CN104328090B - 一种猪伪狂犬病病毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括免疫量的猪伪狂犬病病毒抗原和兽医学上接受的佐剂。该疫苗组合物可以在猪、犬体内诱导有效的免疫反应，且免疫该疫苗组合物的仔猪体温升高时间更短，食欲基本正常，并且基本没有临床症状，显示出很好的免疫保护。

Description

一种猪伪狂犬病病毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种疫苗组合物，属于动物病毒学领域。

背景技术

伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科（Herpesviridae）α亚科中的猪疱疹病毒Ⅰ型（Suid herpesvirus1strain）所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻痹，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜伏感染特性，在外周神经系统可以长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒，被潜伏感染的宿主就会发病。

研究表明亚单位疫苗能够给免疫动物提供相应的保护，亚单位疫苗是利用基因工程方法将病原保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫苗。目前发现伪狂犬病毒糖蛋白中的gB、gC、gD均能使机体产生中和抗体，这些抗体无论是在体内、体外，还是在有无补体存在的情况下都有中和PRV的能力。“伪狂犬病亚单位疫苗研究进展”（杨承槐，娄高明，谌南辉《江西畜牧兽医杂志》2004年第3期)公开了在伪狂犬病病毒目前已发现的11种糖蛋白中，gB、gC、gD均能诱导机体产生中和抗体。在没有补体的参与下，gB、gC、gD的单克隆抗体能中和PRV。猪和小鼠注射抗gB、gC、gD的单克隆抗体均能抵抗PRV强毒的攻击。因此，gB、gC、gD是研制PRV亚单位疫苗的首选蛋白。糖蛋白gD是一种重要的中和抗原，也是保护性抗体的主要目标，能诱导较好的保护反应。US6858385和US6521231公开了利用猪伪狂犬病病毒gD蛋白可以制备疫苗用于猪伪狂犬病的预防。

猪PRV只有一个血清型，通常认为毒株的交叉保护力很强，但目前仍存在仔猪注射商品化疫苗后发生典型猪伪狂犬病，例如长时间体温升高，精神沉郁，食欲减退，出现呼吸道和/或神经症状。

伴随着伪狂犬毒株的变异，犬感染伪狂犬病毒引起的发病和死亡屡有发生，例如刘蕾等人在“关注伪狂犬病患犬，它就在你面前，中国畜牧兽医学会小动物医学分会第六次学术研讨会暨兽医外科学分会第十八次学术研讨会论文集第一部分，小动物医学文集，56-59，2011。”报道了犬因为食用患伪狂犬的猪肉而发生伪狂犬病，并且利用PCR方法从犬脑组织中扩增出了PRV基因片段。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种猪伪狂犬病病毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒株具有序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的gD糖蛋白。

本发明术语“gD糖蛋白”，是猪伪狂犬病病毒进行感染必需的结构蛋白，是成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也称为gp50蛋白。

本发明术语“同源性”在本申请中是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计算得到，例如，可以将目标氨基酸(或核苷酸)序列与参比氨基酸(或核苷酸)序列进行序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸(或核苷酸)数目达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸(或核苷酸)序列之间相同氨基酸(或核苷酸)的百分比。氨基酸(或核苷酸)序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现，例如，但不限于，BLAST软件(在美国国立生物技术信息中心(NCBI)的网址上可获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者见，例如，Altschul S.F.et al，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；Stephen F.et al，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))，ClustalW2软件(在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://www.eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/，另见，例如，Higgins D.G.et al，Methods in Enzymology，266：383-402(1996)；Larkin M.A.et al，Bioinformatics(Oxford，England)，23(21)：2947-8(2007))；和TCoffee软件等(在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得：http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例如，Poirot O.et al，NucleicAcids Res.，31(13)：3503-6(2003)；Notredame C.etal，J.Mol.Boil.，302(1)：205-17(2000))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。

“编码序列”在本申请中是指一种DNA序列，其能够被转录得到相应的RNA序列。

本发明的主要目的在于提供一种猪伪狂犬病病毒株，所述猪伪狂犬病病毒株基因组包含编码SEQ.NO.1的gD蛋白的基因。

本发明的另一目的在于提供一种猪伪狂犬病毒HN1202株（Pseudorabies virus，strain HN1202），所述猪伪狂犬病毒株保藏号为V201335，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年8月26日。

