KR20140036262A - 돼지 바이러스 감염의 예방을 위한 혼합 백신 - Google Patents

돼지 바이러스 감염의 예방을 위한 혼합 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서로에 대해 면역 억제가 실질적으로 없는 PRRSV 백신 및 2차 돼지 바이러스 백신을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 2차 돼지 바이러스 백신은 CSFV 및/또는 PRV일 수 있다. 백신 및 제제에 대한 제조 방법이 또한 제공된다. 본 발명에 제공된 백신 조성물은 돼지 생식기 호흡기 증후군, 돼지 열병 및/또는 가성광견병에 대항하여 돼지에 보호 면역성을 제공한다.

Description

돼지 바이러스 감염의 예방을 위한 혼합 백신{Combined Vaccines for Prevention of Porcine Virus Infections}
본 발명은 수의학적인 생물학적 생성물, 특히 돼지 생식기 호흡기 증후군, 돼지 열병 및 돼지 가성광견병 바이러스를 예방하기 위한 생 혼합 백신 및 이의 제제에 관한 것이다.
돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)은 전세계 여러 곳에서 돼지 산업을 위협하는 주요 감염 질병 중 하나이다. 2006년 중국에서 고 병원성 돼지 생식기 호흡기 증후군(고 병원성 청이병으로도 불림)의 발생 이후, PRRS는 중국 돼지 산업에 큰 경제적 손실을 일으켰고 중국 농무부에 의해 강제 백신이 요구되는 질병 중 하나로서 기재되었다.
PRRS 이외에, 돼지는 돼지 열병(CSF) 및 가성광견병과 같은 다른 감염 질병에 의해 추가로 감염될 수 있다. 그러나, PRRS 바이러스(PRRSV)는 숙주를 감염시킨 후 면역 억제를 유도하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 주로 2차 감염에 대한 감소된 면역 반응 또는 심지어 백신접종 실패를 초래한다. 연구들이 PRRSV는, 예를 들어, 면역 반응을 발생시키는데 중요한 폐포 대식세포를 파괴 및/또는 2차 감염에 대한 면역 방어를 제공하는 사이토카인 발현을 억제함으로써 숙주 면역계를 손상시키는 것을 입증하였다. 예를 들어, PRRSV 감염은 돼지 열병 바이러스(CSFV) 백신에 대한 숙주 면역 반응을 현저하게 억제하여, 심지어 CSFV 백신접종 실패를 초래하는 것으로 밝혀졌다(Suradhat, S. et al, Vaccine, 24: 2634-3642 (2006); Li, H. et al, Veterinary Microbiology, 95: 295-301 (2003)). 약독 PRRSV 및 약독 CSFV의 공동 백신접종은 약 60%의 감소된 면역 보호율을 갖는 것으로 보고되며, 이는 백신접종 조건을 충족하지 못한다. 두 병원균에 대해 접종을 하기 위해서, 14일 간격으로 분리된 개별 백신접종이 필요하다(예를 들어, Du, X.Z. et al, Zhejiang Journal Animal Science and Veterinary Medicine, 2: p5-6 (2011) 참조). 다른 예의 경우, PRRSV는 가성광견병 바이러스(PRV)의 백신접종 효과에 부정적인 영향을 미치며 PRV에 대한 숙주 면역 반응을 현저하게 감소시키거나 지연하는 것으로 밝혀졌다(De Bruin, M.G.M. et al, Veterinary Immunology and Immunopathology, 76(1-2): p125-135 (2000)).
PRRSV의 면역 억제는 돼지에 대한 백신접종법을 복잡하게 하고 백신접종 효과 및 효율을 감소시키는 경향이 있다. 돼지가 PRRSV 및 다른 바이러스에 대해 접종될 때, 주로 반복적 주사와 수회 투약을 실시하는 것이 필수적이어서, 백신접종 과정을 시간이 소요되고, 일이 많고 비용이 많이 들게 한다. 또한, 수회 백신접종법에서, 투약을 놓치면 백신의 보호 효과에 직접적인 영향을 미칠 수 있는 반면 빈번하고 반복된 백신접종은 면역 마비를 초래할 수 있고 면역학적 스트레스를 유도할 수 있다.
따라서, 상당한 면역 억제가 없는, PRRSV 및 다른 돼지 감염 질병에 대한 혼합 백신 조성물에 대한 많은 요구가 존재한다.
본 발명의 한 양태는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 백신 및 2차 돼지 바이러스 백신을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이며, PRRSV 백신 및 2차 백신은 서로에 대해 면역 억제가 실질적으로 없다. 특정 실시태양에서, 백신 조성물은 3차 돼지 백신 바이러스를 더 포함하며, PRRSV 백신, 2차 백신 및 3차 백신은 서로에 대해 면역 억제가 실질적으로 없다.
특정 실시태양에서, 2차 돼지 바이러스 백신은 돼지 열병 바이러스(CSFV) 백신 및 가성광견병 바이러스(PRV) 백신으로부터 선택된다. 특정 실시태양에서, 3차 돼지 바이러스 백신은 돼지 열병 바이러스(CSFV) 백신 및 가성광견병 바이러스(PRV) 백신으로부터 선택된다. 2차 백신은 3차 백신과 다르다.
특정 실시태양에서, 백신 조성물은 PRRSV 백신, CSFV 백신 및 PRV 백신을 포함하며, PRRSV 백신, CSFV 백신 및 PRV 백신은 서로에 대해 면역 억제가 실질적으로 없다.
특정 실시태양에서, PRRSV 백신은 약독 PRRSV를 포함한다. 특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 4와 비교할 때, 적어도 50개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 단편이 결핍된 DNA 서열에 의해 암호화된 Nsp2 뉴클레오티드를 포함하며, 단편은 SEQ ID NO: 8의 동일한 길이 부분과 적어도 약 80% 상동이다. 특정 실시태양에서, DNA 단편은 적어도 100, 적어도 120, 적어도 150, 적어도 180, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220, 적어도 230, 적어도 240, 적어도 250, 적어도 260, 적어도 270, 적어도 280, 적어도 290, 적어도 300, 적어도 310, 적어도 320, 적어도 330, 적어도 340, 적어도 350, 또는 적어도 360개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시태양에서, DNA 단편은 SEQ ID NO: 8의 동일한 길이 부분과 적어도 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 상동이다. 특정 실시태양에서, DNA 단편은 SEQ ID NO: 8을 포함한다.
특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 11과 비교할 때, 적어도 20개 연속 아미노산을 포함하는 펩타이드 단편이 결핍된 Nsp2 단백질 서열을 암호화하는 Nsp2 뉴클레오티드를 포함하며, 단편은 SEQ ID NO: 9의 동일한 길이 부분과 적어도 약 80% 상동이다. 특정 실시태양에서, 펩타이드 단편은 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100, 적어도 105, 적어도 110, 적어도 115, 또는 적어도 120개 연속 아미노산을 포함한다. 특정 실시태양에서, 펩타이드 단편은 SEQ ID NO: 9의 동일한 길이 부분과 적어도 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 상동이다. 특정 실시태양에서, DNA 단편은 SEQ ID NO: 9를 포함한다.
특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 고 병원성 PRRSV로부터 약독된다. 특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 5와 비교할 때, SEQ ID NO: 6 내에 불연속 90개 뉴클레오티드가 결핍된 DNA 서열에 의해 암호화된 Nsp2 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시태양에서, Nsp2 뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 실시태양에서, Nsp2 뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 2를 포함하는 서열에 의해 암호화된다.
특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 SEQ ID NO:1과 적어도 90% 상동성을 가진 서열에 의해 암호화되는 Nsp1 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 1에 의해 암호화된 Nsp1 뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NO: 2에 의해 암호화된 Nsp2 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 3와 적어도 90% 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된 PRRSV 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 3에 의해 암호화된 PRRSV 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 CGMCC No.:3121의 미생물 수탁 번호를 가진다.
특정 실시태양에서, CSFV 백신은 약독 CSFV를 포함한다. 특정 실시태양에서, 약독 CSFV는 SEQ ID NO: 10과 적어도 80% 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된다. 특정 실시태양에서, 약독 CSFV는 SEQ ID NO: 10에 의해 암호화된다. 특정 실시태양에서, 약독 CSFV는 CGMCC No.:3891의 미생물 수탁 번호를 가진다.
특정 실시태양에서, PRV 백신은 약독 PRV를 포함한다. 특정 실시태양에서, 약독 PRV는 NC_006151의 NCBI 참조 번호를 가진 서열과 적어도 80% 상동성을 가진 서열을 포함한다.
특정 실시태양에서, 약독 PRV는 TK, PK, RR, dUTPase, gG, gC, gE, gD 및 gI로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 불활성 유전자를 가진다. 특정 실시태양에서, 약독 PRV는 불활성 gE 유전자를 가진다. 특정 실시태양에서, 약독 PRV는 CGMCC No.:5076의 미생물 수탁 번호를 가진다.
특정 실시태양에서, 본 발명에 제공된 백신 조성물은 면역학적 유효량의 PRRSV 백신, CSFV 백신 및/또는 PRV 백신을 포함한다. 특정 실시태양에서, PRRSV 백신의 면역학적 유효량은 적어도 104.5 TCID50, 105.0 TCID50, 또는 105.5 TCID50이며, CSFV 백신의 면역학적 유효량은 적어도 100.5 FA-TCID50 (형광 항체 - TCID50), 101.0 FA-TCID50, 101.5 FA-TCID50, 102.0 FA-TCID50, 102.5 FA-TCID50, 103.0 TCID50, 103.5 FA-TCID50, 104.0 FA-TCID50, 104.5 FA-TCID50, 또는 105.0 FA-TCID50이거나 적어도 2.5 RID (토끼 감염량), 3 RID, 5 RID, 10 RID, 30 RID, 100 RID, 150RID, 300 RID, 750RID, 1000 RID, 3000 RID 또는 7500 RID이며, 및/또는 PRV 백신의 면역학적 유효량은 적어도 103.0 TCID50, 103.5TCID50, 104.0TCID50, 104.5TCID50, 105.0TCID50, 105.5 TCID50 또는 106.0 TCID50이다.
특정 실시태양에서, 혼합 백신에서 PRRSV 백신 대 CSFV 백신의 TCID50 비는 10000:1 내지 1:1이다. 특정 실시태양에서, 혼합 백신에서 PRRSV 백신 대 PRV 백신의 TCID50 비는 1:1 내지 1:30이다. 특정 실시태양에서, 혼합 백신에서 PRRSV 백신 : CSFV 백신 : PRV 백신의 TCID50 비는 약 104: 1: 105 내지 약 5:1:6이다.
특정 실시태양에서, 백신 조성물은 항원보강제를 더 포함한다. 특정 실시태양에서, 백신 조성물은 동결방지제를 더 포함한다. 특정 실시태양에서, 동결방지제는 수크로오스, L-소듐 글루타메이트 및/또는 락트알부민 가수분해물을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 개개의 감수성이 있는 세포(susceptible cell)에서 배양된 PRRSV 백신 균주, CSFV 백신 균주 및/또는 PRV 백신 균주를 수집하는 단계 및 (b) 적절한 TCID50 비율로 둘 이상의 바이러스 균주를 혼합하는 단계를 포함하여, 본 발명에 제공된 백신 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
특정 실시태양에서, PRRSV 백신 균주에 대한 감수성이 있는 세포는 Marc-145, MA-104, Vero, 및 CL-2621로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포주 또는 PAM 세포인 프라이머리 세포이다. 특정 실시태양에서, CSFV 백신 균주에 대한 감수성이 있는 세포는 BT, Vero, MPK, SK6, PK2a, CPK, RKC, MDBK, MDCK, CRFK, ST, 및 PT로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포주 또는 BT 세포인 프라이머리 세포이다. 특정 실시태양에서, PRV 백신 균주에 대한 감수성이 있는 세포는 ST, PK-15, Marc-145, MDBK, BT, Vero, BHK-21, 돼지 신장 세포주(IBRS-2), 토끼 신장 세포주(RK), 및 닭 배아 섬유아세포 세포주로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포주 또는 돼지 신장 프라이머리 세포인 프라이머리 세포이다.
특정 실시태양에서, 배양은 롤러 병 배양액에서 1x106/ml-5x106/ml의 세포 밀도로 또는 현탁 배양액에서 5x106/ml-1x107/ml의 세포 밀도로 감수성이 있는 세포에 대한 각 백신 균주를 바이오리액터에 주입된 부착 담체로 접종하는 것을 포함한다.
특정 실시태양에서, PRRSV 백신 균주는 0.01-0.5의 다중감염도(MOI)로 접종되며, CSFV 백신 균주는 0.1-0.5의 MOI로 접종, 및/또는 PRV 백신 균주는 0.005-0.5의 MOI로 접종된다.
특정 실시태양에서, 단계(b)는 10000:1 내지 1:1의 TCID50 비율로 수집된 PRRSV 백신 바이러스를 CSFV 백신 바이러스와 혼합하는 단계를 포함한다. 특정 실시태양에서, 단계(b)는 1:1 내지 1:30의 TCID50 비율로 수집된 PRRSV 백신 바이러스를 PRV 백신 바이러스와 혼합하는 단계를 포함한다. 특정 실시태양에서, 단계(b)는 104:1:105 내지 약 5:1:6의 TCID50 비율로 수집된 PRRSV 백신 바이러스, CSFV 백신 바이러스 및 PRV 백신 바이러스를 혼합하는 단계를 포함한다.
특정 실시태양에서, 단계(b)는 수집된 바이러스 용액의 혼합물과 동결방지제를 혼합하는 단계를 더 포함한다. 특정 실시태양에서, 수집된 바이러스 용액의 혼합물은 75-80 : 25-20의 부피비로 동결방지제와 혼합된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 방법을 사용하여 제조된 백신 조성물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 PRRS, CSF 및/또는 PR를 예방 또는 치료하기 위한 의약의 제조에서 본 발명에 제공된 백신 조성물의 용도를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 백신 조성물을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하여 돼지를 면역화하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 ST, PK-15, Marc-145, MDBK, BT, Vero, BHK-21, 돼지 신장 세포주(IBRS-2), 토끼 신장 세포주(RK), 및 닭 배아 섬유아세포 세포주로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포주 또는 돼지 신장 프라이머리 세포인 프라이머리 세포에서 배양된 CSFV 백신 균주를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 CSFV 백신 균주를 배양하는데 이런 세포주의 용도를 제공한다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 PRRSV TJM 균주의 서열을 암호화하는 Nsp2에 존재하지 않으나, PRRSV TJ 균주의 Nsp2 뉴클레오티드 서열에 존재하는 360개 연속 뉴클레오티드를 도시한다.
도 2는 PRRSV TJM 균주의 서열에 의해 암호화된 Nsp2 단백질에 존재하지 않으나, PRRSV TJ 균주의 Nsp2 단백질에 존재하는 120개 아미노산 서열을 도시한다.
도 3은 고 병원성 PRRSV 균주의 Nsp2 암호화 서열에서 90개 뉴클레오티드 결실, 및 약독 PRRSV TJM 균주에서 90개 뉴클레오티드 결실 및 360개 뉴클레오티드 결실을 도시하는 개략도이다.
도 4는 고 병원성 PRRSV 균주에 존재하지 않으나 PRRSV VR-2332 균주에 존재하는 불연속 90개 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 5는 각각 PRRSV TJM 백신 균주(레인 2), 고 병원성 PRRSV TJ 유독성 균주(레인 1) 및 물(레인 3, 음성 대조군)의 전기영동 이미지를 도시한다. M은 분자량 마커를 의미한다.
도 6은 각각 PRV 백신 균주(레인 1), 유독성 균주(레인 2) 및 물(레인 3, 음성 대조군)의 전기영동 이미지를 도시한다. M은 분자량 마커를 의미한다.
도 7은 PRRSV TJM 단일 백신, CSFV C 균주(F16) 단일 백신 및 혼합 백신 또는 음성 대조군으로 접종한 테스트 돼지들에서 CD3+ T 세포의 변화(%)를 도시한다.
도 8은 PRRSV TJM 단일 백신, CSFV C 균주(F16) 단일 백신 및 혼합 백신 또는 음성 대조군으로 접종한 테스트 돼지들에서 CD4+ T 세포의 변화(%)를 도시한다.
도 9는 PRRSV TJM 단일 백신, CSFV C 균주(F16) 단일 백신 및 혼합 백신 또는 음성 대조군으로 접종한 테스트 돼지들에서 CD8+ T 세포의 변화(%)를 도시한다.
도 10은 PRRSV TJM 단일 백신, CSFV C 균주(F16) 단일 백신, PRRSV 및 CSFV에 대한 혼합 백신 또는 음성 대조군으로 접종한 테스트 돼지들에서 CD4+CD8+ T 세포의 변화(%)를 도시한다.
도 11은 PRRSV TJM 단일 백신, PRRSV TJM 및 CSFV C 균주(F16)에 대한 혼합 백신 또는 음성 대조군으로 접종한 돼지들에서 PRRSV 항체 역가(ELISA에 의해 측정)를 도시한다.
도 12는 CSFV C 균주(F16) 단일 백신, PRRSV TJM 및 CSFV C 균주(F16)에 대한 혼합 백신 또는 음성 대조군으로 접종한 돼지들에서 CSFV 항체 역가(ELISA에 의해 측정)를 도시한다.
도 13은 PRRSV TJM 단일 백신, CSFV C 균주(F16) 단일 백신, PRRSV TJM 및 CSFV C 균주(F16)에 대한 혼합 백신 또는 음성 대조군에 의한 백신접종 후 돼지들의 직장 온도를 도시한다.
도 14는 PRRSV 유독성 바이러스에 의한 공격 접종(challenge) 후 돼지들의 직장 온도를 도시하며, 돼지들은 PRRSV TJM 단일 백신, PRRSV TJM 및 CSFV C 균주(F16)에 대한 혼합 백신 또는 음성 대조군으로 접종되었다.
도 15는 CSFV 유독성 바이러스에 의한 공격 접종 후 돼지들의 직장 온도를 도시하며, 돼지들은 CSFV C 균주(F16) 단일 백신, PRRSV TJM 및 CSFV C 균주(F16)에 대한 혼합 백신 또는 음성 대조군으로 접종되었다.
도 16은 PRRSV 유독성 바이러스에 의한 공격 접종 후 돼지들의 임상적 증상 점수를 도시하며, 돼지들은 PRRSV TJM 단일 백신, PRRSV TJM 및 CSFV C 균주(F16)에 대한 혼합 백신 또는 음성 대조군으로 접종되었다.
도 17은 CSFV 유독성 바이러스에 의한 공격 접종 후 돼지들의 임상적 증상 점수를 도시하며, 돼지들은 CSFV C 균주(F16) 단일 백신, PRRSV TJM 및 CSFV C 균주(F16)에 대한 혼합 백신 또는 음성 대조군으로 접종되었다.
도 18은 PRRSV 유독성 바이러스에 의한 공격 접종 후 돼지들에서 CD3+ T 세포의 변화(%)를 도시하며, 돼지들은 PRRSV TJM 단일 백신, PRRSV TJM 및 CSFV C 균주(F16)에 대한 혼합 백신 또는 음성 대조군으로 접종되었다.
도 19는 PRRSV 유독성 바이러스에 의한 공격 접종 후 CD4+ T 세포의 변화(%)를 도시한다.
도 20은 PRRSV 유독성 바이러스에 의한 공격 접종 후 CD8+ T 세포의 변화(%)를 도시한다.
도 21은 PRRSV 유독성 바이러스에 의한 공격 접종 후 CD4+ CD8+ T 세포의 변화(%)를 도시한다.
도 22는 CSFV 유독성 바이러스에 의한 공격 접종 후 CD3+ T 세포의 변화(%)를 도시하며, 돼지들은 CSFV C 균주(F16) 단일 백신, PRRSV TJM 및 CSFV C 균주(F16)에 대한 혼합 백신 또는 음성 대조군으로 접종되었다.
도 23은 CSFV 유독성 바이러스에 의한 공격 접종 후 CD4+ T 세포의 변화(%)를 도시한다.
도 24는 CSFV 유독성 바이러스에 의한 공격 접종 후 CD8+ T 세포의 변화(%)를 도시한다.
도 25는 CSFV 유독성 바이러스에 의한 공격 접종 후 CD4+ CD8+ T 세포의 변화(%)를 도시한다.
도 26은 PRRSV 및 PRV에 의한 백신접종 후 항-PRV 중성화 항체의 역가를 도시한다. 그룹 I는 PRRSV TJM 단일 백신 및 PRV Bartha K61 단일 백신으로 연속적으로 접종되었고, 그룹 II는 2-콤보 생백신으로 접종되었고, 그룹 III는 PRV Bartha K61 단일 백신으로 접종되었고, 그룹 IV는 단지 살균 PBS로 접종되었다.
도 27은 37℃에서 14일 동안 저장 후 CSFV 단일 백신 및 2-콤보 백신(PRRSV 및 CSFV)에서 CSFV C 균주(F16)의 바이러스 역가를 도시한다. 200904, 200905 및 200906은 2-콤보 백신의 3개 배치를 나타내며, 200901, 200902 및 200903은 PRRSV TJM 단일 백신의 3개 배치를 나타낸다.
도 28은 37℃에서 14일 동안 저장 후 PRRSV TJM 단일 백신 및 2-콤보 백신(PRRSV 및 CSFV)에서 PRRSV TJM 균주의 바이러스 역가를 도시한다. 200904, 200905 및 200906은 2-콤보 백신의 3개 배치를 나타내며, 200907, 200908 및 200909는 CSFV C 균주(F16)의 3개 배치를 나타낸다.
도 29는 2-8℃에서 18개월 동안 저장 후 CSFV 단일 백신 및 2-콤보 백신(PRRSV 및 CSFV)에서 CSFV C 균주(F16)의 바이러스 역가를 도시한다. 200904, 200905 및 200906은 2-콤보 백신의 3개 배치를 나타내며, 200901, 200902 및 200903은 PRRSV TJM 단일 백신의 3개 배치를 나타낸다.
도 30은 2-8℃에서 18개월 동안 저장 후 PRRSV TJM 단일 백신 및 2-콤보 백신(PRRSV 및 CSFV)에서 PRRSV TJM 균주의 바이러스 역가를 도시한다. 200904, 200905 및 200906은 2-콤보 백신의 3개 배치를 나타내며, 200907, 200908 및 200909는 CSFV C 균주(F16)의 3개 배치를 나타낸다.
