CN102727882B - 猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、伪狂犬病的三联活疫苗及其制备方法 - Google Patents
猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、伪狂犬病的三联活疫苗及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种预防猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟和伪狂犬病的三联疫苗组合物及其制备方法和用途。本发明提供的三联苗中的三种疫苗株之间无免疫抑制，从安全性、免疫原性、免疫持续期及免疫保护效果方面相比，与各单苗之间无差别；从免疫的方便性上比较，本发明提供的三联苗比各单苗使用方便，只需免疫一次，就可以预防三种疾病，减轻了免疫接种工作量，亦减少了对猪群的应激，避免了因频繁免疫所造成的免疫麻痹和免疫失败，从而起到预防猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、和伪狂犬病的效果。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，更具体是涉及一种制备猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、伪狂犬病三联疫苗及其制备方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine productive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的猪的一种高度传染病，该病主要侵害繁殖系统，以发热、厌食、流产、木乃伊胎、死胎、弱仔以及仔猪的呼吸症状和高死亡率为特征的高度传染性病毒病。目前该病在世界各养猪国家均流行，在中国的流行和分布也越来越广泛，危害也日益严重。
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(PRvirus，PRV)引起多种家畜和野生动物的一种重要传染病。猪是PRV的唯一自然宿主，临床以仔猪的神经症状，严重的呼吸道疾病以及母猪发生流产、死胎和产仔数下降等症状为特征，耐过猪增重减慢。我国自1947年首次发现本病，现至少有18个省、市、自治区(包括台湾和香港)都有本病的发生，给畜牧业特别是养猪业造成了巨大的经济损失。
猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的一种以稽留高热、出血和高死亡率为主要特征的高度接触性传染病，本病主要通过消化道、呼吸道、黏膜和伤口进行水平传播，也可通过胎盘进行垂直传播，各个日龄的猪均可感染发病，是严重威胁养猪业的烈性传染病。
这三种病是危害我国养猪业发展的十分重要的传染病。我国主要采取疫苗免疫的方法来预防这三种烈性传染病的暴发与流行。目前，市场上有许多种类的猪用单苗，但是它们均存在免疫程序繁琐，成本高，费时费力等缺点，直接影响了这三种疾病的预防效果。另外，由于猪繁殖与呼吸综合征病毒会降低猪的免疫力(如，通过破坏肺泡巨噬细胞的正常功能)并引发免疫抑制(见，例如，庞海洋等，第三届猪病防控学术研讨会会议论文集，第262-265页，2008年)，所以，即使将猪繁殖与呼吸综合征疫苗与其他疫苗联合免疫，也难以实现与单苗免疫相当的效果。因此，本领域迫切需要一种技术方案，提高对猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病和猪瘟的免疫效果，同时简化单苗多次免疫的繁琐的程序。
发明内容
在一方面，本发明提供了一种疫苗组合物，其含有猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗、猪瘟疫苗与猪伪狂犬疫苗。在某些实施方式中，所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗、猪瘟疫苗与猪伪狂犬疫苗之间基本上无免疫抑制。
在某些实施方式中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗、所述猪瘟疫苗及所述伪狂犬病疫苗的混合比例为1∶4∶1。
在某些实施方式中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗含有Nsp1核苷酸序列，所述序列的编码序列与SEQ ID NO：1具有至少90％的同源性。在某些实施方式中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗进一步含有Nsp2核苷酸序列，所述Nsp2核苷酸的编码序列与SEQ ID NO：2具有至少90％的同源性。
在某些实施方式中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗含有由SEQ ID NO：1编码的Nsp1核苷酸序列，且含有由SEQ ID NO：2编码的Nsp2核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗含有猪繁殖与呼吸综合征病毒的核苷酸序列，该序列的编码序列与SEQ ID NO：3具有至少90％的同源性。
在某些实施方式中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗含有猪繁殖与呼吸综合征病毒的核苷酸序列，该序列由SEQ ID NO：3编码。
在某些实施方式中，所述猪瘟疫苗的编码序列与SEQ ID NO：9具有至少80％的同源性。在某些实施方式中，所述猪瘟疫苗的编码序列如SEQ ID NO：9所示。
在某些实施方式中，所述伪狂犬病疫苗编码序列与NCBI参考号NC_006151的核苷酸序列至少具有80％的同源性。在某些实施方式中，所述伪狂犬病疫苗编码序列如NCBI参考号NC_006151的核苷酸序列所示。
在另一方面，本发明提供了一种制备所述疫苗组合物的方法，以及用该方法制备得到的疫苗组合物，其含有猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗、猪瘟疫苗和猪伪狂犬疫苗。
本发明还提供了所述疫苗组合物在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟与猪伪狂犬病的生物制品中的用途。
本发明还提供了一种免疫猪的方法，包括对猪施用本发明所述的疫苗组合物。
附图说明
图1为高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟及伪狂犬病三联活疫苗2-8℃保存期试验中，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的滴定结果。031-01、031-02和031-03分别代表三个批次的三联活疫苗。031-04、031-05和031-06分别代表三个批次的PRRSV TJM株活疫苗的单苗。
图2为高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟及伪狂犬病三联活疫苗2-8℃保存期试验中，猪瘟病毒的滴定结果。031-01、031-02和031-03分别代表三个批次的三联活疫苗。031-07、031-08和031-09分别代表三个批次的猪瘟病毒C株活疫苗的单苗。
图3为高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟及伪狂犬病三联活疫苗2-8℃保存期试验中，伪狂犬病毒的滴定结果。031-01、031-02和031-03分别代表三个批次的三联活疫苗。031-10、031-11和031-12分别代表三个批次的伪狂犬病毒Bartha K61株活疫苗的单苗。
图4为高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟及伪狂犬病三联活疫苗37℃耐老化试验中，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的滴定结果。031-01、031-02和031-03分别代表三个批次的三联活疫苗。031-04、031-05和031-06分别代表三个批次的PRRSV TJM株活疫苗的单苗。
图5为高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟及伪狂犬病三联活疫苗37℃耐老化试验中，猪瘟病毒的滴定结果。031-01、031-02和031-03分别代表三个批次的三联活疫苗。031-07、031-08和031-09分别代表三个批次的猪瘟病毒C株活疫苗的单苗。
