CN109810950A - 一株G2b亚型猪流行性腹泻病毒弱毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一株G2b亚型猪流行性腹泻病毒致弱毒株的制备及其应用。所述G2b亚型猪流行性腹泻病毒致弱毒株是JSX2014/ATT，它的保藏号是CCTCC NO.V201865；它的基因组序列如SEQ ID NO.37所示。本发明还公开了该弱毒株JSX2014/ATT在制备G2b亚型猪流行性腹泻病毒变异毒株弱毒疫苗中的应用。本发明通过Vero细胞连续传代和空斑纯化，筛选出致弱的G2b亚型PEDV弱毒株JSX2014/ATT株，在Vero细胞上复制性能稳定，效价高，可用于进一步研制G2b亚型PEDV变异毒株弱毒苗。

Description

一株G2b亚型猪流行性腹泻病毒弱毒株及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一株G2b亚型猪流行性腹泻病毒致弱毒株的制备及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)，属于冠状病毒科α-冠状病毒属，其基因组为不分节段的线性单股正链RNA，可引起猪，特别是新生仔猪厌食、腹泻、呕吐以及脱水，各个年龄和各个品种的猪均可感染，其中哺乳仔猪最易感，死亡率可高达95％，是近年来在多个国家和地区造成新生仔猪死亡的重要原因之一。PED于1971年首次在英国被报道，随后在欧洲其他多个国家流行(EN Wood.An apparently new syndromeof porcine epidemic diarrhoea[J].Veterinary Record,1977,100(12):243-4.)。该病在亚洲国家流行情况较欧洲国家更加严重，哺乳仔猪感染后呈现出高感染率和死亡率。自1984年起，PED就成为引起我国仔猪腹泻的重要疾病之一，20多年来，由于针对G1a亚型的CV777疫苗的使用，并未对我国养猪业造成重大的经济损失(Wang D,Fang L,XiaoS.Porcine epidemic diarrh ea in China.[J].Virus Research,2016,226:7-13.)。但从2010年开始，我国南方多个省份暴发了由一种新的基因型(G2b亚型)PEDV变异毒株引起的仔猪腹泻，造成大量仔猪的死亡，疾病迅速蔓延至全国，经研究发现CV777疫苗株不能对该型变异株产生足够的免疫保护(LiW,Li H,Liu Y,et al.New variants of porcineepidemic diarrhea virus,China,2011[J].Emerging Infectious Diseases,2012,18(8):1350-1353.)。随后，G2b亚型PEDV变异毒株引起世界范围的PED大暴发，给全球养猪业造成了巨大的经济损失(Porcine epidemic diarrhea virus:An overview of currentvirological and serological diagnostic methods[J].Virus Resea rch,2016,226:60-70.)。与经典的G1a亚型毒株相比，新出现的G2b亚型毒株致病性更强。由于G1a亚型疫苗株CV777不能针对G2b亚型变异毒株提供有效的保护，因此迫切需要研制G2b亚型变异毒株疫苗。

弱毒疫苗是一种病原致病力减弱但仍具有活力和良好免疫原性的完整病原疫苗，也就是用人工致弱或自然筛选的弱毒株，经培养后制备的疫苗。弱毒疫苗具有很多优点，如病原可在免疫动物体内繁殖、用量小、免疫原性好、免疫期长、成本低、使用方便等，而研制G2b亚型PEDV致弱毒株对研制与当前流行毒株抗原性一致的弱毒苗具有重要意义，以期能够有效防控G2b亚型PEDV感染与流行。

PEDV(JSX2014株)是本实验室从江苏某规模化猪场急性腹泻的哺乳仔猪小肠样品中分离到1株PEDV野毒株，该毒株通过细胞传代适应之后可在Vero细胞上稳定增殖并产生细胞病变(CPE)(孙莹.基因2b亚型猪流行性腹泻病毒变异株的分离鉴定和疫苗研制.扬州大学硕士学位论文，2017)。对JSX2014株进行全基因组测序，并与其他PEDV毒株的全基因序列及S基因序列遗传进化关系，表明JSX2014毒株属于当前流行的G2b亚型。利用该毒株制备的氢氧化铝佐剂灭活疫苗，免疫产前母猪及50日龄断奶仔猪，利用间接ELISA方法和血清中和试验分别检测疫苗免疫后的抗体消长规律。结果显示，断奶仔猪于免疫后14d已开始产生特异性抗体，免疫后42d表现100％血清抗体转阳。以JSX2014作为指示病毒进行中和实验，显示接种灭活JSX2014疫苗的断奶仔猪于免疫后42天表现最高血清抗体水平，与间接ELISA检测抗体增长规律相一致。免疫母猪分娩后7天的血清、初乳样品的中和抗体效价明显高于G1a型CV777毒株制备的灭活疫苗免疫组。所有实验结果均表明，JSX2014株具有良好的免疫原性，可以进一步进行致弱研制对应的弱毒活疫苗。

