CN106148287B - 猪流行性腹泻病毒株及其疫苗组合物、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有良好免疫原性的猪流行性腹泻病毒株以及由该猪流行性腹泻病毒株制备的灭活疫苗。本发明提供的猪流行性腹泻病毒株，是目前的流行毒株，具有良好的免疫原性和稳定性；由该毒株制备的疫苗相比于商品疫苗株，具有安全性好、免疫保护能力强、免疫效力高等优点，能够全面有效地防治猪流行性腹泻。

Description

猪流行性腹泻病毒株及其疫苗组合物、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒株，本发明还涉及由该病毒株制备的疫苗组合物以及该疫苗组合物的制备方法和应用，属于生物医药领域。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种以腹泻、呕吐和脱水为主要特征的猪肠道传染病。各种年龄的猪均易感，尤其以哺乳仔猪受害最严重。该病已经成为猪养殖产业发展中的一个严重问题，2012年至今该病在全球范围内迅速爆发，造成了严重的经济损失。

PEDV为冠状病毒科(Coronviridae)冠状病毒属(Coronavirus)成员。PEDV基因组是单股正链具有感染性的RNA，其基因组5′端有一个帽子结构(cap)，3′端有一个Poly(A)尾，基因组全长为约28033nt。PEDV主要的结构蛋白有糖基化纤突蛋白(S蛋白)、基化囊膜蛋白(M蛋白)和与RNA结合的未糖基化核衣壳蛋白(N蛋白)。S蛋白在受体细胞结合吸附、膜融合等方面发挥重要作用；也是诱导机体产生保护性中和抗体的主要免疫蛋白。近几年的一些研究表明：冠状病毒S基因的变化更能够体现病毒的变异情况，在S蛋白已知的中和表位SS6和COE中和表位，流行毒株与传统毒株存在差异。由于上述在中和表位的异同，导致传统毒株的疫苗对当前流行毒株虽具有一定的交叉保护力，但不能很好地抵御流行毒株。

采用疫苗进行免疫预防是国内外控制猪流行性腹泻的根本手段，而市场销售的商品疫苗主要是猪流行性腹泻-猪传染性胃肠炎二联灭活苗/活苗，以及猪流行性腹泻-猪传染性胃肠炎-猪轮状病毒三联灭活苗/活苗，这些疫苗的应用对猪流行性腹泻起到了一定的预防作用，但由于猪流行性腹泻病毒S基因的变异导致现有的疫苗不能完全预防该病的发生，从而导致疫苗的免疫效果不太理想，猪流行性腹泻在中国乃至全球一些国家和地区持续爆发。因此，需要一种针对现有猪流行性腹泻病毒流行株的疫苗株或其免疫原性物质来解决上述问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种猪流行性腹泻病毒株以及由其制得的疫苗组合物，该猪流行性腹泻病毒株制得的疫苗组合物可以对流行野毒株提供有效的交叉保护，显示出显著的交叉免疫特性。

本发明的第一方面在于提供一种猪流行性腹泻病毒株，其中所述病毒株S基因含有编码氨基酸序列SEQ ID NO.6所示的SS6中和表位和/或SEQ ID NO.2所示的COE中和表位的核苷酸序列。

具备上述特征的S基因的猪流行性腹泻病毒株，具有目前的流行毒株的抗原特异性，具有良好的免疫原性和稳定性；由该毒株制备的疫苗具有较高的免疫效力和安全性，能够全面有效地防治猪流行性腹泻，并且对猪体安全。

优选地，本发明提供的猪流行性腹泻病毒株，其中所述病毒株S基因进一步含有编码氨基酸序列SEQ ID NO.4所示的SS2中和表位和/或SEQ ID NO.8所示的2C10中和表位的核苷酸序列。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪流行性腹泻病毒株为猪流行性腹泻病毒HN1303株(Porcine epidemic diarrhea virus,strain HN1303)，所述HN1303株生物保藏编号为：CCTCC NO.V201514，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年3月4日。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪流行性腹泻病毒株为猪流行性腹泻病毒CV777株(公开于中国专利CN101117627A)的变异株CV777-1株，所述CV777-1株是将SS6中和表位第1位氨基酸L突变为S，第3位氨基酸D突变为S；将COE中和表位第51位氨基酸T突变为S，第96位氨基酸G突变为S，第135位氨基酸Q突变为K。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪流行性腹泻病毒株为猪流行性腹泻病毒DR13株(公开于D.S.Song,et al.Oral efficacy of Vero cell attenuated porcineepidemic diarrhea virus DR13strain.Research in Veterinary Science 82(2007)134-140中)的变异株DR13-1株，所述DR13-1株是将SS6中和表位第1位氨基酸L突变为S，第3位氨基酸D突变为S；将COE中和表位第51位氨基酸T突变为S，第96位氨基酸G突变为S，第135位氨基酸Q突变为K。

作为本发明的一个实施方式，本发明提供的猪流行性腹泻病毒株，其S基因包含氨基酸序列为SEQ ID NO.2、4、6、8及核苷酸序列为SEQ ID NO.1、3、5、7所示的变体。