图6为高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟及伪狂犬病三联活疫苗37℃耐老化试验中，伪狂犬病毒的滴定结果。031-01、031-02和031-03分别代表三个批次的三联活疫苗。031-10、031-11和031-12分别代表三个批次的伪狂犬病毒BarthaK61株活疫苗的单苗。
具体实施方式
本发明的目的之一是提供一种无免疫抑制的猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪瘟疫苗及伪狂犬病疫苗的三联疫苗组合物。该疫苗组合物的免疫效果好，能够达到一针防三病的目的。
本发明的目的之二是提供一种制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪瘟疫苗及伪狂犬疫苗的三联疫苗组合物的方法。
本发明提供了一种疫苗组合物，其含有猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪瘟疫苗及伪狂犬病疫苗。
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种正链RNA病毒，目前已发现两种基因型：欧洲型和美洲型，目前在我国均有检出。PRRSV基因组中有多个开放阅读框，其中第一个开放阅读框(ORF1a和ORF1b)含有PRRSV基因组的80％的序列，其编码PRRSV病毒复制 所必须的RNA复制酶(Straw et al，Diseases of Swine，9TH edition，chapter 24(2006))。ORF1a和ORF1b被翻译成一个多蛋白(poly-protein)，该多蛋白被其中含有的蛋白酶活性区域切割成多个非结构蛋白，包括Nsp1-Nsp12(见，例如，Vries et al，Seminars in Virology，8：33-47(1997)；Allende et al，Journal of General Virology，80：307-315(1999))。
猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触传染性、致死性猪传染病，是世界粮农组织和各国政府密切关注的主要传染病之一。世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类16种法定传染病之一，在我国亦被列为一类传染病。全世界约有50个国家和地区暴发或出现猪瘟，给世界养猪业带来了巨大的经济损失。我国是世界养猪大国，生猪饲养量居世界首位，据中国兽医药品监察所对全国各省市的调查结果表明，猪瘟感染率接近10％，每年给我国造成的经济损失近100亿元，对我国养猪业的危害极其严重。猪瘟病毒是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员之一。该病毒外被囊膜，基因组为单股正链RNA，全长约12.5kb，由5’-非编码区(5’-UTR)、一个开放阅读框(ORF)和3’-非编码区(3’-UTR)三部分组成。其中ORF编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，分子量约为438kD，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工成4个成熟的结构蛋白和7个非结构蛋白。
猪瘟疫苗包括灭活疫苗和弱毒疫苗。灭活苗由于接种量大、免疫期短、产生免疫力慢、不能引起局部免疫、成本高等缺点，已逐步被弱毒疫苗所取代。世界公认安全有效，没有残余致病力的弱毒疫苗株有三种：①中国兔化弱毒疫苗C株；②日本GPE(-)细胞弱毒疫苗；③法国“Thiveosal”冷变异弱毒株。其中我国学者研制成功的中国兔化弱毒疫苗，自1957年起，除在我国广泛应用外，并已推广到欧亚很多国家，使这些国家控制或消灭了猪瘟。其突出优点是：用其接种的猪不产生病毒血症和脑炎病变，可安全的免疫接种任何怀孕期母猪和哺乳仔猪，不影响受精率及存活率，不引起流产、死胎，可安全用于建立种猪群。此种疫苗根据生产工艺的不同分为：猪瘟活疫苗(细胞源)，即猪瘟细胞苗；猪瘟活疫苗(兔源)，即猪瘟组织苗。根据生产时使用成年兔还是乳兔，可以将猪瘟组织苗分为猪瘟脾淋苗和猪瘟乳兔苗。但猪瘟组织苗的生产工艺需要使用大量家兔，质量控制难度较大，生产成本较高。而细胞苗产量高、成本低，免疫效果与组织苗无差别，因此近几十年来在猪瘟防疫体系中发挥主要作用的是猪瘟细胞苗。
猪伪狂犬病毒(PRV)属于疱疹病毒科(Herpesvirdae)、α2疱疹病毒亚科(Alpherpesvirinae)。目前仅发现一种血清型的PRV。PRV的基因组是双链线性DNA，约为 150kb。病毒基因组由长独特区(UL)和短独特区(US)以及US两侧的末端重复序列(TR)与内部重复序列(IR)组成。目前PRV基因组中已有65种基因被定位，其中大多数基因的功能也有所了解。在UL区已被定位的基因有UL1-UL54共56种，包括了已被测序的糖蛋白gB、gC、gH、gK、gL、gM、gN、胸腺激酶TK、碱性核酸酶(AN)、核苷酸还原酶(RR)、DNA聚合酶(POL)、DBP基因、MCP基因、ICP18.5基因和早期蛋白0(EP0)基因等。US区已被全部测序，其中被定位的基因有7种：糖蛋白gD、gE、gG、gI、蛋白激酶(PK)基因、11kd和28kd蛋白基因。
在一方面，本发明提供了疫苗组合物，其含有猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪瘟疫苗及伪狂犬病疫苗，且所述的猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪瘟疫苗及伪狂犬病疫苗之间基本上无免疫抑制。
“基本上无免疫抑制”是指，所述猪繁殖与呼吸综合征疫苗、所述猪瘟疫苗及所述伪狂犬病疫苗三者在免疫猪以后不会显著削弱对方的免疫效果。例如，在免疫所述疫苗组合物后，所述疫苗组合物在猪体内产生的抗PRV抗体的量或者该抗体中和抗原的效价不显著低于单独免疫所述PRV疫苗时产生的抗体的量或效价；所述疫苗组合物在猪体内产生的抗CSFV抗体的量或者该抗体中和抗原的效价不显著低于单独免疫所述CSFV疫苗时产生的抗体的量或效价；和/或所述疫苗组合物在猪体内产生的抗PRRSV抗体的量或者该抗体中和抗原的效价不显著低于单独免疫所述PRRSV疫苗时产生的抗体的量或效价。可以通过常规的方法在免疫后的适当的时间检测抗体产生的量或者中和抗原的效价。例如，可以通过ELISA的方法，用对应的抗原进行检测。
在某些实施方式中，所述疫苗组合物中，所述猪瘟疫苗、所述猪繁殖与呼吸综合征疫苗及所述伪狂犬病疫苗可以以适当的比例混合。可以将所述猪瘟疫苗、所述猪繁殖与呼吸综合征疫苗及所述伪狂犬病疫苗分别制成具有一定病毒滴度的抗原液，再根据测得的病毒滴度计算混合的比例。病毒滴度可以通过50％组织培养感染剂量(TCID50)表征，TCID50值可以通过本领域已知的适当方法进行测定。例如，可以将病毒进行10倍系列稀释，接种长满特异细胞的96孔细胞培养板，每个稀释度接种8孔，100ul/孔，接种后置于37℃，5％CO2培养箱中培养4-5天，观察细胞病变，根据出现细胞病变的孔数计算TCID50。具体方法可见参考文献Reed LJ，Muench H.A simple method of estimating fifty percent end points.Am J Hyg 1938；27：493-97。在某些实施方式中，可以根据测得的所述PRRSV疫苗、所述CSFV疫苗和所述PRV疫苗的TCID50值进行混合，使得混合物中两种疫苗的TCID50值在适当 的比例范围。在某些实施方式中，所述PRRSV疫苗、所述CSFV疫苗及所述PRV疫苗的TCID50值的比例为1∶4∶1。
在某些实施方式中，所述疫苗组合物中含有适当量的所述PRRSV疫苗、所述CSFV疫苗与所述PRV疫苗。例如，在每头份疫苗中，所述PRRSV疫苗、所述CSFV疫苗与PRV疫苗的含量分别不低于104.5～105.5、105.0～106.0、104.5～105.5TCID50。
在某些实施方式中，所述PRRSV疫苗是减毒的PRRSV。在本申请中，“减毒PRRSV”是指一种PRRSV，其能够感染宿主，但是不能引起猪繁殖与呼吸综合征，或者其引起的症状较少和/或较轻。“猪繁殖与呼吸综合征”是指天然的PRRSV感染猪后引起的一系列生理和病理的症状。这些症状包括，但不限于，发热、嗜睡、食欲不振、倦怠、呼吸困难、咳嗽、母猪繁殖障碍、仔猪生长缓慢、或死亡等。减毒PRRSV包括活的减毒PRRSV以及由其灭活得到的灭活产物。减毒PRRSV的例子包括，但不限于，TJM株、JXA1-R株、HuN4-F112株及CH-1R株。
在某些实施方式中，所述PRRSV疫苗是减毒的PRRSV活疫苗。在某些实施方式中，所述减毒的PRRSV活疫苗含有Nsp1核苷酸序列，所述序列的编码序列与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同源性。在某些实施方式中，所述减毒的PRRSV活疫苗进一步含有Nsp2核苷酸序列，所述Nsp2核苷酸序列的编码序列与SEQ ID NO：2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同源性。