所述猪伪狂犬病毒HN1202株（Pseudorabies virus，strain HN1202）保藏号为CCTCC NO.V201335；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉市·武汉大学，保藏日期为2013年8月26日。

本发明提供了一种DNA序列，所述DNA序列实质上编码SEQ.NO.1的gD蛋白。

本发明的再一目的在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的所述的猪伪狂犬病病毒抗原和兽医学上接受的佐剂。

优选地，所述猪伪狂犬病病毒抗原为所述猪伪狂犬病病毒或其培养物的减毒全病毒抗原、灭活全病毒抗原、亚单位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原。

优选地，所述猪伪狂犬病病毒抗原为含有序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的gD糖蛋白毒株的抗原。

所述术语“培养物”是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员 知晓不同代次之间其基因序列仅可能会发生微小的变异，优选地，所述培养物是5-35代以内的培养物。

本发明所用的术语“活疫苗”指的是以毒力已经减弱但仍可在宿主体内或细胞上复制的病毒制备的疫苗。本发明所用的术语“减毒”用于指以使病原丧失致病性、但保持免疫原性的方式对基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV辐射、化学处理或体外连续高阶继代培养实现减毒。人工的基因改变，例如将已知序列中的特定核苷酸缺失以使毒力减弱。

所用的术语“灭活疫苗”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。

术语“亚单位疫苗”指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫苗。它比全病毒疫苗引起副反应的可能性小。例如，表达的猪伪狂犬病病毒的gD蛋白可用于制备亚单位疫苗。

术语“合成肽疫苗”指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽,即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽,与载体连接后加佐剂所制成的疫苗。

更优选地，所述猪伪狂犬病病毒抗原为所述猪伪狂犬病病毒HN1202株或其培养物的减毒全病毒抗原、灭活全病毒抗原、亚单位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原；优选地，所述培养物为培养5-35代以内的培养物。

进一步优选地，所述猪伪狂犬病病毒抗原为所述猪伪狂犬病病毒HN1202株或其培养物的灭活全病毒抗原或gD重组蛋白抗原。

本发明的疫苗组合物可以包含所述猪伪狂犬病病毒或其抗原作为活性成分。用于疫苗的组合物的猪伪狂犬病病毒具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列或与其共有98%以上同源性的氨基酸序列表示的gD糖蛋白。

用于本发明的抗原是指病毒组分的抗原部分，它引起免疫应答，并可包含具有SEQID NO.1的氨基酸序列。

优选地，所述猪伪狂犬病病毒或其培养物含量为≥10^6.0TCID₅₀/ml。

优选地，所述疫苗组合物包括≥10^6.0TCID₅₀/ml的猪伪狂犬病病毒株HN1202株或其培养物灭活疫苗。

优选地，本发明的疫苗组合物可包含每头份10^6.0TCID₅₀量的猪伪狂犬病病毒。当猪伪狂犬病病毒以少于10^6.0TCID₅₀的量使用时，疫苗不能有效刺激抗体产生。另一方面，超过的量可能是不经济的。

此外，本发明的猪伪狂犬疫苗可与其他失活病原体或抗原组合使用以制备抵抗包括猪伪狂犬病的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。本发明所用的术语“联合疫苗”指利用本发明的猪伪狂犬病病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。术语“复合疫苗”指的是从病毒和细菌制备的疫苗。例如，本发明的猪伪狂犬病毒可与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒和/或副猪嗜血杆菌、支原体混合或组合。

优选地，所述疫苗组合物进一步包括介质、佐剂、赋形剂。

本发明的疫苗组合物还可包含介质、佐剂和/或赋形剂。生理盐水或蒸馏水可用作介质。用于疫苗组合物的佐剂的例子包括弗氏的不完全佐剂或完全佐剂、氢氧化铝凝胶、植物油或矿物油等。赋形剂的例子包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾，但不限于此。在实践中，本领域技术人员已知的用于疫苗制备的所有物质均可适用于本发明的疫苗组合物。