“变体”旨在表示基本上类似序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸之内的一个或更多位点的一个或更多核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中一个或更多位点的一个或更多核苷酸的取代。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本发明的特定多核苷酸(即,参照多核苷酸)的变体也可通过比较由变体多核苷酸编码的多肽和由参照多核苷酸编码的多肽之间的百分率序列同一性来评价。“变体”蛋白旨在表示通过在天然蛋白中的一个或更多位点的一个或更多氨基酸的缺失或添加，和/或天然蛋白中的一个或更多位点的一个或更多氨基酸的取代而源于天然蛋白的蛋白。本发明包括的变体蛋白有生物学活性，即，它们有引发免疫应答的能力，能对猪流行性腹泻病毒株攻击具有保护性反应的能力。

变体包括等位基因变体。术语"等位基因变体"指称含有导致蛋白的氨基酸序列变化及在天然的群(例如，病毒物种或变种)之内存在的多态性的多核苷酸或多肽。该天然的等位基因变异可一般导致多核苷酸或多肽的1％～5％变异。等位基因变体可通过在许多不同物种中测序目的核酸序列来鉴定，其可通过使用鉴定那些物种中的相同的遗传座位的杂交探针来容易进行。任何和全部该核酸变异及得到的氨基酸多态性或是天然的等位基因变异的结果且不改变目的基因的功能活性的变异旨在本发明的范围之内。

当以根据本发明所述的猪流行性腹泻病毒株调配于疫苗组合物中时，所述猪流行性腹泻病毒CV777-1株、DR13-1株以及HN1303株均显示出显著交叉免疫特性。因此，对于所述疫苗组合物而言，所述猪流行性腹泻病毒CV777-1株、DR13-1株、HN1303株，以及其他本质上具有相同本质识别特征的分离株极为优选。

本发明的猪流行性腹泻病毒株包含猪流行性腹泻病毒HN1303株，其保藏编号为：CCTCC NO.V201514，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：中国武汉市武汉大学；保藏日期：2015年3月4日。

本发明提供的猪流行性腹泻病毒HN1303株具体获得方法如下：通过对不同地区所采集的临床病料中病毒的分离培养，得到十几株猪流行性腹泻病毒株，对这十几株病毒的S、M和ORF3基因进行RT-PCR扩增、克隆及测序，并对其序列变化、遗传进化关系、抗原位点、糖基化位点和多肽极性进行分析。这十几株分离株与其他文献报道的分离株对比结果表明，其中1株有明显的差异。该猪流行行腹泻病毒株从S基因的遗传进化树可以看出，该分离株属于G2群2a亚群，处于目前中国的主要流行毒株分支上，与现在的分离株比对结果显示：(1)该毒株S基因与疫苗株CV777相比，核苷酸同源性为94.0％，氨基酸同源性为92.8％；与美国流行株IA1相比，核苷酸和氨基酸同源性均为99.2％；(2)该毒株ORF3基因与CV777疫苗株相比，核苷酸同源性为98.1％，氨基酸同源性为98.6％；与G2群2a亚群分离株GD-B、JS-HZ-2012ORF3基因的核苷酸一致，为100％；(3)该毒株M基因与DR13疫苗株相比，核苷酸同源性为97.7％，氨基酸同源性为97.4％；与GD-B、MN、JS-HZ-2012相比，核苷酸同源性为99.7％，氨基酸同源性为99.1％；(4)与现用疫苗株(CV777)相比，该毒株S蛋白的抗原位点、糖基化位点和跨膜螺旋均有明显改变。这些结果分析表明，该分离株有可能是目前的主要流行毒株。

根据PEDV核酸序列设计引物，用PCR方法对该HN1303株进行鉴定，结果显示阳性，证明该分离株为猪流行性腹泻病毒毒株。另外，对该HN1303株利用PCR方法进行外源微生物检测，结果显示PRRSV、CSFV、TGEV、PRV、BVDV、PPV、PCV2和猪轮状病毒均为阴性。

对该猪流行性腹泻病毒毒株HN1303的毒力测定结果表明：该HN1303株具有较强的毒力,攻毒动物发病情况符合猪流行性腹泻的典型症状，攻毒后发病或病死动物的疾病是由猪流行性腹泻病毒引起的。具体测定方法如下：将该HN1303株接种Vero细胞，按照现有的方法盲传10代后，出现典型的猪流行性腹泻病毒相同的细胞病变。为了证明该分离株HN1303的致病性，分别取第0、6、11代的病毒液，进行动物攻毒试验，观察动物发病情况，比较不同代次病毒液临床症状的差异，同时根据临床症状，从发病或病死动物中分离病毒、接种后进行序列比对。

对该猪流行性腹泻病毒毒株HN1303的免疫原性和保护效力测定结果表明：该毒株具有良好的免疫原性，能够刺激机体快速产生免疫力，且抗体持续维持在一个较高水平，对流行野毒株提供有效的交叉保护，显示出显著的交叉免疫特性。

为了分析该猪流行性腹泻病毒HN1303株S基因中和表位，对其进行测序。测序比对结果显示：与CV777、DR13、83P-5等疫苗株相比，该分离株在S蛋白的N端aa 58-61插入“NQGV”，aa 140处插入“N”；aa165-166处缺失“GK”；在S蛋白已知的4个中和表位，有2个中和表位即SS2、2C10流行株与CV777疫苗株完全一致，分别为“YSNIGVCK”和“GPRLQPY”；另外2个中和表位流行株与CV777疫苗株存在差异，其中SS6中和表位，CV777疫苗毒株为LQDGQVKI，而该分离株为SQSGQVKI；COE中和表位，分离株与疫苗毒株在3个位点存在差异，分别为T552S、G597S、Q636K。