发明内容

本发明的目的在于研制一种G2b亚型PEDV致弱毒株及其制备方法和应用。

本发明所述G2b亚型PEDV致弱毒株是通过对G2b亚型PEDV分离株JSX2014连续细胞传代进行致弱筛选，在传代过程中分别挑取形态大小差异明显的空斑，进行空斑纯化，通过测定TCID50来评价不同空斑克隆株的复制能力。最终获得完全致弱且复制性能稳定的弱毒株JSX2014/ATT株，对新生仔猪无致病性，为研制针对G2b亚型变异毒株的弱毒疫苗奠定基础。

本发明提供了一株G2b亚型猪流行性腹泻病毒弱毒株JSX2014/ATT，它的保藏号是CCTCC NO.V201865。

本发明还公开了所述的G2b亚型猪流行性腹泻病毒弱毒株JSX2014/ATT全基因组序列，基因组全长为28031bp，其序列如SEQ ID NO.37所示。

JSX2014/ATT全基因组序列中，ORF3基因在第14位之后有1个碱基(胸腺嘧啶，T)插入而导致翻译提前终止，M基因具有一个独特的15个核苷酸的插入，编码5个额外的氨基酸。

进一步地的，本发明公开了G2b亚型猪流行性腹泻病毒弱毒株JSX2014/ATT的ORF3基因和M基因共同作为区分弱毒株JSX2014/ATT和野毒株的分子标记的应用；所述ORF3基因的序列如SEQ ID NO.38所示；所述M基因的序列如SEQ ID NO.39所示。

本发明还公开了所述的G2b亚型猪流行性腹泻病毒弱毒株JSX2014/ATT在制备G2b亚型猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株弱毒疫苗中的应用。

本发明中，获得G2b亚型PEDV致弱毒株的方法是：

(1)G2b亚型PEDV变异毒株JSX2014的传代：将G2b亚型PEDV流行株JSX2014接种于长成70％～90％单层的生长良好的Vero细胞上进行连续传代。

(2)G2b亚型PEDV变异毒株JSX2014的空斑纯化和减毒株筛选：从传代至第80代开始，每隔20代进行一次空斑纯化，通过测定TCID50来评价不同空斑克隆株的复制能力，挑选出复制能力好的空斑克隆株继续传代。对120代病毒进行空斑纯化后挑取复制能力最佳的克隆继续传代10代，经口服感染三日龄未吸吮母乳的初生仔猪进行毒力鉴定证明已经完全致弱，获得的致弱毒株命名为JSX2014/ATT，于2018年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国·武汉·武汉大学，保藏编号CCTCCNO.V201865。

(3)弱毒株JSX2014/ATT全基因组测定与分析：为了确定JSX2014/ATT弱毒株在细胞传代后基因水平的变化情况，根据文献设计引物对其全基因组进行分段克隆和测序，并与亲本株JSX2014基因组序列进行比对分析，分别从核苷酸和氨基酸水平比较传代前后基因组序列的差异。

本发明的有益效果体现在：本发明通过Vero细胞连续传代和空斑纯化，筛选出致弱的G2b亚型PEDV弱毒株JSX2014/ATT株，在Vero细胞上复制性能稳定，效价高，可用于进一步研制G2b亚型PEDV变异毒株弱毒苗。

附图说明

图1是JSX2014/ATT株ORF3基因与亲本毒株JSX2014ORF3基因核苷酸序列比对结果图，方框所示为1个核苷酸(T)插入。

图2是JSX2014/ATT株M基因与亲本毒株JSX2014M基因核苷酸序列比对结果图，方框所示为15个核苷酸(ACTCGGCAGTATCAT)插入。

图3是JSX2014/ATT株M基因与亲本毒株JSX2014M基因编码氨基酸序列比对结果图，方框所示为5个氨基酸(LGSII)插入。

图4是攻毒仔猪和健康对照猪肠道病理组织学检查结果，A为JSX2014/ATT感染猪肠道组织病理切片，B为健康对照猪肠道组织病理切片。

致弱的G2b亚型PEDV弱毒株JSX2014/ATT株于2018年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国·武汉·武汉大学，保藏编号CCTCC NO.V201865，分类命名为猪流行性腹泻病毒弱毒株JSX2014/ATT。

具体实施方式

下面将通过附图和具体实施方式对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。

实施例1 PEDVJSX2014株的致弱

(1)细胞培养连续传代：将G2b亚型PEDV流行株JSX2014接种于长成70％～90％单层的生长良好的Vero细胞上进行连续传代。

(2)G2b亚型PEDV变异毒株JSX2014的空斑纯化和减毒株筛选：从传代至第80代开始，每隔20代进行一次空斑纯化，通过测定TCID50来评价不同空斑克隆株的复制能力，挑选出复制能力强的空斑克隆株继续传代。在80代时挑取的10个空斑分别进行TCID50测定，根据病毒滴度测定结果(见表1)，确定形态大的空斑比形态小的空斑病毒滴度高，说明形成大空斑的克隆其复制能力优于形成小空斑的克隆。选取复制效率最高的大空斑继续传代。对120代病毒进行空斑纯化后挑取复制能力最佳的克隆继续传代10代，获得的毒株命名为JSX2014/ATT，于2018年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国·武汉·武汉大学，保藏编号CCTCC NO.V201865。