“编码序列”在本申请中是指一种DNA序列，其能够被转录得到相应的RNA序列。PRRSV是正链RNA病毒。PRRSV的编码序列是一种DNA，其能够被转录成正链RNA，该正链RNA与PRRSV病毒本身的基因组中的RNA序列相同。
“同源性”在本申请中是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计算得到，例如，可以将目标氨基酸(或核苷酸)序列与参比氨基酸(或核苷酸)序列进行序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸(或核苷酸)数目达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸(或核苷酸)序列之间相同氨基酸(或核苷酸)的百分比。氨基酸(或核苷酸)序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现，例如，但不限于，BLAST软件(在美国国立生物技术信息中心(NCBI)的网址上可获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者见，例如，Altschul S.F.et al，J.Mol.Biol.， 215：403-410(1990)；Stephen F.et al，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))，ClustalW2软件(在欧洲生物信息、研究所网址上可获得：http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/，另见，例如，Higgins DG.et al，Methods in Enzymology，266：383-402(1996)；Larkin M.A.et al，Bioinformatics(Oxford，England)，23(21)：2947-8(2007))；和TCoffee软件等(在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得：http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例如，Poirot O.et al，Nucleic Acids Res.，31(13)：3503-6(2003)；Notredame C.et al，J.Mol.Boil.，302(1)：205-17(2000))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。
在某些实施方式中，所述减毒的PRRSV活疫苗含有由SEQ ID NO：1编码的Nsp1核苷酸序列，且含有由SEQ ID NO：2编码的Nsp2核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述减毒的PRRSV活疫苗含有PRRSV的核苷酸序列，该序列的编码序列与SEQ ID NO：3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同源性。在某些实施方式中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的核苷酸序列由SEQ ID NO：3编码。
在某些实施方式中，所述PRRSV疫苗是减毒的高致病性PRRSV的活疫苗。
“高致病性PRRSV”是指，所述PRRSV的Nsp2蛋白的编码序列与PRRSV VR-2332株的Nsp2蛋白的编码序列(SEQ IDNO：6)相比，在SEQ IDNO：6的第1440位到第1680位的核苷酸片段中(即：SEQ ID NO：7)缺失了不连续的90个核苷酸。缺失了所述不连续的90个核苷酸的PRRSV通常比PRRSVVR-2332毒株具有更强的致病性。在某些实施方式中，所述90个不连续的核苷酸包括SEQ ID NO：6中第1440-1442位的“TTT”以及如SEQ ID NO：8所示的序列。在某些实施方式中，所述高致病性PRRSV的Nsp2蛋白编码序列含有如SEQ IDNO：4(即：PRRSV TJ株的Nsp2核苷酸序列)所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述高致病性PRRSV为PRRSV TJ株，其基因组编码序列见GenBank登录号EU860248所示。
在某些实施方式中，所述减毒的高致病性PRRSV的活疫苗在Nsp2蛋白的编码序列中不仅缺失了上述不连续的90个核苷酸，还进一步具有部分序列的缺失。在某些实施方式中，所述减毒的高致病性PRRSV的活疫苗的Nsp2蛋白的编码序列与SEQ ID NO：4相比，缺失了如SEQ ID NO：5所示的360个核苷酸。在某些实施方式中，所述减毒的高致病性PRRSV的活疫苗的Nsp2蛋白编码序列含有由SEQ ID NO：2编码的序列。在某些实施方式中，所述减毒的高致病性PRRSV为PRRSV TJM株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.3121。
在某些实施方式中，所述的猪瘟疫苗是猪瘟兔化弱毒细胞苗。在某些实施方式中，所述猪瘟疫苗的编码序列与SEQ ID NO：9具有至少80％、85％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同源性。猪瘟病毒是正链RNA病毒。猪瘟病毒疫苗的编码序列是一种DNA，其能够被转录成正链RNA，该正链RNA与猪瘟病毒本身的基因组中的RNA序列相同。在某些实施方式中，所述猪瘟疫苗的编码序列是SEQ ID NO：9。在某些实施方式中，所述猪瘟疫苗为CSFV C株，其微生物保藏号是：CGMCC No.3891。
在某些实施方式中，本发明提供的疫苗组合物中的所述PRV疫苗是减毒的PRV疫苗。“减毒的猪伪狂犬疫苗”(或减毒PRV疫苗)是指一种PRV，其能够感染宿主，但是不能引起猪伪狂犬病，或者其引起的症状较少和/或较轻。减毒PRV包括活的减毒PRV以及由其灭活得到的灭活产物。“猪伪狂犬病”是指天然的PRV感染猪后引起的一系列生理和病理的症状。这些症状包括，但不限于，流产、死胎、弱胎、木乃伊胎，发热、食欲下降、神经症状、麻痹、衰竭、甚至死亡等。
在某些实施方式中，所述PRV疫苗是减毒的PRV活疫苗。在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗的基因组序列与NCBI参考号NC_006151的核苷酸序列具有至少80％、85％、88％、89％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同源性。在某些实施方式中，所述PRV疫苗的基因组序列与NCBI参考号NC_006151的核苷酸序列相同。
在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗的基因组序列中的一个或多个与毒力相关的基因失活。基因“失活”是指，由于基因的全部或部分被删除或缺失，或者基因中存在突变或插入，导致基因原本的功能减弱或丧失。与PRV毒力相关的基因的例子包括，但不限于，TK(例如，NCBI Gene ID：2952559)、PK(例如，NCBI Gene ID：2952530或2952561)、RR(例如，NCBI Gene ID：2952535或2952536)、dUTPase(例如，NCBI Gene ID：2952537)、gG(例如，NCBI Gene ID：2952520)、gC(例如，NCBI Gene ID：2952505)、gE(例如，NCBI Gene ID：2952517)、gD(例如，NCBI Gene ID：2952521)和gI(例如，NCBI Gene ID：2952516)。
在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗的基因组序列中的一个或多个基因失活，所述基因选自下组：TK、PK、RR、dUTPase、gG、gC、gE、gD和gI。在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗的基因组序列中的gE基因失活。在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗的基因组序列中仅有gE基因失活。在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗的基因组序列中除gE基因失活外，还进一步失活了一个或多个其他的毒力基因，例如，TK、PK、RR、dUTPase、gG、gC、gD和/或gI。