为了验证与疫苗株CV777存在差异的中和表位SS6及COE是否是导致HN1303株能够提供对流行毒株交叉保护的原因之一，特将CV777疫苗株的SS6中和表位第1位氨基酸L突变为S，第3位氨基酸D突变为S；将COE中和表位第51位氨基酸T突变为S，第96位氨基酸G突变为S，第135位氨基酸Q突变为K。氨基酸突变后的菌株命名为猪流行性腹泻病毒CV777-1株。

同时，将疫苗株DR13的SS6中和表位第1位氨基酸L突变为S，第3位氨基酸D突变为S；将COE中和表位第51位氨基酸T突变为S，第96位氨基酸G突变为S，第135位氨基酸Q突变为K。氨基酸突变后的菌株命名为猪流行性腹泻病毒DR13-1株。

对猪流行性腹泻病毒CV777-1株和猪流行性腹泻病毒DR13-1株的稳定性和安全性进行试验，结果表明，两个毒株是稳定的，其毒力较强，安全性好，对怀孕母猪、仔猪均安全，无副作用，不会对机体造成危害。

对猪流行性腹泻病毒CV777-1株和猪流行性腹泻病毒DR13-1株的免疫原性和保护效力进行试验，结果表明，两株病毒株均具有良好的免疫原性，能够刺激机体快速产生免疫力，且抗体持续维持在一个较高水平，对流行野毒株提供一定的交叉保护，显示出一定的交叉免疫特性。

本发明的第二方面在于提供一种猪流行性腹泻病毒株的S基因，其中，所述S基因含有实质上编码氨基酸序列SEQ ID NO.6所示的SS6中和表位和/或SEQ ID NO.2所示的COE中和表位的核苷酸序列。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述S基因含有实质上编码氨基酸序列SEQ ID NO.6所示的SS6中和表位和/或SEQ ID NO.2所示的COE中和表位的核苷酸序列，所述S基因进一步含有实质上编码SEQ ID NO.4所示的SS2中和表位和/或序列SEQ ID NO.8所示的2C10中和表位的核苷酸序列。

术语“实质上编码”指其编码的蛋白可以通过添加、删除、替换一个或多个氨基酸残基同时保持其功能和免疫原性。

本发明涉及的猪流行性腹泻病毒S蛋白，其有利地激发动物中的保护性反应。具体地，本发明实施方式的蛋白序列包含与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。

“基本上相同”可以理解为本发明的蛋白优选地具有这样的氨基酸序列，其与SEQID NO.10中所示的序列的部分或全部具有至少70％同源性或甚至优选地80％同源性，或甚至更优选地90％同源性，或最优选地95％同源性。

在本文中术语“同源性”还包括与参比序列相同或类似，同时提供任何氨基酸的简单替换/修饰。可以用BLAST-P(基本局部排比检索工具)，本领域技术人员公知的程序进行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列，同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和BLASTN程序。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述的猪流行性腹泻病毒株的S基因，含有实质上编码SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述的猪流行性腹泻病毒株的S基因，含有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

本发明的猪流行性腹泻病毒株的S基因可以应用于表达载体、活载体、核酸疫苗、诊断试剂开发以及其他预防和/或治疗猪流行性腹泻相关药物开发。

本发明的第三方面在于提供一种猪流行性腹泻病毒的S蛋白，所述S蛋白实质上含有序列表中SEQ.NO.10所述的氨基酸序列。

本发明的第四方面在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的所述猪流行性腹泻病毒株的抗原和药学上可接受的载体；所述猪流行性腹泻病毒株抗原包括减毒全病毒抗原、灭活全病毒抗原、亚单位抗原或合成肽抗原。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，所述猪流行性腹泻病毒株的抗原包括所述猪流行性腹泻病毒株的灭活全病毒；所述灭活的猪流行性腹泻病毒全病毒抗原含量为灭活前10^7.0TCID₅₀/ml～10^8.0TCID₅₀/ml。

本发明所用的术语“疫苗组合物”系指含有猪流行性腹泻病毒免疫原性的药物组合物。该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对猪流行性腹泻病毒的免疫反应。疫苗组合物包括免疫量的猪流行性腹泻病毒株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗。

本发明所用的术语“活疫苗”指的是以毒力已经减弱但仍可在宿主体内或细胞上复制的病毒制备的疫苗。本发明所用的术语“减毒”用于指以使病原丧失致病性、但保持免疫原性的方式对基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV辐射、化学处理或体外连续高阶继代培养实现减毒。人工的基因改变，例如将已知序列中的特定核苷酸缺失以使毒力减弱。

本发明所用的术语“灭活疫苗”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。例如用本发明的强毒株HN1303可以通过灭活的方法制备成灭活疫苗。

本发明所用的术语“亚单位疫苗”指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫苗。它比全病毒疫苗引起副反应的可能性小。例如，表达的猪流行性腹泻病病毒的S蛋白可用于制备亚单位疫苗。

本发明所用的术语“合成肽疫苗”指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽,即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽,与载体连接后加佐剂所制成的疫苗。

