero细胞后，铺上2％的低熔点琼脂糖，48h后待细胞出现明显的病变和荧光后，挑取带有绿色荧光的噬斑于-70℃冻融3次后，10倍倍比稀释接种到预先铺好的Vero细胞六孔板中，继续挑取绿色荧光噬斑进行纯化，经过10轮的噬斑纯化，得到纯化的不含PRV-TK^-病毒的重组病毒rPRV-GFP-TK^-gE^-gI^-。

2.3TK/gE/gI缺失重组病毒中GFP标记基因的删除

将表达Cre酶的pBS185质粒(购买自addgene，Cre酶识别同源臂gEIA下游和gEIB上游的loxP位点，将两个loxp位点中间的序列删除)和重组病毒rPRV-GFP-TK^-gE^-gI^-基因组DNA共转染vero细胞，结果转染后24h出现比较明显的病变，而且单个荧光比较多。收获的P0代病毒倍比稀释后接种进行空斑筛选，挑取没有荧光的噬斑进行下一轮纯化。经过2轮筛选纯化，得到没有荧光的病毒，命名为vPRV-TK^-gE^-gI^-。提取纯化病毒基因组DNA，PCR鉴定表明TK、gE、gI基因均已经缺失，且GFP标记基因也已经删除。说明不含GFP标记基因的TK/gE/gI缺失病毒纯化成功。将缺失TK/gE/gI基因的病毒株命名为PRV HN1201TK^-/gE^-/gI^-株。

2.4PRV HN1201TK^-/gE^-/gI^-毒株缺失基因鉴定

提取TK/gE/gI缺失病毒和野生型病毒的病毒基因组，进行PCR鉴定，TK缺失鉴定引物同实施例2中的1.4；gE/gI基因缺失鉴定引物如下：

gEICF:tgcgtctacatcttcttccgcctgag

gEICR:caagtccgagtccgtgcccaca

野生型病毒扩增的PCR产物大小为3531bp,TK/gE/gI缺失病毒扩增的PCR片段大小为592bp，见图7。

实施例3PRV HN1201TK-/gE-/gI-/UL21-缺失毒株的制备

3.1PRV HN1201缺失UL21所需的GFP中间转移载体的构建

用实施例2制备PRV HN1201TK^-/gE^-/gI^-株。根据要缺失的UL21基因的序列，在其两端设计同源臂，分别为UL21A和UL21B。将UL21A和UL21B克隆到pUC19载体上，命名为pUCUL21AB。然后将GFP基因克隆至pUCUL21AB上，获得重组病毒转移载体，命名pUCUL21A-GFP-B。转移载体中同源臂为UL21两侧序列，所以重组后得到的重组病毒即为UL21基因缺失的。重组转移载体构建示意图见图1，图2为UL21A和UL21B同源臂在基因组上所在位置。

3.1.1、同源重组臂的扩增及克隆

3.1.1.1引物设计和模板制备

左侧同源臂UL21A的上下游引物分别为：

UL21AF:CCGGAATTCTCTCCCACAGCCAGACTCCC(下划线为EcoR I酶切位点)

右侧同源臂UL21B的上下游引物分别为：

UL21BR:CCCAAGCTTGGCGTTGAGGGAGCGGCGAT(下划线为Hind III酶切位点)

3.1.1.2同源臂UL21A、UL21B的扩增及克隆

利用TAKARA的PrimeSTAR进行PCR扩增UL21A、UL21B，体系及条件如下：

3.1.2标记基因GFP的扩增

3.1.2.1GFP载体pAcGFP-C1多克隆位点的去除

3.1.2.2GFP基因的扩增

根据pAcGFP-C1载体序列设计扩增GFP的引物：

上游引物

CMVU:ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG(下划线为SalI酶切位点)

下游引物

SV40R:ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC(下划线为Sph I酶切位点)

以质粒pAcGFPΔMCS为模板扩增GFP基因，体系及条件如下：

电泳回收目的条带进行下一步的连接。

3.1.3GFP标记基因与pUCUL21AB的连接

3.2含有GFP的重组病毒的获得

3.2.1转移载体和HN1201DNA共转染Vero细胞获得重组病毒

3.2.2重组病毒的噬斑纯化

3.3UL21缺失重组病毒中GFP标记基因的删除

将表达Cre酶的pBS185质粒(购买自addgene，Cre酶识别同源臂UL21A下游和UL21B上游的loxP位点，将两个loxp位点中间的序列删除)和重组病毒rPRV-GFP-UL21^-基因组DNA共转染vero细胞，结果转染后24h出现比较明显的病变，而且单个荧光比较多。收获的P0代病毒倍比稀释后接种进行空斑筛选，挑取没有荧光的噬斑进行下一轮纯化。经过2轮筛选纯化，得到没有荧光的病毒，命名为vPRV-UL21^-。提取纯化病毒基因组DNA，PCR鉴定表明UL21基因缺失，且GFP标记基因也已经删除。说明不含GFP标记基因的UL21缺失病毒纯化成功。将缺失TK/gE/gI/UL21基因的病毒株命名为PRV HN1201TK^-/gE^-/gI^-/UL21^-株。