表1不同形态空斑的病毒滴度

实施例2致弱毒株JSX2014/ATT基因组测序与分子特征分析

为了确定JSX2014/ATT在细胞传代后与亲本毒株JSX2014相比在基因组水平的变化情况，对其全基因组进行分段克隆和测序分析。

PCR引物主要参考孙莹设计的全基因组克隆引物(孙莹.基因2b亚型猪流行性腹泻病毒变异株的分离鉴定和疫苗研制.扬州大学硕士学位论文，2017)，重新设计了第14分段的克隆引物PEDV 14F＇/R＇，引物序列见表2，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表2基因组分段克隆PCR引物序列

*：代表引物在亲本株JSX2014基因组(GenBank登录号：)序列中对应的位置。

通过TRIzol法提取JSX2014/ATT株总RNA，分别用表2所述18对特异性引物进行RT-PCR扩增，阳性条带进行克隆和测序。测序完成的序列经Lasergene7.0软件中EditSeq编辑去除载体序列后用SeqMan程序拼接获得全长基因组序列，然后用MegAlign程序比较JSX2014/ATT与JSX2014亲本毒株在全基因组水平的核苷酸序列和氨基酸的差异。

测序结果显示，JSX2014/ATT基因组全长为28031bp，序列如SEQ ID NO.37所示，而亲本株JSX2014基因组全长为28015bp。

与亲本毒JSX2014相比，JSX2014/ATT复制酶ORF1ab基因发生13个错义突变A³⁸C，A³⁷³G，A⁵⁵⁴T，C⁶⁶²T，T⁸²⁰C，A⁹⁸²G，G¹⁵⁸⁷T，A⁴⁶⁵⁷G，T¹⁰⁴⁰⁵G，G¹¹¹⁷²T，C¹³⁸⁶³T，C¹⁸³⁴⁶T，A²⁰³³⁸C(表3)和2个同义突变(ORF1ab nsp10中C¹²⁰⁹⁹T以及nsp13中A¹⁵²⁶⁰G)，错义突变主要集中在ORF1ab的nsp2编码区。此外，JSX2014/ATT ORF3基因(SEQ ID NO.38)在第14位插入一个T而导致翻译提前终止(见图1)。

表3.JSX2014/ATT和亲本毒株非结构基因核苷酸和氨基酸水平上的差异

*：终止密码子。

与亲本毒株相比，JSX2014/ATT结构基因碱基突变主要集中在S基因上，共有11处错义突变，分别为A³⁹⁷C，C⁴⁶⁹T，G⁷⁷²A，T⁹⁷⁶C，C¹¹⁷¹T，A³²⁶²G，A³³⁷³G，A³⁵³²T，A³⁷⁸⁴C，G³⁷⁸⁷A，C³⁸⁰²T。在E和N基因都只有1个错义突变。N基因有3个同义突变(T⁵⁵⁸G；C⁷⁰⁸T和C⁷²⁰T)。M基因(SEQ IDNO.39)除了具有2个错义突变外还具有一个独特的15个核苷酸的插入(见图2)，编码5个氨基酸(见图3)，这5个氨基酸的插入在目前所有的PEDV致弱毒株中未曾出现过。

表3.5 JSX2014/ATT和原始毒株在结构基因核苷酸和氨基酸水平上的差异

实施例3 JSX2014/ATT的致病性测定

选用3日龄未吸吮初乳的新生仔猪进行对JSX2014/ATT进行致病性测定。仔猪肌肉注射10^7.6TCID50/mL JSX2014/ATT病毒液，剂量为2mL/头，空腹2h后进行正常饲喂。每天观察是否有呕吐、腹泻等临床症状并采集仔猪肛拭子和血液进行PEDV检测。5d后处死仔猪，解剖并采集仔猪的肠管样品，进行病理组织学检查，以确定JSX2014/ATT是否对攻毒仔猪肠道造成损伤。

结果显示：仔猪肌肉注射JSX2014/ATT病毒液后，未出现呕吐、腹泻等临床症状。仔猪感染后5d内肛拭子qPCR检测结果显示，仔猪肛拭子中检测不到病毒。仔猪感染后前3d血液样品进行qPCR检测，仅在感染后第1d血液中可检测到病毒，之后未再检测到。5d后处死仔猪，解剖发现，仔猪肠管正常，无鼓气、肠壁变薄等病变。肠管组织病理切片如图4，其中A为JSX2014/ATT感染猪肠道组织病理切片，B为健康对照猪肠道组织病理切片。观察结果显示仔猪肠道组织结构完整，肠绒毛未发生明显萎缩、脱落可见JSX2014/ATT株感染猪肠道组织未发现任何病理变化，与对照组无明显差异。结果表明JSX2014/ATT对新生仔猪无致病性，安全性良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一株G2b亚型猪流行性腹泻病毒弱毒株及其应用