도 31은 2-8℃에서 24개월 동안 저장 후 2-콤보 백신(PRRSV 및 CSFV)에서 PRRSV TJM 균주의 바이러스 역가를 도시한다. SD001, SD002 및 SD003는 각각 2-콤보 생백신의 3개의 다른 배치를 나타낸다.
도 32는 2-8℃에서 24개월 동안 저장 후 2-콤보 백신(PRRSV 및 CSFV)에서 PRV Bartha K61 균주의 바이러스 역가를 도시한다. SD001, SD002 및 SD003는 각각 2-콤보 생백신의 3개의 다른 배치를 나타낸다.
도 33은 37℃에서 14일 동안 저장 후 2-콤보 백신(PRRSV 및 CSFV)에서 PRRSV TJM 균주의 바이러스 역가를 도시한다. SD001, SD002 및 SD003는 각각 2-콤보 생백신의 3개의 다른 배치를 나타낸다.
도 34는 37℃에서 14일 동안 저장 후 2-콤보 백신(PRRSV 및 CSFV)에서 PRV Bartha K61 균주의 바이러스 역가를 도시한다. SD001, SD002 및 SD003는 각각 2-콤보 생백신의 3개의 다른 배치를 나타낸다.
도 35는 2-8℃에서 18개월 동안 저장 후 3-콤보 생백신(PRRSV TJM + CSFV C 균주(F16) + PRV Bartha K61)에서 PRRSV TJM 균주의 바이러스 역가를 도시한다. 031-01, 031-02 및 031-03는 3-콤보 생백신의 3개 배치를 나타내며, 031-04, 031-05 및 031-06은 PRRSV TJM 단일 백신의 3개 배치를 나타낸다.
도 36은 2-8℃에서 18개월 동안 저장 후 3-콤보 생백신(PRRSV TJM + CSFV C 균주(F16) + PRV Bartha K61)에서 CSFV C 균주(F16)의 바이러스 역가를 도시한다. 031-01, 031-02 및 031-03는 3-콤보 생백신의 3개 배치를 나타내며, 031-07, 031-08 및 031-09는 CSFV C 균주(F16) 단일 백신의 3개 배치를 나타낸다.
도 37은 2-8℃에서 18개월 동안 저장 후 3-콤보 생백신(PRRSV TJM + CSFV C 균주(F16) + PRV Bartha K61)에서 PRV Bartha K61 균주의 바이러스 역가를 도시한다. 031-01, 031-02 및 031-03는 3-콤보 생백신의 3개 배치를 나타내며, 031-10, 031-11 및 031-12는 PRV Bartha K61 단일 백신의 3개 배치를 나타낸다.
도 38은 37℃에서 14일 동안 저장 후 3-콤보 생백신(PRRSV TJM + CSFV C 균주(F16) + PRV Bartha K61)에서 PRRSV TJM 균주의 바이러스 역가를 도시한다. 031-01, 031-02 및 031-03는 3-콤보 생백신의 3개 배치를 나타내며, 031-04, 031-05 및 031-06은 PRRSV TJM 단일 백신의 3개 배치를 나타낸다.
도 39는 37℃에서 14일 동안 저장 후 3-콤보 생백신(PRRSV TJM + CSFV C 균주(F16) + PRV Bartha K61)에서 CSFV C 균주(F16)의 바이러스 역가를 도시한다. 031-01, 031-02 및 031-03는 3-콤보 생백신의 3개 배치를 나타내며, 031-07, 031-08 및 031-09는 CSFV C 균주(F16) 단일 백신의 3개 배치를 나타낸다.
도 40은 37℃에서 14일 동안 저장 후 3-콤보 생백신(PRRSV TJM + CSFV C 균주(F16) + PRV Bartha K61)에서 PRV Bartha K61 균주의 바이러스 역가를 도시한다. 031-01, 031-02 및 031-03는 3-콤보 생백신의 3개 배치를 나타내며, 031-10, 031-11 및 031-12는 PRV Bartha K61 단일 백신의 3개 배치를 나타낸다.
다음 설명은 단지 본 발명의 다양한 실시태양을 설명하려는 것이다. 이와 같이, 논의된 특정 변형은 제한적인 것으로 생각되지 않는다. 당업자는 여러 등가물, 변화 및 변형이 본 발명에 제공된 주제의 취지 또는 범위로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것을 알 것이며, 이런 등가 실시태양들이 본 발명에 포함될 것이 이해된다. 본 발명에서 인용된 모든 공보, 특허 또는 특허출원은 전문이 참조로 포함된다.
본 발명의 한 양태는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 백신 및 2차 돼지 바이러스 백신을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이며, PRRSV 백신 및 2차 백신은 서로에 대해 실질적으로 면역 억제가 없다.
PRRSV는 양성 가닥 RNA 바이러스이며, 이에 대해 2개의 유전자형이 현재 동정되었다: 유럽인 유전자형 및 미국인 유전자형. PRRSV의 지놈은 여러 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 여기서 제 1 오픈 리딩 프레임(ORF1a 및 ORF1b)은 PRRSV 지놈에서 서열의 80%를 포함하며 PRRSV 복제에 필요한 RNA 복제효소를 암호화한다(Straw et al, Diseases of Swine, 9TH edition, chapter 24(2006)). ORF1a 및 ORF1b는 폴리-단백질로 번역되며, 그 안에 포함된 단백질 분해효소 도메인에 의해 Nsp1-Nsp12를 포함하는 여러 비 구조 단백질로 절단된다(예를 들어, Vries et al, Seminars in Virology, 8: 33-47 (1997); Allende et al, Journal of General Virology, 80: 307-315(1999) 참조).
PRRSV 백신 및 2차 돼지 바이러스 백신은 서로에 대해 실질적으로 면역 억제가 없다.
본 발명에 사용된 용어 "실질적으로 면역 억제가 없다"는 둘 이상의 단일 백신의 혼합이 단일 백신들의 하나 또는 단일 백신들의 전부에 대해 숙주에서 보호 면역 반응에 실질적인 감소를 유도하지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명에서 사용된 용어 "실질적인 감소"는 ≥20% 감소를 의미한다(예를 들어, ≥30%, ≥40%, ≥50%, 또는 ≥60% 감소).
특정 실시태양에서, 둘 이상의 단일 백신의 혼합은 단일 백신에 의해 유발된 수준에 필적할만한 수준으로 단일 백신들의 각각에 대한 보호 면역 반응을 유발할 수 있다. 예를 들어, 혼합 PRRSV 백신 및 2차 돼지 바이러스는 PRRSV 단일 백신에 의해 유발된 수준에 필적할만한 수준인 PRRSV에 대한 면역 반응을 유발할 수 있으며 및/또는 2차 돼지 바이러스 단일 백신에 의해 유발된 수준에 필적할만한 수준인 2차 돼지 바이러스 백신에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다.
보호 면역 반응은 통상적으로 체액, 세포 및/또는 점막 면역 반응을 포함하며, 당업계에 공지된 방법들을 사용하여 묘사될 수 있다. 체액 면역 반응은 항원에 대항하여 혈청에서 항체들(예를 들어, IgG)의 생산에 의해 발생한다. 항체 역가는 ELISA(효소 결합 면역흡착 분석법)와 같은 분석법을 사용하여 쉽게 측정될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 항원이 고체 지지체 상에 코팅될 수 있고, 그런 후에 항체를 포함하는 것으로 생각되는 샘플과 접촉된 후, 항원-항체 복합체의 형성의 측정이 뒤따른다. 세포 면역 반응은 주로 세포독성 T 림프구의 발생으로부터 기인하며, 흐름세포분석기와 같은 방법을 사용하여 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 CD4+CD8+ T 세포와 같은 T 세포의 특정 하부집단의 특정을 통해 묘사될 수 있다. 간단하게, T 세포는 특정 표면 마커에 대항하여 항체들로 염색되며 표면 마커의 존재에 따라 상이한 하부집단으로 분류되고 정량화된다. 점막 면역 반응은 통상적으로 점막 표면상에 발생된 분비성 IgA로부터 기인한다.
특정 실시태양에서, 혼합 백신 조성물로서 투여될 때, PRRSV 백신 및 2차 돼지 바이러스 백신은 PRRSV 백신 및/또는 2차 돼지 바이러스 백신에 반응하여 숙주에서 항체 생산을 실질적으로 감소시키지 않는다.
특정 실시태양에서, 혼합 백신 조성물로서 투여될 때, PRRSV 백신 및 2차 돼지 바이러스 백신은 PRRSV 백신 및/또는 2차 돼지 바이러스 백신에 반응하여 숙주에서 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및/또는 CD4+CD8+ T 세포의 수준을 실질적으로 감소시키지 않는다.
특정 실시태양에서, PRRSV 백신은 약독 PRRSV을 포함한다. 본 발명에서, 사용된 "약독 PRRSV"는 숙주를 감염시킬 수 있으나 돼지 생식기 호흡기 증후군을 일으키지 않거나 더 약하고 및/또는 더 온화한 증상을 가진 PRRSV를 의미한다. 약독 PRRSV는 생 약독 PRRSV 및 이의 불활성화 생성물을 포함한다. 본 발명에서 사용된 "돼지 생식기 호흡기 증후군"(PRRS)은 자연 발생 PRRSV의 감염 후 일련의 생리학적 및 병리학적 증후군을 의미한다. 증상은 다른 것들 중에서 열, 어지러움, 식욕감퇴, 나른함, 호흡곤란, 기침, 돼지 번식 장애 및 새끼 돼지 느린 성장 또는 사망을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 4와 비교할 때, 적어도 50개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 단편이 결핍된 DNA 서열에 의해 암호화된 Nsp2 뉴클레오티드를 포함하며, 단편은 SEQ ID NO: 8의 동일한 길이 부분과 적어도 약 80% 상동이다.
본 발명에 사용된 용어 "DNA 서열에 의해 암호화된"은 상응하는 RNA 서열로 전사될 수 있는 DNA 서열을 의미한다. PRRSV 및 CSFV와 같은 단일 가닥 RNA는 왓슨 크릭 염기쌍을 기초로 한 DNA 분자에 의해 암호화될 수 있는 단일 가닥 RNA 분자로 구성되는 지놈을 가진다. 전사될 때, 이런 DNA 분자는 바이러스 지놈에서 RNA 서열과 동일한 양성 가닥 RNA 분자를 생산할 수 있다.
이론에 한정되지 않고, SEQ ID NO: 8에 상동인 부분 내에 Nsp2 서열에 이런 뉴클레오티드 단편의 부존재가, 예를 들어, 비 기능적인 또는 덜 기능적인 Nsp2 단백질을 생산하고 및/또는 다른 PRRSV 단백질의 발현 또는 기능에 부정적인 영향 및/또는 PRRSV의 생명 주기에 부정적인 영향을 미침으로써 PRRSV의 유독성뿐만 아니라 면역 억제력을 감소시킬 수 있다고 생각된다.
결핍된 단편은 PRRSV의 유독성뿐만 아니라 면역 억제를 PRRSV 유독성을 없애고 다른 공동 감염된 바이러스 또는 백신에 대한 면역성을 손상시키지 않고 PRRSV에 대한 보호 면역성을 유도하는데 충분한 정도로 감소시킬 수 있는 한 임의의 적절한 길이일 수 있다. 예를 들어, 결핍된 DNA 단편은 적어도 100, 적어도 120, 적어도 150, 적어도 180, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220, 적어도 230, 적어도 240, 적어도 250, 적어도 260, 적어도 270, 적어도 280, 적어도 290, 적어도 300, 적어도 310, 적어도 320, 적어도 330, 적어도 340, 적어도 350, 또는 적어도 360개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 결핍된 뉴클레오티드 단편의 길이는 범위가 본 발명에 명백하게 기재된 경우, 위에 제공된 대로 두 값 중 임의의 것에 의해 정해진 범위 내에 있을 수 있다. 특정 실시태양에서, 결핍된 뉴클레오티드 단편은 약 300개 연속 뉴클레오티드, 약 310, 약 320, 약 330, 약 340, 약 350 또는 약 360개 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
당업자는 SEQ ID NO: 8에 상동인 부분 내에 Nsp2 뉴클레오티드 서열에 다양한 결실을 가진 재조합 바이러스를 쉽게 제조할 수 있고 당업계에 공지된 방법 및 본 발명에 제공된 방법을 사용하여, 생존력, 유독성 및 면역 억제력에 대해 이들 재조합 바이러스를 테스트할 수 있다. 예를 들어, Nsp2에 결실을 포함하는 재조합 PRRSV의 유독성을 일으키고 테스트하는 것에 관해서, 방법들이 Kim, Dal-Young et al, Virus Genes, 38: 118-128 (2009)에 기술되었다. 재조합 PRRSV의 면역 억제를 테스트하는 것에 관해서, 방법이 Suradhat, S. et al, Vaccine, 24: 2634-3642 (2006) 및 본 발명의 실시예에 기술되었다. SEQ ID NO: 8에 상동인 부분 내의 단편을 결실시킴으로써(예를 들어, 부분에서 1st부터 50th 뉴클레오티드까지, 2nd부터 60th 뉴클레오티드까지, 5th부터 100th 뉴클레오티드까지 결실시킴으로써), 관심 Nsp2 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 PRRSV를 제조할 수 있고 세포변성 플라크를 형성하는 능력에 대해 생존가능한 재조합 PRRSV 균주를 추가로 테스트할 수 있어서, 2차 돼지 바이러스 균주에 대해 면역 억제력을 위해 약독 재조합 PRRSV 균주가 되고 돼지에서 추가로 테스트될 수 있다.
특정 실시태양에서, 결핍된 DNA 단편은 SEQ ID NO: 8의 동일한 길이 부분과 적어도 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 상동이다. 특정 실시태양에서, 결핍된 DNA 단편은 SEQ ID NO: 8을 포함한다. 특정 실시태양에서, 결핍된 DNA 단편은 SEQ ID NO: 8이다(도 1 참조).
특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 11과 비교할 때, 적어도 20개 연속 아미노산을 포함하는 펩타이드 단편이 결핍된 Nsp2 단백질 서열을 암호화하는 Nsp2 뉴클레오티드를 포함하며, 펩타이드 단편은 SEQ ID NO: 9의 동일한 길이 부분과 적어도 약 80% 상동이다.
본 발명에 사용된 용어 "을 암호화하는"은 유전자 코돈에 따라 상응하는 아미노산 서열로 번역될 수 있는 RNA 서열을 의미한다.
이론에 한정되지 않으나, 이런 펩타이드 단편이 결핍된 Nsp2 단백질은 덜 기능적이거나 비기능적이라서, PRRSV의 유독성을 손상시키고 또한 2차 돼지 바이러스 백신에 대한 면역 억제를 감소시킨다고 생각된다.
특정 실시태양에서, 결핍된 펩타이드 단편은 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100, 적어도 105, 적어도 110, 적어도 115 또는 적어도 120개 연속 아미노산을 포함한다. 특정 실시태양에서, 결핍된 DNA 단편은 SEQ ID NO: 9의 동일한 길이 부분과 적어도 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 상동이다. 특정 실시태양에서, 결핍된 DNA 단편은 SEQ ID NO: 9를 포함한다. 특정 실시태양에서, 결핍된 DNA 단편은 SEQ ID NO: 9이다(도 2 참조).
Nsp2 단백질에서 펩타이드 단편의 결핍은 Nsp2 뉴클레오티드 서열을 통해 결정될 수 있다. 예를 들어, Nsp2 뉴클레오티드는 서열화될 수 있고 아미노산 서열로 번역될 수 있고, 결핍된 펩타이드 서열을 동정하기 위해 SEQ ID NO: 11과의 정렬이 뒤따른다.
본 발명에 사용된 "상동성" 또는 "상동한"은 두 아미노산 서열 또는 두 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성을 의미한다. 아미노산 서열들 또는 뉴클레오티드 서열들 사이의 상동성은 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법들을 사용하여 계산될 수 있는데, 예를 들어, 후보 아미노산 (뉴클레오티드) 서열은 참조 아미노산 서열(뉴클레오티드)과 정렬될 수 있고, 필요한 경우 공간을 제공하여, 정렬된 서열들 사이의 동일한 아미노산 잔기(뉴클레오티드)의 최대 수를 얻으며, 이를 기초로 두 아미노산(뉴클레오티드) 서열 사이의 동일한 아미노산 잔기(뉴클레오티드)의 백분율이 계산될 수 있다. 아미노산(또는 뉴클레오티드) 서열들의 정렬 및 이들의 상동성 계산은, 예를 들어, BLAST 프로그램(바이오테크놀러디 정보 국립 센터(NCBI)의 웹사이트에서 이용가능:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，또는 예를 들어, Altschul S.F. et al, J. Mol. Biol.,215:403-410 (1990); Stephen F. et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)) 참조), ClustalW2 소프트웨어(유럽 바이오인포메틱스 인스티츄트의 웹사이트에서 이용가능: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/, 예를 들어, Higgins D.G. et al, Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996); Larkin M.A. et al, Bioinformatics (Oxford,England), 23(21): 2947-8 (2007) 참조); 라르킨 엠.에이. 등, 바이오인포메틱스((Oxford,England), 23(21): 2947-8 (2007)); 및 TCoffee 소프트웨어(스웨덴 바이오인포메틱스 인스티츄트의 웹사이트에서 이용가능: http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi, 또는 예를 들어, Poirot O. et al, Nucleic Acids Res., 31(13): 3503-6 (2003); Notredame C.et al, J. Mol. Boil., 302(1): 205-17(2000) 참조)와 같으나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 소프트웨어를 사용하여 성취될 수 있다. 소프트웨어가 서열들을 정렬하는데 사용될 때, 소프트웨어에 의해 제공된 디폴트 변수들은 실제 상황에 따라 사용되거나 조절될 수 있으며, 이런 것들은 당업자의 지식 범위 내에 있다.
특정 실시태양들에서, 약독 PRRSV는 고 병원성 PRRSV로부터 약독된다.
용어 "고 병원성 PRRSV"는 SEQ ID NO: 5와 비교할 때, SEQ ID NO: 6의 부분(즉, SEQ ID NO: 5의 1440번째 내지 1680번째 단편) 내의 불연속 90개 뉴클레오티드가 결핍된 DNA 서열에 의해 암호화된 Nsp2 뉴클레오티드를 포함하는 PRRSV에 관한 것이다. 이런 90개 불연속 뉴클레오티드가 결핍된 PRRSV 분리물(도 3 참조)은 PRRSV VR-2322 균주보다 높은 병원성을 갖는 것으로 발견된다(예를 들어, Tian et al, PLoS ONE 2(6): e526, (2007) doi:10.1371 참조). 특정 실시태양에서, 불연속 90개 뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 5의 1440 내지 1442 뉴클레오티드로부터의 "TTT" 및 SEQ ID NO: 7에 도시된 서열을 포함한다(예를 들어, 도 4 참조).
특정 실시태양에서, 고 병원성 PRRSV는 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 서열(즉 PRRSV TJ 균주의 Nsp2 뉴클레오티드 서열)에 의해 암호화된 Nsp2 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시태양에서, 고 병원성 PRRSV는 PRRSV TJ 균주이며, 이의 지놈은 EU860248의 진뱅크 등록번호를 가진 서열에 의해 암호화된다.
특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 고 병원성 PRRSV로부터 약독되며, SEQ ID NO: 5와 비교할 때, 불연속 90개 뉴클레오티드가 결핍된 Nsp2 뉴클레오티드를 포함하며, 불연속 90개 뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 6 내에 있다.
특정 실시태양에서, 약독 PRRSV의 Nsp2 뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 상동성을 가진 서열(즉, PRRSV TJM 균주의 Nsp2 뉴클레오티드를 암호화하는 서열)에 의해 암호화된다. 특정 실시태양에서, Nsp2 뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 2를 포함하는 서열에 의해 암호화된다.
특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 1과 적어도 90% 상동성을 가진 서열(즉, PRRSV TJM 균주의 Nsp1 뉴클레오티드를 암호화하는 서열)에 의해 암호화된 Nsp1 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 1에 의해 암호화된 Nsp1 뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NO: 2에 의해 암호화된 Nsp2 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 상동성을 가진 서열(즉, PRRSV TJM 균주의 지놈을 암호화하는 서열)에 의해 암호화된 PRRSV 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 3에 의해 암호화된 PRRSV 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시태양에서, 약독 PRRSV는 CGMCC No.:3121의 미생물 수탁 번호를 가진다(이런 약독 PRRSV 균주는 또한 본 발명에서 PRRSV TJM 균주로 언급된다).
본 발명에 제공된 PRRSV 백신은 2차 돼지 바이러스 백신에 면역 억제가 실질적으로 없다. 특정 실시태양에서, 2차 돼지 바이러스 백신은 돼지 열병 바이러스(CSFV) 백신 및 가성광견병 바이러스(PRV) 백신으로부터 선택된다.
돼지 열병(CSF)은 돼지 열병 바이러스(CSFV)에 의해 유발된 고 감염성이며 치명적인 돼지 감염성 질병이다. 동물 건강 세계기구(OIE)는 보고될 것이 법으로 요구되는 질병으로 OIE 질병 목록에 이 질병을 포함시켰다. 중국에서, 돼지 열병은 주요 감염성 질병 중 하나이며, 타입 I, II 및 III 동물 질병의 항목"에서 타입 I 동물 질병으로 기입되어 있다. CSF의 발생 및 확산은 중국 및 전세계에서 돼지 산업에 큰 경제적 손실을 일으킨다.
돼지 열병 바이러스(CSFV)는 바이러스의 플라비비리데과 내의 페스티바이러스 종의 일원으로 분류된다. CSFV는 외피보유 양성 가닥 RNA 바이러스이다. 이 바이러스는 전장 길이 12.5kb의 지놈을 가지며, 대략 4000개 아미노산을 포함함 약 438kD의 분자량을 가지는 폴리-단백질을 암호화하는 단지 하나의 대형 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다. 폴리-단백질은 바이러스 및 숙주 단백질 분해효소에 의해 12개 성숙한 단백질로 추가로 처리된다. CSFV의 구조 및 비 구조 단백질의 전부는 이 대형 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된다.