本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

根据本发明，在所述疫苗组合物中，所述猪流行性腹泻病毒株抗原灭活前含量≥10^7.0TCID₅₀/ml。

优选地，在所述疫苗组合物中，所述猪流行性腹泻病毒株抗原灭活前含量为10^7.0TCID₅₀/ml～10^8.0TCID₅₀/ml。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，所述猪流行性腹泻病毒株的抗原包括所述猪流行性腹泻病毒HN1303株的灭活全病毒抗原；所述灭活的HN1303株全病毒抗原含量为灭活前≥10^7.0TCID ₅₀/ml。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，所述疫苗组合物中所述灭活的HN1303株全病毒抗原含量为灭活前10^7.0TCID₅₀/ml～10^8.0TCID₅₀/ml。

优选地，所述疫苗组合物包括免疫量的猪流行性腹泻病毒HN1303株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗或合成肽疫苗。

优选地，所述疫苗组合物包括免疫量的猪流行性腹泻病毒HN1303株的灭活疫苗。

本发明的疫苗组合物可使用可用技术来调配，优选为兽医药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。因此，本发明中，所述可药用疫苗佐剂包括油佐剂，其选自白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油(Drakeoil)，以及其他动物油、植物油或矿物油。上述油佐剂既可以是来源，也可以是经过人工合成获得的。本发明中，所述疫苗组合物为水包油乳液、油包水乳液或双重乳液，所述双重乳液通常表现为水包油包水乳液。

在本发明的一个实施方式中，所述疫苗组合物还包括助悬剂、表面活性剂、抗原灭活剂或防腐剂。所述助悬剂可包括，例如，硬脂酸铝，以及所属技术领域可用的其他助悬剂。所述表面活性剂可包括，例如，脱水山犁醇单油酸酯(TWEEN系列)，司本(SPAN)，以及所属技术领域可用的其他表面活性剂。所述抗原灭活剂包括(但不限于)，例如福尔马林、β－丙内酯等等。所述防腐剂包括，例如硫柳汞。上述物质的使用方法及用量均为本领域技术人员所熟知。

基于油佐剂会对动物体带来一定的副反应，还可以选择本领域的其它佐剂，包括氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐，来制备混悬液，减少免疫刺激。

本发明的第五方面在于提供一种制备所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：(1)培养增殖所述的猪流行性腹泻病毒；(2)灭活所述步骤(1)所述增殖的猪流行性腹泻病毒；以及(3)加入佐剂，乳化。

本发明的第六方面在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。

本发明的第七个方面在于提供所述的S蛋白在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。

术语“保护性反应”意为在动物中预防猪流行性腹泻病毒相关疾病或由猪流行性腹泻病毒导致的感染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。

本发明所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪流行性腹泻或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪流行性腹泻病毒感染引起的症状减轻或好转的所有行为。

发明优点

本发明采用目前中国猪流行性腹泻病毒流行毒株，制备灭活疫苗。该灭活疫苗具有良好的免疫原性和稳定性，接种仔猪和后备母猪后，均能够刺激机体快速地产生免疫力，产生较高的中和抗体水平，且抗体持续维持在一个较高水平；该灭活疫苗对20-25日龄和怀孕母猪均安全。本发明的毒株能够有效地保护流行强毒的攻击，具有很好的交叉保护作用，可以有效地保护猪群抵抗猪流行性腹泻，提高猪群的生产力。

序列表中：

SEQ ID NO.1为猪流行性腹泻病毒HN1303株S基因COE中和表位的核苷酸序列；

SEQ ID NO.2为猪流行性腹泻病毒HN1303株S基因COE中和表位的编码氨基酸序列；

SEQ ID NO.3为猪流行性腹泻病毒HN1303株S基因SS2中和表位的核苷酸序列；

SEQ ID NO.4为猪流行性腹泻病毒HN1303株S基因SS2中和表位的编码氨基酸序列；

SEQ ID NO.5为猪流行性腹泻病毒HN1303株S基因SS6中和表位的核苷酸序列；

SEQ ID NO.6为猪流行性腹泻病毒HN1303株S基因SS6中和表位的编码氨基酸序列。

SEQ ID NO.7为猪流行性腹泻病毒HN1303株S基因2C10中和表位的核苷酸序列；

SEQ ID NO.8为猪流行性腹泻病毒HN1303株S基因2C10中和表位的编码氨基酸序列；

SEQ ID NO.9为猪流行性腹泻病毒HN1303株S基因的核苷酸序列；

SEQ ID NO.10为猪流行性腹泻病毒HN1303株S基因的编码氨基酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 猪流行性腹泻病毒HN1303株的分离与增殖培养

1病毒分离

将临床采集的猪流行性腹泻典型发病的小肠连同肠内容物，用无菌的剪刀剪碎，按质量体积比1:3加入无菌的PBS(pH 7.4)，用无菌研磨器在冰上小心研磨完全。收集研磨后的液体，10000rpm 4℃离心15min。取离心后的上清，用0.22μm滤器过滤，取过滤液1ml接种Vero细胞(25T细胞瓶)，37℃吸附2h，之后补加维持液至适当体积，置于37℃5％CO₂培养，每天更换80％的维持液，培养6天后收获病毒液冻于-20℃；连续盲传5代即看见明显的细胞病变。