减毒的PRV活疫苗可以通过本领域公知的方法获得。例如，可以将分离到的猪伪狂犬野生毒株用非猪源的细胞传代，或在鸡胚中培养，或者加入致突变剂在较高培养温度下培养，从而致弱获得猪伪狂犬弱毒苗。本领域已知多种这样的减毒的PRV活疫苗，例如，Bartha K61株(见，例如，Bartha，A.Experiments to reduce the virulence of Aujeszky′s virus.Magyar allatorvosok lapja 16，42-45(1961))、BUK株、NIA4株、Alfort株、和VGNKI株等。这些减毒的PRV活疫苗都可以在本发明中使用。例如，还可以将野生的或减毒的PRV毒株进行基因工程改造，使得目标毒力基因失活，但病毒仍些能够复制，从而获得减毒的PRV活疫苗。本领域公知，通过基因工程改造已经获得多种减毒的PRV活疫苗，例如，PRV-BUK-d13株(见，例如Kit S.et al，Am.J.Vet.Res.，1985，46(6)：1359-1367)、PRV dlgC/dlTK株(见，例如KitS.et al，Am.J.Vet.Res.，1987，48(5)：780-793)、S-PRV-002缺失疫苗株(见，例如Shin Y S.et al，J.Vet.Med.Sci.，1997，59(1)：51-53)、PRV783株(见，例如Van Oirschot J T et al，Am.J.Vet.Res.，1984，45(10)：2099-2103)、EL-001、PRV376等。
在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗为伪狂犬病毒的Bartha K61株。Bartha K61株是经过鸡胚细胞传代致弱的疫苗株，可用于疫苗制备。在某些实施方式中，Bartha K61株缺失gE基因。在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗在Bartha K61株的基础上进一步失活了其他基因。
在某些实施方式中，所述减毒的PRV活疫苗还可以进一步缺失一个或多个非毒力相关的基因，或者进一步具有插入的异源的基因。例如，非毒力相关的基因可以包括不影响病毒复制、感染宿主等的基因。缺失的非毒力基因和插入的异源基因可以有助于疫苗的检测和/或诊断。
在本申请提供的疫苗组合物中还可以进一步含有佐剂。佐剂可以保护疫苗不受体内破坏，和/或非特异性地刺激免疫系统，从而有助于增强对所述疫苗的免疫反应。佐剂的例子 包括，但不限于，矿物盐类(例如，氢氧化铝、磷酸铝、氢氧化钙)、油包水乳剂(例如，弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等)、皂苷类(saponin)佐剂(如：StimulonTM等)、细菌或微生物衍生物类(如，脂多糖、脂A衍生物(lipid A derivatives)等)、和微粒(如聚-α羟基酸等)。
在本申请提供的疫苗组合物中还可以进一步含有稳定剂。稳定剂可以保护生物制品在冻干过程中的稳定性，减少冻干过程对疫苗的生物活性的破坏。稳定剂的例子包括蔗糖、L-谷氨酸钠、或水解乳蛋白。
在某些实施方式中，本申请的疫苗组合物中的抗原液与稳定剂的比例为4∶1。
在某些实施方式中，本申请提供的疫苗组合物含有减毒的高致病性PRRSV活疫苗、减毒的CSFV活疫苗及减毒的PRV活疫苗。在某些实施方式中，所述减毒的高致病性PRRSV活疫苗优选是TJM株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.3121；所述减毒的CSFV活疫苗优选是C株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.3891；所述减毒的PRV活疫苗优选是Bartha K61株，其微生物保藏号是：CGMCC No.5076。
PRRSV TJM株的具体保藏信息如下：微生物保藏号：CGMCC No.3121；分类命名：猪繁殖与呼吸综合征病毒；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间：2009年6月15日。
CSFV C株的具体保藏信息如下：微生物保藏号：CGMCC No.3891；分类命名：猪瘟病毒；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间：2010年5月27日。
PRV Bartha K61株的具体保藏信息如下：微生物保藏号：CGMCC No.5076；分类命名：伪狂犬病病毒；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间：2011年7月21日。
PRRSV TJM株和猪瘟疫苗C株之间无免疫抑制，并且均具有良好的安全性、免疫原性和特异性，能够很好的预防当前猪群中主要流行的猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟。
PRRSV TJM株和PRV Bartha K61株之间无免疫抑制，并且均具有良好的安全性、免疫原性和特异性，能够很好的预防当前猪群中主要流行的猪繁殖与呼吸综合征和伪狂犬病。
PRV Bartha K61株和猪瘟疫苗C株之间无免疫抑制，并且均具有良好的安全性、免疫原性和特异性，能够很好的预防当前猪群中主要流行的猪瘟和伪狂犬病。
含有PRRSV TJM株、猪瘟疫苗C株和猪伪狂犬疫苗Bartha K61株的三联疫苗通过一次免疫，有效预防和控制猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟和伪狂犬病这三种疫病的发生与流行，减轻免疫接种的工作量，减少免疫次数，避免因频繁免疫所造成的免疫麻痹，相应减少了对猪群的应激。
本申请还提供了一种制备本发明所述三联疫苗组合物的方法，包括：
(a)将猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗、猪瘟病毒疫苗和猪伪狂犬病病毒疫苗分别接种于各自的易感细胞，并培养所述接种后的易感细胞；
(b)收获并混合所述步骤(a)得到的细胞培养物中的病毒。
在某些实施方式中，所述制备方法可以包括：(1)将易感细胞系进行传代和培养；(2)将高致病性猪繁殖与呼吸综合征TJM株、猪瘟兔化弱毒株C株及伪狂犬病Bartha K61株分别接种易感细胞系，用维持液培养，制备生产毒种；(3)将所制备的生产毒种分别接种长满90-100％细胞的介质上，用维持液培养增殖得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征TJM株病毒抗原液、猪瘟兔化弱毒株细胞毒抗原液及伪狂犬病Bartha K61株病毒抗原液；(4)将高致病性猪繁殖与呼吸综合征TJM株抗原液、猪瘟兔化弱毒株细胞毒抗原液及伪狂犬病Bartha K61株病毒抗原液按比例混合，加入稳定剂，混合均匀，经冷冻真空干燥，即得。
其中，步骤(1)、(2)、(3)中所述的用于生长高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的细胞包括但不限于Marc-145细胞系、MA-104细胞系、Vero细胞系、DL-2621细胞系等传代细胞系或PAM细胞等原代细胞；用于生长猪瘟病毒的细胞包括但不限于BT细胞系、Vero细胞系、MPK细胞系、SK6细胞系、PK2a细胞系、CPK细胞系、RKC细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、CRFK细胞系、PT细胞系和ST细胞系等传代细胞系或BT细胞等原代细胞，其中PT细胞系和ST细胞系均为猪睾丸传代细胞系；用于生长伪狂犬病病毒的细胞包括但不限于非洲绿猴肾细胞系Marc-145细胞、牛肾细胞系MDBK细胞等传代细胞系或牛睾丸细胞系BT细胞等原代细胞。
步骤(1)中所述细胞系的传代和培养包括：将细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，细胞长满90-100％时，用于继续传代或接种病毒；其中，所述的细胞培养方法优选为以下任意一种：在转瓶中培养，使其细胞密度达到5×107/ml-1×108/ml；或者在生物反应器中添加附着载体进行悬浮培养，使其细胞密度达到5×108/ml-1×109/ml，所述的附着载体优选为微载体或纸片。
步骤(1)、(2)、(3)中所述的培养温度优选是33-37℃，所述的细胞培养环境是5％CO2。
步骤(2)中所述的生产毒种病毒含量标准包括：高致病性猪繁殖与呼吸综合征TJM株毒种标准为每1ml病毒含量应不低于107.0TCID50；猪瘟兔化弱毒细胞毒毒种标准为每1ml含病毒＞100,000个家兔感染量或应用免疫荧光法测定病毒含量应不低于106.0TCID50；伪狂犬病病毒Bartha K61株毒种标准为每1ml病毒含量应不低于108.0TCID50。