돼지 열병을 제어하는 중요한 도구는 불활성화 백신 및 약독 백신을 포함하는 백신이다. 불활성화 CSFV 백신의 제조는 1950-60대 절정에 달았고, 그 기간 동안 포말린 및 크리스탈 바이올렛 불활성화 CSFV 백신이 널리 사용되었다. 그러나, 이들은 많은 투약량, 짧은 면역 기간, 면역 반응의 느린 발생 및 높은 비용의 단점 때문에 약독 CSFV 백신으로 점차 대체되었다.
특정 실시태양에서, CSFV 백신은 약독 CSFV 백신이다. CSFV 약독 백신 균주는 CSFV 필드 균주의 약독화에 의해 생산될 수 있다. 다른 나라에서의 보고들이, 다른 방법들이 토끼에 CSF 바이러스를 적응시키고 약독 돌연변이 균주를 생산하는데 사용될 수 있다는 것을 증명하였다. 예를 들어, 3개의 약독 백신 균주가 안정하고 효과적이나 잔여 병원성이 없는 것으로 널리 인식된다: 1) 중국 가토화(lapinized) 백신 균주(예를 들어, Qiu, H.J. et al, Scientia Agricultura Sinica, 38(8): 1675-1685 (2005) 참조); 2) 일본 GPE(-) 세포 약독 백신 균주(예를 들어, Liu, C. et al, Chinese Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Vol. 10, pp. 50-51 (2004)); 및 3) 프랑스 "티브오살"(Thiveosal) 감기 약독 백신 균주(예를 들어, Zhu, L. Q. et al, Chinese Veterinary Journal, 39 (2): 33-37 (2005) 참조).
특정 실시태양에서, 약독 CSFV 백신은 중국 가토화 백신 균주(C 균주)이다. CSFV C 균주의 지놈 서열은 SEQ ID NO: 10에 도시된다. 중국 과학자들에 의해 개발된 중국 CSF 가토화 백신(또한 C 균주로 불림)은 1957년 이래로 중국에서 널리 사용되었고 여러 다른 나라에 소개되었고, 그곳에서 돼지 열병이 제어되거나 제거되었다. 이런 백신은 전세계에서 가장 유용한 CSFV 백신 균주 중 하나로 인식되었다.
CSF 가토화 백신(C 균주)은 상이한 제조 방법에 따라 분류될 수 있다. 제 1 방법은 토끼의 백신을 제조하는 단계를 수반한다. 토끼는 CSFV로 접종되고, 림프절, 비장 또는 조직은 토끼로부터 수집되어 비장 및 림프 조직 기원의 CSFV 백신 또는 토끼 기원의 CSFV 백신을 제조한다. 이 방법은 외인성 바이러스의 오염을 효과적으로 예방할 수 있고 바이러스의 유전적 안정성을 보장할 수 있다. 그러나, 많은 토끼가 필요하나 품질은 제어하기 어렵고, 제조 비용은 상대적으로 높다. 제 2 방법은 백신, 즉 세포 기원의 CSFV 백신을 생산하는데 소 또는 양 프라이머리 세포 또는 돼지 세포주를 사용하는 것을 수반한다. 예를 들어, 세포 기원의 CSFV 백신은 세포에 CSF 가토화 바이러스(비장 기원)를 통과시키고 연속 희석에 의해 2 순환의 클론 정제를 실행함으로써 제조될 수 있다. 이 방법은 여러 동물을 사용하는 것을 필요로 하지 않는다. 특정 실시태양에서, CSFV C 균주는 비장 및 림프 조직 기원의 CSFV C 균주이다. 특정 실시태양에서, CSFV C 균주는 세포 기원의 CSFV C 균주이며, 프라이머리 세포 또는 세포주로부터 유래될 수 있다.
특정 실시태양에서, 약독 CSFV는 SEQ ID NO: 10과 적어도 80% 상동성을 가진 서열(즉, CSFV C 균주의 지놈을 암호화하는 서열)에 의해 암호화된다. 특정 실시태양에서, 약독 CSFV는 SEQ ID NO: 10에 의해 암호화된다.
특정 실시태양에서, 약독 CSFV는 CGMCC No.:3891의 미생물 수탁 번호를 가진다(이런 약독 CSFV 균주는 또한 본 발명에서 CSFV C 균주 또는 F16 또는 CSFV C 균주(F16)로 언급된다). CSFV C 균주(F16)는 세포 기원의 CSFV C 균주이다.
특정 실시태양에서, 2차 돼지 바이러스 백신은 가성광견병 바이러스(PRV) 백신이다.
PRV는 헤르페스 바이러스과 및 알파 헤르페스 바이러스아과에 속한다. 현재, 단지 하나의 혈청형의 PRV가 동정되었다. PRV의 지놈은 약 150kb의 길이를 가진 이중 가닥 DNA이다. 바이러스 지놈은 독특한 길이(UL) 영역, 독특한 짧은(US) 영역 및 US 영역을 측면화(flanking)하는 말단 반복 서열 및 내부 반복 서열로 구성된다. 현재, PRV 지놈에 65개 유전자가 위치되었고 이들의 대부분은 기능적으로 묘사되었다. 56개 유전자는 gB, gC, gH, gK, gL, gM, gN, 티미딘 키나아제(TK), 알칼리성 뉴클레아제(AN), 리보뉴클레오티드 환원효소(RR), DNA 중합효소(POL), DBP 유전자, MCP 유전자, ICP 18.5 유전자 및 초기 단백질 O(EPO) 등을 포함하는 UL 영역에 위치되었다. US 영역은 완전히 서열화되었고, 여기에 당단백질 gD, gE, gG, gI 및 단백질 키나아제(PK) 유전자, 11kd 및 28kd 단백질 유전자를 포함하는 7개 유전자가 위치되었다.
특정 실시태양에서, PRV 백신은 약독 PRV를 포함한다. 용어 "약독 PRV 백신"은 숙주를 감염시킬 수 있으나 가성광견병을 일으키지 않거나 감소되거나 덜 심한 증상을 가진 PRV를 의미한다. 약독 PRV는 생 약독 PRV 및 이의 불활성화 생성물을 포함한다. "가성광견병"은 야생형 PRV의 감염에 의해 유발된 일련의 생리학적 및 병리학적 증상을 의미한다. 이런 증상은, 제한 없이, 유산, 사산, 약한 태아, 바싹 마른 태아, 열, 낮은 식욕, 신경학적 증상, 마비, 조직 이상 및 심지어 사망을 포함한다.
특정 실시태양에서, 약독 PRV는 NC_006151의 NCBI 참조 번호를 가진 서열과 적어도 80% 상동성, 예를 들어, 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가진 서열을 포함한다.
특정 실시태양에서, 약독 PRV는 병원성과 관련된 하나 이상의 불활성 유전자를 가진다. "불활성화" 유전자는 완전 또는 부분 서열의 결핍 또는 결실 또는 유전자에 삽입 또는 돌연변이 때문에 기능이 감소되거나 없어진 유전자를 의미한다. PRV 병원성과 관련된 유전자의 예들은, 제한 없이, TK(예를 들어, NCBI Gene ID: 2952559), PK(예를 들어, NCBI Gene ID: 2952530 또는 2952561), RR(예를 들어, NCBI Gene ID: 2952535 또는 2952536), dUTPase(예를 들어, NCBI Gene ID: 2952537), gG(예를 들어, NCBI Gene ID: 2952520), gC(예를 들어, NCBI Gene ID: 2952505), gE(예를 들어, NCBI Gene ID: 2952517), gD(예를 들어, NCBI Gene ID: 2952521) 및 gI(예를 들어, NCBI Gene ID: 2952516)을 포함한다.
특정 실시태양에서, 약독 PRV는 TK, PK, RR, dUTPase, gG, gC, gE, gD 및 gI로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 불활성 유전자를 가진다. 특정 실시태양에서, 약독 PRV는 불활성 gE 유전자를 가진다. 특정 실시태양에서, 단지 gE 유전자가 약독 PRV에서 불활성화된다. 특정 실시태양에서, 약독 PRV는 불활성화 gE 유전자를 가지며, 병원성과 관련된 하나 이상의 불활성 유전자, 예를 들어, TK, PK, RR, dUTPase, gG, gC, gD 및/또는 gI를 더 가진다.
약독 PRV 백신은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, PRV 야생형 균주의 분리물은 비-돼지 세포 또는 난자 태아에 바이러스를 패시징(passaging)하거나 고온 및/또는 돌연변이 유도물의 존재하에서 배양함으로써 약독될 수 있다. 예를 들어, Bartha K61 균주(예를 들어, Bartha, A. Experiments to reduce the virulence of Aujeszky's virus. Magyar allatorvosok lapja 16, 42-45 (1961) 참조), BUK 균주, NIA4 균주, Alfort 균주 및 VGNKI 균주 등인 여러 약독 PRV 백신이 당업계에 공지되어 있다. 이런 약독 PRV 백신은 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 또는 약독 PRV 균주는 추가로 변형될 수 있어서, 병원성과 관련된 하나 이상의 표적 유전자는 불활성화되나 바이러스는 여전히 복제할 수 있다. 예를 들어, PRV-BUK-d13 균주(예를 들어, Kit S. et al, Am. J. Vet. Res., 1985, 46 (6): 1359-1367 참조), PRV dlgC /dlTK 균주(예를 들어, Kit S. et al, Am. J. Vet. Res., 1987, 48 (5): 780-793 참조), S-PRV-002(예를 들어, U.S. 특허 4,514,497 참조), PRV783 균주(예를 들어, Van Oirschot J T et al, Am. J. Vet. Res., 1984, 45 (10): 2099-2103 참조), EL-001 및 PRV376 등과 같은 유전자 처리에 의해 얻은 여러 약독 PRV 백신이 당업계에 공지되어 있다.
특정 실시태양에서, 약독 PRV는 gE 유전자가 결핍된다. 특정 실시태양에서, 약독 PRV는 CGMC No.:5076의 미생물 수탁 번호를 가진다(이런 약독 PRV 균주는 본 발명에서 또한 PRV Bartha K61 균주로 불린다)
특정 실시태양에서, 약독 PRV는 바이러스 복제 또는 숙주 감염에 영향을 미치지 않는 하나 이상의 불활성화 유전자를 더 포함한다. 특정 실시태양에서, 약독 PRV는 PRV 지놈에 존재하지 않는 하나 이상의 이형 유전자를 더 포함한다. 삽입된 이형 유전자는 백신의 탐지 및/또는 분류에 유용하다.
특정 실시태양에서, 백신 조성물은 3차 돼지 백신을 더 포함하며, PRRSV 백신, 2차 돼지 바이러스 백신 및 3차 돼지 바이러스 백신은 서로에 대해 실질적으로 면역 억제가 없다. 특정 실시태양에서, 2차 돼지 백신이 3차 백신과 다른 경우, 3차 돼지 백신은 CSFV 백신 및 PRV 백신으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시태양에서, 백신 조성물은 PRRSV 백신, CSFV 백신 및 PRV 백신을 포함하며, PRRSV 백신, CSFV 백신 및 PRV 백신은 서로에 대해 실질적으로 면역 억제가 없다. 백신 조성물에 혼합될 때, 3개 백신은 PRRSV 백신, CSFV 백신 및/또는 PRV 백신에 반응하여 숙주에서 항체 생산 및/또는 T 세포 하부집단 수준을 실질적으로 감소시키지 않는다. 특정 실시태양에서, PRRSV 백신은 PRRSV TJM 백신을 포함한다. CSFV 백신은 CSFV C 균주를 포함하나 이에 제한되지 않는 본 발명에 제공된 약독 CSFV 중 하나를 포함한다. PRV 백신은, 예를 들어, PRV Bartha K61 균주와 같으나 이에 제한되지 않는 본 발명에 제공된 약독 PRV 균주 중 하나를 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CGMCC NO.3121의 미생물 수탁번호를 가진 PRRSV TJM 균주 및 CSFV C 균주를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 특정 실시태양에서, CSFV C 균주는 CGMCC NO.3891의 미생물 수탁번호를 가진 CSFV F16이다. PRRSV TJM 균주 및 CSFV C 균주(F16)는 서로에 대해 어떠한 면역 억제 또는 면역 억압을 나타내지 않는다. 두 백신 균주는 우수한 안정성, 면역성 및 특이성을 가지며, 돼지 무리에서 주요 유행병 중 둘인 고 병원성 돼지 생식기 호흡기 증후군 및 돼지 열병 모두에 대한 효과적인 보호를 제공할 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 CGMCC NO.3121의 미생물 수탁번호를 가진 PRRSV TJM 균주 및 CGMCC NO.5076의 미생물 수탁번호를 가진 PRV Bartha K61 균주를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. PRRSV TJM 균주 및 PRV Bartha K61 균주는 서로에 대해 어떠한 면역 억제 또는 면역 억압을 나타내지 않는다. 두 백신 균주는 우수한 안정성, 면역성 및 특이성을 가지며, 돼지 무리에서 주요 유행병 중 둘인 고 병원성 돼지 생식기 호흡기 증후군 및 가성광견병 모두에 대한 효과적인 보호를 제공할 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 PRRSV TJM 균주, CSFV C 균주(F16) 및 PRV Bartha K61 균주를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. PRRSV TJM 균주, CSFV C 균주(F16) 및 PRV Bartha K61 균주는 서로에 대해 어떠한 면역 억제 또는 면역 억압을 나타내지 않는다. 세 백신 균주는 우수한 안정성, 면역성 및 특이성을 가지며, 돼지 무리에서 주요 유행병 중 셋인 고 병원성 돼지 생식기 호흡기 증후군, 돼지 열병 및 가성광견병 모두에 대한 효과적인 보호를 제공할 수 있다.
PRRSV TJM 균주의 세부 수탁 정보는 다음과 같다: 미생물 수탁 번호: CGMCC No. 3121; 분류학적 이름: 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스; 수탁 주소: Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, NO.1 West Beichen Road, Chaoyang District, Beijing, China; 수탁 기관: China General Microbiological Culture Collection Center; 및 수탁 날짜: 2009년 6월 15일.
CSFV C 균주(F16)의 세부 수탁 정보는 다음과 같다: 미생물 수탁 번호: CGMCC No. 3891; 분류학적 이름: 돼지 열병 바이러스; 수탁 주소: Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, NO.1 West Beichen Road, Chaoyang District, Beijing, China; 수탁 기관: China General Microbiological Culture Collection Center; 및 수탁 날짜: 2010년 5월 27일.
PRV Bartha K61 균주의 세부 수탁 정보는 다음과 같다: 미생물 수탁 번호: CGMCC No. 5076; 분류학적 이름: 가성광견병 바이러스; 수탁 주소: Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, NO.1 West Beichen Road, Chaoyang District, Beijing, China; 수탁 기관: China General Microbiological Culture Collection Center; 및 수탁 날짜: 2011년 7월21일.
특정 실시태양에서, 본 발명에 제공된 백신 조성물은 면역학적 유효량의 PRRSV 백신, CSFV 백신 및/또는 PRV 백신을 포함한다. 본 발명에 사용된 용어 "면역학적 유효량"은 의도한 항원 또는 병원균에 대항하여 숙주에서 보호 면역반응을 유도하는데 충분한 백신의 양을 의미한다. 예를 들어, 면역학적 유효량은 감염의 하나 이상의 증상의 개시의 감소 또는 지연, 감염된 숙주의 이환률 및/또는 사망률의 감소, 병원균에 대항하여 항체의 충분한 수준의 유도, T 세포 하부집단의 수준의 증가 및 이의 임의의 조합에 충분할 수 있다. 보호 면역반응의 묘사 및/또는 정량화는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 실행될 수 있는데, 예를 들어, 상기한 대로 병원균에 대항하는 항체 역가 및/또는 T 세포 하부집단의 양을 측정하거나 유독 바이러스 공격 접종 후 접종된 돼지의 임상적 징후를 관찰함으로써 실행될 수 있다.
바이러스 백신의 면역학적 유효량은, 예를 들어, 50% 조직 배양 감염 투여량(TCID50)에서 바이러스 역가로 묘사될 수 있다. 특정 실시태양에서, PRRSV 백신의 면역학적 유효량은 적어도 103.0 TCID50, 103.5 TCID50, 104.0 TCID50, 104.5 TCID50, 105.0 TCID50 또는 105.5 TCID50이다. 특정 실시태양에서, PRRSV 백신의 면역학적 유효량은 적어도 104.5 TCID50, 적어도 105.0 TCID50 또는 적어도 105.5 TCID50이다. 특정 실시태양에서, 본 발명에 제공된 백신 조성물은 PRRSV 백신의 약 104.5 TCID50 내지 약 106.0 TCID50, 또는 약 105.0 TCID50 내지 약 106.0 TCID50을 포함한다.
특정 실시태양에서, 면역학적 유효량의 CSFV 백신은 적어도 100.5 FA-TCID50 (형광 항체 - TCID50), 101.0 FA-TCID50, 101.5 FA-TCID50, 102.0 FA-TCID50, 102.5 FA-TCID50, 103.0 TCID50, 103.5 FA-TCID50, 104.0 FA-TCID50, 104.5 FA-TCID50, 또는 105.0 FA-TCID50이다. 특정 실시태양에서, 면역학적 유효량의 CSFV 백신은 104.0 FA-TCID50/ml이다. 특정 실시태양에서, 본 발명에 제공된 백신 조성물은 CSFV 백신의 약 100.5 FA-TCID50 내지 약 105.0 FA-TCID50, 또는 약 104.0 FA-TCID50 내지 약 105.0 FA-TCID50을 포함한다. 용어 "FA-TCID50"은 형광 항체를 기초로 한 방법에 의해 측정한 TCID50 값을 의미한다.
특정 실시태양에서, CSFV 백신의 면역학적 유효량은 적어도 2.5 RID, 3 RID, 5 RID, 10 RID, 30 RID, 100 RID, 150RID, 300 RID, 750 RID, 1000 RID, 3000 RID, 또는 7500 RID이다.
특정 실시태양에서, PRV 백신의 면역학적 유효량은 적어도 103.0 TCID50, 103.5TCID50, 104.0TCID50, 104.5TCID50, 105.0TCID50, 105.5 TCID50 또는 106.0 TCID50이다. 특정 실시태양에서, PRV 백신의 면역학적 유효량은 적어도 105.5 TCID50, 또는 적어도 106.0 TCID50이다. 특정 실시태양에서, 본 발명에 제공된 백신 조성물은 PRV 백신의 약 105.0 TCID50 내지 약 106.5 TCID50, 또는 약 105.5 TCID50 내지 약 106.5 TCID50을 포함한다.
바이러스 백신의 TCID50은 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 백신(PRRSV 백신 및/또는 PRV 백신)은 바이러스 용액으로 제조될 수 있고, 바이러스 용액의 10배 연속 희석물이 제조될 수 있고 감수성 있는 세포로 씨드된 96웰 배양판에서 접종될 수 있다. 각 희석물의 바이러스 용액은 100ul/well에서 8웰에서 접종될 수 있다. 판은 37℃에서, 5% CO2로 배양기에 놓일 수 있고 4-5일 동안 배양될 수 있다. 세포변성 작용에 대해 세포들이 관찰되며, TCID50은 조직 배양액의 50%가 세포변성 작용을 나타내는 바이러스 농도로 계산된다. 방법의 상세한 설명은 Reed LJ, Muench H, A simple method of estimating fifty percent end points. Am J Hyg 1938; 27:493-97에서 발견될 수 있다.
CSFV는 뚜렷한 세포변성 작용을 일으키지 않는 바이러스이며 따라서 TCID50은 면역형광 방법에 의해 또는 토끼 감염 연구로 측정된다. 특정 실시태양에서, CSFV 백신에 대한 FA-TCID50은 면역형광방법에 의해 측정된다. 간략하게, CSFV 백신 균주는 1 dose/ml를 포함하는 용액으로 제조되며 10배 연속 희석물은 3.5% 혈청으로 보충된 DMEM 배양 배지로 제조된다. 원래 바이러스 샘플의 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 및 10-5를 포함하는 희석물은 0.1ml/well에서 BT 세포의 단일층에 각각에 접종된다. 3-4일 배양 후, 세포는 고정되고 (직접 면역형광 방법을 위해) CSFV의 형광 단클론 항체와 접촉된다. 45-60분 반응 후, 바이러스의 존재를 나타내는 형광의 존재에 대해 세포가 관찰된다. 선택적으로, 고정된 세포는 (간접 면역형광 방법을 위해) CSFV의 표지화되지 않은 단클론 항체와 접촉될 수 있고 45-60분 반응 후, 세포는 추가 45-60분 동안 형광-표지화 2차 항체와 반응된다. 바이러스의 존재를 나타내는 형광의 존재에 대해 세포가 관찰된다. FA-TCID50는 리드-무엔치(Reed-Muench) 방법에 따라 계산된다(예를 들어, Reed LJ, Muench H, A simple method of estimating fifty percent end points. Am J Hyg 1938; 27:493-97 참조).
특정 실시태양에서, CSFV 백신의 양은 토끼 감염량에 의해 측정된다. 간략하게, CSFV 백신 균주는 1 양을 포함하는 용액으로 제조된 후 7500배 희석되어 테스트 샘플을 제조한다. 1.5-3kg의 두 토끼에 1ml 테스트 샘플이 각각 주입되며, 체온은 첫 번째 48시간 동안 하루 2회 측정하며 그 후 6시간마다 1회 측정한다. 체온 반응이 관찰되며 아래 기준에 따라 등급이 매겨진다: 1) 통상적인 열 반응(++): 잠복기는 약 48-96시간이며, 체온은 현저하게 상승하며, 적어도 1℃만큼 정상 온도 이상의 적어도 3회 온도 상승하며 18-36시간 동안 지속된다; 2) 약간 열 반응(+): 잠복기는 약 48-96시간이며, 체온은 현저하게 상승하며, 적어도 0.5℃만큼 정상 온도 이상의 적어도 2회 온도 상승하며 12-36시간 동안 지속한다; 3) 추정 열 반응(±): 잠복기는 약 48-96시간이며, 체온은 수시로 변하며, 상승된 온도는 12시간 미만 동안 지속되고 또는 잠복기는 적어도 24시간이며, 열 반응은 48시간 내에 또는 96 내지 120시간 후에 나타난다; 및 4) 열 반응 없음(-): 체온은 정상이다. 만일 두 테스트 토끼 모두 통상적인 열 반응(++)을 나타내거나 토끼 중 하나가 통상적인 열 반응(++)을 나타내는 반면 다른 하나는 약간의 열 반응(+)을 나타내는 경우, 백신은 7500 RID의 양을 가진 것으로 측정된다. 토끼들이 묘사하기 어려운 다른 반응을 나타낸 경우, 테스트는 반복될 수 있으나 3회 이상 동안 반복되지 않아야 한다.