根据PEDV核酸序列设计特异性引物，用PCR方法进行检测，结果显示PEDV阳性，证实了该分离株确实为猪流行性腹泻病毒，命名为猪流行性腹泻病毒HN1303株。

将该猪流行性腹泻病毒毒株命名为猪流行性腹泻病毒HN1303株(Porcineepidemic diarrhea virus，strain HN1303)，保藏号为CCTCC NO.V201514；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉·武汉大学；保藏日期为2015年3月4日。

另外，采用PCR的方法对分离株HN1303株进行外源微生物的检测，结果显示PRRSV、CSFV、PPV、PCV1/2、PRV、BVDV、TGEV、轮状病毒和支原体均为阴性(猪蓝耳病病毒RT-PCR检测试剂盒、猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒、猪细小病毒PCR检测试剂盒、猪圆环PCR检测试剂盒和猪伪狂犬PCR检测试剂盒均为北京世纪元亨动物防疫技术有限公产品；BVDV、TGEV和轮状病毒为实验室自建方法)，表明该毒种纯净。

PEDV特异性扩增引物序列：

F：5'-GAAATAACCAGGGTCGTGGA-3'

R：5'-GCTCACGAACAGCCACATTA-3'

2病毒繁殖

将分离的病毒液进行100倍稀释，取1ml接种Vero细胞(25T)，37℃吸附2h，之后补加维持液至适当体积，置于37℃5％CO₂培养，培养36-48h后，待细胞病变达到80％以上时收获病毒液。病毒含量应不低于10^7.0TCID₅₀/ml。

3病毒TCID₅₀测定

Vero细胞传代后，按照3万细胞/孔，铺96孔细胞板，每孔100μl。置于37℃5％CO₂培养箱培养1天，细胞长成良好单层。将收获的病毒液用维持液进行10倍梯度稀释(10^-1、10^-2…10^-8)，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-85个稀释度，加入到长成单层细胞的96孔细胞板中，每个稀释度做8个重复，每孔100μl，置于37℃5％CO₂培养箱培养4天，每天观察细胞病变。根据细胞病变孔数，按照Reed-Muench方法计算病毒毒价。PEDV TCID₅₀可达10^7.0TCID₅₀/ml以上。

实施例2 猪流行性腹泻病毒HN1303株的序列分析

根据GenBank中发表的PEDV CV777株(AF353511)的序列设计特异性引物，用于扩增本发明的分离株，由于S基因较长，人为地分为3部分(S1、S2、S3)进行扩增，引物如下表1：

表1 S基因扩增引物序列

测序比对结果显示：与CV777、DR13、83P-5等疫苗株相比，该分离株在S蛋白的N端aa 58-61插入“NQGV”，aa140处插入“N”；aa165-166处缺失“GK”。在S蛋白已知的4个中和表位，有2个中和表位即SS2、2C10流行株与CV777疫苗株完全一致，分别为“YSNIGVCK”和“GPRLQPY”；另外2个中和表位流行株与CV777疫苗株存在差异。其中SS6中和表位，CV777疫苗毒株为LQDGQVKI，而该分离株为SQSGQVKI；COE中和表位，分离株与疫苗毒株在3个位点存在差异，分别为T552S、G597S、Q636K。分离株ORF3基因aa 82-98处均未见疫苗株(CV777vs、atDR13等)特征性的氨基酸缺失；与CV777、DR13疫苗株相比，未见有共有的变异位点。分离株M蛋白与疫苗株及其它变异株相比，存在点突变，即E13Q、A214S。

从S基因的遗传进化树可以看出，该分离株属于G2群2a亚群，处于目前中国的主要流行毒株分支上。与CV777疫苗株相比，核苷酸同源性为94.0％，氨基酸同源性为92.8％；与美国流行株IA1相比，核苷酸和氨基酸同源性均为99.2％。与CV777疫苗株ORF3基因相比，核苷酸同源性为98.1％，氨基酸同源性为98.6％；与G2群2a亚群分离株GD-B、JS-HZ-2012ORF3基因的核苷酸一致，为100％。与DR13疫苗株M基因相比，核苷酸同源性为97.7％，氨基酸同源性为97.4％；与GD-B、MN、JS-HZ-2012相比，核苷酸同源性为99.7％，氨基酸同源性为99.1％。

实施例3 HN1303株PEDV灭活苗制备

1.毒株PEDV分离株HN1303株15代，实验室分离。

2.PEDV毒株纯净性检验

病毒株应无细菌、霉菌(按照中华人民共和国兽用生物制品规程附录，以下简称附录的第50页进行)、支原体(附录第53页)及其他外源病毒污染(附录54页)。

3.PEDV灭活苗的制备过程：

3.1PEDV传代培养用细胞为非洲绿猴肾细胞(Vero细胞，购自上海生化所)。取1ml病毒液进行100倍稀释后，接种于长成良好单层的Vero细胞，37℃吸附2h后补加维持液至合适体积，置于37℃5％CO₂培养箱中培养36-48h，当细胞病变达80％以上时收获病毒液，冻于-20℃备用。