步骤(2)或(3)中所述的高致病性猪繁殖与呼吸综合征TJM株感染剂量(MOI)为0.01-0.5，接种后培养3-5天，当细胞病变达到70％时收获病毒液；猪瘟兔化弱毒株的感染剂量(MOI)为0.1-0.5或接种量为3％-5％细胞毒，接种后5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液，收获不超过5次；伪狂犬病病毒Bartha K61株感染剂量(MOI)为0.005-0.5，接种后2-3天，收获细胞培养液作为生产用毒种。
步骤(3)中所述收获抗原液病毒含量标准包括：高致病性猪繁殖与呼吸综合征TJM株毒种标准为每1ml病毒含量应不低于107.0TCID50；猪瘟兔化弱毒细胞毒种鉴定完全符合猪瘟兔化弱毒株毒种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每1ml含病毒＞100,000个家兔感染量或应用免疫荧光法测定病毒含量应不低于106.0TCID50；伪狂犬病病毒Bartha K61株毒种标准为每1ml病毒含量应不低于108.0TCID50。
步骤(4)中所述的抗原液体积份数为75-80，耐热稳定剂的体积份数为25-20。
步骤(4)中所述的制成制品的效检标准包括：每剂量疫苗中高致病性猪繁殖与呼吸综合征TJM株病毒抗原含量应≥105.0TCID50/ml；猪瘟兔化弱毒(C株)抗原含量应≥7500个家兔感染量或应用免疫荧光法测定病毒含量≥104.0TCID50/ml；伪狂犬病病毒Bartha K61株抗原含量应≥105.5TCID50。
本发明提供的制备方法与现有技术相比具有多种优势。例如，其制备过程简单且稳定、易操作、病毒含量高、批间差异小、质量易控、可显著提高疫苗产量和质量、减少过敏反应等。利用本发明的制备方法得到的猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、和伪狂犬病二联活疫苗安全好、免疫效力高，对猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟和伪狂犬病的强毒攻击具有较好的免疫保护作用。
本发明还提供了通过上述制备方法得到的疫苗组合物，其含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗、猪瘟疫苗及伪狂犬病疫苗。
本发明还提供了所述的疫苗组合物在制备预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟及伪狂犬病的生物制品中的用途。
本发明提供的猪用三联苗在预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟及伪狂犬病方面表现出显著的技术效果。本发明提供的减毒的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗株、减毒的猪瘟活疫苗株及减毒的伪狂犬病活疫苗株之间无免疫抑制，应用具制备的三联苗与各单苗比较，在安全性、免疫原性、免疫持续期、免疫保护效果和保存期试验上无差别。安全性试验显示，疫苗单剂量、单剂量重复、超剂量接种试验动物后安全，体温、精神状态正常，无任何临床症状。效力试验显示，本发明提高的疫苗组合物对高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟和伪狂犬病毒的强毒攻击有良好的保护作用，可有效预防这三种病毒的感染。免疫持续期试验显示，免疫持续期为6个月，可确保免疫期内对猪提供有效保护。疫苗保存期试验显示，疫苗在2℃～8℃保存期为18个月，具有保存期长，存储稳定的优点。应用本发明提供的三联疫苗组合物免疫接种动物，可实现一针防三病，减轻免疫接种工作量，减少免疫次数，减少对猪群的应激，避免因频繁免疫所造成的免疫麻痹和免疫失败。
本发明还提供了免疫猪的方法，包括对猪施用本发明所述的疫苗组合物。可以通过例如注射的方式对猪免疫。可以进行单剂量给药、多剂量重复给药等方式进行免疫。具体的免疫方式和免疫剂量可以根据由有兽医经验的人员根据实际情况进行调整。
优势
本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、和伪狂犬病三联活疫苗与现有技术相比具有显著的的优势。现有技术中，猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪瘟、和伪狂犬疫苗的免疫存在诸多问题。第一，现有技术中的猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪瘟疫苗和伪狂犬疫苗之间存在免疫抑制，当三种疫苗联用时，其免疫效果显著低于分别免疫的效果，因此难以通过联用的方式实现对三种病毒的有效免疫。例如，猪繁殖与呼吸综合征病毒会显著抑制猪瘟疫苗产生的抗体，并影响淋巴细胞等免疫细胞的功能(陈仕龙等，福建畜牧兽医，第28卷第1期，24-25页，2006年；李华等，中国兽医学报，第21卷第3期，第219-222页，2001年5月)，进而导致免疫抑制。第二，由于前述免疫抑制的因素，现有技术中的猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪瘟疫苗和伪狂犬疫苗都是进行分别免疫，这增加了免疫次数，对猪群产生较大的应激刺激，进而影响猪群体重增长，且会刺激猪免疫系统导致原本潜伏的病毒被激活和发病。第三，现有技术中，反复多次的频繁免疫还可能导致猪群对疫苗产生免疫麻痹，使得疫苗在体内的免疫效果降低。
与现有技术相比，本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、和伪狂犬病三联活疫苗不会产生免疫抑制，其联合使用时能够达到的免疫效果与分别使用时的免疫效果相当，因此能够同时使用，实现一针防三病的效果。由于无需进行分次免疫，因此本发明的三联活疫苗与现有技术相比，免疫次数显著减少，对猪群造成的应激刺激也相应减少，也不会造成因频繁免疫而导致的免疫麻痹。同时，本发明的三联疫苗还可大大减少免疫的工作量，节约免疫成本，有利于合理安排免疫程序。另外，本发明的三联疫苗无需进行两种疫苗的单独制备和包装，简化了疫苗制备和包装过程。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1用细胞系生产高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟及伪狂犬病三联活疫苗的方法
(1)制苗用细胞的传代与培养：
用Marc-145细胞系制备高致病性PRRSV TJM株疫苗。Marc-145细胞系经胰酶-EDTA细胞分散液消化传代，一比三进行传代。加细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒。
用BT细胞系制备猪瘟兔化弱毒株C株疫苗。BT细胞系用经胰酶-EDTA细胞分散液消化传代，一比五进行传代；分别加细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒。
用Marc-145细胞系制备伪狂犬病毒Bartha K61株疫苗。Marc-145细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成传代细胞单层时，用于继续传代或接种病毒。细胞培养温度是36-37℃。
(2)细胞毒种的繁殖：
将高致病性PRRSV TJM株毒种按照MOI 0.01-0.5的接种量进行接种，接种后培养3-5天，当细胞病变达到70％时收获病毒液。将猪瘟兔化弱毒新鲜脾毒制成0.3％的病毒悬液， 接种生长良好的BT细胞系单层，置37℃继续培养，隔5日收获细胞培养毒液作为生产用毒种。将伪狂犬病毒BarthaK61株用含2-4％牛血清的MEM细胞维持液，将伪狂犬病病毒弱毒株接种生长良好的Marc-145细胞单层，37℃继续培养；2-3日后收获细胞培养液作为生产用毒种。
毒种鉴定：按《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪安全无副作用，其中高致病性猪繁殖与呼吸综合征TJM株毒种每1ml病毒含量应不低于107.0TCID50；猪瘟兔化弱毒细胞毒种鉴定完全符合猪瘟兔化弱毒株毒种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每1ml含病毒＞100,000个家兔感染量或应用免疫荧光法测定每1ml病毒含量应不低于106.0TCID50；伪狂犬活疫苗生产用细胞毒种应对猪安全无副作用，细胞毒种每1ml含病毒≥108.0TCID50。
(3)制苗毒液的繁殖：取已长满90-100％单层Marc-145细胞，弃去细胞培养液，用PBS洗2次，将高致病性猪繁殖与呼吸综合征TJM株毒种按照MOI 0.01-0.5的接种量进行接种，接种后培养3-5天，当细胞病变达到70％时收获病毒液作为制苗用毒液。取已长满90-100％单层BT细胞，弃去细胞培养液，用PBS洗2次，将猪瘟兔化弱毒株细胞毒毒种按照MOI0.1-0.5或接种量为3％-5％进行接种，接种后5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液，收获不超过5次，将收获的各收次病毒液作为制苗用毒液；收获的病毒液置-20℃以下保存。将伪狂犬病毒Bartha K61株以MOI：0.005-0.5接种于长满良好单层的Marc-145细胞(或MDBK、BT传代细胞)，加入维持液，置36-37℃进行培养，当CPE达70％以上时收获病毒液，冻融2次，测定病毒含量(TCID50)，同时抽样进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验。将检验合格的病毒液作为制苗用抗原液，置-15℃以下保存备用。