단일 바이러스 백신은 본 발명에 제공된 백신 조성물을 제공하기 위해 적절한 비율로 혼합될 수 있다. 예를 들어, 단일 바이러스 백신은 특정 바이러스 역가(예를 들어, 특정 TCID50)에서 백신 균주를 포함하는 바이러스 용액으로 제조될 수 있고 둘 이상의 단일 바이러스 백신은 소정량(예를 들어, TCID50) 또는 비율로 각 단일 백신을 포함하는 혼합 백신을 제공하기 위해서 적절한 비율로 혼합된다.
특정 실시태양에서, PRRSV 백신 및 CSFV 백신을 포함하는 혼합 백신 조성물에서, PRRSV 백신 대 CSFV 백신의 TCID50 비율은 10000:1 내지 1:1, 1000:1 내지 1:1, 100:1 내지 1:1, 10:1 내지 1:1 또는 5:1 내지 1:1 범위이다. 예를 들어, 백신 조성물은 104.5 TCID50의 PRRSV 백신, 및 100.5 FA-TCID50의 CSFV 백신, 또는 104.5 TCID50의 PRRSV 백신, 및 103.5 FA-TCID50의 CSFV 백신, 또는 105.0 TCID50의 PRRSV 백신, 및 104.0 FA-TCID50의 CSFV 백신을 포함할 수 있다.
특정 실시태양에서, PRRSV 백신 및 PRV 백신을 포함하는 혼합 백신 조성물에서, PRRSV 백신 대 PRV 백신의 TCID50 비율은 1:1 내지 1:30, 1:1 내지 1:25, 1:1 내지 1:20, 1:1 내지 1:15, 1:1 내지 1:10, 1:1 내지 1:9, 1:1 내지 1:8, 1:1 내지 1:7, 1:1 내지 1:6, 1:1 내지 1:5, 1:2 내지 1:10, 1:3 내지 1:10, 1:4 내지 1:10, 또는 1:5 내지 1:10 범위이다. 예를 들어, 백신 조성물은 104.5 TCID50의 PRRSV 백신, 및 105.5 TCID50의 PRV 백신, 또는 105.0 TCID50의 PRRSV 백신, 및 105.5 TCID50 의 PRV 백신, 또는 105.0 TCID50의 PRRSV 백신, 및 106.5 TCID50의 PRV 백신을 포함할 수 있다.
특정 실시태양에서, PRRSV 백신, CSFV 백신 및 PRV 백신을 포함하는 혼합 백신 조성물에서, PRRSV 백신 : CSFV 백신 : PRV 백신의 TCID50 비율은 약 104: 1: 105 내지 약 5:1:이다. 예를 들어, 백신 조성물은 104.5 TCID50의 PRRSV 백신, 100.5 FA-TCID50의 CSFV 백신 및 105.5 TCID50의 PRV 백신을 포함할 수 있다. 예를 들어, 백신 조성물은 104.5 TCID50의 PRRSV 백신, 104.0 FA-TCID50의 CSFV 백신 및 105.5 TCID50의 PRV 백신을 포함할 수 있다. 예를 들어, 백신 조성물은 105.7 TCID50의 PRRSV 백신, 105.0 FA-TCID50의 CSFV 백신 및 105.8 TCID50의 PRV 백신을 포함할 수 있다. 예를 들어, 백신 조성물은 106.0 TCID50의 PRRSV 백신, 105.0 FA-TCID50의 CSFV 백신 및 106.5 TCID50의 PRV 백신을 포함할 수 있다.
본 발명에 제공된 백신 조성물은 항원보강제를 더 포함할 수 있다. 항원보강제는 인비보 분해로부터 백신을 보호할 수 있고 및/또는 면역계를 비 특이적으로 자극하여, 백신에 대한 면역학적 반응을 강화하는데 도움이 될 수 있다. 항원보강제의 예는, 제한 없이, 미네랄 염(예를 들어, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 수산화칼슘), 워터 인 오일 에멀젼(예를 들어, 완전 프로인트 항원보강제, 불완전 프로인트 항원보강제 등), 사포닌 항원보강제(예를 들어, StimulonTM 등), 박테리아 또는 미생물의 유도체(예를 들어, LPS, 지질 A 유도체 등) 및 미세 입자(예를 들어, 폴리-α-하이드록시산 등)를 포함한다.
본 발명에 제공된 백신 조성물은 동결방지제를 더 포함할 수 있다. 동결방지제는 생물학적 생성물을 매우 안정하게 유지할 수 있고 동결건조 과정 동안 백신의 생물학적 활성에 대한 손상을 감소시킬 수 있다. 동결방지제의 예들은 수크로오스, L-소듐 글루타메이트 또는 락트알부민 가수분해물을 포함한다.
제조 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 개개의 감수성이 있는 세포(susceptible cell)에서 배양된 (a) PRRSV 백신 균주, CSFV 백신 균주 및/또는 PRV 백신 균주를 수집하는 단계 및 (b) 적절한 TCID50 비율로 둘 이상의 바이러스 균주를 혼합하는 단계를 포함하여, 본 발명에 제공된 백신 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
특정 실시태양에서, 단계(a)는 PRRSV 백신 균주, CSFV 백신 균주 및/또는 PRV 백신 균주를 이들 개개의 감수성이 있는 세포에 접종하고, 백신 생산을 위한 씨드 바이러스를 제조하도록 세포를 배양하고, 씨드 바이러스를 이들 개개의 감수성이 있는 세포에 접종하고, 개개의 바이러스를 포함하는 항원 용액을 얻도록 세포를 번식시키는 단계를 포함한다.
특정 실시태양에서, PRRSV 백신 균주는 고 병원성 PRRSV의 약독 백신 균주이다. 특정 실시태양에서, PRRSV 백신 균주는 PRRSV TJM 균주이다.
특정 실시태양에서, CSFV 백신 균주는 약독 CSFV이다. 특정 실시태양에서, CSFV 백신 균주는 CSFV C 균주(F16)이다.
특정 실시태양에서, PRV 백신 균주는 약독 PRV이다. 특정 실시태양에서, PRV 백신 균주는 Bartha K61 균주이다.
특정 실시태양에서, PRRSV 백신 균주에 대한 감수성이 있는 세포는 제한 없이 Marc-145 세포주, MA-104 세포주, Vero 세포주, 또는 CL-2621 세포주와 같은 세포주 또는 PAM 세포와 같은 프라이머리 세포를 포함한다.
특정 실시태양에서, CSFV 백신 균주에 대한 감수성이 있는 세포는 제한 없이 BT 세포주, Vero 세포주, MPK 세포주, SK6 세포주, PK2a 세포주, CPK 세포주, RKC 세포주, MDBK 세포주, MDCK 세포주, CRFK 세포주, ST 세포주, 또는 PT 세포주와 같은 세포주 또는 BT 세포와 같은 프라이머리 세포를 포함한다. 두 PT 세포주 및 ST 세포주는 돼지 고환 세포주이다.
특정 실시태양에서, PRV 백신 균주에 대한 감수성이 있는 세포는 제한 없이ST 세포주(ATCC No.: CRL-1746), PK-15 세포주(ATCC No.: CCL-33), Marc-145 세포주(ATCC No.: CRL-12219), 소 신장 MDBK 세포주(ATCC No.: CCL-22), 소 비개골 BT 세포주(ATCC No.: CRL-1390), Vero 세포주(ATCC No.: CCL-81), BHK-21 세포주(ATCC No.: CCL-10), 돼지 신장 세포주(IBRS-2, 예를 들어, DECASTRO, M. P. 1964. Behavior of foot and mouth disease virus in cell culture: susceptibility of the IB-RS-2 swine cell line. Arquivos Instituto Biologica 31: 63-78 참조) 및 토끼 신장 RK 세포주(ATCC No.: CCL-106)와 같은 세포주; 또는 닭 배아 섬유아세포 세포주 및 돼지 신장 세포와 같은 프라이머리 세포를 포함한다. 프라이머리 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어,동물로부터 조직을 분리하고 세포를 제조함으로써 제조될 수 있다.
특정 실시태양에서, 감수성이 있는 세포는 5% CO2의 존재하에서, 바람직하게는 33-37℃에서 배양되었다. 감수성이 있는 세포를 배양하는 방법은 분해 후 EDTA-트립신 용액으로 세포주를 패시징하는 단계, 성장 배지에서 세포주를 계속 배양하는 단계를 포함할 수 있으며, 세포가 90-100% 밀집도에 도달할 때, 세포는 씨드 바이러스에 의해 추가로 패시지되거나 접종될 수 있다. 세포주를 배양하는 방법은 바람직하게는 다음 중 하나이다: 롤러 병에 세포를 배양하고 세포 밀도가 1x106/ml-5x106/ml에 도달하게 하는 단계; 또는 현택 배양을 위해 바이오리액터에 부착 담체를 주입하고 세포 밀도가 5x106/ml-1x107/ml에 도달하게 하는 단계, 부착 담체는 바람직하게는 미세담체 또는 종이이다.
특정 실시태양에서, PRRSV 백신 균주는 0.01-0.5의 다중감염도(MOI)로 이의 감수성이 있는 세포에 접종되며, CSFV 백신 균주는 0.1-0.5의 MOI로 이의 감수성이 있는 세포에 접종되며 또는 접종량은 세포 기원의 3%-5% 바이러스이며, 및/또는 PRV 백신 균주는 0.005-0.5의 MOI로 이의 감수성이 있는 세포에 접종된다.
특정 실시태양에서, 개개의 바이러스 백신 균주로 접종된 세포는 접종 후 3-5일 동안 배양되며, 백신 생산을 위한 씨드 바이러스가 수확될 수 있다. PRRSV 균주의 경우, 씨드 바이러스는 세포변성 작용이 70%에 도달할 때 수확된다. CSFV 균주의 경우, 1차 수확은 접종 후 5일에 배지 교환에 의해 실행되며, 5회 이하 수확이 실행되는 한, 후속 수확은 4일 간격으로 배지 교환에 의해 실행된다. PRV 균주의 경우, 바이러스를 포함하는 세포 배양 배지는 접종 2-3일 후 수확된다.
특정 실시태양에서, 백신 생산을 위한 씨드 바이러스는 적절한 바이러스 역가를 가진다. 예를 들어, PRRSV TJM 균주를 위한 씨드 바이러스는 적절한 바이러스 함량, 예를 들어, ml당 107.0TCID50 이상 바이러스일 수 있고, CSFV C 균주(F16)를 위한 씨드 바이러스는 ml당 >100,000 토끼 감염량 또는 면역형광 기초 분석법에 의해 측정된 것과 같이 ml당 106.0 FA-TCID50 이상 바이러스일 수 있으며 및/또는 PRV Bartha K61 균주를 위한 씨드 바이러스는 ml당 108.0TCID50 이상일 수 있다.
특정 실시태양에서, 씨드 바이러스는 개개의 감수성이 있는 세포에 접종되며, 개별 바이러스를 포함하는 항원 용액을 얻기 위해 번식된다. 특정 실시태양에서, 얻은 항원 용액은 적절한 바이러스 함량, 예를 들어, PRRSV TJM 균주에 대해 ml당 107.0TCID50 이상 바이러스, CSFV C 균주(F16)에 대해 ml당 >100,000 RID 또는 면역형광 기초 분석법에 의해 측정된 것과 같이 ml당 106.0 FA-TCID50 이상 바이러스일 수 있으며 및/또는 PRV Bartha K61 균주에 대해 ml당 108.0TCID50 이상을 가진다.
특정 실시태양에서, 단계(b)는 10000:1 내지 1:1의 TCID50 비율로 수집된 PRRSV 백신 바이러스를 CSFV 백신 바이러스와 혼합하는 단계를 포함한다. 특정 실시태양에서, 단계(b)는 1:1 내지 1:30의 TCID50 비율로 수집된 PRRSV 백신 바이러스를 PRV 백신 바이러스와 혼합하는 단계를 포함한다. 특정 실시태양에서, 단계(b)는 104:1:105 내지 약 5:1:6의 TCID50 비율로 수집된 PRRSV 백신 바이러스, CSFV 백신 바이러스 및 PRV 백신 바이러스를 혼합하는 단계를 포함한다.
특정 실시태양에서, 단계(b)는 수집된 바이러스 용액의 혼합물과 동결방지제를 혼합하는 단계를 더 포함한다. 특정 실시태양에서, 수집된 바이러스 용액의 혼합물은 75-80 : 25-20의 부피비로 동결방지제와 혼합된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 방법을 사용하여 제조된 백신 조성물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 PRRS, CSF 및/또는 PR를 예방 또는 치료하기 위한 의약의 제조에서 본 발명에 제공된 백신 조성물의 용도를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 백신 조성물을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하여 돼지를 면역화하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 ST, PK-15, Marc-145, MDBK, BT, Vero, BHK-21, 돼지 신장 세포주(IBRS-2), 토끼 신장 세포주(RK), 및 닭 배아 섬유아세포 세포주로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포주 또는 돼지 신장 프라이머리 세포인 프라이머리 세포에서 배양된 CSFV 백신 균주를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 CSFV 백신 균주를 배양하는데 이런 세포주의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 제조 방법을 사용하여 제조된, PRRSV 백신 및 CSFV 백신을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 돼지 생식기 호흡기 증후군 및 돼지 열병을 예방 또는 치료하기 위한 생물학적 생성물을 제조하는데 백신 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명에 제공된 혼합 백신은 고 병원성 돼지 생식기 호흡기 증후군 및 돼지 열병을 예방하는데 현저한 효과를 나타낸다. 본 발명에 제공된 고 병원성 PRRSV 균주 및 CSFV 백신 균주는 어떠한 면역억제를 나타내지 않으며 이에 의해 제공된 혼합 백신은 안전성, 면역원성, 면역 기간, 면역학적 보호 및 안정성의 면에서 이들의 단가 백신과 차이를 나타내지 않는다. 안전성 연구의 결과는 백신의 1회 투약, 반복 투약, 과도 투약 접종을 받은 동물이 어떠한 임상적 증상 없이 정상 체온과 기분을 나타낸다는 것을 입증한다. 효과 연구의 결과는 본 발명에 제공된 백신이 고 병원성 PRRSV 및 CSFV의 유독 균주의 공격 접종에 대항하여 동물에 현저한 보호를 제공할 수 있고 고 병원성 PRRSV 및 CSFV의 감염을 효과적으로 예방할 수 있다는 것을 입증한다. 면역 기간 연구의 결과는 면역 기간은 6개월 동안 지속되며, 이는 면역 기간 동안 돼지에 대한 효과적인 보호를 보장할 수 있다는 것을 입증한다. 안정성 연구의 결과는 18개월 동안 2-8℃에서 저장될 수 있고, 이는 긴 사용 수명 및 안정한 저장에서 이의 장점을 나타낸다는 것을 입증한다. 본 발명에 제공된 백신은 동물을 접종하고 1회 주사로 두 질병을 예방하는데 사용될 수 있어서, 백신 접종 및 면역화 주기의 업무량을 줄이며, 돼지 무리에 대한 스트레스를 최소화하고 빈번한 백신 접종에 의해 유발된 면역 내성 및 실패를 예방한다.
본 발명은 또한 본 발명에 제공된 백신 조성물을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하여 돼지를 면역화하는 방법을 제공한다. 돼지는, 예를 들어, 주사에 의해 면역화될 수 있다. 면역화는 1회 투여 또는 수회 투여량의 반복 투여일 수 있다. 면역화 또는 투약 방법은 실제 상황에 따라 경험 있는 전문 수의사에 의해 조절될 수 있다.
실시예
다음 실시예는 본 발명을 추가로 설명하려는 것이다. 본 발명의 장점 및 특징은 다음 설명에 의해 분명해질 것이다. 그러나, 이런 설명은 단지 예시적이며, 본 발명의 범위에 대한 제한으로 해석되지 않는다.
일반 원리
백신의 접종은 돼지의 목 근육 속에 주입함으로써 실행될 수 있다. 테스트 돼지의 코에 바이러스를 적하 및/또는 테스트 돼지의 근육에 바이러스를 주사함으로써 바이러스 공격 접종을 실행하였다. CSFV 바이러스 양의 FA-TCID50은 면역형광 기초 방법에 의해 측정하였다.
T 세포에 대한 FACS 분석법. T 세포를 세포흐름분석방법으로 측정하였다. 간략하게, 혈액 샘플을 항응고제로 처리한 후 적혈구 세포를 용해하였다. 처리된 샘플을 각각 FITC-CD8 단클론 항체(mAb), PE-CD4 mAb, PECy5-CD3 mAb(모든 항체는 51AB Biotech, Beijing으로부터 구입하였다)로 염색하였다. 45분 배양 후, 미반응 항체들을 제거하고, 세포들을 PBS로 현탁하고 흐름세포분석기(BD FACSAria)에서 분석하였다.
ELISA 분석법. PRRSV 항원에 대항하는 항체, CSFV 항원에 대항하는 항체를 Beijing IDEXX Yuanheng Laboratories Co., Ltd로부터 구입한 개별 탐지 키트를 사용하여 ELISA로 측정하였다.
파트 I: 백신의 제조
실시예 1: PRRSV 백신의 제조
세포 패시지 및 배양
PRRSV 백신 균주를 배양하는데 사용한 Marc-145 세포들을 트립신처리하고 1:3으로 나눴다. 세포들을 배양 배지에서 37℃로 배양하였다. 세포들이 단일층을 형성한 후, 바이러스 균주로 패시지 또는 접종하였다.
세포들에서 씨드 바이러스의 번식
고 유독 PRRSV에 대한 백신 균주 TJM을 0.01-0.5의 MOI에서 Marc-145 세포들에 접종하였다. 접종된 세포들을 3-5일 동안 배양하였고, 세포변성 작용(CPE)이 70%에 도달했을 때 바이러스 용액을 수집하였다. 수집된 바이러스 용액을 PRRSV TJM 균주의 씨드 바이러스로 사용하였다.
씨드 바이러스를 중국의 수의학 약전에 따라 묘사하였다. 박테리아, 곰팡이 또는 마이코플라즈마에 대한 씨드 바이러스는 없었다. PRRSV 씨드 바이러스 용액은 돼지에 악영향을 나타내지 않았다. PRRSV TJM 균주의 씨드 바이러스는 1ml당 107.0TCID50 바이러스 이상을 포함하였다.
백신 생산을 위한 바이러스 용액의 번식
Marc-145 세포들을 90-100% 밀집도 단일층에 배양하였다. 세포 배양 배지를 버리고 세포들을 PBS로 2회 세척하였다. PRRSV TJM 균주의 씨드 바이러스 용액을 0.01-0.5의 MOI에서 접종하였다. 접종된 세포들을 3-5일 동안 배양하였고, 세포변성 작용(CPE)이 70%에 도달했을 때 바이러스 용액을 수집하였다. 수집된 바이러스 용액을 백신 생산을 위한 바이러스 용액으로 사용하였다. 이런 바이러스 용액을 묘사하였고 박테리아, 곰팡이 또는 마이코플라즈마에 대해 없었고, PRRSV TJM 균주의 바이러스 용액은 1ml당 107.0TCID50 이상 바이러스를 포함하였다. 바이러스 용액을 적절하게 희석하여 PRRSV 단일 백신을 제조하거나 다른 백신과 혼합하여 혼합 백신을 제조하였다.
실시예 2: CSFV 백신의 제조
세포 패시지 및 배양
CSFV 백신 균주를 배양하는데 사용한 BT 세포들을 트립신처리하고 1:5로 나눴다. 세포들을 배양 배지에서 37℃로 배양하였다. 세포들이 단일층을 형성한 후, 바이러스 균주로 패시지 또는 접종하였다.
CSFV C 균주(F16)을 0.3% 바이러스 용액으로 제조하였고 BT 세포들의 단일층에 접종하였다. 접종된 세포들을 5일 동안 배양하고, 바이러스 용액을 CSFV 백신 균주의 씨드 바이러스로 수집하였다.
씨드 바이러스의 묘사
씨드 바이러스를 중국의 수의학 약전에 따라 묘사하였다. 박테리아, 곰팡이 또는 마이코플라즈마에 대한 씨드 바이러스는 없었다. CSFV C 균주(F16)를 정량화된 씨드 바이러스 용액으로 테스트하였고, 돼지에 대한 악영향을 나타내지 않았다. CSFV C 균주(F16)의 씨드 바이러스 용액은 1ml당 >100,000 토끼 감염량(RID) 또는 면역형광 기초 분석법에 의해 측정된 것과 같이 106.0 FA-TCID50 이상 바이러스를 포함하였다.
백신 생산을 위한 바이러스 용액의 번식
BT 세포들을 90-100% 밀집도 단일층에 배양하였다. 세포 배양 배지를 버리고 세포들을 PBS로 2회 세척하였다. CSFV C 균주(F16)의 씨드 바이러스 용액을 0.01-0.5의 MOI에서 또는 3%-5%의 양에서 접종하였다. 접종 후 5일에, 배지 교환에 의해 1차 수확을 실행하고 5회 이하 수확이 실행되는 한, 후속 수확은 4일 간격으로 실행한다. 수집된 바이러스 용액을 -20℃하에서 저장하였고 백신 생산을 위한 바이러스 용액으로 사용하였다. 이런 바이러스 용액을 묘사하였고 CSFV C 균주(F16)의 바이러스 용액은 1ml당 >100,000 토끼 감염량(RID) 또는 면역형광 기초 분석법에 의해 측정된 것과 같이 106.0 FA-TCID50 이상 바이러스를 포함하였다. 바이러스 용액을 적절하게 희석하여 CSFV 단일 백신을 제조하거나 다른 백신과 혼합하여 혼합 백신을 제조하였다.
실시예 3: PRV 백신의 제조
세포 패시지 및 배양
PRV 백신 균주 Bartha K61을 배양하는데 사용된 Marc-145 세포, MDBK 세포 및 BT 세포들을 트립신처리하고 세포 성장 배지에 각각 패시지하였다. 세포들을 배양 배지에서 37℃로 배양하였다. 세포들이 단일층을 형성한 후, 바이러스 균주로 각각 패시지 또는 접종하였다.