3.2对收获的病毒液经浓缩后进行病毒含量和纯净性检验，病毒含量为10^9.0TCID₅₀/ml，纯净性检验合格的病毒可用于配苗。

3.3将病毒含量和纯净性检验合格的病毒液用β-丙内酯进行灭活处理，并对灭活后的病毒液进行灭活检验。

3.4将灭活检验合格的抗原按9:1的体积比与铝胶佐剂乳化配苗，即制备成猪流行性腹泻灭活疫苗，具体配比见表2。

表2 猪流行性腹泻病毒HN1303株疫苗组合物成分配比

	疫苗1	疫苗2
			HN1303株抗原	10<sup>7.0</sup>TCID <sub>50</sub>/ml	10<sup>8.0</sup>TCID <sub>50</sub>/ml
铝胶佐剂(V/V％)	10％	10％

实施例4 HN1303株PEDV灭活疫苗的安全性试验

1.仔猪的安全性试验用检验合格的疫苗1和疫苗2各颈部肌肉接种PEDV抗原和抗体阴性的8-10日龄仔猪5头，于首免后14日进行二免。首免和二免接种双倍剂量4ml/头，免后连续观察14天，观察仔猪的接种部位及临床症状。同时设立对照组2头，不做任何处理。

2.怀孕母猪安全性试验用检验合格的疫苗1和疫苗2颈部肌肉接种PEDV抗原和抗体阴性的怀孕母猪5头，产前7周进行第一次免疫，接种剂量为4ml/头，产前4周进行第二次免疫，接种双倍剂量4ml/头。观察接种部位情况，统计母猪产仔数量及质量。同时设立对照组2头不做任何处理。

3.试验结果

表3 PEDV(HN1303)灭活疫苗双倍剂量安全试验(仔猪)

免疫组5头仔猪接种PEDV灭活苗后，连续观察14天，精神、饮食正常，体温未见升高，未见腹泻相关临床症状。二免后14天剖杀，取接种部位进行病理切片观察，未见异常。说明该疫苗对仔猪安全。

表4 PEDV(HN1303)灭活疫苗双倍剂量安全试验(母猪)

5头怀孕母猪接种PEDV(HN1303)灭活疫苗后未见明显临床症状，接种部位无异常情况。观察至母猪分娩，免疫组和对照组仔猪各有1头弱仔，无仔猪流产和死胎情况。免疫组和对照组平均产仔数没有明显差异，说明该疫苗对母猪安全。

安全性试验结果表明，本发明猪流行性腹泻病毒HN1303株对仔猪和怀孕母猪均安全，无副作用。

实施例5 HN1303株PEDV灭活疫苗的免疫效力试验

1.仔猪免疫效力试验

选择13头PEDV抗原和抗体阴性的8-10日龄仔猪用于本试验。将仔猪随机分为3组，第一组为疫苗1免疫组，5头，颈部肌肉接种，2ml/头；第二组为疫苗2免疫组，5头，颈部肌肉接种，2ml/头；第三组为空白对照组，3头，不做任何处理。于首免后14日进行二免，免疫后观察接种部位炎症情况及仔猪的临床症状，二免2周开始每周采血，检测血清中PEDV中和抗体效价。结果见表5。

表5 PEDV(HN1303)灭活疫苗免疫仔猪后中和抗体结果

免疫组仔猪接种部位均未见红肿、硬块、结痂等炎症反应，未见明显异常临床症状。血清中PEDV中和抗体结果显示，疫苗1组和疫苗2组在免后第3周，5头仔猪的中和抗体均大于1:32，在免后第4周达到最高峰，且能维持1周，免后第五周之后逐渐下降。该试验结果表明，对于8-10日龄仔猪，PEDV(HN1303)灭活疫苗免疫效力良好，免疫力持续时间长。

2.母猪免疫效力试验

选择11头PEDV抗原和抗体阴性的后备母猪用于本试验。将后备母猪随机分为3组，第一组为疫苗1免疫组，4头，颈部肌肉接种，2ml/头；第二组为疫苗2免疫组，4头，颈部肌肉接种，2ml/头；第三组为空白对照组，3头，不做任何处理。产前7周首免，产前4周二免，免疫后观察接种部位炎症情况及母猪的临床症状，二免后2周开始每周采血，检测血清中PEDV中和抗体效价。结果见表6。

表6 PEDV(HN1303)灭活疫苗免疫后备母猪后中和抗体结果

免疫组母猪猪接种部位均未见红肿、硬块、结痂等炎症反应，未见明显异常临床症状。血清中PEDV中和抗体结果显示，PEDV(HN1303)灭活疫苗组在免后第3周，所有母猪的中和抗体均大于1:32，在免后第4周达到最高峰，且能维持1周，免后第五周之后逐渐下降。该试验结果表明，本发明接种母猪后，能产生较高的中和抗体，且能维持在相对较高的水平，具有良好的免疫效力。

实施例6 HN1303株PEDV灭活疫苗的免疫效力比较试验

1.仔猪免疫效力试验

1.1试验方法

选择13头PEDV抗原和抗体阴性的8-10日龄仔猪用于本试验。将仔猪随机分为3组，第一组为疫苗1免疫组，5头，颈部肌肉接种，2ml/头；第二组为PEDV灭活疫苗商品苗(批号：201301，哈药集团生物疫苗有限公司)免疫组，5头，颈部肌肉接种，2ml/头；第三组为空白对照组，3头，不做任何处理。于首免后14日进行二免，免疫后观察接种部位炎症情况及仔猪的临床症状，二免后2周开始每周采血，检测血清中PEDV中和抗体效价。