实施例4、伪狂犬病毒基因缺失株的致病性试验

9日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪25头随机分成5组(A、B、C、D和空白对照组)，每组5头，分组和攻毒情况见表1。

表1、致病性试验动物分组

病毒接种后，每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况，具体结果见表2。

表2不同猪伪狂犬基因缺失株对9日龄仔猪的致病性

结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1201株可以导致9日龄仔猪100％死亡(5/5)而缺失UL21基因的PRV HN1201UL21^-株和缺失TK/gE/gI的PRV HN1201TK^-/gE^-/gI^-/株，都可以造成病毒的毒性降低，但仍有残留毒力，会造成发热等临床症状，而缺失TK/gE/gI/UL21基因的PRVHN1201株TK^-/gE^-/gI^-/UL21^-已完全没有毒性。

实施例5、猪伪狂犬病病毒基因缺失活疫苗的制备

5.1、疫苗病毒的增殖

将实施例1制备的RV HN1201UL21^-株、实施例2制备的PRVHN1201TK^-/gE^-/gI^-株和实施例3制备的PRV HN1201TK^-/gE^-/gI^-/UL21^-株的毒种5×10⁴倍稀释后接种已长成单层的ST细胞，吸附1h后，加入1000ml含2％胎牛血清的DMEM培养液，置37℃温室中转瓶培养，转速为6转/小时。待80％细胞病变后，反复冻融2次，收获病毒，测定病毒滴度。病毒液置低温保存。

5.2、保护剂的配制每100ml去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置高压蒸气灭菌(121℃30min)。

5.3、疫苗病毒混悬液的配比

将5.1中制备并保存的病毒液与5.2中制备的保护剂保护剂按1:1(体积比)混合，分装至灭菌的青瓶中，每瓶装量2.6ml。冻干。检验疫苗无细菌及外源病毒污染，与冻干前病毒含量基本一致。将实施例1制备的RV HN1201UL21^-株批号为20140101，实施例2制备的PRV HN1201TK^-/gE^-/gI^-株批号为20140202，实施例3制备的PRV HN1201TK^-/gE^-/gI^-/UL21^-株批号为20140303。

实施例6、猪伪狂犬病病毒基因缺失活疫苗的免疫原性实验

将9日龄的PRV抗原抗体阴性仔猪25头随机分成5组，5头/组，按照表3接种实施例5制备的疫苗，对照疫苗采用西班牙海博莱生物大药厂的猪伪狂犬活疫苗(Bartha K-61株)批号为42RH，按照说明书用量使用，对照组接种DMEM培养基1ml/头。免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为HN1201株猪伪狂犬病病毒1×10^7.0TCID₅₀/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况(结果见表3)，攻毒前分别对试验组和对照组仔猪采血。

表3免疫原性试验动物分组

组别	注射疫苗	免疫剂量
			I组	20140101批	肌注接种1ml10^6.0TCID₅₀/头
II组	20140202批	肌注接种1ml10^6.0TCID₅₀/头
			III组	20140303批	肌注接种1ml10^6.0TCID₅₀/头
对照疫苗组	猪伪狂犬病病毒活疫苗	肌注接种2ml10^6.0TCID₅₀/头
			空白对照组	DMEM培养基	肌注接种1ml/头

疫苗免疫后，每周参照GB/T18641-2002方法中血清中和试验的方法测定中和抗体效价，结果见表4。

表4猪伪狂犬基因缺失活疫苗免疫仔猪后不同时间的抗体情况

表4的结果显示，猪伪狂犬基因缺失活疫苗免疫仔猪后，能产生较高的中和抗体，且随免疫时间逐渐升高。

免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病毒HN1201株1×10^7.0TCID₅₀/头，1ml/头，观察临床症状和死亡情况见表5，攻毒后每日测定仔猪体温并观察临床症状。

表5猪伪狂犬活疫苗免疫仔猪后的攻毒情况及临床情况

表4和表5的结果显示，猪伪狂犬基因缺失疫苗免疫仔猪后，可以阻断病毒感染(出现临床症状)，能为仔猪提供100％(5/5)保护，而对照仔猪攻毒后5日后全部死亡，因此，猪伪狂犬活疫苗具有很好的保护力。而III组效果相对于对照组活疫苗,以及I组和II组，完全没有临床症状，显示出很好的免疫保护和安全性。

实施例7NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD、HN1202株伪狂犬病毒变异株的基因缺失株的构建