세포에서 씨드 바이러스의 번식
PRV 백신 균주 Bartha K61을 2-4% 소 혈청을 포함하는 MEM 배지에 Marc-145 세포, MDBK 세포 또는 BT 세포의 단일층에 접종하였다. 접종된 세포를 2-3일 동안 각각 배양하였고 바이러스 용액을 PRV 백신 균주의 씨드 바이러스로서 수집하였다.
씨드 바이러스의 묘사
씨드 바이러스를 묘사하였다. PRV 씨드 바이러스를 정량화된 씨드 용액으로 테스트하였고, 돼지에 악영향을 나타내지 않았다. PRV 균주의 씨드 바이러스 용액은 1ml당 108.0 FA-TCID50 이상 바이러스를 포함하였다.
PRV 백신 균주의 바이러스 용액의 번식
PRV 균주를 유지 배지를 첨가하여 0.005-0.5의 MOI에서 Marc-145 세포, MDBK 세포 또는 BT 세포들의 밀집 단일층에 접종하였다. 접종된 세포들을 36-37에서 배양하였고, CPE가 70%에 도달했을 때 바이러스 용액을 수집하였다.
2 사이클 동안 동결 해동 후 바이러스 용액의 양을 측정하였다. 씨드 바이러스 용액은 1ml당 108.0 FA-TCID50 이상 바이러스를 포함하였다. 씨드 바이러스를 중국의 수의학 약전에 따라 묘사하였고 박테리아, 곰팡이 또는 마이코플라즈마에 대한 씨드 바이러스는 없었다. 정량화된 바이러스 용액을 -15℃하에서 저장하였고 백신 생산을 위한 바이러스 용액으로 사용하였다. 바이러스 용액을 적절하게 희석하여 PRV 단일 백신을 제조하거나 다른 백신과 혼합하여 혼합 백신을 제조하였다.
실시예 4. PRRSV 및 CSFV를 위한 혼합 백신 조성물의 제조
PRRSV TJM 균주의 바이러스 용액(실시예 1에 따라 제조) 및 CSFV C균주(F16)의 바이러스 용액(실시예 2에 따라 제조)을 혼합함으로써 항원 용액을 제조하였다.
열 저항성 동결방지제를 적절한 비율로 수크로오스, L-소듐 글루타메이트 및 락트알부민 가수분해물을 혼합하고 오토클레이브에 의해 제조하였다.
75-80 부피 분획의 항원 용액을 25-20 부피 분획의 동결방지제와 혼합하였고 혼합물을 소정량으로 앰풀 속에 정리하였다. 앰풀에 마개를 덮고 저온 및 건조 처리를 받게 하여 동결 건조 백신 조성물을 얻었다. 살균성, 안정성 및 효과에 대해 백신 조성물을 테스트하였다.
제조된 혼합된 PRRSV 및 CSFV 백신의 각 투여량에서, PRRSV TJM 균주의 양은 ≥105.0TCID50 이었고, CSFV C 균주(F16)의 양은 ≥7500 RID(또는 ≥750 RID 또는 ≥150 RID) 또는 면역형광 기초 방법에 의해 측정한 것과 같이 104.0 FA-TCID50 이상 바이러스였다.
혼합 백신을 중국 수의사 약전의 부록의 15, 19 및 20 페이지에 따라 묘사하였다. 박테리아, 곰팡이, 마이코플라즈마 및 외인성 바이러스에 대한 혼합 백신은 없었다.
실시예 5. PRRSV 및 PRV를 위한 혼합 백신 조성물의 제조
PRRSV TJM 균주의 바이러스 용액(실시예 1에 따라 제조) 및 PRV Bartha K61 균주의 바이러스 용액(실시예 3에 따라 제조)을 혼합함으로써 항원 용액을 제조하였다.
열 저항성 동결방지제를 적절한 비율로 수크로오스, L-소듐 글루타메이트 및 락트알부민 가수분해물을 혼합하고 오토클레이브에 의해 제조하였다.
6-8 부피 분획의 항원 용액을 2-4 부피 분획의 동결방지제와 혼합하였고 혼합물을 소정량으로 앰풀 속에 정리하였다. 앰풀에 마개를 덮고 저온 및 건조 처리를 받게 하여 동결 건조 백신 조성물을 얻었다.
제조된 혼합된 PRRSV 및 PRV 백신의 각 투여량에서, PRRSV TJM 균주의 양은 ≥105.0TCID50 이었고, PRV Bartha K61 균주의 양은 ≥105.5TCID50 이었다.
혼합 백신을 중국 수의사 약전의 부록의 15, 19 및 20 페이지에 따라 묘사하였다. 박테리아, 곰팡이, 마이코플라즈마 및 외인성 바이러스에 대한 혼합 백신은 없었다.
실시예 6. PRRSV, CSFV 및 PRV를 위한 혼합 백신 조성물의 제조
PRRSV TJM 균주의 바이러스 용액(실시예 1에 따라 제조), CSFV C균주(F16)의 바이러스 용액(실시예 2에 따라 제조) 및 PRV Bartha K61 균주의 바이러스 용액(실시예 3에 따라 제조)을 혼합함으로써 항원 용액을 제조하였다.
열 저항성 동결방지제를 적절한 비율로 수크로오스, L-소듐 글루타메이트 및 락트알부민 가수분해물을 혼합하고 오토클레이브에 의해 제조하였다.
75-80 부피 분획의 항원 용액을 25-20 부피 분획의 동결방지제와 혼합하였고 혼합물을 소정량으로 앰풀 속에 정리하였다. 앰풀을 동결 건조하여 백신 조성물을 얻었다. 살균성, 안정성 및 효과에 대해 백신 조성물을 테스트하였다.
제조된 혼합된 PRRSV, CSFV 및 PRV 백신의 각 투여량에서, PRRSV TJM 균주의 양은 ≥105.0TCID50 이었고, CSFV C 균주(F16)의 양은 ≥7500 RID(또는 ≥750 RID, ≥150 RID) 또는 면역형광 기초 방법에 의해 측정한 것과 같이 104.0 FA-TCID50 이상 바이러스였고 PRV Bartha K61 균주의 양은 ≥105.5TCID50 이었다.
혼합 백신을 중국 수의사 약전의 부록의 15, 19 및 20 페이지에 따라 묘사하였다. 박테리아, 곰팡이, 마이코플라즈마 및 외인성 바이러스에 대한 혼합 백신은 없었다.
실시예 7. PRRSV TJM 균주의 유전자 묘사
실시예 1에 따라 제조된 바이러스 용액 및 실시예 4-6에 따라 제조된 혼합 백신에 포함된 PRRSV TJM 균주를 PRRSV의 nsp2에 특이적인 프라이머(포워드 프라이머: 5'-GGCAAGAAGTTGAGGAAGT-3'; 리버스 프라이머: 5'-TGGCAGGTTGGTCACAGA-3')를 사용하여 PCR로 묘사하였다. PRRSV TJ 균주는 양성 대조군이었고 물은 음성 대조군이었다.
결과는 PRRSV TJ 균주를 포함하는 양성 대조군에서 567bp 밴드와 비교하여, PRRSV TJM 균주를 포함하는 샘플에서 특이적 207bp 밴드를 나타내었다(도 5). 결과는 PRRSV TJM 균주는 nsp2 유전자에 360개 뉴클레오티드가 결핍된다는 것을 확인하였고 제조된 백신이 PRRSV TJ 균주에 의해 오염되지 않는다는 것을 추가로 확인하였다.
실시예 8. PRV Bartha K61 균주의 유전자 묘사
실시예 3에 따라 제조된 바이러스 용액 및 실시예 5-6에 따라 제조된 혼합 백신에 포함된 PRV Bartha K61 균주를 PRV의 gE에 특이적인 프라이머(포워드 프라이머: 5'-CGTCACGGTCACCAAGGAGC-3'; 리버스 프라이머: 5'-GCACAGCACGCAGAGCCAG-3')를 사용하여 PCR로 묘사하였다. PRV 유독 균주(JL1 균주)는 양성 대조군이었고 물은 음성 대조군이었다.
결과는 PRV 유독 균주에서 232bp 밴드와 비교하여, PRV Bartha K61 균주를 포함하는 샘플에서 밴드가 발견되지 않았다(도 6).
결과는 PRV Bartha K61 균주는 gE 유전자에 결실을 포함한다는 것을 확인하였고 제조된 백신이 PRV 유독 균주에 의해 오염되지 않는다는 것을 추가로 확인하였다.
파트 II: 효과 연구
실시예 9: PRRSV TJM 균주에 대한 최소 면역학적 유효량의 측정
25 마리의 건강한 젖을 뗀 돼지를 연구에 사용하였다. 돼지들은 항원과 항체 모두의 면에서 고 병원성 PRRSV에 대해 음성이었다. 돼지들을 5개 그룹으로 무작위 추출하였다. 그룹 I 내지 VI를 다른 투여량의 PRRSV TJM 균주로 접종하고, 그룹 V를 음성 대조군으로 유지하였다(표 1). 돼지를 유독 PRRSV TJ 균주로 공격 접종하고 연구 후 보호율을 계산하였다. 표 1에 따라, 104.5 TCID50 이상의 양에서 PRRSV TJM 균주는 돼지에서 보호 면역성을 유도하는데 충분하였고, 4/5의 보호율을 가진다.
그룹 돼지 수 접종 투여량/돼지 바이러스 공격접종 투여량/돼지 아픈 돼지 수/테스트된 돼지 수 죽은 돼지 수/테스트된 돼지 수 보호율
I 5 105.5TCID50 2x104.0-2x104.5TCID50 1/5 0/5 4/5
II 5 104.5TCID50 2x104.0-2x104.5TCID50 1/5 0/5 4/5
III 5 103.5TCID50 2x104.0-2x104.5TCID50 3/5 0/5 2/5
IV 5 102.5TCID50 2x104.0-2x104.5TCID50 5/5 1/5 0/5
V 5 PBS 2x104.0-2x104.5TCID50 5/5 2/5 0/5
실시예 10: CSFV C 균주(F16)에 대한 최소 면역학적 유효량의 측정
28 마리의 건강한 젖을 뗀 돼지를 연구에 사용하였다. 돼지들은 항원과 항체 모두의 면에서 고 병원성 CSFV에 대해 음성이었다. 돼지들을 6개 그룹으로 무작위 추출하였다. 그룹 I 내지 V를 다른 투여량의 CSFV C 균주(F16)로 접종하고, 그룹 VI를 음성 대조군으로 유지하였다(표 2). 돼지를 유독 CSFV 시멘(Shimen) 균주로 공격 접종하고 연구 후 보호율을 계산하였다. 표 2에 따라, 100.5 TCID50 이상의 양에서 CSFV C 균주(F16)는 돼지에서 보호 면역성을 유도하는데 충분하였고, 5/5의 보호율을 가진다.
그룹 돼지 수 접종 투여량/돼지 바이러스 공격접종 투여량/돼지 아픈 돼지 수/테스트된 돼지 수 죽은 돼지 수/테스트된 돼지 수 보호율
I 5 104.5 FA TCID50 106.0MLD 0/5 0/5 5/5
II 5 103.5 FA TCID50 106.0MLD 0/5 0/5 5/5
III 5 102.5 FA TCID50 106.0MLD 0/5 0/5 5/5
IV 5 101.5 FA TCID50 106.0MLD 0/5 0/5 5/5
V 5 100.5 FA TCID50 106.0MLD 0/5 0/5 5/5
VI 3 PBS 106.0MLD 3/3 3/3 0/3
MLD: 최소 치사량.
실시예 11: PRRSV TJM 균주 및 CSFV C 균주(F16)의 혼합 백신에 대한 최소 면역학적 유효량의 측정
40마리 건강한 돼지새끼를 연구에 사용하였다. 돼지들은 항원과 항체 모두의 면에서 고 병원성 PRRSV 및 CSFV에 대해 음성이었다. 돼지들을 4개 그룹으로 무작위 추출하였다. 그룹 I 내지 III를 다른 투여량의 PRRSV TJM 균주 및 CSFV C 균주(F16)의 혼합 백신으로 접종하고, 그룹 IV를 음성 대조군으로 유지하였다. 각 그룹의 돼지 절반을 PRRSV TJ 균주로 공격 접종하고 다른 절반을 CSFV 시멘 균주로 공격 접종하였다. 연구 후 보효율을 계산하였다.
표 3에 따라, 104.5 TCID50의 PRRSV TJM 및 103.5 FA-TCID50의 CSFV C 균주(F16)를 포함하는 혼합 백신은 돼지에서 보호 면역성을 유도하는데 충분하였다(표 3 및 4). 특히, CSFV C 균주(F16)는 혼합 백신에서 테스트한 것과 같이 전체 투여량에서 100% 보호를 나타내었고, CSFV C 균주(F16)에 대한 면역 반응은 PRRSV TJM 균주에 의해 억제되지 않았다는 것을 나타낸다. 또한, 실시예 10에서 나타낸 것과 같이 CSFV C 균주(F16)의 매우 낮은 면역학적 유효량의 관점에서, 더 낮은 투여량의 CSFV C 균주(F16)는 보호율을 감소시키지 않고 혼합 백신에 사용될 수 있다.
그룹 돼지의 수 접종 투여량/돼지 PRRSV TJ 공격접종 투여량/돼지 아픈 돼지 수/테스트된 돼지 수 죽은 돼지 수/테스트된 돼지 수 보호율
I 5 PRRSV TJM: 105.5TCID50; CSFV C 균주 (F16): 104.5 FA-TCID50 2x104.0- 2x104.5TCID50 0/5 0/5 5/5
II 5 PRRSV TJM: 104.5TCID50; CSFV C 균주 (F16): 103.5 FA-TCID50 2x104.0-2x104.5TCID50 0/5 0/5 5/5
III 5 PRRSV TJM: 103.5TCID50; CSFV C 균주 (F16): 102.5 FA-TCID50 2x104.0-2x104.5TCID50 2/5 0/5 3/5
IV 5 PBS 2x104.0-2x104.5TCID50 5/5 4/5 0/5
그룹 돼지의 수 접종 투여량/돼지 CSFV 시멘 공격접종 투여량/돼지 아픈 돼지 수/테스트된 돼지 수 죽은 돼지 수/테스트된 돼지 수 보호율
I 5 PRRSV TJM: 105.5TCID50; CSFV C 균주 (F16): 104.5 FA-TCID50 106.0MLD 0/5 0/5 5/5
II 5 PRRSV TJM: 104.5TCID50; CSFV C 균주 (F16): 103.5 FA-TCID50 106.0MLD 0/5 0/5 5/5
III 5 PRRSV TJM: 103.5TCID50; CSFV C 균주 (F16): 102.5 FA-TCID50 106.0MLD 0/5 0/5 5/5
IV 5 PBS 106.0MLD 5/5 5/5 0/5
실시예 12: 혼합 PRRSV TJM 균주 및 CSFV C 균주(F16)는 면역 억제를 갖지 않는다
21-28일령 30마리 건강한 돼지새끼를 연구에 사용하였다. 돼지들은 항원과 항체 모두의 면에서 고 병원성 PRRSV 및 CSFV에 대해 음성이었다. 돼지들을 7개 그룹으로 무작위 추출하였고, 그룹 I 내지 V의 각각에 5마리 돼지, 그룹 VI에 3마리 돼지 그룹 VII에 2마리 돼지가 있다(표 5). 표 5에 도시된 연구 목적에 따라 각 돼지를 1ml의 테스트 샘플로 접종하거나 전부 접종하지 않았다(즉, 그룹 VII).
그룹 돼지의 수 테스트 샘플 양 백신 투여량
I 5 PRRSV TJM 1ml 105.0TCID50/ml
II 5 CSFV C 균주 (F16) 1ml 7500RID/ml (또는 104.0 FA-TCID50/ml)
III 5 PRRSV TJM + CSFV C 균주 (F16) 1ml PRRSV: 105.0TCID50/ml
CSFV: 7500RID (또는 104.0 FA-TCID50/ml)
IV 5 PRRSV TJM + CSFV C 균주 (F16) 1ml PRRSV:105.0TCID50/ml
CSFV:7500RID (또는 104.0 FA-TCID50/ml)
V 5 PBS 1ml N/A
VI 3 PBS 1ml N/A
VII 2 N/A N/A N/A
"RID": 토끼 감염량;
"N/A": 접종 또는 백신 접종이 실행되지 않았다.
돼지의 직장 온도를 백신 접종 전 3일부터 백신 접종 후 14일까지 매일 측정하였다. 체중은 7일마다 측정하였다. 또한 돼지를 면밀한 임상적 관찰하에 두었다. 혈액 샘플을 각각 백신 접종 전 3일, 백신 접종 후 0일, 3일, 7일, 10일, 14일, 21일 및 28일에 각 돼지로부터 채취하였다. 각 혈액 샘플을 두 부분으로 나눴다. 하나는 항응고제로 처리하여 CD3+, CD4+, CD8+ 및 CD4+CD8+ T 세포의 탐지에 사용하였다. 다른 부분은 응고제로 처리하여 항체 역가 분석에 사용하였다.
결과는 백신 접종 돼지에서 CD3+, CD4+, CD8+ 및 CD4+CD8+ T 세포의 변화는 대조군의 돼지에서 관찰된 것과 유사하였다(도 7-10). 혼합 백신에 의해 백신 접종 후, 그룹 III 및 IV의 돼지는 두 백신에 대항하는 항체를 생산하였고 이런 항체 생산은 서로에 대해 간섭하지 않았다(도 11-12). 그룹 III 및 IV의 돼지에 대한 PRRSV 항체 생산의 동역학은 그룹 I의 돼지에 대한 동역학과 유사하였고, 그룹 III 및 IV의 돼지에 대한 CSFV 항체 생산에 대한 동역학은 그룹 II의 돼지에 대한 동역학과 유사하였다. 결과는 PRRSV TJM 균주의 백신 접종은 CSFV C 균주(F16)에 대항하는 면역 반응을 억제하지 않으며 반대 경우도 마찬가지이다.
각 그룹에 있는 돼지의 직장 온도 및 체중은 현저한 차이를 보이지 않는다(도 13).
접신 접종 후 28일에, 표 6에 도시된 연구 목적에 따라 돼지를 유독 바이러스로 공격 접종하였다. 바이러스 공격 접종 후, 돼지의 직장 온도를 매일 측정하였고 식욕, 호흡 및 기분을 포함하는 임상적 징후에 대해 돼지를 관찰하였다. 혈액 샘플을 바이러스 공격 접종 후 각각 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일에 각 돼지로부터 채취하였고, CD3+, CD4+, CD8+ 및 CD4+CD8+ T 세포의 탐지를 위해 항응고제로 처리하였다. PRRSV 바이러스 및 CSFV 바이러스의 분리 및 바이러스 혈증의 존재의 측정을 위해, 혈액 샘플을 바이러스 공격 접종 당일 그리고 공격 접종 후 다음날 채취하였다. 임상 보호율, 이환율(즉, 아픈 돼지의 수/테스트된 돼지의 수) 및 사망률(즉, 죽은 돼지의 수/테스트된 돼지의 수)을 바이러스 공격 접종 후 14일에 각 동물 그룹에 대해 계산하였고 결과는 표 6에 나타난다.
그룹 돼지 수 공격 접종 샘플 공격 접종량/돼지 아픈 돼지 수/테스트된 돼지 수 죽은 돼지 수/테스트된 보호율
I 5 PRRSV TJ 2x104.0 - 2x104.5 TCID50 0/5 0/5 5/5
II 5 CSFV 시멘 106.0MLD 0/5 0/5 5/5
III 5 PRRSV TJ 2x104.0 - 2x104.5 TCID50 0/5 0/5 5/5
IV 5 CSFV 시멘 106.0MLD 0/5 0/5 5/5
V 5 PRRSV TJ 2x104.0 - 2x104.5 TCID50 5/5 3/5 0/5
VI 3 CSFV 시멘 106.0MLD 3/3 3/3 0/3
VII 2 N/A N/A N/A N/A N/A
"MLD": 최소 치사량;
"N/A": 접종 또는 백신 접종이 실행되지 않았다.
결과는 바이러스 공격 접종 후, 체온은 돼지 V 및 VI의 비 백신 접종 돼지에서 상승되었으나, 그룹 I-IV의 백신 접종 돼지에서는 상승되지 않았다(도 14-15). 그룹 V의 돼지는 좋지 않은 기분, 호흡에 부담, 빨간 피부 등과 같은 고 병원성 PRRS에 대한 임상적 증상을 나타내었다. 그룹 VI의 돼지는 좋지 않은 기분, 변비에 이은 설사, 빨간 피부 등을 포함하는 돼지 열병에 대한 현저한 증상을 나타내었다. 백신 접종 그룹의 돼지는 이런 임상적 증상을 나타내지 않았다(도 16-17).
바이러스 공격 접종 후, 그룹 V 및 VI의 비 백신 접종 돼지는 CD3+, CD4+, CD8+ 및 CD4+CD8+ T 세포에 현저한 감소를 나타내었고 바이러스 공격 접종 후 7일부터 죽기 시작했다. 한편, 혼합 백신 또는 단일 백신으로 백신 접종된 돼지는 T 세포에 이런 현저한 감소를 나타내지 않았고 T 세포 프로파일은 블랭크 대조군에 있는 건강한 돼지에 필적할만했다. 이것은 백신이 세포 면역 반응을 유도하는데 효과적이었다는 것을 나타낸다. 또한, 혼합 백신으로 백신 접종된 돼지 및 단일 백신으로 백신 접종된 돼지는 CD3+, CD4+, CD8+ 및 CD4+CD8+ T 세포에 유사한 변화를 나타내었으며, 이는 혼합 백신은 서로에 대해 면역 억제가 없었다는 것을 나타낸다(도 18-25).
고 유독 PRRSV에 의한 공격 접종 후, 그룹 V의 비 백신 접종 돼지는 2일부터 바이러스 혈증을 나타내기 시작했고, 11일까지 지속되었다. 그러나, 혼합 백신 또는 PRRSV 단일 백신으로 백신 접종된 돼지는 4일까지 바이러스 혈증을 나타내지 않았고, 5일까지 지속되었다. 이것은 혼합 백신 및 단일 백신 모두는 고 병원성 PRRSV의 감염에 대해 효과적인 보호를 제공하였고, 혼합 백신은 서로에 대해 면역 억제가 없었다는 것을 나타내었다.