制苗毒液的检验：按《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。制苗毒液对猪安全无副作用。其中高致病性猪繁殖与呼吸综合征TJM株毒种每1ml病毒含量应不低于107.0TCID50；猪瘟兔化弱毒细胞毒种鉴定完全符合猪瘟兔化弱毒株毒种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每1ml含病毒＞100,000个家兔感染量或应用免疫荧光法测定每1ml病毒含量应不低于106.0TCID50；伪狂犬病毒Bartha K61株每1ml病毒含量应不低于108.0TCID50。
(4)耐热稳定剂制备：将耐热稳定剂各组分，包括蔗糖、L-谷氨酸钠、和水解乳蛋白，按照一定比例配制后经高压灭菌备用。
(5)配苗、冻干及分装：将体积份数为75-80的抗原液与体积份数为25-20的稳定剂混 合均匀后定量分装至安瓶内，加盖后置于冻干机内，经预冷、干燥过程冻干疫苗。疫苗冻干后进行无菌检验，安全性检验和效力检验。
本实施例制备的高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟及伪狂犬病三联活疫苗，每剂量疫苗中高致病性PRRSV活疫苗TJM株的病毒抗原含量≥105.0TCID50；猪瘟兔化弱毒疫苗C株的抗原含量≥7500个家兔感染量或应用免疫荧光法测定病毒含量≥104.0TCID50；伪狂犬病毒疫苗Bartha K61株的抗原含量≥105.5TCID50。性状检验、安全检验、效力检验等均合格。
实施例2三联活疫苗的免疫抑制试验
试验使用21-28日龄健康仔猪46头，试验分为10组。所用的健康仔猪中，高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟及伪狂犬病的抗原、抗体都呈双阴性。第一组使用试验动物5头，颈部肌肉注射高致病性PRRSV活疫苗TJM株的单苗，接种毒种剂量为105.0TCID50/ml，1ml/头猪。第二组使用试验动物5头，颈部肌肉注射猪瘟兔化弱毒细胞毒疫苗C株的单苗，接种毒种剂量为7500个家兔感染量/ml(或荧光定量为104.0TCID50/ml)，1ml/头猪。第三组使用试验动物5头，颈部肌肉注射伪狂犬病毒疫苗Bartha K61株的单苗，接种毒种剂量为105.5TCID50/ml，1ml/头猪。第四组、第五组和第六组各使用试验动物5头，颈部肌肉注射三联活疫苗的混合液，1ml/头猪，每1ml三联疫苗的混合液中含有：高致病性PRRSV活疫苗TJM株105.0TCID50，猪瘟兔化弱毒细胞毒疫苗C株7500个家兔感染量(或荧光定量为104.0TCID50)，和伪狂犬病毒疫苗Bartha K61株105.5TCID50/ml。第七组为高致病性PRRSV阴性不接种对照组，使用5头试验动物，颈部肌肉注射疫苗培养的细胞液。第八组为猪瘟阴性不接种对照组，使用3头试验动物，颈部肌肉注射疫苗培养的细胞液。第九组为伪狂犬病阴性不接种对照组，使用5头实验动物，颈部肌肉注射疫苗培养的细胞液。第十组为空白对照组，使用3头试验动物，至试验结束不接种任何物质。
疫苗接种前3天与接种后7天，每天测定所有仔猪直肠温度并进行临床观察。在接种前3天及接种后0天、3天、7天、10天、14天、21天、28天、31天、35天、38天、和42天，分别采集所有仔猪的血液，经处理分别得到抗凝血和促凝血，抗凝血用于CD3+、CD4+、CD8+T细胞检测，促凝血分离血清用于抗体效价监测。
免疫后28天进行攻毒试验，取第一组、第四组、第七组试验动物分别滴鼻加肌肉注射高致病性猪繁殖与呼吸综合征检验用强毒3ml/头猪，滴鼻2ml(1ml/鼻孔)，肌注1ml；取第二组、第五组、第八组试验动物肌肉注射猪瘟检验用强毒石门血毒，1ml/头猪；取第三组、第六组、第九组实验动物分别滴鼻加肌肉注射伪狂犬病检验用强毒3ml/头猪，滴鼻2ml(1ml/鼻孔)，肌 注1ml；第十组空白对照试验动物不攻击任何强毒。攻击后每天观察试验动物临床症状，包括食欲、呼吸、精神状态等，每天测温。高致病性猪繁殖与呼吸综合征强毒攻击试验于攻毒后21天结束，猪瘟强毒攻击试验于攻毒后16天结束，伪狂犬病毒攻击试验于攻毒后21天结束，攻击试验结束后，计算每组动物临床保护率、发病率和死亡率。
结果：
白细胞检测结果显示：在免疫后28天内，各免疫组与对照组试验动物CD3+、CD4+、CD8+T细胞变化规律相似，差异不显著；第四组、第五组及第六组试验动物同时免疫三种基础毒种后，不相互干扰抗体生成，并且第四组、第五组、第六组试验动物抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体消长规律与第一组试验动物的抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体消长规律相一致，第四组、第五组、第六组试验动物的抗猪瘟病毒抗体消长规律与第二组试验动物的抗猪瘟病毒抗体消长规律相一致；第四组、第五组、第六组试验动物的抗猪瘟病毒抗体消长规律与第三组试验动物的抗伪狂犬病毒抗体消长规律相一致。
高致病性猪繁殖与呼吸综合征检验用强毒攻毒结果显示：第一组攻毒保护率为5/5，攻毒发病率为0/5，攻毒死亡率0/5；第四组攻毒保护率为5/5，攻毒发病率为0/5，攻毒死亡率0/5；第七组攻毒保护率为0/5，攻毒发病率为5/5，攻毒死亡率3/5。
猪瘟检验用强毒石门血毒攻毒结果显示：第二组攻毒保护率为5/5，攻毒发病率为0/5，攻毒死亡率0/5；第五组攻毒保护率为5/5，攻毒发病率为0/5，攻毒死亡率0/5；第八组攻毒保护率为0/3，攻毒发病率为3/3，攻毒死亡率3/3。
伪狂犬病检测用强毒攻毒结果显示：第三组攻毒保护率为5/5，攻毒发病率为0/5，攻毒死亡率0/5；第六组攻毒保护率为5/5，攻毒发病率为0/5，攻毒死亡率0/5；第九组攻毒保护率为0/5，攻毒发病率为5/5，攻毒死亡率5/5。
综上所述，试验结果显示，高致病性PRRSV活疫苗TJM株、猪瘟兔化弱毒细胞毒疫苗C株及伪狂犬病毒疫苗Bartha K61株间无免疫抑制。使用三联活疫苗得到的免疫效果与分别用单苗进行免疫得到的效果相当，证实本发明的高致病性PRRSV活疫苗TJM株对联用的另两种疫苗不会产生免疫抑制。
实施例3三联活疫苗的安全性试验
对用实施例1的方法制备得到的3批三联活疫苗(批号分别为031-01、031-02、031-03)进行安全性试验。试验内容包括，对育肥仔猪进行1次单剂量接种、单剂量重复接种、超剂量接种的实验，并对非使用日龄仔猪进行超剂量接种，和对不同品种的猪进行超剂量接种的实验。
结果表明，单剂量接种、单剂量重复接种和超剂量接种后各组试验动物体温正常，精神状态及食欲良好，注射部位及全身未见不良反应，对生产性能无影响，三联苗超剂量接种对非使用日龄仔猪、对不同品种猪超剂量接种均安全。
实施例4三联活疫苗的效力试验
对用实施例1的方法制备得到的3批三联活疫苗(批号分别为031-01、031-02、031-03)分别进行效力实验。在进行三联疫苗的效力实验同时，对比进行三种单苗的效力实验，即，将高致病性PRRSV疫苗TJM株单苗、猪瘟兔化弱毒疫苗C株单苗、和伪狂犬病毒疫苗Bartha K61株单苗分别作为对照试验组。
实验使用健康仔猪43头，分为九组。所用的健康仔猪中，高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟及伪狂犬病的抗原、抗体都呈双阴性。第一组、第二组、第三组为三联活疫苗测试组，每组使用试验动物5头，经颈部肌肉注射，接种3批三联活疫苗中的一批，剂量为1ml/头。每ml三联活疫苗中，猪瘟兔化弱毒疫苗C株的含量为7500个家兔感染量(或荧光定量为104.0TCID50)，高致病性PRRSV疫苗TJM株的含量为105.0TCID50，伪狂犬病毒Bartha K61株疫苗的含量为105.5TCID50。第四组到第六组为单苗测试组，每组使用试验动物5头。第四组的动物经颈部肌肉注射，接种猪瘟兔化弱毒疫苗C株的细胞毒疫苗，剂量为1ml/头，疫苗含量为7500个家兔感染量(或荧光定量为104.0TCID50)。第五组的动物经颈部肌肉注射，接种高致病性PRRSV疫苗TJM株，剂量为1ml/头，疫苗含量为105.0TCID50。第六组的动物经颈部肌肉注射，接种伪狂犬病疫苗Bartha K61株，剂量为1ml/头，疫苗含量为105.5TCID50。第七组为猪瘟阴性不接种对照组，使用试验动物3头，经颈部肌肉注射疫苗培养的细胞液。第八组为高致病性猪繁殖与呼吸综合征阴性不接种对照组，使用试验动物5头，经颈部肌肉注射疫苗培养的细胞液。第九组为伪狂犬病阴性不接种对照组，使用试验动物5头，经颈部肌肉注射疫苗培养的细胞液。