本发明的又一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：（1）培养增殖所述猪伪狂犬病病毒；（2）灭活所述增殖的猪伪狂犬病病毒；（3）加入佐剂，乳化。

具体地，所述方法为：(1)将猪伪狂犬病病毒疫苗株接种于易感细胞，并培养所述接种后的易感细胞；收获细胞培养物；

(2)用甲醛溶液、BPL(β-丙内酯)或BEI(二乙烯亚胺)处理来自步骤（1）的病毒；

所述易感细胞可以是传代细胞系，也可以是原代细胞。适合于猪伪狂犬病病毒的易感细胞包括但不限于，ST细胞系(ATCC编号： CRL-1746)、PK-15细胞系(ATCC编号：CCL-33)、非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞系(ATCC编号：CRL-12219)、牛肾细胞MDBK细胞系(ATCC编号：CCL-22)、牛睾丸传代细胞BT细胞系(ATCC编号：CRL-1390)、Vero细胞系(ATCC编号：CCL-81)、BHK-21细胞系(ATCC编号：CCL-10)、猪肾传代细胞系(如：IBRS-2，见例如，DECASTRO，M.P.1964.Behavior offoot and mouth disease virus in cell culture：susceptibility of the IB-RS-2swine cell line.Arquivos Instituto Biologica31：63-78)、兔肾传代细胞系(RK，如：ATCC编号：CCL-106)等传代细胞系，或者鸡胚成纤维细胞和猪肾细胞等原代细胞。原代细胞可以通过本领域公知的方法，用动物体内的组织进行分离和制备。

本发明的提供了一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：（1）表达所述猪伪狂犬病病毒gD抗原；（2）加入佐剂，乳化。

可将根据本发明的疫苗组合物制备成口服剂型或非口服剂型。优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。

本发明的还一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗伪狂犬病病毒相关疾病的药物中的应用。

本文所用的术语“猪伪狂犬病病毒相关疾病”用于指由猪伪狂犬病病毒感染引起的疾病。它的例子包括发病仔猪表现出明显的神经症状、昏睡、呜叫、呕吐、拉稀、体温升高，一旦发病，怀孕母猪可发生流产、产木乃伊胎儿或死胎或繁殖障碍，但不限于此。

本文所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪伪狂犬感染或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪伪狂犬病病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。

附图说明

图1为HN1202株gD抗原氨基酸序列与猪伪狂犬病毒Bartha K-61株gD抗原氨基酸序列同源分析结果。

序列表中：

序列1为猪伪狂犬病病毒HN1202株gD蛋白氨基酸序列；

序列2为猪伪狂犬病病毒HN1202株gD基因核苷酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明中的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量。

本发明中所述的“TCID₅₀”（50%tissue culture infective dose）是指半数细胞培养物感染量，是表示病毒感染力的一种表示方式。

MEM液体培养基（液）用购自美国Life Technologies公司的MEM干粉培养基按照其说明书配制。

本发明的DMEM培养基参照GB/T18641-2002附录A配制方法配制。

本发明中所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline）的英文缩写，本发明中使用的是0.01mM的pH7.4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。

实施例1、病毒的采集分离

从来自河南的疑似猪伪狂犬感染的样本中分离样本无菌采集猪脑组织，以1∶10（体积比）加入MEM培养液，研磨，制备组织悬液，经反复3次冻融后，2000r/min离心15min，收集上清液，再经0.2μm滤膜滤器过滤，在PK-15细胞上接种37℃培养1h，换加含2％犊牛血清的MEM培养液，37℃培养5日。收获含毒培养液，经2次冻融后，收毒，换加含2％犊牛血清的MEM培养液。采用猪伪狂犬病病毒PCR检测试剂盒(北京世纪元亨动物防疫技术有限公司）检测猪伪狂犬病病毒，结果为阳性；对分离的病毒利用利用PCR试剂盒进行外源病毒的检测(猪蓝 耳病病毒RT-PCR检测试剂盒、猪细小病毒PCR检测试剂盒猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒均为北京世纪元亨动物防疫技术有限公产品），PCR检测结果均为阴性，表明毒种纯净。