유독 CSFV에 의한 공격 접종 후, 그룹 VI의 모든 돼지는 바이러스 혈증이 발현되었으나, 백신 접종 돼지들은 바이러스 혈증이 발현되지 않았다. 이것은 혼합 백신 및 단일 백신 모두는 유독 CSFV의 감염에 대해 효과적인 보호를 제공하였고, 혼합 백신은 서로에 대해 면역 억제가 없었다는 것을 나타내었다.
실시예 13: PRRSV 및 CSFV에 대한 2-콤보 백신의 효과 연구
실시예 4에 따라 제조한 PRRSV 및 CSFV에 대한 실험실 제조 2-콤보 백신의 3개 배치(배치 No.: 200904, 200905, 및 200906)를 사용하여 효과 연구를 실행하였다.
항원과 항체의 면에서, 고 유독 PRRSV 및 CSFV 모두에 대해 음성인 28마리 건강한 돼지를 2-콤보 백신 샘플의 각 배치에 대한 연구에 사용하였다. 돼지를 6개 그룹으로 무작위 추출하였고, 그룹 I 내지 IV 및 그룹 VI의 각각에 5마리 돼지, 그룹 V에 3마리 돼지가 있다. 돼지의 각 그룹을 개별 테스트 샘플로 접종하였고 백신 접종 후 28일에, 돼지를 표 7에 도시된 연구 목적에 따라 유독 바이러스로 공격 접종하였다.
그룹 테스트 샘플 및 투여량 바이러스 공격 접종 및 투여량/돼지 보호율
200904 200905 200906
I 2-콤보 백신, 1ml/pig:
PRRSV TJM (105.0TCID50/ml) +
CSFV C 균주 (F16) (7500 RID/ml, 또는 104.0 FA-TCID50/ml)		 CSFV 시멘:
106.0MLD		 5/5 5/5 5/5
II 2-콤보 백신, 1ml/pig:
PRRSV TJM (105.0TCID50/ml) +
CSFV C 균주 (F16) (7500 RID/ml, 또는 104.0 FA-TCID50/ml)		 PRRSV TJ,
2x104.0 - 2x104.5 TCID50 		4/5 4/5 5/5
III CSFV C 균주 (F16), 1ml/pig:
7500 RID/ml, 또는 104.0 FA-TCID50/ml		 CSFV 시멘:
106.0MLD		 5/5 5/5 5/5
IV PRRSV TJM, 1ml/pig:
105.0TCID50/ml		 PRRSV TJ,
2x104.0 - 2x104.5 TCID50 		5/5 4/5 4/5
V PBS, 1ml/pig CSFV 시멘:
106.0MLD		 0/3 0/3 0/3
VI PBS, 1ml/pig PRRSV TJ,
2x104.0 - 2x104.5 TCID50 		0/5 0/5 0/5
"RID": 토끼 감염량;
"MLD": 최소 치사량;
CSFV 바이러스 공격 접종 연구는 공격 접종 후 16일에 종료하였고 PRRSV 바이러스 공격 접종 연구는 공격 접종 후 21일에 종료하였다. 보호율을 계산하였고 결과는 표 7에 도시된다. PRRSV 및 CSFV의 2-콤보 백신의 3개 배치 모두는 고 유독 PRRSV 또는 CSFV에 의한 공격 접종에 대항하여 우수한 보호를 나타내었다. 2-콤보 백신에 의한 보호는 단일 백신 대조군과 현저한 차이를 보이지 않았다. 비 백신 접종 돼지 모두는 감염의 분명한 임상적 증상을 보였다.
실시예 14: PRRSV 및 CSFV에 대한 2-콤보 백신의 면역 지속 연구
(실시예 4에 따라 제조한) PRRSV 및 CSFV에 대한 2-콤보 백신을 사용하여 면역 지속 연구를 실행하였다. (실시예 1에 따라 제조한) PRRSV 단일 백신 및 (실시예 2에 따라 제조한) CSFV 단일 백신을 대조군으로 사용하였다.
56마리 건강한 돼지를 면역 지속 연구에 사용하였다. 모든 돼지는 항원과 항체의 면에서, PRRSV 및 CSFV 모두에 대해 음성이었다. 돼지를 6개 그룹으로 무작위 추출하였고, 도 8에 도시된 개별 테스트 샘플로 접종하였다. 혈액 샘플을 백신 접종 후 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월에 항체 역가의 측정을 위해 수집하였다.
백신 접종 후 3개월 및 6개월에, 동물의 절반을 각 연구 그룹으로부터 수집하였다. 이 동물에, 도 8에 도시된 대로, 개별 유독 바이러스로 공격 접종하였다.
결과는 (도 8 참조), 2-콤보 백신은 백신 접종 6개월 후 바이러스 공격 접종에 대항하여 돼지에 효과적인 보호를 제공하였고, 따라서, 6개월 면역 지속 기간을 지속시켰다. 2-콤보 백신의 면역 지속은 단일 백신의 면역 지속과 필적할만하다는 것을 발견하였다.
그룹 백신 접종 및 투여량 바이러스 공격 접종 및 투여량/돼지 보호율
3-mon 6-mon
I 2-콤보 백신, 1ml/pig:
PRRSV TJM (105.0TCID50/ml) + CSFV C 균주 (F16) (7500 RID, 또는 104.0 FA-TCID50/ml)		 CSFV 시멘 균주
106.0MLD		 5/5 5/5
II 2-콤보 백신, 1ml/pig:
PRRSV TJM (105.0TCID50/ml) + CSFV C 균주 (F16) (7500 RID, 또는 104.0 FA-TCID50/ml)		 PRRSV TJ 균주,
2x104.0 - 2x104.5 TCID50 		5/5 5/5
III CSFV C 균주 (F16), 1ml/pig:
7500 RID, 또는 104.0 FA-TCID50/ml		 CSFV 시멘 균주
106.0MLD		 5/5 5/5
IV PRRSV TJM, 1ml/pig:
105.0TCID50/ml		 PRRSV TJ 균주,
2x104.0 - 2x104.5 TCID50 		4/5 4/5
V PBS, 1ml/pig: CSFV 시멘 균주
106.0MLD		 0/3 0/3
VI PBS, 1ml/pig: PRRSV TJ 균주,
2x104.0 - 2x104.5 TCID50 		0/5 0/5
"RID": 토끼 감염량;
"MLD": 최소 치사량;
실시예 15: 혼합 PRRSV TJM 균주 및 PRV Bartha K61 균주는 면역 억제를 갖지 않는다.
(실시예 5에 따라 제조한) PRRSV TJM 균주 및 PRV Bartha K61에 대한 2-콤보 백신을 연구에 사용하였다. 4-5주령 돼지를 4그룹으로 무작위로 추출하였고, 각 그룹에 4마리 돼지가 있다. 모든 돼지는 항원과 항체 모두의 면에서 PRRSV 및 PRV에 대해 음성이었다.
돼지를 표 9에 도시된 연구 목적에 따라 개별 테스트 샘플로 접종하였다. 2차 백신 접종을 1차 백신 접종 1주 후에 실행하였다.
그룹 1차 백신 접종 2차 백신 접종
I PRRSV TJM, 1ml/pig:
105.0TCID50/ml		 PRV Bartha K61, 1ml:
105.5 TCID50/ml
II N/A 2-콤보 백신, 1ml:
PRRSV TJM (105.0TCID50/ml) +
PRV Bartha K61(105.5 TCID50/ml)
III N/A PRV Bartha K61, 1ml
(105.5 TCID50/ml)
IV N/A PBS
"N/A": 접종 또는 백신 접종이 실행되지 않았다.
백신 접종 후, 돼지의 혈액 샘플을 백신 접종 후 28일까지 매주 수집하였다. 혈액 샘플을 처리하고 PRV에 대항하는 항체 역가에 대해 측정하였다.
결과는 (도 26), PRV 항체 역가는 그룹 I 내지 III 중에서 현저하게 다르지 않았다. 이것은 PRRSV TJM 균주는 PRV 백신에 대항하여 면역 억제를 갖지 않았다는 것을 암시하였다. PRRSV TJM 균주는 개별적으로 PRV와의 혼합 백신으로 투여될 때 PRV 항체 영가에 영향을 주지 않았다. PRRSV 및 PRV에 대한 2-콤보 백신은 PRV 단일 백신에 효과에 필적할만한 효과를 가졌다.
실시예 16: 혼합 PRRSV 및 PRV 백신의 효과 연구
실시예 5에 따라 제조한 PRRSV 및 PRV에 대한 2-콤보 백신의 3개 배치를 사용하여 효과 연구를 실행하였다.
4-5주령 돼지를 4개 그룹으로 무작위로 추출하였고, 각 그룹에 10마리 돼지가 있었다. 그룹 I 내지 III을 2-콤보 백신의 개별 배치의 한 투여량으로 주사하였다. 백신의 각 투여량은 105.0TCID50/ml PRRSV TJM 균주 및 105.5TCID50/ml PRV Bartha K61 균주를 포함하였다. 그룹 IV는 대조군이었고 1ml MEM 배지로 주사하였다.
백신 접종 후, 임상 징후 및 부작용에 대해 돼지를 관찰하였다. 돼지의 혈액을 매주 수집하였고, 혈청을 항체 역가의 묘사를 위해 분리하였다. 돼지의 체중을 매주 측정하였다.
백신 접종 4주 후, 각 그룹에 있는 5마리 돼지를 2x104.0 - 2x104.5 TCID50의 투여량으로 PRRSV TJ 균주로 공격 접종하였고 다른 5마리 돼지를 103.0-103.5 TCID50의 투여량으로 PRV 유독 균주(JL1 균주)로 공격 접종하였다. 바이러스 공격 접종 후, 식욕 및 기분을 포함하는 임상적 징후에 대해 돼지를 관찰하였다. 돼지의 직장 온도를 매일 측정하였다. 바이러스 묘사를 위해 혈액 샘플과 코 스와브를 수집하였다.
결과는 그룹 I 내지 III의 돼지는 정상 온도를 나타내었고 백신 접종 후 좋은 기분과 좋은 식욕 상태였다. 바이러스 공격 접종 후, 백신 접종 돼지는 4/5 이상의 보호율로 보호된 반면, 대조군의 모든 비 백신 접종 돼지는 감염이 발현되었고 유독 PRRSV 공격 접종에 의해 2/5의 사망율 및 PRV 공격 접종에 의해 3/5 사망률을 가졌다. 결과는 PRRSV 및 PRV에 대한 2-콤보 백신은 두 바이러스의 공격 접종에 대항하여 우수한 효과를 가졌고 PRRSV 및 PRV의 감염을 예방하는데 효과적이었다.
실시예 17: 혼합 PRRSV TJM 균주, CSFV C 균주 및 PRV Bartha K61 균주는 면역 억제를 갖지 않는다.
21-28일령 46마리 건강한 돼지를 연구에 사용하였다. 돼지들은 항원과 항체 모두의 면에서 고 병원성 PRRSV, CSFV 및 PRV에 대해 음성이었다. 돼지들을 10개 그룹으로 무작위 추출하였고, 그룹 I 내지 VII 및 그룹 IX의 각각에 5마리 돼지, 그룹 VIII 및 X의 각각에 3마리 돼지가 있다. 표 10에 도시된 연구 목적에 따라 각 돼지를 1ml의 테스트 샘플로 접종하거나 전부 접종하지 않았다(즉, 그룹 X).
그룹 돼지의 수 테스트 샘플 백신 투여량
I 5 PRRSV TJM, 1ml/pig 105.0TCID50/ml
II 5 CSFV C 균주 (F16), 1ml/pig 7500 RID/ml (또는 104.0 FA-TCID50/ml)
III 5 PRV Bartha K61, 1ml/pig 105.5TCID50/ml
IV 5 3-콤보 백신, 1ml/pig: PRRSV TJM +
CSFV C 균주 (F16) +
PRV Bartha K61		 PRRSV: 105.0TCID50/ml
CSFV: 7500 RID/ml (또는 104.0 FA-TCID50/ml)
PRV: 105.5TCID50/ml
V 5 3-콤보 백신, 1ml/pig:
PRRSV TJM +
CSFV C 균주 (F16) +
PRV Bartha K61		 PRRSV: 105.0TCID50/ml
CSFV: 7500 RID/ml (또는 104.0 FA-TCID50/ml)
PRV: 105.5TCID50/ml
VI 5 3-콤보 백신, 1ml/pig:
PRRSV TJM +
CSFV C 균주 (F16) +
PRV Bartha K61		 PRRSV: 105.0TCID50/ml
CSFV: 7500 RID/ml (또는 104.0 FA-TCID50/ml)
PRV: 105.5TCID50/ml
VII 5 PBS, 1ml/pig N/A
VIII 3 PBS, 1ml/pig N/A
IX 5 PBS, 1ml/pig N/A
X 3 N/A N/A
"RID": 토끼 감염량;
"N/A": 접종 또는 백신 접종이 실행되지 않았다.
돼지의 직장 온도를 백신 접종 전 3일부터 백신 접종 후 7일까지 매일 측정하였다. 또한 돼지를 면밀한 임상적 관찰하에 두었다. 혈액 샘플을 각각 백신 접종 전 3일, 백신 접종 후 0일, 3일, 7일, 10일, 14일, 21일, 28일, 31일, 35일, 38일 및 42일에 각 돼지로부터 채취하였다. 각 혈액 샘플을 두 부분으로 나눴다. 하나는 항응고제로 처리하여 CD3+, CD4+, 및 CD8+ T 세포의 탐지에 사용하였다. 다른 부분은 응고제로 처리하여 항체 역가 분석에 사용하였다.
백신 접종 28일 후에, 표 11에 도시된 연구 목적에 따라, 돼지를 유독 바이러스로 공격 접종하였다. 공격 접종 후, 돼지의 직장 온도를 매일 측정하였고 식욕, 호흡 및 기분을 포함하는 임상적 징후에 대해 돼지를 관찰하였다. PRRSV 공격 접종 연구는 바이러스 공격 접종 후 21일에 종료하였고 CSFV 공격 접종 연구는 바이러스 공격 접종 후 16일에 종료하였다. 임상 보호율, 이환율(즉, 아픈 돼지의 수/테스트된 돼지의 수) 및 사망률(즉, 죽은 돼지의 수/테스트된 돼지의 수)을 바이러스 공격 접종 후 각 동물 그룹에 대해 계산하였고 결과는 표 11에 나타난다.
그룹 돼지 수 공격 접종 샘플 공격 접종 투여량/돼지 아픈 돼지 수/테스트된 돼지 수 죽은 돼지 수/테스트된 돼지 수 보호율
I 5 PRRSV TJ 2x104.0 - 2x104.5 TCID50 0/5 0/5 5/5
II 5 CSFV 시멘 106.0MLD 0/5 0/5 5/5
III 5 PRV JL1 103.0-103.5 TCID50 0/5 0/5 5/5
IV 5 PRRSV TJ 2x104.0 - 2x104.5 TCID50 0/5 0/5 5/5
V 5 CSFV 시멘 106.0MLD 0/5 0/5 5/5
VI 5 PRV JL1 103.0-103.5 TCID50 0/5 0/5 5/5
VII 5 PRRSV TJ 2x104.0 - 2x104.5 TCID50 5/5 3/5 0/5
VIII 3 CSFV 시멘 106.0MLD 3/3 3/3 0/3
IX 5 PRV JL1 103.0-103.5 TCID50 5/5 5/5 0/5
X 3 N/A N/A N/A N/A N/A
"MLD": 최소 치사량;
"N/A": 접종 또는 백신 접종이 실행되지 않았다.
결과는 CSFV C 균주 및 PRV Bartha K61 균주와 혼합될 때 PRRSV TJM 균주는 모든 3개 유독 바이러스의 공격 접종에 대항하여 효과적인 보호를 제공하였다는 것을 나타내었다. 혼합 백신은 각 단일 백신의 효과에 필적할만한 효과를 나타내었고, 이는 혼합 백신은 서로에 대해 면역 억제가 없다는 것을 암시한다.
실시예 18: 혼합 PRRSV TJM 균주, CSFV C 균주 및 PRV Bartha K61 균주에 대한 효과 연구
실시예 6에 따라 제조한 실험실 제조 2-콤보 백신의 3개 배치(배치 No.: 031-01, 031-02, 및 031-03)를 사용하여 효과 연구를 실행하였다.
항원과 항체의 면에서, 고 유독 PRRSV 및 CSFV 모두에 대해 음성인 43마리 건강한 돼지를 연구에 사용하였다. 돼지를 9개 그룹으로 무작위 추출하였고, 그룹 I 내지 VI, 그룹 VIII 내지 그룹 IX의 각각에 5마리 돼지, 그룹 VII에 3마리 돼지가 있다. 돼지의 각 그룹을 개별 테스트 샘플로 접종하였고 백신 접종 28일 후, 표 12에 도시된 연구 목적에 따라, 돼지를 개별 유독 바이러스로 공격 접종하였다. PRRSV 공격 접종 연구는 바이러스 공격 접종 후 21일에 종료하였고 CSFV 공격 접종 연구는 바이러스 공격 접종 후 16일에 종료하였고, PRV 공격 접종 연구는 바이러스 공격 접종 후 14일에 종료하였다. 임상 보호율, 이환율 및 사망률을 바이러스 공격 접종 후 각 동물 그룹에 대해 계산하였고 결과는 표 12에 나타난다.
그룹 백신 접종 및 투여량 바이러스 공격 접종 및 투여량/돼지 보호율
배치 No.1 배치 No.2 배치 No.3
I 3-콤보 백신, 1ml/pig:
PRRSV TJM (105.0TCID50/ml) +
CSFV C 균주 (F16) (7500 RID, 또는 104.0 FA-TCID50/ml) +
PRV Bartha K61 (105.5TCID50/ml)		 CSFV 시멘:
106.0MLD		 5/5 5/5 5/5
II 3-콤보 백신, 1ml/pig:
PRRSV TJM (105.0TCID50/ml) +
CSFV C 균주 (F16) (7500 RID, 또는 104.0 FA-TCID50/ml) +
PRV Bartha K61 (105.5TCID50/ml)		 PRRSV TJ,
2x104.0 - 2x104.5 TCID50 		4/5 4/5 5/5
III 3-콤보 백신, 1ml/pig:
PRRSV TJM (105.0TCID50/ml) +
CSFV C 균주 (F16) (7500 RID, 또는 104.0 FA-TCID50/ml) +
PRV Bartha K61 (105.5TCID50/ml)		 PRV JL1:
103.0-103.5 TCID50 		5/5 4/5 5/5
IV CSFV C 균주 (F16), 1ml/pig:
7500 RID, 또는 104.0 FA-TCID50/ml		 CSFV 시멘:
106.0MLD		 5/5 5/5 5/5
V PRRSV TJM, 1ml/pig:
105.0TCID50/ml		 PRRSV TJ,
2x104.0 - 2x104.5 TCID50 		5/5 4/5 4/5
VI PRV Bartha K61, 1ml/pig:
105.5TCID50/ml		 PRV JL1:
103.0-103.5 TCID50 		4/5 4/5 5/5
VII PBS, 1ml/pig CSFV 시멘:
106.0MLD		 0/3 0/3 0/3
VIII PBS, 1ml/pig PRRSV TJ,
2x104.0 - 2x104.5 TCID50 		0/5 0/5 0/5
IX PBS, 1ml/pig PRV JL1:
103.0-103.5 TCID50 		0/5 0/5 0/5
"RID": 토끼 감염량;
"MLD": 최소 치사량;
PRRSV, CSFV 및 PRV의 3-콤보 백신의 3개 배치는 모두 고 유독 PRRSV, CSFV 또는 PRV에 의한 공격 접종에 대항하여 우수한 보호를 나타낸 반면, 음성 대조군 모두는 감염의 분명한 임상적 증상을 나타내었다. 3-콤보 백신에 의한 보호는 단일 백신 대조군과 현저한 차이를 나타내지 않았다.
실시예 19: 혼합 PRRSV TJM 균주, CSFV C 균주 및 PRV Bartha K61 균주에 대한 면역 지속 연구
실시예 6에 따라 제조한 3-콤보 백신(배치 No.: 031-01, 031-02, 및 031-03)을 사용하여 면역 지속 연구를 실행하였다.
86마리 건강한 돼지를 면역 지속 연구에 사용하였다. 모든 돼지는 항원과 항체의 면에서, 고 유독성 PRRSV, CSFV 및 PRV에 대해 음성이었다. 돼지를 9개 그룹으로 무작위 추출하였고, 그룹 VII에 6마리 돼지 및 잔존 그룹의 각각에 10마리 돼지가 있다. 표 13에 도시된 연구 목적에 따라 돼지를 백신 접종하거나 하지 않았다. 혈액 샘플을 백신 접종 후 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월에 항체 역가의 측정을 위해 수집하였다.
백신 접종 후 3개월 및 6개월에, 동물의 절반을 각 연구 그룹으로부터 수집하였고 표 13에 도시된 대로, 개별 유독 바이러스로 공격 접종하였다.