实验动物接种疫苗后28日进行攻毒实验。取第一组、第四组、第七组试验动物分别肌肉注射猪瘟检验用强毒石门血毒，1ml/头猪，猪瘟攻毒试验于攻毒后16天结束。取第二组、第五组、第八组试验动物分别滴鼻加肌肉注射高致病性猪繁殖与呼吸综合征检验用强毒3ml/头猪，滴鼻2ml(1ml/鼻孔)，肌注1ml，高致病性猪繁殖与呼吸综合征攻毒试验于攻毒后21天结束。取第三组、第六组、第九组实验动物分别肌肉注射伪狂犬病毒检验用强毒(效价为103.5-104.5TCID50/ml)3ml病毒液/头猪，滴鼻2ml(1ml/鼻孔)，肌注1ml。
结果表明，3批高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟及伪狂犬病三联活疫苗接种试验动物后，三联苗免疫组对高致病性猪繁殖与呼吸综合征强毒攻击、猪瘟强毒攻击及伪狂犬病强毒攻击均可产生良好的保护作用，与单苗对照组无差别。其中，三批三联苗对猪瘟的保护率分别为5/5、5/5和5/5，三批猪瘟单苗对猪瘟的保护率分别为5/5、5/5和5/5；三批三联苗对高致病性猪繁殖与呼吸综合征的保护率分别为4/5、4/5和5/5，三批高致病性猪繁殖与呼吸综合征单苗对高致病性猪繁殖与呼吸综合征的保护率分别为5/5、4/5和4/5；三批三联苗对伪狂犬病的保护率分别为5/5、4/5和5/5，三批伪狂犬病单苗对伪狂犬病的保护率为4/5、4/5和5/5。猪瘟阴性对照组、高致病性猪繁殖与呼吸综合征阴性对照组及伪狂犬病阴性对照组动物均发病，表现明显的临床症状，发病率符合规定标准。
实施例5三联活疫苗的免疫持续期试验
对用实施例1的方法制备得到的3批三联活疫苗(批号分别为031-01、031-02、031-03)分别进行免疫持续期实验，同时将高致病性PRRSV疫苗TJM株单苗、猪瘟兔化弱毒疫苗C株单苗、和伪狂犬病毒疫苗Bartha K61株单苗分别作为对照实验组。
实验使用健康仔猪56头，分为九组。所用的健康仔猪中，高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟及伪狂犬病的抗原、抗体都呈双阴性。第一组、第二组、第三组为三联活疫苗测试组，各使用试验动物10头，颈部肌肉注射接种三联活疫苗，剂量为1ml/头。每ml三联活疫苗中，猪瘟兔化弱毒疫苗C株的含量为7500个家兔感染量(或荧光定量为104.0TCID50)，高致病性PRRSV疫苗TJM株的含量为105.0TCID50；伪狂犬病毒疫苗Bartha K61株的含量为105.5TCID50。第四组到第六组为单苗测试组，每组使用试验动物10头。第四组的动物经颈部肌肉注射，接种猪瘟兔化弱毒株(C株)细胞毒疫苗，剂量为1ml/头，疫苗含量为7500个家兔感染量(或荧光定量为104.0TCID50)。第五组的动物经颈部肌肉注射，接种高致病性PRRSV疫苗TJM株疫苗，剂量为1ml/头，疫苗含量为105.0TCID50。第六组的动物经颈部肌肉注射，接种伪狂犬病毒疫苗Bartha K61株，剂量为1ml/头，疫苗含量为105.5TCID50。第七组为猪瘟阴性不接种对照组，使用试验动物6头，经颈部肌肉注射疫苗培养的细胞液。第八组为高致病性猪繁殖与呼吸综合征阴性不接种对照组，使用试验动物10头，经颈部肌 肉注射疫苗培养的细胞液。第九组为伪狂犬病阴性不接种对照组，使用实验动物10头，经颈部肌肉注射疫苗培养的细胞液。
疫苗接种后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、和6个月分别采血，检测抗体效价。疫苗免疫后3个月和6个月，分别抽取一半数量的各组实验动物进行攻毒试验，其中第一组、第四组、第七组实验动物分别经肌肉注射猪瘟检验用强毒石门血毒，1ml/头猪；第二组、第五组、第八组试验动物分别滴鼻注射高致病性猪繁殖与呼吸综合征检验用强毒2ml/头猪，1ml/鼻孔；第三组、第六组、第九组实验动物分别滴鼻注射伪狂犬病检验用强毒2ml/头猪，1ml/鼻孔。
接种后3个月的攻毒结果表明，三联苗组和猪瘟单苗组对猪瘟强毒攻毒的保护率分别为5/5、5/5，三联苗组和高致病性猪繁殖与呼吸综合征单苗组对高致病性猪繁殖与呼吸综合征强毒攻毒的保护率分别为5/5、4/5，三联苗组和伪狂犬病单苗组对伪狂犬病强毒攻毒的保护率分别为5/5、4/5。
接种后6个月的攻毒结果表明，三联苗组和猪瘟单苗组对猪瘟强毒攻毒的保护率分别为5/5、5/5，三联苗组和高致病性猪繁殖与呼吸综合征单苗组对高致病性猪繁殖与呼吸综合征强毒攻毒的保护率分别为5/5和4/5，三联苗组和伪狂犬病单苗组对伪狂犬病强毒攻毒的保护率分别为5/5和4/5。
根据上述结果，将免疫持续期定为6个月。在此期间，三联活疫苗能够确保免疫期内对猪提供有效的保护。本次实验结果同时表明，三联苗产生的免疫持续期效果与三种单苗产生免疫持续期效果无显著差别。
实施例6三联活疫苗的保存期试验
在疫苗的保存期和稳定性试验中，使用实施例1的方法制备得到的3批高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟及伪狂犬病三联活疫苗(批号分别为031-01、031-02、031-03)，进行疫苗稳定性和保存期研究，并与三种单苗(批号分别为031-04、031-05、031-06、031-07、031-08、031-09、031-10、031-11、031-12)进行了同期对比试验。
上述疫苗制品置于2～8℃保存3、6、9、12、18个月，分别取样进行性状、真空度、剩余水分含量、效力试验以及37℃耐老化试验。结果表明，3批三联苗制品在2～8℃保存18个月后， 性状仍为白色疏松团块，加入稀释液后迅速溶解。真空度检测为白色或紫色辉光。平均剩余水分均符合《中华人民共和国兽药典》规定标准。
3批三联苗(批号同上)中，高致病性PRRSV疫苗TJM株的病毒效价分别为105.4TCID50/ml、105.3TCID50/ml、105.3TCID50/ml。3批高致病性PRRSV疫苗TJM株(批号分别为031-04、031-05、031-06)单苗的病毒效价分别为105.3TCID50/ml、105.3TCID50/ml、105.3TCID50/ml。2～8℃保存期试验结果表明(见图1)，在18个月的保存期中，三联苗与高致病性PRRSV疫苗TJM株单苗相比，TJM株的病毒滴度变化差别不显著。
3批三联苗(批号同上)中，猪瘟兔化弱毒疫苗C株的效价分别为104.2TCID50/ml、104.1TCID50/ml、104.3TCID50/ml(均≥7500个家兔感染量)。3批猪瘟兔化弱毒疫苗C株单苗(批号分别为031-07、031-08、031-09)中，病毒效价分别为104.1TCID50/ml、104.1TCID50/ml、104.1TCID50/ml(均≥7500个家兔感染量)。2～8℃保存期试验结果表明(见图2)，在18个月的保存期中，三联苗与猪瘟兔化弱毒疫苗C株单苗相比，猪瘟兔化弱毒疫苗C株的病毒滴度变化差别不显著。
3批三联苗(批号同上)中，伪狂犬病毒疫苗Bartha K61株的效价分别为105.6TCID50/ml、105.5TCID50/ml、105.6TCID50/ml。3批伪狂犬病毒疫苗Bartha K61株的单苗(批号分别为031-10、031-11、031-12)中，病毒效价分别为105.5TCID50/ml、105.5TCID50/ml、105.6TCID50/ml。2～8℃保存期试验结果表明(见图3)，在18个月的保存期中，三联苗与伪狂犬病毒疫苗Bartha K61株单苗相比，Bartha K61株的病毒滴度变化差别不显著。
耐老化实验表明，上述疫苗在37℃放置14日后，病毒效价仍维持在较高水平，均可达到疫苗质量标准。在37℃放置14日后，3批三联苗(批号同上)中，高致病性猪繁殖与呼吸综合征TJM株病毒效价分别为105.2TCID50/ml、105.2TCID50/ml、105.1TCID50/ml，3批高致病性猪繁殖与呼吸综合征TJM株单苗(批号分别为031-04、031-05、031-06)病毒效价分别为105.1TCID50/ml、105.2TCID50/ml、105.1TCID50/ml。实验结果表明(见图4)，三联苗与高致病性PRRSV疫苗TJM株单苗相比，TJM株的病毒滴度变化差别不显著。
在37℃放置14日后，3批三联苗(批号同上)中，猪瘟兔化弱毒细胞毒效价分别为104.2TCID50/ml、104.2TCID50/ml、104.3TCID50/ml(均≥7500个家兔感染量)。3批猪瘟兔化弱毒疫苗C株单苗(031-07、031-08、031-09)病毒效价分别为104.2TCID50/ml、104.2TCID50/ml、104.2TCID50/ml(均≥7500个家兔感染量)。实验结果表明(见图5)，三联苗与猪瘟兔化弱毒疫 苗C株单苗相比，猪瘟兔化弱毒疫苗C株的病毒滴度变化差别不显著。