1.2试验结果

表7 PEDV(HN1303)灭活疫苗免疫仔猪后中和抗体比较结果

免疫组仔猪接种部位均未见红肿、硬块、结痂等炎症反应，未见明显异常临床症状。血清中PEDV中和抗体结果显示，疫苗1免疫组在免后第3周，5头仔猪的中和抗体均大于1:32，在免后第4周达到最高峰，且能维持1周，免后第5周之后逐渐下降；而商品苗组在免后第3周只有3头仔猪抗体水平大于1:32，抗体增长较慢，同样在免后第4周达到高峰，但是在免后第5周开始下降，免后第6周抗体水平明显下降。该试验结果表明，对于8-10日龄仔猪，本发明PEDV(HN1303)灭活疫苗免疫效力比商品苗好，免疫力持续时间长。

2.母猪免疫效力试验

2.1试验方法

选择11头PEDV抗原和抗体阴性的后备母猪用于本试验。将后备母猪随机分为3组，第一组为疫苗1免疫组，4头，颈部肌肉接种，2ml/头；第二组为PEDV灭活疫苗商品苗免疫组，4头，颈部肌肉接种，2ml/头；第三组为空白对照组，3头，不做任何处理。产前7周首免，产前4周二免，免疫后观察接种部位炎症情况及母猪的临床症状，二免后2周开始每周采血，检测血清中PEDV中和抗体效价。

表8 PEDV(HN1303)灭活疫苗免疫后备母猪后中和抗体比较结果

免疫组母猪猪接种部位均未见红肿、硬块、结痂等炎症反应，未见明显异常临床症状。血清中PEDV中和抗体结果显示，疫苗1免疫组在免后第3周，所有母猪的中和抗体均大于1:32，在免后第4周达到最高峰，且能维持1周，免后第5周之后逐渐下降；而商品苗组在免后第3周有4头仔猪抗体水平大于1:32，抗体增长较慢，在免后第4周达到最高峰，免后第4周之后下降；疫苗1的抗体水平明显高于商品苗，且持续时间比商品苗长。该试验结果表明，本发明PEDV(HN1303)灭活疫苗接种母猪后，能产生较高的中和抗体，且能维持在相对较高的水平，具有良好的免疫效力。

实施例7 HN1303株PEDV灭活苗的攻毒保护比较试验

选择4头预产期相同的待产健康母猪，PEDV抗体抗原阴性。其中2头母猪接种疫苗1，2头母猪接种PEDV商品苗。4头母猪均于产前7周进行首免，颈部肌肉接种，2ml/头，产前4周以相同方法进行二免。疫苗1和商品苗免疫的母猪，各选13头状态良好的仔猪用于攻毒试验。其中各有10头母乳喂养；3头不吃母乳，人工饲养。仔猪7日龄时，进行口服攻毒(10^5.667TCID₅₀/ml，2ml/头)，仔猪分组及攻毒情况见表9。

表9 PEDV(HN1303)灭活疫苗免疫仔猪后攻毒保护比较结果

组别

仔猪数

母猪接种疫苗

饲养方式

攻毒毒株

功毒方式

保护率

1

5

疫苗1

母乳

CV777

口服

5/5

2

5

疫苗1

母乳

HN1303

口服

5/5

3

5

商品苗

母乳

CV777l

口服

4/5

4

5

商品苗

母乳

HN1303

口服

2/5

5

3

疫苗1

人工

CV777

口服

0/3

6

3

商品苗

人工

HN1303

口服

0/3

结果本发明灭活疫苗对传统猪流行性腹泻毒株及流行毒株的攻击均具有良好的保护性能，而商品疫苗对流行毒株的攻击保护率仅为传统毒株攻击保护率的一半，攻毒对照两组全数发病。

综上所述，本发明所制备的灭活疫苗对于仔猪有着良好的免疫保护效果，不仅对能抵抗传统毒株的攻击，还能对流行毒株有着良好的免疫保护效果，交叉保护性能良好。

实施例8 商品疫苗株的改造验证试验

将CV777、DR13疫苗株S基因COE及SS6中和表位按照HN1303株S基因COE及SS6中和表位进行基因突变，突变后，CV777、DR13疫苗株与HN1303株S基因四个中和表位COE、SS2、SS6、2C10氨基酸完全一致，CV777疫苗株基因突变后的新毒株命名为猪流行性腹泻病毒CV777-1株，DR13疫苗株基因突变后的新毒株命名为猪流行性腹泻病毒DR13-1株。

按照实施例3的方法进行疫苗制备。疫苗具体成分配比见表10。

表10 PEDV CV777-1株、DR13-1株灭活疫苗成分配比

	疫苗3(CV777-1株)	疫苗4(DR13-1株)
			抗原含量	10<sup>7.0</sup>TCID <sub>50</sub>/ml	10<sup>7.0</sup>TCID <sub>50</sub>/ml
铝胶佐剂(V/V％)	10％	10％