그룹 백신 접종 및 투여량 바이러스 공격 접종 및 투여량/돼지 보호율
3-mon 6-mon
I 3-콤보 백신, 1ml/pig:
PRRSV TJM (105.0TCID50/ml) +
CSFV C 균주 (F16) (7500 RID, 또는 104.0 FA-TCID50/ml) +
PRV Bartha K61 (105.5TCID50/ml)		 CSFV 시멘:
106.0MLD		 5/5 5/5
II 3-콤보 백신, 1ml/pig:
PRRSV TJM (105.0TCID50/ml) +
CSFV C 균주 (F16) (7500 RID, 또는 104.0 FA-TCID50/ml) +
PRV Bartha K61 (105.5TCID50/ml)		 PRRSV TJ,
2x104.0 - 2x104.5 TCID50 		5/5 5/5
III 3-콤보 백신, 1ml/pig:
PRRSV TJM (105.0TCID50/ml) +
CSFV C 균주 (F16) (7500 RID, 또는 104.0 FA-TCID50/ml) +
PRV Bartha K61 (105.5TCID50/ml)		 PRV JL1:
103.0-103.5 TCID50 		5/5 5/5
IV CSFV C 균주 (F16), 1ml/pig:
7500 RID, 또는 104.0 FA-TCID50/ml		 CSFV 시멘:
106.0MLD		 5/5 5/5
V PRRSV TJM, 1ml/pig:
105.0TCID50/ml		 PRRSV TJ,
2x104.0 - 2x104.5 TCID50 		4/5 4/5
VI PRV Bartha K61, 1ml/pig:
105.5TCID50/ml		 PRV JL1:
103.0-103.5 TCID50 		4/5 4/5
VII PBS, 1ml/pig CSFV 시멘:
106.0MLD		 0/3 0/3
VIII PBS, 1ml/pig PRRSV TJ,
2x104.0 - 2x104.5 TCID50 		0/5 0/5
IX PBS, 1ml/pig PRV JL1:
103.0-103.5 TCID50 		0/5 0/5
"RID": 토끼 감염량;
"MLD": 최소 치사량;
결과는 (표 13 참조), 3-콤보 백신은 백신 접종 6개월 후 바이러스 공격 접종에 대항하여 돼지에 효과적인 보호를 제공하였고, 따라서 6개월 면역 지속 기간을 지원하였다. 3-콤보 백신의 면역 지속은 단일 백신의 각각에 필적할만한 것으로 발견되었다.
파트 III: 안전성 연구
실시예 20: 혼합 PRRSV 및 CSFV 백신의 안전성 연구
실시예 4에 따라 제조한 PRRSV 및 CSFV에 대한 실험실 제조 2-콤보 백신의 3개 배치(배치 No.: 200904, 200905, 및 200906)를 사용하여 안전성 연구를 실행하였다.
연구는 표적 연령 돼지에 대한 단일 투여 안전성 연구, 반복 투여 안전성 연구, 과다 투여 안전성 연구, 미성숙 돼지에 대한 과다 투여 안전성 및 다른 종의 돼지에 대한 과다 투여 안정성을 포함하였다.
결과는, 백신 접종 후, 각 연구 그룹의 돼지는 정상 온도를 나타내었고, 좋은 기분과 좋은 식욕 상태에 있었다. 전신 또는 국소 부작용이 관찰되지 않았다. 혼합 백신의 과량 투여는 미성숙 돼지에게 안전하고 또한 다른 종의 돼지에게도 안전한 것으로 나타났다.
실시예 21: 혼합 PRRSV 및 PRV 백신의 안전성 연구
실시예 5에 따라 제조한 PRRSV 및 PRV에 대한 2-콤보 백신의 3개 배치를 사용하여 안전성 연구를 실행하였다.
항원과 항체의 면에서, PRRS 및 PR 모두에 대해 음성인 4-5주령 돼지를 3개 그룹으로 무작위로 추출하였고, 각 그룹에 15개 돼지가 있다. 각 그룹은 단일 투여(105.0-105.5TCID50 virus/ml), 반복 투여 또는 10배 과다 투여로 2-콤보 백신으로 접종하였다. 5마리 돼지를 대조군으로 사용하였고 모두 접종하지 않았다.
돼지의 직장 온도를 백신 접종 후 21일까지 매일 측정하였다. 또한 돼지를 면밀한 임상적 관찰하에 두었다.
결과는 각 그룹의 돼지는 정상 온도를 나타내었고 백신 접종 후 병적 변화가 없었다. 2-콤보 백신은 돼지에게 안전하였다.
실시예 22: 혼합 PRRSV, CSFV 및 PRV 백신의 안전성 연구
실시예 6에 따라 제조한 PRRSV, CSFV 및 PRV(배치 No.: 031-01, 031-02, 및 031-03)에 대한 2-콤보 백신의 3개 배치를 사용하여 안전성 연구를 실행하였다. 연구는 표적 연령 돼지에 대한 단일 투여 안전성 연구, 반복 투여 안전성 연구, 과다 투여 안전성 연구, 미성숙 돼지에 대한 과다 투여 안전성 및 다른 종의 돼지에 대한 과다 투여 안정성을 포함하였다.
결과는, 백신 접종 후, 각 연구 그룹의 돼지는 정상 온도를 나타내었고, 좋은 기분과 좋은 식욕 상태에 있었다. 전신 또는 국소 부작용이 관찰되지 않았다. 혼합 백신의 과량 투여는 미성숙 돼지에게 안전하고 또한 다른 종의 돼지에게도 안전한 것으로 나타났다.
파트 IV: 안정성 연구
실시예 23: PRRSV 및 CSFV에 대한 2-콤보 백신의 안정성 연구
실험실 제조 혼합 PRRSV 및 CSFV 백신(배치 Nos.: 200904, 200905, 및 200906)을 안정성에 대해 테스트하였고 PRRSV 단일 백신 및 CSFV 단일 백신의 3개 배치(배치 Nos.: 200901, 200902, 200903, 200907, 200908, 및 200909)와 평행하게 비교하였다.
백신 조성물의 각각의 3개 배치를 2-8℃로 유지하였다. 샘플을 각각 연구의 3, 6, 9, 12, 및 18개월에 수집하였다. 샘플을 37℃에서 물리화학적 특성, 진공도, 잔여 물 함량, 효능 및 노화에 대해 테스트하였다.
2-8℃에서 18개월 저장 후, 2-콤보 백신 조성물의 3개 배치는 흰색의 무른 덩어리였고, 이는 희석 버퍼의 첨가에 의해 빠르게 분해되었다. 진공도의 테스트에서, 백신은 흰색 또는 자줏빛 발광을 나타내었다. 테스트 백신의 평균 잔여 물 함량은 중국 수의학 약전에 의해 설정된 필요조건을 충족하였다.
백신 조성물의 바이러스 역가를 측정하였고, 결과는 도 27-30에 도시되었다. 18개월 동안 2-8℃에서 저장 후, 2-콤보 백신의 바이러스 역가는 각 단일 백신의 바이러스 역가와 현저하게 다르지 않았다. 14일 동안 37℃에서 유지한 후, 2-콤보 백신은 여전히 높은 수준의 바이러스 역가를 포함하며, 평행 연구(parallel studies)에서 단일 백신의 각각과 현저하게 다르지 않았다. 백신 조성물의 바이러스 역가는 적격인 백신에 대한 필요조건을 충족하였다. 이것은 열 저항성 동결방지제가 동결 건조 절차 동안 PRRSV 백신 균주 및 CSFV 백신 균주에 대해 우수한 보호를 제공하였다는 것을 나타내었다.
당업계에 공지된 것과 같이, 통상적인 백신은 0℃(-20℃)하에서 주로 유지되며, 이것이 백신의 저장을 복잡하게 한다. 이런 실시예의 결과는 새로운 동결방지제에 의해, 백신 조성물은 더 높은 온도에서 운송되고 저장될 수 있어서, 더 높은 안정성의 백신을 제공한다.
실시예 24: PRRSV 및 PRV에 대한 2-콤보 백신의 안정성 연구
PRRSV 및 PRV에 대한 실험실 제조 2-콤보 백신의 3개 배치를 2-8℃로 유지하였다. 샘플을 각각 연구의 3, 6, 9, 12, 18, 21 및 24개월에 수집하였다. 샘플을 37℃에서 물리화학적 특성, 진공도, 잔여 물 함량, 효능 및 노화에 대해 테스트하였다.
2-8℃에서 24개월 저장 후, 2-콤보 백신 조성물의 3개 배치는 흰색의 무른 덩어리였고, 이는 희석 버퍼의 첨가에 의해 빠르게 분해되었다. 진공도의 테스트에서, 백신은 흰색 또는 자줏빛 발광을 나타내었다. 백신 조성물의 바이러스 역가를 측정하였고, 결과는 도 31-34에 도시되었다. 혼합 백신은 24개월 동안 2-8℃에서 저장한 후 안정하였고, 바이러스 역가는 저장 전의 바이러스 역가와 현저하게 다르지 않았다.
실시예 25: PRRSV, CSFV 및 PRV에 대한 3-콤보 백신의 안정성 연구
실험실 제조 혼합 PRRSV, CSFV 및 PRV 백신(배치 Nos.: 031-01, 031-02 및 031-03)을 안정성에 대해 테스트하였고 PRRSV 단일 백신의 3개 배치(배치 Nos.: 031-04, 031-05, 031-06), CSFV 단일 백신(배치 Nos.: 031-07, 031-08, 031-09) 및 PRV 단일 백신(배치 Nos.: 031-10, 031-11 및 031-12)의 3개 배치와 평행하게 비교하였다.
백신 조성물을 2-8℃로 유지하였다. 샘플을 각각 연구의 3, 6, 9, 12, 및 18개월에 수집하였다. 샘플을 37℃에서 물리화학적 특성, 진공도, 잔여 물 함량, 효능 및 노화에 대해 테스트하였다.
2-8℃에서 18개월 저장 후, 백신 조성물의 3개 배치는 흰색의 무른 덩어리였고, 이는 희석 버퍼의 첨가에 의해 빠르게 분해되었다. 진공도의 테스트에서, 백신은 흰색 또는 자줏빛 발광을 나타내었다. 테스트 백신의 평균 잔여 물 함량은 중국 수의학 약전에 의해 설정된 필요조건을 충족하였다.
백신 조성물의 바이러스 역가를 측정하였고, 결과는 도 35-40에 도시되었다. 18개월 동안 2-8℃에서 저장 후, 2-콤보 백신의 바이러스 역가는 단일 백신의 바이러스 역가와 현저하게 다르지 않았다. 14일 동안 37℃에서 유지한 후, 혼합 백신은 여전히 높은 수준의 바이러스 역가를 나타내였고, 평행 연구(parallel studies)에서 단일 백신의 각각과 현저하게 다르지 않았다. 이것은 열 저항성 동결방지제가 동결 건조 절차 동안 PRRSV 백신 균주, CSFV 백신 균주 및 PRV 백신 균주에 대해 우수한 보호를 제공하였다는 것을 나타내었다.
SEQUENCE LISTING <110> Sinovet (Beijing) Biotechnology Co. Ltd Wu, Hua Xia, Mingqi He, Yanliang <120> COMBINED VACCINES FOR PREVENTION OF PORCINE VIRUS INFECTIONS <130> 038229-8002WO01 <150> CN201110140951.5 <151> 2011-05-27 <150> CN201110331206.9 <151> 2011-10-27 <150> CN201110331159.8 <151> 2011-10-27 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1149 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 1 atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt tgtggcggag 60 ggccaggtct actgcacacg atgtctcagt gcacggtctc tccttcctct gaatctccaa 120 gttcctgagc ttggggtgct gggtctattc tataggcccg aagagccact ccggtggacg 180 ttgccacgtg cattccccac tgtcgagtgc tcccccgccg gggcctgctg gctttctgcg 240 atctttccga ttgcacgaat gactagtgga aacctgaact ttcaacaaag aatggtgcgg 300 gtcgcagctg aaatctacag agccggccaa ctcaccccta cagttctaaa gactctacaa 360 gtttatgaac ggggttgtcg ctggtacccc attgtcgggc ccgtccctgg ggtgggcgtt 420 tacgccaact ccctgcatgt gagtgacaaa cctttcccgg gagcaactca tgtgttaacc 480 aacttgccgc tcccgcagag gcccaaacct gaggactttt gcccttttga gtgtgctatg 540 gctgacgtct atgacattgg tcgtggcgcc gtcatgtatg tggccggagg aaaggtctct 600 tgggcccctc gtggtgggaa tgaagtgaaa tttgaacctg tccccaagga gttgaagttg 660 gttgcgaacc gactccacac ctccttcccg ccccatcacg tagtggacat gtccaggttt 720 accttcatga cccctgggag tggtgtctcc atgcgggttg agtaccaata cggctgcctc 780 cccgctgaca ctgtccctga aggaaactgc tggtggcgct tgtttgactc gctcccaccg 840 gaagttcagt acaaagaaat tcgccacgct aaccaatttg gctatcaaac caagcatggt 900 gtccctggca agtacctaca gcggaggctg caagttaatg gtcttcggac agtgaccgac 960 acacatggac ctatcgtcat acagtacttc tctgttaagg agagttggat ccgccacctg 1020 aagttggtgg aagaacccag cctccccggg tttgaggatc tcctcagaat cagggttgag 1080 cccaatacgt caccactggc tggaaaggat gagaagattt tccggtttgg cagtcataag 1140 tggtacggt 1149 <210> 2 <211> 2490 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 2 gccggaaaga gagcaaggaa aacacgctct ggtgcgacta ctatggtcgc tcatcacgct 60 tcgtccgctc ataaaatccg gcaggccacg aagcacgagg gtgccggcgc taacaaggct 120 gagcatctca agcgctactc tccgcctgcc gaagggaact gtggttggca ctgcatttcc 180 gccatcgcca accggatggt gaattccaac tttgagacca cccttcctga aagagtaagg 240 ccttcagatg actgggccac tgacgaggat cttgtgaata ccatccaaat cctcaggctc 300 cctgcggcct tggacaggaa cggcgcttgc ggtagcgcca agtacgtgct taaactggag 360 ggtgagcatt ggactgtctc tgtgatccct gggatgtccc ctactttgct cccccttgaa 420 tgtgttcagg gttgttgtga acataagggc ggtcttgttt ccccggatgc ggtcgaaatt 480 tccggatttg atcctgcctg ccttgaccga ctggctaagg taatgcactt gcctagcagt 540 accatcccag ccgctctggc cgaattgtcc gacgactcca accgtccggt ttccccggcc 600 gctactacgt ggactgtttc gcaattctat gctcgtcata gaggaggaga tcatcatgac 660 caggtgtgct tagggaaaat catcagcctt tgtcaagtta ttgaggactg ctgctgccat 720 cagaataaaa ccaaccgggc tactccggaa gaggtcgcgg caaagattga tcagtacctc 780 cgtgacgcaa caagtcttga ggaatgcttg gccaaacttg agagagtttc cccgccgagc 840 gcagcggaca cctcctttga ttggaatgtt gtgcttcctg gggttgaggc gacgaatcag 900 acaaccgaac aacctcacgt caactcatgc tgcaccccgg tccctcccgt gactcaagag 960 cctttgggcg aggactcggt ccctctgacc gccttctcac 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ccggatgcgg tcgaaatttc cggatttgat cctgcctgcc ttgaccgact ggctaaggta 1860 atgcacttgc ctagcagtac catcccagcc gctctggccg aattgtccga cgactccaac 1920 cgtccggttt ccccggccgc tactacgtgg actgtttcgc aattctatgc tcgtcataga 1980 ggaggagatc atcatgacca ggtgtgctta gggaaaatca tcagcctttg tcaagttatt 2040 gaggactgct gctgccatca gaataaaacc aaccgggcta ctccggaaga ggtcgcggca 2100 aagattgatc agtacctccg tgacgcaaca agtcttgagg aatgcttggc caaacttgag 2160 agagtttccc cgccgagcgc agcggacacc tcctttgatt ggaatgttgt gcttcctggg 2220 gttgaggcga cgaatcagac aaccgaacaa cctcacgtca actcatgctg caccccggtc 2280 cctcccgtga ctcaagagcc tttgggcgag gactcggtcc ctctgaccgc cttctcactg 2340 tccaattgct attaccctgc acaaggtgac gaggttcatc accgtgagag gttaaattcc 2400 gcactctcta agttggaaga ggttgtcctg gaagaatatg ggctcatgtc cactggactt 2460 ggcccgcgac ccgtgctgcc gagcgggctc gacgagctta aagaccagat ggaggaggat 2520 ctgctagaac tagccaacac ccaggcgact tcagaaatga tggcctgggc ggctgagcag 2580 gtcgatttaa aagcttgggt caaaagctac ccgcggtgga caccaccacc ccctccacca 2640 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tgaaatttgt tgactacaaa ggcacctttc taactaggga ggctctagag gcattaagtt 9660 tgggcaggcc taaaaagaaa aacataacca aggcagaagc gcagtggttg ctgtgccccg 9720 aggaccaaat ggaagagcta cccgactggt tcgcagccgg ggaacccata tttttagagg 9780 ccaacattaa acatgacagg taccatctgg tgggggatat agctaccatc aaggaaaaag 9840 ccaaacagtt gggggctaca gactccacaa agatatctaa ggaggttggt gccaaagtgt 9900 attctatgaa actgagtaat tgggtgatgc aagaagaaaa taaacagggc aacctgaccc 9960 ccttgtttga agagctcctg caacagtgtc cacccggggg ccagaacaaa accgcacaca 10020 tggtctctgc ttaccaactg gctcaaggga actggatgcc gaccagctgc catgttttca 10080 tggggaccat atctgccagg agaaccaaga cccacccata tgaagcatac gtaaagttaa 10140 gggagttggt agaggaacac aagatgaaaa cactgtgtcc cggatcaagc ctgggtaagc 10200 acaacgattg gataattgga aaaattaaat accagggaaa cctgaggacc aaacacatgt 10260 tgaaccccgg caaggtggca gagcaactgt gcagagaggg acacagacac aatgtgtata 10320 acaagacaat aagctcagta atgacagcta ctggtatcag gttggagaag ttgcccgtgg 10380 ttagggccca gacagaccca accaacttcc accaagcaat aagggataag atagacaagg 10440 aagagaacct acaaaccccg ggtttacata agaaattaat ggaagttttc aacgcattga 10500 aacgacccga gttagagtcc tcctacgacg ccgtggaatg ggaggaactg gagagaggaa 10560 taaacaggaa gggtgctgct ggttttttcg aacgcaaaaa tataggggaa atattggatt 10620 cagagaaaaa taaagtcgaa gagattattg acaatctgaa aaaaggtaga aacattaaat 10680 attatgaaac cgcgatccca aagaatgaga agagggacgt caacgatgac tggaccgccg 10740 gtgatttcgt ggacgagaag aaacctagag tcatacaata ccctgaagca aaaacaagac 10800 tggccatcac caaggtgatg tataagtggg tgaagcagaa gccagtagtt atacccgggt 10860 atgaagggaa gacacctcta ttccaaattt ttgacaaagt gaagaaggaa tgggatcaat 10920 ttcaaaatcc agtggcagtg agcttcgaca ctaaggcgtg ggacacccag gtaaccacaa 10980 aagatttgga gctgataagg gacatacaaa agtattattt caagaagaaa tggcacaaat 11040 ttattgacac cctgaccacg catatgtcag aagtacccgt gattagtgct gatggggaag 11100 tatacataag gaaagggcaa agaggcagtg gacaacctga cacaagtgcg ggcaacagca 11160 tgctaaatgt cttaacaatg gtttacgcct tctgcgaggc cacaggagta ccctacaaga 11220 gctttgacag ggtggcaaaa attcatgtgt gcggggatga tggcttcctg atcacagaaa 11280 gagctctcgg tgagaaattt gcaagtaagg gagtccagat cctttatgaa gctgggaagc 11340 cccagaagat cactgaaggg gacaaaatga aagtggccta ccaatttgat gatattgagt 11400 tttgctccca tacaccaata caagtaagat ggtcagataa cacttctagt tacatgccgg 11460 ggagaaatac aaccacaatc ctggcaaaga tggccacgag gttagattcc agcggtgaaa 11520 ggggtaccat agcatatgag aaagcagtag catttagctt cctgctgatg tattcctgga 11580 acccactaat tagaaggatc tgcttactgg tgctatcaac tgaactgcaa gtgaaaccag 11640 ggaagtcaac tacttactat tatgaaggag acccgatatc tgcctacaag gaagtcatcg 11700 gccacaatct ttttgatctt aagagaacaa gctttgagaa gctggccaag ttaaatctta 11760 gcatgtctgt actcggggcc tggactagac acaccagtaa aagactacta caagactgtg 11820 tcaatatagg tgttaaagag ggcaactggc tagtcaatgc agacagacta gtaagtagca 11880 agaccgggaa taggtacata cccggagagg gtcacaccct gcaaggaaga cattatgaag 11940 aactggtgtt ggcaagaaaa cagatcaaca actttcaagg gacagacagg tacaacctag 12000 gcccaatagt caacatggtg ttaaggaggc tgagagtcat gatgatgacg ctgataggga 12060 gaggggcatg agcgcgggta acccgggatc tgaacccgcc agtaggaccc tattgtagat 12120 aacactaatt ttcttttttc ttttttattt atttagatat tattatttat ttatttattt 12180 atttattgaa tgagtaagaa ctggtataaa ctacctcaag ttaccacact acactcattt 12240 ttaacagcac tttagctgga aggaaaattc ctgacgtcca cagttggact aaggtaattt 12300 ctaacggccc 12310 <210> 11 <211> 950 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 11 Ala Gly Lys Arg Ala Arg Lys Pro Arg Ser Gly Ala Thr Thr Met Val 1 5 10 15 Ala His His Ala Ser Ser Ala His Glu Thr Arg Gln Ala Thr Lys His 20 25 30 Glu Gly Ala Gly Ala Asn Lys Ala Glu His Leu Lys Arg Tyr Ser Pro 35 40 45 Pro Ala Glu Gly Asn Cys Gly Trp His Cys Ile Ser Ala Ile Ala Asn 50 55 60 Arg Met Val Asn Ser Asn Phe Glu Thr Thr Leu Pro Glu Arg Val Arg 65 70 75 80 Pro Ser Asp Asp Trp Ala Thr Asp Glu Asp Leu Val Asn Thr Ile Gln 85 90 95 Ile Leu Arg Leu Pro Ala Ala Leu Asp Arg Asn Gly Ala Cys Gly Ser 100 105 110 Ala Lys Tyr Val Leu Lys Leu Glu Gly Glu His Trp Thr Val Ser Val 115 120 125 Ile Pro Gly Met Ser Pro Thr Leu Leu Pro Leu Glu Cys Val Gln Gly 130 135 140 Cys Cys Glu His Lys Gly Gly Leu Val Ser Pro Asp Ala Val Glu Ile 145 150 155 160 Ser Gly Phe Asp Pro Ala Cys Leu Asp Arg Leu Ala Lys Val Met His 165 170 175 Leu Pro Ser Ser Thr Ile Pro Ala Ala Leu Ala Glu Leu Ser Asp Asp 180 185 190 Ser Asn Arg Pro Val Ser Pro Ala Ala Thr Thr Trp Thr Val Ser Gln 195 200 205 Phe Tyr Ala Arg His Arg Gly Gly Asp His His Asp Gln Val Cys Leu 210 215 220 Gly Lys Ile Ile Ser Leu Cys Gln Val Ile Glu Asp Cys Cys Cys His 225 230 235 240 Gln Asn Lys Thr Asn Arg Ala Thr Pro Glu Glu Val Ala Ala Lys Ile 245 250 255 Asp Gln Tyr Leu Arg Gly Ala Thr Ser Leu Glu Glu Cys Leu Ala Lys 260 265 270 Leu Glu Arg Val Ser Pro Pro Ser Ala Ala Asp Thr Ser Phe Asp Trp 275 280 285 Asn Val Val Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Asn Gln Thr Thr Glu Gln 290 295 300 Pro His Val Asn Ser Cys Cys Thr Leu Val Pro Pro Val Thr Gln Glu 305 310 315 320 Pro Leu Gly Lys Asp Ser Val Pro Leu Thr Ala Phe Ser Leu Ser Asn 325 330 335 Cys Tyr Tyr Pro Ala Gln Gly Asp Glu Val His His Arg Glu Arg Leu 340 345 350 Asn Ser Val Leu Ser Lys Leu Glu Glu Val Val Leu Glu Glu Tyr Gly 355 360 365 Leu Met Ser Thr Gly Leu Gly Pro Arg Pro Val Leu Pro Ser Gly Leu 370 375 380 Asp Glu Leu Lys Asp Gln Met Glu Glu Asp Leu Leu Lys Leu Ala Asn 385 390 395 400 Thr Gln Ala Thr Ser Glu Met Met Ala Trp Ala Ala Glu Gln Val Asp 405 410 415 Leu Lys Ala Trp Val Lys Ser Tyr Pro Arg Trp Thr Pro Pro Pro Pro 420 425 430 Pro Pro Arg Val Gln Pro Arg Arg Thr Lys Ser Val Lys Ser Leu Pro 435 440 445 Glu Gly Lys Pro Val Pro Ala Pro Arg Arg Lys Val Arg Ser Asp Cys 450 455 460 Gly Ser Pro Val Leu Met Gly Asp Asn Val Pro Asn Gly Ser Glu Glu 465 470 475 480 Thr Val Gly Gly Pro Leu Asn Leu Pro Thr Pro Ser Glu Pro Met Thr 485 490 495 Pro Met Ser Glu Pro Val Leu Val Pro Ala Ser Arg Arg Val Pro Lys 500 505 510 Leu Met Thr Pro Leu Ser Gly Ser Ala Pro Val Pro Ala Pro Arg Arg 515 520 525 Thr Val Thr Thr Thr Leu Thr His Gln Asp Glu Pro Leu Asp Leu Ser 530 535 540 Ala Ser Ser Gln Thr Glu Tyr Glu Ala Phe Pro Leu Ala Pro Ser Gln 545 550 555 560 Asn Met Gly Ile Leu Glu Ala Gly Gly Gln Glu Val Glu Glu Val Leu 565 570 575 Ser Glu Ile Ser Asp Ile Leu Asn Asp Thr Asn Pro Ala Pro Val Ser 580 585 590 Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Val Lys Ile Thr Arg Pro Lys Tyr Ser 595 600 605 Ala Gln Ala Ile Ile Asp Ser Gly Gly Pro Cys Ser Gly His Leu Gln 610 615 620 Lys Glu Lys Glu Ala Cys Leu Ser Ile Met Arg Glu Ala Cys Asp Ala 625 630 635 640 Ser Lys Leu Gly Asp Pro Ala Thr Gln Glu Trp Leu Ser Arg Met Trp 645 650 655 Asp Arg Val Asp Met Leu Thr Trp Arg Asn Thr Ser Ala Tyr Gln Ala 660 665 670 Phe Arg Ile Leu Asn Gly Arg Phe Glu Phe Leu Pro Lys Met Ile Leu 675 680 685 Glu Thr Pro Pro Pro His Pro Cys Gly Phe Val Met Leu Pro Arg Thr 690 695 700 Pro Ala Pro Ser Val Ser Ala Glu Ser Asp Leu Thr Ile Gly Ser Val 705 710 715 720 Ala Thr Glu Asp Val Pro Arg Ile Leu Gly Lys Ile Gly Asp Thr Asp 725 730 735 Glu Leu Leu Asp Arg Gly Pro Ser Ala Pro Ser Lys Gly Glu Pro Val 740 745 750 Cys Asp Gln Pro Ala Lys Asp Pro Arg Met Ser Pro Arg Glu Ser Asp 755 760 765 Glu Ser Met Ile Ala Pro Pro Ala Asp Thr Gly Gly Val Gly Ser Phe 770 775 780 Thr Asp Leu Pro Ser Ser Asp Gly Val Asp Val Asp Gly Gly Gly Pro 785 790 795 800 Leu Arg Thr Val Lys Thr Lys Ala Gly Arg Leu Leu Asp Gln Leu Ser 805 810 815 Cys Gln Val Phe Ser Leu Val Ser His Leu Pro Ile Phe Phe Ser His 820 825 830 Leu Phe Lys Ser Asp Ser Gly Tyr Ser Pro Gly Asp Trp Gly Phe Ala 835 840 845 Ala Phe Thr Leu Phe Cys Leu Phe Leu Cys Tyr Ser Tyr Pro Phe Phe 850 855 860 Gly Phe Ala Pro Leu Leu Gly Val Phe Ser Gly Ser Ser Arg Arg Val 865 870 875 880 Arg Met Gly Val Phe Gly Cys Trp Leu Ala Phe Ala Val Gly Leu Phe 885 890 895 Lys Pro Val Ser Asp Pro Val Gly Thr Ala Cys Glu Phe Asp Ser Pro 900 905 910 Glu Cys Arg Asn Val Leu His Ser Phe Glu Leu Leu Lys Pro Trp Asp 915 920 925 Pro Val Arg Ser Leu Val Val Gly Pro Val Gly Leu Gly Leu Ala Ile 930 935 940 Leu Gly Arg Leu Leu Gly 945 950