将分离到的伪狂犬病毒提交保藏，所述猪伪狂犬病毒株为HN1202株（Pseudorabies virus，strain HN1202），保藏号为CCTCC NO.V201335；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年8月26日。

实施例2、分离病毒的遗传特性

通过基因分析来确定实施例1中分离的病毒的遗传特性。利用在PK15细胞上分离的猪伪狂犬病病毒基因组DNA做模板，使用表1所示的引物进行PCR。分别使用PrimerPremier5.0来设计用于扩增gD基因的引物序列。

以提取的基因组DNA为模板，制备PCR扩增体系如下：模板DNA100μg，PrimerSTARHS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl，2×PrimerSTARGC Buffer25μl，上下游引物各1μl（10pmol/μl），dNTP Mix（2.5mM each）4μl，并用蒸馏水将体积补足50μl。进行两步PCR反应：在98℃变性10sec，然后在68℃退火和延伸1min15sec，共30个循环。在4℃终止PCR反应。通过在含有溴化乙锭的1%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析所得的PCR产物。PCR产物进行序列测定。用Lasergene软件分析所得到的序列数据。

表1PCR引物序列

实施例3、病毒的致病性试验

3.1不同日龄仔猪的致病性

将34～35日龄猪伪狂犬病抗体阴性仔猪6头随机分成2组，5头/组（试验组）和2头/组（对照组），滴鼻接种猪伪狂犬病病毒HN1202株 （攻毒剂量为2×10^8.0TCID₅₀/头），对照组接种DMEM培养基；病毒接种后，每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况，具体结果见表2。

表2猪伪狂犬强毒HN1202株对不同日龄仔猪的致病性

结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1202株接种35日龄的仔猪均可导致仔猪发病，且可导致3/5的仔猪死亡。

实施例4、猪伪狂犬病病毒病灭活苗的制备

将按照表3将所分离的毒株的不同代次的培养物接种于PK-15细胞培养物先形成种子批，然后按病毒培养液量的1％（V/V)接入形成单层的PK细胞培养物中，置37℃旋转培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收毒，测定毒价。分别向不同代次病毒液中加入10%（v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(V/V)，37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活后病毒液用PH7.4的PBS液稀释至表3所示的病毒含量然后与206佐剂（法国SEPPIC公司产品）按照体积比54:46混合，在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟。

表3各组别猪伪狂犬疫苗的制备

实施例5、猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备

1.PRV gD基因的扩增

在生长良好的PK15细胞上接种PRV HN1202病毒，病毒收获后用TAKARA公司MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取PRV基因组DNA。取1μl基因组DNA作为模板，利用gD特异性引物：

gDSF:5′ATGCTGCTCGCAGCGCTATTGGC3′和gDSR:5′CTACGGACCGGGCTGCG CTTTTAG3′

进行PCR扩增，利用TAKARA的高保真酶 HS DNAPolymerase withGC Buffer，扩增条件为：94℃3min；94℃30s，68℃90s，30cycles；72℃5min。。PCR产物命名为gD。其核苷酸序列见SEQNO.2，推导其氨基酸序列为SEQNO.1。

2.重组Bacmid的获取及鉴定

将高保真酶扩增获得的PCR产物gD克隆至pFastBac/HBM-TOPO载体（购自Invitrogen公司，货号A11339），克隆体系如下：PCR产物gD4μl，Salt solution(盐溶液）1μl，TOPO vector1μl，共6μl。混合均匀，室温孵育5min，转化One ShotR Mach1^TMT1R感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板，挑取单克隆鉴定gD基因的插入方向，插入方向正确的质粒送Invitrogen公司测序，鉴定gD序列的正确性。测序正确的质粒命名为pFastBac/HBM-TOPO-gD。

pFastBac/HBM-TOPO-gD质粒转化DH10Bac感受态细胞（来源），pFastBac/HBM-TOPO-gD和感受态细胞中的穿梭质粒Bacmid进行转座，用Invitrogen的PureLink HiPurePlasmid DNA Miniprep Kit提取获得的 重组质粒，并用pUCM13Forward/pUCM13Reverse引物鉴定gD的插入，阳性Bacmid命名为Bacmid-gD。