<130>

<160> 39

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 28031

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catctggcgg tcttttatca ctggtcttaa tacaatgtgg gatttttgca agcatcttaa 2520

agtcagcttt ggactagatg gcattgttgt cactgtagca cgcaaattta aacgacttgg 2580

tgctctcttg gcagaaatgt ataacactta cctttcaact gtggtggaaa acttggtact 2640

ggccggtgtt agcttcaagt attatgccac cagtgtccca aaaattgttt tgggctgttg 2700

ttttcacagt gttaaaagtg ttcttgcaag tgccttccag attcctgtcc aggcaggcgt 2760

tgagaagttt aaagtcttcc ttaactgtgt tcaccctgtt gtaccacgtg tcattgaaac 2820

ttcttttgtg gaattagaag agacgacatt taaaccacca gcactcaatg gtagtattgc 2880

tattgttgat ggctttgctt tctattatga tggaacacta tactatccca ccgatggtaa 2940

tagcgttgtt cctatctgct ttaagaagaa aggtggtggt gatgtcaaat tctctgatga 3000

agtctctgtt aaaaccattg acccagttta taaggtctcc cttgaatttg agttcgagtc 3060

tgagactatt atggctgtgc ttaataaggc tgttggtaat tgtatcaagg ttacaggtgg 3120

ttgggacgat gttgttgagt atatcaatgt tgccattgag gttcttaaag atcacatcga 3180

tgtgcctaag tactacatct atgatgagga aggtggcacc gatcctaatc tgcccgtaat 3240

ggtttctcag tggccgttga atgatgacac gatctcacag gatctgcttg atgttgaagt 3300

tgttactgat gcgccagttg atttcgaggg tgatgaagta gactcctctg accctgataa 3360

ggtggcagac gtggctaact ctgagcctga ggatgacggt cttaatgtag ctcctgaaac 3420

aaatgtagag tctgaagttg aggaagttgc cgcaaccttg tcctttatta aagatacacc 3480

ttccacagtt actaaggatc cttttgcttt tgactttgca agctatggag gacttaaggt 3540

tttaagacaa tctcataaca actgctgggt tacttctacc ttggtgcagc tacaattgct 3600

tggcatcgtt gatgaccctg caatggagct ttttagtgct ggtagagttg gtccaatggt 3660

tcgcaaatgc tatgagtcac aaaaggctat cttgggatct ttgggtgatg tgtcggcttg 3720

cctagagtct ctgactaagg acctacacac acttaagatt acctgttctg tagtctgtgg 3780

ttgtggtact ggtgaacgta tctatgatgg ttgtgctttt cgtatgacgc caactttgga 3840

accgttccca tatggtgctt gtgctcagtg tgctcaagtt ttgatgcaca cttttaaaag 3900

tattgttggc accggcatct tttgtcgaga tactactgct ctctccttgg attctttggt 3960

tgtagaacct ctttgtgcgg ctgcttttat aggcaaggat agtggtcatt atgtcactaa 4020

cttttatgat gctgctatgg ctattgatgg ttatggtcgt catcagataa agtatgacac 4080

actgaacact atttgtgtta aagacgttaa ttggacagca ccttttgtcc cagacgttga 4140

gcctgtattg gagcttgttg tcaaaccttt ctattcttat aagaatgttg atttttacca 4200

aggagatttt agtgaccttg ttaaacttcc atgtgatttt gttgttaatg ctgcaaatga 4260

gaatttgtct cacggtggcg gcatagcaaa ggccattgat gtttatacca agggcatgtt 4320

gcagaagtgc tcgaatgatt acattaaagc acacggtccc attaaagttg gacgtggtgt 4380

catgttggag gcattaggtc ttaaggtctt taatgttgtt ggtccacgta agggtaagca 4440

tgcacctgag cttcttgtta aggcttataa gtccgttttt gctaattcag gtgttgctct 4500

tacacctttg attagtgttg gaatttttag tgttcctttg gaagaatctt tatctgcttt 4560

tcttgcatgt gttggtgatc gccactgtaa gtgcttttgt tatagtgaca aagagcgcga 4620

ggcgatcatt aattacatgg atggcttggt agatgctatt ttcaaatatg cacttgttga 4680

tactactcct gtccaggaag atgttcaaca agtttcacaa aaaccagttt tgcctaattt 4740

tgaacctttc aggattgaag gtgctcatgc tttctatgag tgcaaccctg aaggtttgat 4800

gtcattaggt gctgacaagc tggtgttgtt tacaaattcc aatttggatt tttgtagcgt 4860

tggtaagtgt cttaacaatg tgactggcgg tgcattgctt gaagccataa atgtatttaa 4920

aaagagtaac aaaacagtgc ctgctggcga ctgtgttact tttgagtgtg cagatatgat 4980

ttctattact atggtagtat tgccatctga cggtgatgct aattatgaca aaaattatgc 5040

acgcgccgtc gtcaaggtat ctaagcttaa aggcaagtta ttgcttgctg ttggtgatgc 5100

catgttgtat tccaagttgt cccacctcag cgtgttaggt ttcgtatcca cacctgatga 5160

tgtggagcgt ttctacgcaa ataagagtgt ggttattaaa gttactgagg atacacgtag 5220

tgttaagact gttaaagtag aatccactgt tacttatgga caacaaattg gaccttgtct 5280