选择4头预产期相同的待产健康母猪，PEDV抗体抗原阴性。其中1头母猪接种疫苗3，1头母猪接种疫苗4，1头母猪接种PEDV商品苗1(CV777株),1头母猪接种商品苗2(DR13株)。4头母猪均于产前7周进行首免，颈部肌肉接种，2ml/头，产前4周以相同方法进行二免。疫苗3、疫苗4、商品苗1和商品苗2免疫的母猪，各选8头状态良好的仔猪用于攻毒试验。其中各有5头母乳喂养；3头不吃母乳，人工饲养。仔猪7日龄时，进行口服攻毒(10^5.667TCID₅₀/ml，2ml/头)，仔猪分组及攻毒情况见表11。

表11 PEDV(CV777-1株、DR13-1株)灭活疫苗攻毒保护比较结果

组别

仔猪数

母猪接种疫苗

饲养方式

攻毒毒株

功毒方式

保护率

1

5

疫苗3

母乳

HN1303

口服

4/5

2

5

疫苗4

母乳

HN1303

口服

4/5

3

5

商品苗1

母乳

HN1303

口服

2/5

4

5

商品苗2

母乳

HN1303

口服

2/5

5

3

疫苗3

人工

HN1303

口服

0/3

6

3

疫苗4

人工

HN1303

口服

0/3

7

3

商品苗1

人工

HN1303

口服

0/3

8

3

商品苗2

人工

HN1303

口服

0/3

结果疫苗3和疫苗4对流行毒株的攻击保护率均提升了50％，显示出良好的保护性能，而商品苗1和商品苗2对流行毒株的攻击保护率仅为2/5，攻毒对照组全数发病。

综上所述，本发明所制备的灭活疫苗(CV777-1株、DR13-1株)对于仔猪有着良好的免疫保护效果，尤其是对流行毒株有着良好的免疫保护效果，大大提升了原有商品疫苗交叉保护性能，说明HN1303株S基因的COE及SS6中和表位对流行毒株的交叉保护起着重要的作用，也说明了变异的S基因、S蛋白无论对于猪流行性腹泻病毒传统株还是流行株的免疫保护均具有关键作用。

实施例9猪流行性腹泻病毒HN1303株S蛋白的制备

1.毒株PEDV分离株HN1303株，实验室分离。

2.特异性引物

F:TTTCAACACTTAGCCTACCAA

R:AAGTCTAGGACCCCTACAACA

3.S蛋白制备

取PEDV HN1303病毒液，提取病毒RNA，用上述特异性引物进行扩增。取目的产物连接pMD18-T克隆载体，制备阳性重组质粒pMD18-T-S，挑选阳性重组质粒pMD18-T-S使用特异性引物进行扩增，将扩增产物连接表达载体pGEX-6P-1，并转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆。将构建的阳性表达质粒转入表达宿主菌BL21中，挑选单克隆，接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，用IPTG进行诱导表达，即得到PEDV S蛋白。

实施例10猪流行性腹泻病毒HN1303株S蛋白的免疫原性试验

选择2头预产期相同的待产健康母猪，PEDV抗体抗原阴性。其中1头母猪接种实施例3制备的疫苗1，1头母猪接种实施例9制备的S蛋白。2头母猪均于产前7周进行首免，颈部肌肉接种，2ml/头，产前4周以相同方法进行二免。疫苗1和S蛋白免疫的母猪，各选10头状态良好的仔猪用于攻毒试验。其中各有5头母乳喂养；5头不吃母乳，人工饲养。仔猪7日龄时，用HN1303毒株(10^5.667TCID₅₀/ml，2ml/头)进行口服攻毒，仔猪分组及攻毒情况见表12。

表12 PEDV S蛋白攻毒保护比较结果

组别

仔猪数

母猪接种疫苗

饲养方式

攻毒毒株

功毒方式

保护率

1

5

疫苗1

母乳

HN1303

口服

5/5

2

5

S蛋白

母乳

HN1303

口服

4/5

3

5

疫苗1

人工

HN1303

口服

0/5

4

5

S蛋白

人工

HN1303

口服

0/5

结果显示，疫苗1免疫组未见异常临床症状，5/5保护；PEDV S蛋白免疫仔猪4/5保护，有1头仔猪出现轻微腹泻；对照组则5/5发病，出现连续的腹泻。该结果说明本研究中表达的S蛋白有较好的免疫原性，能够产生较好的保护力。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.猪流行性腹泻病毒株HN1303株，所述HN1303株生物保藏编号为：CCTCC NO.V201514，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年3月4日。

2.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求1所述猪流行性腹泻病毒疫苗株的抗原和药学上可接受的载体；所述猪流行性腹泻病毒疫苗株抗原为灭活全病毒抗原。

3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述猪流行性腹泻病毒疫苗株的抗原包括所述猪流行性腹泻病毒HN1303株的灭活全病毒抗原；所述灭活的HN1303株全病毒抗原含量为灭活前≥10^7.0TCID ₅₀/ml。

4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物中所述灭活的HN1303株全病毒抗原含量为灭活前10^7.0TCID₅₀/ml～10^8.0TCID₅₀/ml。

5.一种制备权利要求3所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：

(1)培养增殖所述的猪流行性腹泻病毒疫苗株；

(2)灭活所述步骤(1)所述增殖的猪流行性腹泻病毒疫苗株；以及

(3)加入佐剂，乳化。

6.根据权利要求2～4任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。