3.转染获得重组杆状病毒

按照Invitrogen公司Bac-to-Bac HBM TOPO Secreted ExpressionSystem的说明书提供的方法进行。6孔板每孔铺8×10⁵个sf9细胞，待细胞贴壁后按照CellfectinⅡ转染试剂的说明书进行转染：分别加入8μlCellfectinⅡ和1μg Bacmid-gD DNA到100ul SF-900Ⅱ培养基中，Vortex混匀，混合稀释后的DNA与稀释后的Cellfectin(总体积～210μl),混合均匀室温孵育15～30min，一滴滴加到细胞中。转染后72h待出现细胞病变后，收集细胞培养上清，记为P0代重组病毒vBac-gD。P0代重组病毒vBac-gD感染sf9细胞，经3代扩大培养后，获得的P3代vBac-gD用于重组蛋白表达。

4.重组杆状病毒感染High-five细胞获得重组蛋白

将P3代重组杆状病毒vBac-gD接种High-five细胞（购自Invitrogen，货号B85502）。在500ml三角瓶中悬浮培养High-five细胞，至细胞密度达到7.0×10⁵cell/ml后，按照1MOI的量接种病毒，感染后72h收取细胞培养上清。利用Millipore的切向流过滤系统将体积浓缩为原来体积的1/5。用1%（体积比）的Triton X-100（购自sigma）灭活杆状病毒，SDS-PAGE光密度法测定蛋白含量为200μg/ml，将抗原用PBS液（pH7.4）稀释至终浓度为50μg/ml的与206佐剂（法国SEPPIC公司产品）按照体积比54:46混合，在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟即得到亚单位疫苗。

实施例6、疫苗对猪的免疫原性实验

将21日龄PRV抗体阴性仔猪20头随机分成5组，4头/组，按照表4的疫苗和剂量注射疫苗，疫苗为实施例4制备的疫苗A、B，剂量为2ml/头；和实施例5制备的亚单位疫苗，剂量为2ml/头，对照疫苗采用猪伪狂犬病活疫苗Bartha K-61株（批号：42LH，西班牙海博莱生物大药厂生产）。对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为 HN1201株（保藏号为CCTCC NO.V201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为湖北省武汉市·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日）猪伪狂犬病病毒2×10^8.0TCID₅₀/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况（结果见表4）

表4免疫原性试验动物分组

疫苗免疫后，每周参照GB/T18641-2002方法血清中和试验的方法测定灭活疫苗组和对照疫苗组的中和抗体效价，结果见表5

表5猪伪狂犬灭活疫苗免疫仔猪后不同时间的抗体情况

表4的结果显示，猪伪狂犬灭活疫苗免疫仔猪后，能产生较对照疫苗更高的中和抗体，且随免疫时间逐渐升高。

免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株(2×10^8.0TCID₅₀/头），观察临床症状和死亡情况见表6，攻毒后每日测定仔猪体温见表7。

表6猪伪狂犬灭活疫苗免疫仔猪后的攻毒情况

表7猪伪狂犬疫苗免疫的仔猪攻毒后仔猪体温变化

天数	灭活苗A组	灭活苗B组	疫苗对照组	亚单位疫苗组
					攻毒后1天	39.4	39.6	39.4	39.6
攻毒后2天	40.2	41.6	41.8	41.6
					攻毒后3天	40.5	40.3	41.2	40.3
攻毒后4天	40.2	39.7	41.6	39.7
					攻毒后5天	39.5	39.5	41.3	39.2
攻毒后6天	39.6	39.2	41.3	39.4
					攻毒后7天	39.7	39.5	41.4	39.3
攻毒后8天	39.5	39.7	41.2	39.7
					攻毒后9天	39.6	39.4	41.5	39.4
攻毒后10天	39.2	39.3	40.6	39.5
					攻毒后11天	39.3	39.4	39.7	39.5
攻毒后12天	39.4	39.5	39.8	39.5
					攻毒后13天	39.3	39.4	39.7	39.4
攻毒后14天	39.2	39.1	39.4	39.1