tgttaatgac accgttgtca cagacaacaa acctgttgtt gctgatgttg tagctaaggt 5340

tgtaccaagt gctaattggg attcacatta tggttttgat aaggctggtg agttccacat 5400

gctagaccat actgggtttg cctttcctag tgaagttgtt aacggtaggc gtgtgcttaa 5460

aaccacagat aataactgtt gggttaatgt tacatgttta caattacagt ttgctagatt 5520

taggttcaag tcagcaggtc tacaggctat gtgggagtcc tattgtactg gtgatgttgc 5580

tatgtttgtg cattggttgt actggcttac tggtgttgac aaaggtcagc ctagtgattc 5640

agaaaatgca cttaacatgt tgtctaagta cattgttcct gctggttctg tcactattga 5700

acgtgtcacg catgacggtt gttgttgtag taagcgtgtt gtcactgcac cagttgtgaa 5760

tgctagcgtg ttgaagcttg gcgtcgagga tggtctttgt ccacatggtc ttaactacat 5820

tgacaaagtt gttgtagtta aaggtactac aattgttgtc aatgttggaa aacctgtagt 5880

ggcaccatcg cacctctttc ttaagggtgt ttcctacaca acattcctag ataatggtaa 5940

cggtgttgcc ggccattata ctgtttttga tcatgacact ggtatggtgc atgatggaga 6000

tgtttttgta ccaggtgatc tcaatgtgtc tcctgttaca aatgttgtcg tctcagagca 6060

gacggctgtt gtgattaaag accctgtgaa gaaagtagag ttagacgcta caaagctgtt 6120

agacactatg aattatgcat cggaaagatt cttttccttt ggtgatttta tgtcacgtaa 6180

tttaattaca gtgtttttgt acatccttag tattttgggt ctctgtttta gggcctttcg 6240

taagagggat gttaaagttc tagctggtgt accccaacgt actggtatta tattgcgtaa 6300

aagtgtgcgc tataatgcaa aggctttggg tgtcttcttc aagctaaaac tttattggtt 6360

caaagttctt ggtaagttta gtttgggtat ttatgcattg tatgcattac tattcatgac 6420

aatacgcttt acacctatag gtggccctgt ttgtgatgat gttgttgctg gttatgctaa 6480

ttctagtttt gacaagaatg agtattgcaa cagtgttatt tgtaaggtct gtctctatgg 6540

gtaccaggaa ctttcggact tctctcacac acaggtagta tggcaacacc ttagagaccc 6600

attaattggt aatgtgatgc ctttctttta tttggcattt ctggcaattt ttgggggtgt 6660

ttatgtaaag gctattactc tctattttat tttccagtat cttaacatac ttggtgtgtt 6720

tttgggccta caacagtcca tttggttttt gcagcttgtg ccttttgatg tctttggtga 6780

cgagatcgtc gtctttttca tcgttacacg cgtattgatg ttccttaagc atgttttcct 6840

tggctgcgat aaggcatctt gtgtggcttg ctctaagagt gctcgcctta agcgcgttcc 6900

tgtccagact atttttcagg gtactagcaa atccttctac gtacatgcca atggtggttc 6960

taagttctgt aagaagcaca atttcttttg tttaaattgt gattcttatg gtccaggctg 7020

cacttttatt aatgacgtca ttgcaactga agttggtaat gttgtcaaac ttaatgtgca 7080

accgacaggt cctgccacta ttcttattga caaggttgaa ttcagtaatg gtttttacta 7140

tctttatagt ggtgacacat tttggaagta caactttgac ataacagata acaaatacac 7200

ttgcaaagag tcacttaaaa attgtagcat aatcacagac tttattgttt ttaacaataa 7260

tggttccaat gtaaatcagg ttaagaatgc atgtgtgtat ttttcacaga tgctttgtaa 7320

acctgttaag ttagtggact cagcgttgtt ggccagtttg tctgttgatt ttggtgcaag 7380

cttacatagt gcttttgtta gtgtgttgtc gaatagtttt ggcaaagacc tgtcaagttg 7440

taatgacatg caggattgca agagcacatt gggttttgat gatgtaccat tggatacctt 7500

taatgctgct gttgctgagg ctcatcgtta cgatgtcctc ttgactgaca tgtcgttcaa 7560

caattttacc accagttatg caaaaccaga ggaaaaactt cccgtccatg acattgccac 7620

gtgtatgcgt gtaggtgcca agattgttaa tcataacgtt cttgtcaagg atagtatacc 7680

tgtggtgtgg cttgtacgtg atttcattgc cctttctgaa gaaactagga agtacattat 7740

tcgtacgact aaagttaagg gtataacctt catgttgacc tttaatgatt gtcgtatgca 7800

tactaccata cctactgttt gcattgcaaa taagaagggt gcaggtcttc ctagtttttc 7860

aaaggttaag aaattcttct ggtttttgtg tctgttcata gttgctgttt tctttgcact 7920

aagctttttt gattttagta ctcaggttag cagtgatagt gattatgact tcaagtatat 7980

tgagagtggc cagttgaaga cttttgacaa tccacttagt tgtgtgcata atgtctttag 8040

taacttcgac cagtggcatg atgccaagtt tggtttcacc cccgtcaaca atcctagttg 8100

tcctatagtc gttggtgtat cagacgaagc gcgcactgtt ccaggtatcc cagcaggtgt 8160