分别以NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株(Xiuling Yu,Zhi Zhou,Dongmei Hu,et al.Pathogenic PseudorabiesVirus,China,2012EmergingInfectious Diseases，www.cdc.gov/eid ol.20,No.1,January2014)(申请人承诺按照专利审查指南规定，自专利申请日起向公众发放20年)，HN1202株(藏号为CCTCC NO.V201335)；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年8月26日)为亲本毒株，参照实施例2、3的方法缺失TK/gE/gI以及UL21基因，制备的弱毒株名称分别为NVDC-PRV-BJ TK^-/gE^-/gI^-/UL21^-株，NVDCPRV-HEB TK^-/gE^-/gI^-/UL21^-株、NVDC-PRV-SDTK^-/gE^-/gI^-/UL21^-株，和PRVHN1202TK^-/gE^-/gI^-/UL21^-株，经PCR跟亲本毒株对比证明基因缺失。

实施例8NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD、HN1202株伪狂犬病毒变异株弱毒株疫苗组合物的制备

按照实施例5.1方法增殖实施例7制备的各弱毒疫苗株，按照体积比1:1比例加入保护剂(每100ml去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置高压蒸气灭菌(121℃30min)后冻干，NVDC-PRV-BJTK^-/gE^-/gI^-/UL21^-株批号为Q01，NVDCPRV-HEB TK^-/gE^-/gI^-/UL21^-株批号为Q02，NVDC-PRV-SDTK^-/gE^-/gI^-/UL21^-株批号为Q03,PRVHN1202TK^-/gE^-/gI^-/UL21^-株批号为Q04。

实施例9、实施例7制备毒株的致病性试验

按照实施例6的方法进行毒性试验，实验猪共分为5组，每组5头，分别滴鼻接种实施例7制备的NVDC-PRV-BJ TK^-/gE^-/gI^-/UL21^-株，NVDCPRV-HEB TK^-/gE^-/gI^-/UL21^-株、NVDC-PRV-SDTK^-/gE^-/gI^-/UL21^-株，和PRVHN1202TK^-/gE^-/gI^-/UL21^-株的进行试验各组均滴鼻接种1ml(10^7.0TCID₅₀/ml),，结果显示各组猪均存活，体温正常，无临床症状。证明通过缺失TK/gE/gI/UL21基因减低了变异伪狂犬毒株的毒性。

实施例10、实施例8制备疫苗的免疫原性试验

按照实施例6的试验方法以及接种量对实施例8制备的疫苗进行免疫原性试验，同时接种对照疫苗猪伪狂犬活疫苗HB-98株批号1308011-1(中牧实业股份有限公司成都药械厂)，免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株1×10^7.0TCID₅₀/头，观察临床症状和死亡情况，攻毒后每日测定仔猪体温并观察临床症状，结果见表6。

表6猪伪狂犬活疫苗免疫仔猪后的攻毒情况及临床情况

表6的结果显示，猪伪狂犬疫苗免疫仔猪后，可以阻断病毒感染(出现临床症状)，能为仔猪提供100％(5/5)保护，疫苗对照组仅能提供80％(4/5)的保护，而对照仔猪攻毒后3日后全部死亡，因此，猪伪狂犬活疫苗具有很好的保护力。另外相对于现有技术的活疫苗，基本没有临床症状，显示出很好的免疫保护

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种猪伪狂犬病毒弱毒株，其中，所述猪伪狂犬病毒弱毒株为缺失UL21基因的猪伪狂犬病毒株，优选地，所述伪狂犬病毒株为伪狂犬变异株。

2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒弱毒株，其中，所述伪狂犬变异株为gE蛋白序列为SEQ ID NO.07或与其序列同源性为95％以上的的毒株；优选地，所述的猪伪狂犬变异株为经分离的所述猪伪狂犬病毒变异株当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中基因缺失伪狂犬弱毒疫苗后依然会造成猪出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝症状的毒株；更优选地，所述的猪伪狂犬变异株为当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中缺失gE、TK和gI基因中的一个及一个以上基因的伪狂犬弱毒疫苗后依然感染猪伪狂犬病并具备具有使9-10日龄仔猪精神沉郁和食欲下降的毒株。

3.根据权利要求1～2任一项所述的猪伪狂犬病毒弱毒株，其中，所述猪伪狂犬病毒弱毒株基因组中整个UL21蛋白的ORF缺失。

4.根据权利要求3所述的猪伪狂犬病毒弱毒株，其中，所述的猪伪狂犬病毒弱毒株进一步缺失TK、gE、gI基因中的一个或多个。

5.一种猪伪狂犬病毒弱毒株，其中，所述的猪伪狂犬病毒弱毒株包括缺失UL21、TK、gE、gI基因的HN1201株、HN1202株、JS-2012株、猪伪狂犬HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株或NVDC-PRV-SD株。

6.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求1～5任一项所述的猪伪狂犬病毒弱毒株抗原和载体。

7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述猪伪狂犬病毒弱毒株抗原为活的猪伪狂犬病毒弱毒株；所述疫苗组合物进一步包括冻干保护剂。

8.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在所述疫苗进一步含有失活病原体或抗原组合，优选地所述抗原为猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒和/或副猪嗜血杆菌或支原体。

9.权利要求6～7任一项所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪伪狂犬病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述的猪伪狂犬病是由权利要求3所述的猪伪狂犬病毒株变异株导致的猪伪狂犬病。