表6和表7的结果显示，猪伪狂犬灭活疫苗和亚单位疫苗免疫仔猪后，虽然不能阻断病毒感染（出现临床症状），但能为仔猪提供100%（4/4）保护，而对照仔猪攻毒后4日后全部死亡，因此，猪伪狂犬灭活疫苗具有很好的保护力。另外相对于对照组活疫苗，灭活疫苗免疫组的仔猪体温升高时间更短，食欲基本正常，并且基本没有临床症状，显示出很好的免疫保护。

实施例7、疫苗对犬的免疫原性试验：

本实施例所使用的疫苗有：实施例4制备的疫苗A、实施例5制备的亚单位疫苗。

1、动物分组：

犬场中随机选取1周岁以下的犬30只、1周岁以上的比格犬各30只，随机分成3组，10只/组，第一组为接种猪伪狂犬病灭活疫苗A的免疫组，第二组为接种猪伪狂犬病亚单位疫苗的免疫组，另一组为未接种疫苗的对照组；

2、疫苗接种：

1)1周岁以下犬的免疫接种：取实施例4制备的灭活疫苗A、实施例5制备的亚单位疫苗，0.25ml/只，对照组犬皮下接种无菌生理盐水1ml/只。

2)1周岁以上犬的免疫接种：实施例4制备的灭活疫苗A、实施例5制备的亚单位疫苗，0.5ml/只，对照组犬皮下接种无菌生理盐水1ml/只，对照组犬皮下接种无菌生理盐水1ml/只。

3)疫苗接种后每天观察试验犬的临床症状。

3、免疫效果的检测：

免疫后3周，将试验犬隔离饲养，一周岁以上和一周岁以下均滴鼻接种猪伪狂犬病病毒HN1202株（攻毒剂量均为1×10^8.0TCID₅₀/头），对照组接种DMEM培养基，然后正常饲养，每天观察犬的临床症状和死亡情况，连续观察7天。

4、结果：

1)将制成抗犬伪狂犬病疫苗组合物作为疫苗对犬类进行接种后，接种疫苗的犬仅2只出现了体温升高，食欲降低的犬，且这2只犬均为1周岁以下的犬，2天后即恢复正常。其余犬只的临床表现均正常，表明该疫苗对犬是安全的。

2)免疫效果：免疫后3周，攻毒后对照组后3-4天发病，发病后36小时内死亡；免疫组犬没有死亡，均键活，表明猪伪狂犬灭活疫苗、亚单位疫苗可以在犬体内诱导有效的免疫反应。结果详见表8。

表8：试验犬临床表现记录表

从上述实施例可以看出，将用猪伪狂犬病疫苗制成的抗犬伪狂犬病药物组合物作为疫苗接种于犬类，既未出现犬类死亡，又能达到有效预防该病的效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种猪伪狂犬病病毒株，所述猪伪狂犬病病毒株基因组包含编码如SEQ.NO.1所示的gD蛋白的基因。

2.一种猪伪狂犬病病毒株HN1202，所述猪伪狂犬病病毒株保藏号为CCTCCNO.V201335，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年8月26日。

3.一种DNA序列，所述DNA序列编码如SEQ.NO.1所示的gD蛋白。

4.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒株的抗原和兽医学上接受的佐剂；其中，所述猪伪狂犬病病毒株的抗原为灭活全病毒抗原或gD蛋白亚单位抗原、gD蛋白合成肽抗原。

5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述猪伪狂犬病病毒株的抗原为猪伪狂犬病病毒HN1202株或其培养物的灭活全病毒抗原、gD蛋白亚单位抗原、或gD蛋白合成肽抗原，所述猪伪狂犬病病毒HN1202株保藏号为CCTCC NO.V201335。

6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述猪伪狂犬病病毒HN1202株培养物为培养从5代至35代任一代的培养物。

7.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述猪伪狂犬病病毒或其培养物含量为≥10^6.0TCID₅₀/ml。

8.一种制备权利要求4所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：

(1)培养增殖所述猪伪狂犬病病毒；

(2)灭活所述增殖的猪伪狂犬病病毒；

(3)加入佐剂，乳化。

9.根据权利要求4～7所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗伪狂犬病的药物中的应用。