ttatttagct ggtaaaacac ttgtttttgc tattaacacc atttttggta catctggttt 8220

gtgctttgat gctagtggcg ttgctgataa gggcgcttgc atttttaatt cggcttgcac 8280

cacattatct ggtttgggtg gaactgctgt ctactgttat aagaatggtc tagttgaagg 8340

tgctaaactt tatagtgagt tggcacctca tagctactat aaaatggtag atggtaatgc 8400

tgtgtcttta cctgaaatta tctcacgcgg ctttggcatc cgtactatcc gtacaaaggc 8460

tatgacctac tgtcgcgttg gccagtgtgt gcaatctgca gaaggtgttt gttttggcgc 8520

cgatagattc tttgtctata atgcagaatc tggttctgac tttgtttgtg gcacagggct 8580

ctttacattg ttgatgaacg ttattagtgt tttttccaag acagtaccag taactgtgtt 8640

gtctggtcaa atacttttta attgcattat tgcttttgct gctgttgcgg tgtgtttctt 8700

atttacaaag tttaagcgca tgttcggtga tatgtctgtt ggcgttttca ctgtcggtgc 8760

ttgtactttg ttgaacaatg tttcctacat tgtaacacag aacacacttg gcatgttggg 8820

ctatgcaact ttgtactttt tgtgcactaa aggtgttaga tatatgtgga tttggcattt 8880

gggatttttg atctcatata tacttattgc accatggtgg gttttgatgg tttatgcctt 8940

ttcagccatt tttgagttta tgcctaacct ttttaagctt aaggtttcaa cacaactttt 9000

tgagggtgac aagttcgtag gctcttttga aaatgctgca gcaggtacat ttgtgcttga 9060

tatgcatgcc tatgagagac ttgccaactc tatctcaact gaaaaactgc gtcagtatgc 9120

tagtacttac aataagtaca agtattattc aggcagtgct tcagaggctg attacaggct 9180

tgcttgtttt gcccatttgg ccaaggctat gatggattat gcttctaatc acaacgacac 9240

gttatacaca ccacccactg tgagttacaa ttcaactcta caggctggct tgcgtaagat 9300

ggcacaacca tctggtgttg ttgagaagtg catagttcgt gtttgctatg gtaatatggc 9360

tcttaatggc ctatggcttg gtgatactgt tatctgccca cgccatgtta tagcgtctag 9420

tactactagc actatagatt atgactatgc cctttctgtt ttacgcctcc acaacttctc 9480

catttcatct ggtaatgttt tcctaggtgt tgtgggtgta accatgcgag gtgctttgtt 9540

gcagataaag gttaatcaaa acaatgtcca cacgcctaag tacacctatc gcacagttag 9600

accgggtgaa tcttttaata tcttggcgtg ctatgatggt tctgcagctg gtgtttacgg 9660

cgttaacatg cgctctaatt acactattag aggctcgttc attaatggcg cttgtggttc 9720

acctggttat aacattaaca atggtaccgt tgagttttgc tatttacacc agcttgaact 9780

tggttcaggc tgtcatgttg gtagcgactt agatggtgtt atgtatggtg gttatgagga 9840

ccaacctact ttgcaagttg aaggcgctag tagtctgttt acagagaatg tgttggcatt 9900

tctttatgca gcactcatta atggttctac ctggtggctt agttcttcta ggattgctgt 9960

agacaggttt aatgagtggg ctgttcataa tggtatgaca acagtagtta atactgattg 10020

cttttctatt cttgctgcta agactggtgt tgatgtacaa cgtttgttgg cctcaatcca 10080

gtctctgcat aagaattttg gtggaaagca aattcttggc tatacctcgt tgacagatga 10140

gtttactaca ggtgaagtta tacgtcaaat gtatggcgtt aatcttcaga gtggttatgt 10200

ttcacgcgcc tgtagaaatg tcttgctggt tggttctttt ctgactttct tttggtcaga 10260

attagtttcc tacactaagt tcttttgggt aaatcctggt tatgtcacac ctatgtttgc 10320

gtgtttgtca ttgctgtcct cacttttgat gttcacactc aagcataaga cattgttttt 10380

ccaggtcttt ctaatacctg ctctgattgt tacatcttgc attaatttgg catttgatgt 10440

tgaagtctac aactatttgg cagagcattt tgattaccat gtttctctca tgggttttaa 10500

tgcacaaggt cttgttaaca tctttgtctg ctttgttgtt accattttac acggcacata 10560

cacatggcgc ttttttaaca cacctgtgag ttctgtcact tatgtggtag ctttgctgac 10620

tgcggcatat aactattttt acgctagtga cattcttagt tgtgctatga cactatttgc 10680

tagtgtgact ggcaacgggt tcgttggtgt tgtttgttat aaagctgctg tttatatggc 10740

cttgagattt cctacttttg tggctatttt tggtgatatt aagagtgtta tgttctgtta 10800

ccttgtgttg ggttatttta cctgttgctt ctacggtatt ctctactggt tcaacaggtt 10860

ttttaaggtt agtgtaggtg tctatgacta tactgttagt gctgctgagt ttaagtatat 10920

ggttgctaac ggcctacgtg caccaactgg aacacttgat tcactacttc tgtctgccaa 10980

attgattggt attggtggtg agcggaatat taagatttct tccgttcagt ctaaactgac 11040