在37℃放置14日后，3批三联苗(批号同上)中，伪狂犬病BarthaK61株病毒效价分别为105.6TCID50/ml、105.5TCID50/ml、105.5TCID50/ml。3批伪狂犬病毒Bartha K61株单苗(031-10、031-11、031-12)病毒效价分别为105.6TCID50/ml、105.5TCID50/ml、105.6TCID50/ml。实验结果表明(见图6)，三联苗与伪狂犬病毒疫苗Bartha K61株单苗相比，BarthaK61株的病毒滴度变化差别不显著。
保存期实验结果说明，疫苗组合物中所含的耐热稳定剂在冻干和保存过程中对疫苗株起到了较好的保护作用。克服了常规疫苗所加稳定剂及冻干工艺只能在零度以下(-20℃)保存的缺陷，从根本上解决了疫苗保存运输及实际应用中的关键技术问题，使该三联活疫苗的保存稳定性达到或接近国际上同类疫苗的水平。
Claims (31)
1.一种疫苗组合物，含有猪繁殖与呼吸综合征疫苗，猪瘟疫苗及猪伪狂犬病疫苗，其中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗是减毒的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗，并且所述减毒的高致病性PRRSV的活疫苗的Nsp2蛋白的编码序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗，猪瘟疫苗及猪伪狂犬病疫苗之间基本上无免疫抑制。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗、所述猪瘟疫苗及所述猪伪狂犬病疫苗的TCID50值的比例为1：4：1。
4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的含量不低于104.5～105.5TCID50、和/或所述猪瘟疫苗的含量不低于105.0～106.0TCID50、和/或所述猪伪狂犬病疫苗的含量不低于104.5～105.5TCID50。
5.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的含量不低于105.0TCID50/ml、和/或所述猪瘟疫苗的含量不低于7500个家兔感染量/ml或应用免疫荧光法测定不低于104.0TCID50/ml、和/或所述猪伪狂犬病疫苗的含量不低于105.5TCID50/ml。
6.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的含量为105.0TCID50、105.2TCID50/ml、105.1TCID50/ml、105.4TCID50/ml、或105.3TCID50/ml，和/或所述猪瘟疫苗的含量为7500个家兔感染量或应用免疫荧光法测定病毒含量为104.0TCID50、104.1TCID50/ml、104.2TCID50/ml、或104.3TCID50/ml，和/或所述猪伪狂犬病疫苗的含量为105.5TCID50、或105.6TCID50/ml。
7.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的Nsp1核苷酸序列由SEQ ID NO:1编码。
8.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的猪繁殖与呼吸综合征病毒的核苷酸序列由SEQ ID NO:3编码。
9.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述减毒的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗是PRRSV TJM株，其微生物保藏号是CGMCC NO.3121。
10.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述猪瘟疫苗的编码序列如SEQ IDNO:9所示。
11.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述猪瘟疫苗是猪瘟兔化弱毒细胞苗。
12.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述猪瘟疫苗是CSFV C株，其微生物保藏号是：CGMCC No.3891。
13.根据权利要求1-12任一所述的疫苗组合物，其中所述猪伪狂犬病疫苗是减毒的猪伪狂犬病疫苗。
14.根据权利要求13所述的疫苗组合物，其中所述猪伪狂犬病疫苗编码序列如NCBI参考号NC_006151的核苷酸序列所示。
15.根据权利要求14所述的疫苗组合物，其中所述猪伪狂犬疫苗的基因组序列中的gE基因失活。
16.根据权利要求13所述的疫苗组合物，其中所述猪伪狂犬疫苗是Bartha K61株，其微生物保藏号是CGMCC NO.5076。
17.根据权利要求1-16任一所述的疫苗组合物，其进一步含有佐剂。
18.根据权利要求1-16任一所述的疫苗组合物，其进一步含有稳定剂。
19.根据权利要求18所述的疫苗组合物，其中所述稳定剂包括蔗糖、L-谷氨酸钠、或水解乳蛋白。
20.一种制备权利要求1-19任一所述的疫苗组合物的方法，包括：
(1)将细胞系进行传代和培养；
(2)将猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗、猪瘟疫苗及猪伪狂犬病疫苗分别接种易感细胞，用维持液培养，制备生产种毒；
(3)将所制备的生产种毒分别接种长满90-100%细胞的介质上，用维持液培养增殖得到猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原液、猪瘟疫苗抗原液及猪伪狂犬病疫苗抗原液；
(4)将猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原液、猪瘟疫苗抗原液及猪伪狂犬病疫苗抗原液与稳定剂充分混合。
21.按照权利要求20所述的方法，其特征在于：步骤(1)、(2)、(3)中所述的用于生长猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的细胞为Marc-145细胞系、MA-104细胞系、Vero细胞系、DL-2621细胞系或PAM细胞。
22.按照权利要求20所述的方法，其特征在于：步骤(1)、(2)、(3)中所述的用于生长猪瘟疫苗的细胞为BT细胞系、Vero细胞系、MPK细胞系、SK6细胞系、PK2a细胞系、CPK细胞系、RKC细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、CRFK细胞系、PT细胞系和ST细胞系或BT细胞。
23.按照权利要求20所述的方法，其特征在于：步骤(1)、(2)、(3)中所述的用于生长猪伪狂犬疫苗的细胞为Marc-145细胞系、MDBK细胞系、BT细胞系。
24.按照权利要求20所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的细胞培养方法包括：在转瓶中培养，使其细胞密度达到5×107/ml-1×108/ml；或者在生物反应器中添加附着载体进行悬浮培养，使其细胞密度达到5×108/ml-1×109/ml。
25.按照权利要求20所述的方法，其特征在于：步骤(2)或(3)中所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗感染剂量(MOI)为0.01-0.5，接种后培养3-5日，当细胞病变达到70%时收获病毒液，用以制备生产毒种和抗原液。
26.按照权利要求20所述的方法，其特征在于：步骤(2)或(3)中所述的猪瘟疫苗的感染剂量(MOI)为0.1-0.5或接种量为3%-5%细胞毒，接种后5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液，收获不超过5次。
27.按照权利要求20所述的方法，其特征在于：步骤(2)或(3)中所述的猪伪狂犬病疫苗的感染剂量(MOI)为0.005-0.5，接种后2-3日收获细胞培养毒液。
28.按照权利要求20所述的方法，其特征在于：步骤(4)中将体积份数为75-80的抗原液与体积份数为25-20的稳定剂混合均匀制备所述疫苗组合物。
29.权利要求20-28任何一项制备方法得到的疫苗组合物，其含有猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗、猪瘟疫苗及猪伪狂犬病疫苗。
30.权利要求1所述的疫苗组合物在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟和猪伪狂犬病的生物制品中的用途。
31.权利要求1或2所述的疫苗组合物在制备猪疫苗的用途，所述猪疫苗用于免疫猪。
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