Claims (55)

  1. 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 백신 및 2차 돼지 바이러스 백신을 포함하는 백신 조성물로서, PRRSV 백신 및 2차 백신은 서로에 대해 면역 억제가 실질적으로 없는 백신 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    3차 돼지 백신 바이러스를 더 포함하며, PRRSV 백신, 2차 백신 및 3차 백신은 서로에 대해 면역 억제가 실질적으로 없는 백신 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    2차 돼지 바이러스 백신은 돼지 열병 바이러스(CSFV) 백신 및 가성광견병 바이러스(PRV) 백신으로부터 선택되는 백신 조성물.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    3차 돼지 바이러스 백신은 돼지 열병 바이러스(CSFV) 백신 및 가성광견병 바이러스(PRV) 백신으로부터 선택되며 3차 백신은 2차 백신과 다른 백신 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRRSV 백신은 약독 PRRSV를 포함하는 백신 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 4와 비교할 때, 적어도 50개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 단편이 결핍된 DNA 서열에 의해 암호화된 Nsp2 뉴클레오티드를 포함하며, DNA 단편은 SEQ ID NO: 8의 동일한 길이 부분과 적어도 약 80% 상동인 백신 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    DNA 단편은 적어도 100, 적어도 120, 적어도 150, 적어도 180, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220, 적어도 230, 적어도 240, 적어도 250, 적어도 260, 적어도 270, 적어도 280, 적어도 290, 적어도 300, 적어도 310, 적어도 320, 적어도 330, 적어도 340, 적어도 350, 또는 적어도 360개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 백신 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    DNA 단편은 SEQ ID NO: 8의 동일한 길이 부분과 적어도 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 상동인 백신 조성물.
  9. 제 6 항에 있어서,
    DNA 단편은 SEQ ID NO: 8을 포함하는 백신 조성물.
  10. 제 5 항에 있어서,
    약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 11과 비교할 때, 적어도 20개 연속 아미노산을 포함하는 펩타이드 단편이 결핍된 Nsp2 단백질 서열을 암호화하는 Nsp2 뉴클레오티드를 포함하며, 단편은 SEQ ID NO: 9의 동일한 길이 부분과 적어도 약 80% 상동인 백신 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    펩타이드 단편은 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100, 적어도 105, 적어도 110, 적어도 115, 또는 적어도 120개 연속 아미노산을 포함하는 백신 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    펩타이드 단편은 SEQ ID NO: 9의 동일한 길이 부분과 적어도 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 상동인 백신 조성물.
  13. 제 10 항에 있어서,
    펩타이드 단편은 SEQ ID NO: 9를 포함하는 백신 조성물.
  14. 제 5 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약독 PRRSV는 고 병원성 PRRSV로부터 약독되는 백신 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 5와 비교할 때, SEQ ID NO: 6 내에 불연속 90개 뉴클레오티드가 결핍된 DNA 서열에 의해 암호화된 Nsp2 뉴클레오티드를 포함하는 백신 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서,
    Nsp2 뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화되는 백신 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    Nsp2 뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 2를 포함하는 서열에 의해 암호화되는 백신 조성물.
  18. 제 5 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약독 PRRSV는 SEQ ID NO:1과 적어도 90% 상동성을 가진 서열에 의해 암호화되는 Nsp1 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 백신 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서,
    약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 1에 의해 암호화된 Nsp1 뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NO: 2에 의해 암호화된 Nsp2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 백신 조성물.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 3와 적어도 90% 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화된 PRRSV 뉴클레오티드 서열을 포함하는 백신 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서,
    약독 PRRSV는 SEQ ID NO: 3에 의해 암호화된 PRRSV 뉴클레오티드 서열을 포함하는 백신 조성물.
  22. 제 20 항에 있어서,
    약독 PRRSV는 CGMCC No.:3121의 미생물 수탁 번호를 가지는 백신 조성물.
  23. 제 3 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CSFV 백신은 약독 CSFV를 포함하는 백신 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서,
    약독 CSFV는 SEQ ID NO: 10과 적어도 80% 상동성을 갖는 서열에 의해 암호화되는 백신 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서,
    약독 CSFV는 SEQ ID NO: 10에 의해 암호화되는 백신 조성물.
  26. 제 24 항에 있어서,
    약독 CSFV는 CGMCC No.:3891의 미생물 수탁 번호를 가지는 백신 조성물.
  27. 제 3 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRV 백신은 약독 PRV를 포함하는 백신 조성물.
  28. 제 27 항에 있어서,
    약독 PRV는 NC_006151의 NCBI 참조 번호를 가진 서열과 적어도 80% 상동성을 가진 서열을 포함하는 백신 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서,
    약독 PRV는 TK, PK, RR, dUTPase, gG, gC, gE, gD 및 gI로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 불활성 유전자를 가지는 백신 조성물.
  30. 제 29 항에 있어서,
    약독 PRV는 불활성 gE 유전자를 가지는 백신 조성물.
  31. 제 27 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약독 PRV는 CGMCC No.:5076의 미생물 수탁 번호를 가지는 백신 조성물.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    본 발명에 제공된 백신 조성물은 면역학적 유효량의 PRRSV 백신, CSFV 백신 및/또는 PRV 백신을 포함하는 백신 조성물.
  33. 제 32 항에 있어서,
    PRRSV 백신의 면역학적 유효량은 적어도 104.5 TCID50, 105.0 TCID50, 또는 105.5 TCID50이며,
    CSFV 백신의 면역학적 유효량은 적어도 100.5 FA-TCID50 (형광 항체 - TCID50), 101.0 FA-TCID50, 101.5 FA-TCID50, 102.0 FA-TCID50, 102.5 FA-TCID50, 103.0 TCID50, 103.5 FA-TCID50, 104.0 FA-TCID50, 104.5 FA-TCID50, 또는 105.0 FA-TCID50이거나 적어도 2.5 RID (토끼 감염량), 3 RID, 5 RID, 10 RID, 30 RID, 100 RID, 150RID, 300 RID, 750RID, 1000 RID, 3000 RID 또는 7500 RID이며, 및/또는
    PRV 백신의 면역학적 유효량은 적어도 103.0 TCID50, 103.5TCID50, 104.0TCID50, 104.5TCID50, 105.0TCID50, 105.5 TCID50 또는 106.0 TCID50인 백신 조성물.
  34. 제 32 항 또는 제 33 항에 있어서,
    PRRSV 백신 대 CSFV 백신의 TCID50 비는 10000:1 내지 1:1인 백신 조성물.
  35. 제 32 항 또는 제 33 항에 있어서,
    PRRSV 백신 대 PRV 백신의 TCID50 비는 1:1 내지 1:30인 백신 조성물.
  36. 제 32 항 또는 제 33 항에 있어서,
    PRRSV 백신 : CSFV 백신 : PRV 백신의 TCID50 비는 약 104: 1: 105 내지 약 5:1:6인 백신 조성물.
  37. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원보강제를 더 포함하는 백신 조성물.
  38. 제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    동결방지제를 더 포함하는 백신 조성물.
  39. 제 38 항에 있어서,
    동결방지제는 수크로오스, L-소듐 글루타메이트 및/또는 락트알부민 가수분해물을 포함하는 백신 조성물.
  40. 제 2 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 제조하는 방법으로서,
    (a) 개개의 감수성이 있는 세포에서 배양된 PRRSV 백신 균주, CSFV 백신 균주 및/또는 PRV 백신 균주를 수집하는 단계 및
    (b) 적절한 TCID50 비율로 둘 이상의 바이러스 균주를 혼합하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서,
    PRRSV 백신 균주에 대한 감수성이 있는 세포는 Marc-145, MA-104, Vero, 및 CL-2621로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포주 또는 PAM 세포인 프라이머리 세포인 방법.
  42. 제 40 항에 있어서,
    CSFV 백신 균주에 대한 감수성이 있는 세포는 BT, Vero, MPK, SK6, PK2a, CPK, RKC, MDBK, MDCK, CRFK, ST, 및 PT로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포주 또는 BT 세포인 프라이머리 세포인 방법.
  43. 제 40 항에 있어서,
    PRV 백신 균주에 대한 감수성이 있는 세포는 ST, PK-15, Marc-145, MDBK, BT, Vero, BHK-21, 돼지 신장 세포주(IBRS-2), 토끼 신장 세포주(RK), 및 닭 배아 섬유아세포 세포주로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포주 또는 돼지 신장 프라이머리 세포인 프라이머리 세포인 방법.
  44. 제 40 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    배양은 롤러 병 배양액에서 1x106/ml-5x106/ml의 세포 밀도로 또는 현탁 배양액에서 5x106/ml-1x107/ml의 세포 밀도로 감수성이 있는 세포에 대한 각 백신 균주를 바이오리액터에 주입된 부착 담체로 접종하는 것을 포함하는 방법.
  45. 제 44 항에 있어서,
    PRRSV 백신 균주는 0.01-0.5의 다중감염도(MOI)로 접종되며, CSFV 백신 균주는 0.1-0.5의 MOI로 접종, 및/또는 PRV 백신 균주는 0.005-0.5의 MOI로 접종되는 방법.
  46. 제 40 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계(b)는 10000:1 내지 1:1의 TCID50 비율로 수집된 PRRSV 백신 바이러스를 CSFV 백신 바이러스와 혼합하는 단계를 포함하는 방법.
  47. 제 40 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계(b)는 1:1 내지 1:30의 TCID50 비율로 수집된 PRRSV 백신 바이러스를 PRV 백신 바이러스와 혼합하는 단계를 포함하는 방법.
  48. 제 40 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계(b)는 104:1:105 내지 약 5:1:6의 TCID50 비율로 수집된 PRRSV 백신 바이러스, CSFV 백신 바이러스 및 PRV 백신 바이러스를 혼합하는 단계를 포함하는 방법.
  49. 제 40 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계(b)는 수집된 바이러스 용액의 혼합물과 동결방지제를 혼합하는 단계를 더 포함하는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서,
    수집된 바이러스 용액의 혼합물은 75-80 : 25-20의 부피비로 동결방지제와 혼합되는 방법.
  51. 제 40 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 제조된 백신 조성물.
  52. 돼지 생식기 호흡기 증후군, 돼지 열병 및/또는 가성광견병을 예방 또는 치료하기 위한 의약의 제조에서 제 1 항 내지 제 39 항 및 제 51 항 중 어느 한 항의 백신 조성물의 용도.
  53. 제 1 항 내지 제 39 항 및 제 51 항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하여 돼지를 면역화하는 방법.
  54. ST, PK-15, Marc-145, MDBK, BT, Vero, BHK-21, 돼지 신장 세포주(IBRS-2), 토끼 신장 세포주(RK), 및 닭 배아 섬유아세포 세포주로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포주 또는 돼지 신장 프라이머리 세포인 프라이머리 세포에서 배양된 CSFV 백신 균주.
  55. CSFV 백신 균주를 배양하는데 세포의 용도로서, 세포는 ST, PK-15, Marc-145, MDBK, BT, Vero, BHK-21, 돼지 신장 세포주(IBRS-2), 토끼 신장 세포주(RK), 및 닭 배아 섬유아세포 세포주로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포주 또는 돼지 신장 프라이머리 세포인 프라이머리 세포로부터 선택된 세포주인 용도.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017116177A3 (ko) * 2015-12-31 2018-03-08 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) 약독화된 돼지열병 바이러스 생마커백신주 및 이를 이용한 경구투여용 백신 조성물

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112013030321A2 (pt) * 2011-05-27 2017-07-11 Sinovet Beijing Biotechnology Co Ltd composição de vacina, método para preparar a composição de vacina, uso da composição de vacina, método para imunizar um porco, cepa de vacina contra csfv e uso de uma célula no cultivo de uma cepa de vacina contra csfv.
US9457073B2 (en) * 2012-09-26 2016-10-04 University Of Manitoba Live attenuated replication-competent arteriviruses having decreased dub/deisgylating activity
KR102319843B1 (ko) * 2013-09-25 2021-10-29 조에티스 서비시즈 엘엘씨 Pcv2b 분지형 백신 조성물 및 사용 방법
EP3080249B1 (en) 2013-12-12 2018-04-11 Intervet International B.V. Immortalized porcine alveolar macrophage
CN104250640A (zh) * 2014-08-22 2014-12-31 普莱柯生物工程股份有限公司 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CN111560355A (zh) * 2015-03-20 2020-08-21 普莱柯生物工程股份有限公司 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用
CN109563518A (zh) * 2016-05-12 2019-04-02 巴伊沃爱普有限公司 来自植物的用于经典猪瘟的疫苗组合物及其制造方法
CN107299078B (zh) * 2017-07-27 2020-06-05 郑州爱科生物科技有限公司 一株适应全悬浮培养的猫肾细胞系f-81 s及其应用
CN107815441B (zh) * 2017-08-31 2020-05-12 浙江大学 一种ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用
CN107653230A (zh) * 2017-08-31 2018-02-02 浙江大学 一种ⅱ型伪狂犬病毒毒株及其应用
CN109735564B (zh) * 2018-12-26 2023-04-21 河南农业大学 一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用
CN111057145B (zh) * 2019-11-22 2021-10-08 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体及其应用
CN111875678B (zh) * 2020-07-07 2021-10-08 华南农业大学 表达猪繁殖与呼吸综合征病毒gp3/gp5/m基因的重组伪狂犬病毒、构建方法和应用
CN113321712B (zh) * 2021-07-20 2023-02-24 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一组猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原多肽及其应用
CN116064557B (zh) * 2022-09-15 2024-06-04 华中农业大学 激活猪的ogfod2基因表达的制剂在制备猪抗伪狂犬病毒感染药物中的应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2751224B1 (fr) * 1996-07-19 1998-11-20 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs
ATE199022T1 (de) 1996-10-09 2001-02-15 Akzo Nobel Nv Europäische vakzinstämme des fortplanzungs- atmungs-syndromsvirus des sweins (prrsv)
CN1283788C (zh) 2003-06-02 2006-11-08 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的重组伪狂犬病毒及应用
KR20100090311A (ko) 2005-02-25 2010-08-13 화이자 프로덕츠 인크. 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 ｎ 단백질 돌연변이체
CA2611820C (en) * 2005-06-24 2015-10-06 Regents Of The University Of Minnesota Prrs viruses, infectious clones, mutants thereof, and methods of use
EP1792996A1 (en) 2005-12-01 2007-06-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
CN101307305B (zh) 2008-04-30 2010-06-16 中国动物疫病预防控制中心 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株及免疫原性物质和疫苗
CN101280292B (zh) 2008-05-13 2010-10-13 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株、其弱毒疫苗株及其应用
KR20100121289A (ko) 2009-05-08 2010-11-17 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 국립수의과학검역원) 유전자재조합 돼지열병 백신바이러스 Ｆｌｃ―ＬＯＭ ｖｉｒｕｓ 및 이의 제조방법
KR20100121288A (ko) 2009-05-08 2010-11-17 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 국립수의과학검역원) 유전자재조합 돼지열병 백신바이러스 Ｆｌｃ―ＬＯＭ―ＢＥｒｎｓ ｖｉｒｕｓ 및 이의 제조방법
CN101603035B (zh) 2009-05-18 2011-06-08 中国兽医药品监察所 猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合重组疫苗株及其生产活疫苗的方法
CN101633909B (zh) 2009-08-13 2012-05-09 华威特（北京）生物科技有限公司 预防猪感染猪繁殖与呼吸综合征的减毒活疫苗
CN101991849A (zh) 2009-08-18 2011-03-30 上海科立特农科（集团）有限公司 一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法
CN101690808A (zh) 2009-10-14 2010-04-07 广东永顺生物制药有限公司 猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法及其制品
US20110150770A1 (en) * 2009-12-18 2011-06-23 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Multivalent vaccine against porcine teschovirus and other disease causing organisms in swine
CN101879311A (zh) 2010-06-28 2010-11-10 武华 猪瘟活疫苗的制备方法及其产品
BR112013030321A2 (pt) * 2011-05-27 2017-07-11 Sinovet Beijing Biotechnology Co Ltd composição de vacina, método para preparar a composição de vacina, uso da composição de vacina, método para imunizar um porco, cepa de vacina contra csfv e uso de uma célula no cultivo de uma cepa de vacina contra csfv.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017116177A3 (ko) * 2015-12-31 2018-03-08 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) 약독화된 돼지열병 바이러스 생마커백신주 및 이를 이용한 경구투여용 백신 조성물

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