tgatattaag tgtagtaacg ttgtgctttt aggctgtctc tctagcatga atgtctcagc 11100

aaattcaaca gaatgggcct attgtgttga cttgcataac aagatcaact tgtgtaatga 11160

cccagaaaaa gcgcaggaaa tgctacttgc tttgttggca tttttcctta gtaagaatag 11220

tgcttttggt ttagatgact tattggaatc ctattttaat gacaatagta tgttgcagag 11280

tgttgcatct acttatgtcg gtttgccttc ttatgtcatt tatgaaaatg cacgccaaca 11340

gtatgaagat gctgttaata atggttctcc acctcagttg gttaagcaat tgcgccatgc 11400

catgaatgta gcaaagagcg aatttgaccg tgaggcttct actcagcgta agcttgatag 11460

aattgcggaa caggctgcag cacagatgta caaagaggca cgagcagtta ataggaagtc 11520

caaagttgta agtgctatgc attcactgct ttttggtatg ttgagacgtt tggacatgtc 11580

ttctgtagac accattctca acttggcaaa ggatggggtt gtacctctgt ctgtcatacc 11640

ggcagtcagt gctactaagc ttaacattgt tacttctgat atcgattctt ataatcgtat 11700

ccagcgtgag ggatgtgtcc actacgctgg taccatttgg aatataattg atatcaagga 11760

caatgatggc aaggtggtac acgttaagga ggtaaccgca cagaatgctg agtccctgtc 11820

atggcccctg gtccttgggt gtgagcgtat tgtcaagctc cagaataatg aaattattcc 11880

cggtaagctg aagcagcgct ccattaaggc agaaggagat ggcatagttg gagaaggtaa 11940

ggcactttac aataatgagg gtggacgtac ttttatgtat gcgttcatct cggacaaacc 12000

ggacctgcgt gtagtcaagt gggagttcga tggtggttgt aacactattg agctagaacc 12060

accacgtaag ttcttggtgg attctcctaa tggtgcacag atcaagtatc tctactttgt 12120

tcgtaacctt aacacgttac gtaggggtgc tgttctcggc tacataggtg ccactgtacg 12180

cttgcaggtt ggtaaacaaa cagaacaggc tattaactct tcattgttga cactttgcgc 12240

tttcgctgtg gatcctgcta agacctacat cgctgctgtc aaaagtggtc acaaaccagt 12300

aggtaactgt gttaagatgt tggccaatgg ttctggtaat ggacaagctg ttactaatgg 12360

tgtggaggct agtactaacc aggattcata tggtggtgcg tccgtgtgtc tatattgtag 12420

agcacatgtt gagcatccat ctatggatgg tttttgcaga ctgaaaggca agtacgtaca 12480

ggttccacta ggtacagtgg atcctatacg ttttgtactt gagaatgacg tttgcaaggt 12540

ttgtggttgt tggctggcta atggctgcac ttgtgacaga tccattatgc aaagcactga 12600

tatggcttat ttaaacgagt acggggctct agtgcagctc gactagagcc ctgtaacggt 12660

actgatacac aacatgtgta tcgtgctttt gacatctaca acaaggatgt tgcttgtcta 12720

ggtaaattcc tcaaggtgaa ctgtgttcgc ctgaagaatt tggataagca tgatgcattc 12780

tatgttgtca aaagatgtac caagtctgcg atggaacacg agcaatccat ctatagcaga 12840

cttgaaaagt gtggagccgt agccgaacac gatttcttca cttggaagga tggtcgtgcc 12900

atctatggta acgtttgtag aaaggatctt accgagtata ctatgatgga tttgtgttac 12960

gctttacgta actttgatga aaacaattgc gatgttctta agagcatttt aattaaggta 13020

ggcgcttgtg aggagtccta cttcaataat aaagtctggt ttgaccctgt tgaaaatgaa 13080

gacattcatc gtgtctatgc attgttaggt accattgttt cacgtgctat gcttaaatgc 13140

gttaagttct gtgatgcaat ggttgaacaa ggtatagttg gtgttgtcac attagataat 13200

caggatctta atggtgattt ttatgatttt ggtgatttta cttgtagcat caagggaatg 13260

ggtataccca tttgcacatc atattactct tatatgatgc ctgttatggg tatgactaat 13320

tgccttgcta gtgagtgttt tgttaagagt gatatatttg gtgaggattt caagtcatat 13380

gacctgctgg aatatgattt cacggagcat aagacagcac tcttcaacaa gtatttcaag 13440

tattggggac tgcaatacca ccctaactgt gtggactgca gtgatgagca gtgcatagtt 13500

cactgtgcca acttcaatac gttgttttcc actactatac ctattacggc atttggacct 13560

ttgtgtcgca agtgttggat tgatggtgtt ccactggtaa ctacagctgg ttatcatttt 13620

aaacagttag gtatagtttg gaacaatgac ctcaacttac actctagcag gctctctatt 13680

aacgaattac tccagttttg tagtgatcct gcattgctta tagcatcatc accagccctt 13740

gttgatcagc gtactgtttg cttttcagtt gcagcgctag gtacaggtat gactaaccag 13800

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ttttctgagg gctctgagct tactttaaag cacttcttct ttgcacagaa gggtgatgca 13920

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cggcagtatc atcagaaaca ccttaagtcc atagttaata ctaggggcgc ttcggttgtt 14340

attggtacta ctaagtttta tggtggttgg gacaatatgc ttaagaacct tattgatggt 14400

gttgaaaatc cgtgtcttat gggttgggac tacccaaagt gcgacagagc actgcccaat 14460

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tatgcaaact cagtttttaa tatcttccaa gcagtaagtg ccaatgttaa caaacttctt 14700

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gagtgctgtt atagatcaac taccgtcgat gaccagttcg tcgttgagta ttatggttac 14820

ttgcgtaaac atttttcaat gatgattctt tctgatgatg gcgttgtttg ttataacaat 14880

gactatgcat cacttggtta tgtcgctgat cttaacgcat tcaaggctgt tttgtattac 14940

cagaacaatg tcttcatgag cgcctctaaa tgttggatcg agcctgacat taataaaggt 15000

cctcatgaat tttgctcgca gcatactatg cagattgtcg ataaagatgg tacttattac 15060

cttccttacc ctgatccttc aagaattctc tctgcaggtg tgtttgttga tgacgttgtt 15120

aaaactgatg cagttgtatt gcttgaacgt tatgtgtcat tggctataga tgcctacccg 15180

ttatctaagc atgaaaaccc tgaatataag aaggtgtttt atgtgctttt ggattgggtt 15240

aagcatctgt acaaaactct taatgctggt gtgttagagt ctttttctgt cacacttttg 15300

gaagattcta ctgctaaatt ctgggatgag agcttttatg ccaacatgta tgagaaatct 15360

gcagttttac aatctgcagg gctttgtgtt gtttgtggct ctcaaactgt tttacgttgt 15420

ggtgattgtc tacggcgtcc tatgctttgt actaagtgtg cttatgatca tgtcattgga 15480

acaactcaca agttcatttt ggccatcact ccatatgtgt gttgtgcttc agattgtggt 15540

gtcaatgatg tgactaagct ctacttaggt ggtcttagtt attggtgtca tgaccacaag 15600

ccacgtcttg cattcccgtt gtgctctgct ggtaatgttt ttggcttgta caaaaattct 15660

gctaccggct cactcgatgt tgaagacttt aatcgcattg ctacatccga ttggactgat 15720

gtttctgact acaggttggc aaatgatgtc aaggactcat tgcgtctgtt tgcagcggaa 15780

actatcaagg ccaaggagga gagcgttaag tcatcctatg cttgtgcaac actacatgag 15840

gttgtaggac ctaaagagtt gttgctcaaa tgggaagtcg gcagacccaa accacccctt 15900

aatagaaatt cggttttcac ttgttatcat ataacgaaga acaccaaatt tcaaatcggt 15960

gagtttgtgt ttgagaaggc agaatatgat aatgatgctg taacatataa aactaccgcc 16020

acaacaaaac ttgttcctgg catggttttt gtgcttacct cacataatgt tcagccattg 16080

cgcgcaccga ccattgctaa tcaagaacgt tattccacta tacataagtt gcatcctgct 16140

tttaacatac ctgaagctta ttctagctta gtgccctatt accaattgat tggtaagcag 16200

aagattacaa ctattcaggg acctcccggt agtggtaaat ctcactgtgt tatagggcta 16260

ggtttgtact atccaggtgc acgtatagtg tttacagctt gttctcatgc agcggtcgat 16320

tcactttgtg tgaaagcttc cactgcttat agcaatgaca aatgttcacg catcatacca 16380

cagcgcgctc gtgttgagtg ttatgatggt ttcaagtcta ataatactag tgctcagtac 16440

cttttctcta ctgtcaatgc tttgccagag tgcaatgcgg acattgttgt ggtggatgag 16500

gtctctatgt gcactaatta tgacttgtct gtcataaatc aacgcatcag ctataggcat 16560

gtagtctatg ttggtgaccc tcaacagctg cctgcaccac gtgttatgat ttcacgtggt 16620

actttggaac caaaggacta caacgttgtc actcaacgca tgtgtgccct taagcctgat 16680

gttttcttgc acaagtgtta tcgctgtcct gctgagatag tgcgtactgt gtctgagatg 16740

gtctatgaaa accaattcat tcctgtgcac ccagatagca agcagtgttt taaaatcttt 16800

tgcaagggta atgttcaggt tgataatggt tcaagcatta atcgcaggca attggatgtt 16860

gtgcgtatgt ttttggctaa aaatcctagg tggtcaaagg ctgtttttat ttctccttat 16920

aacagccaga attatgttgc cagccgcatg ctaggtctac aaattcagac agttgactca 16980

tcccagggta gtgagtatga ctatgtcatt tacacacaaa cttcagatac tgcccatgcc 17040

tgtaatgtta acaggtttaa tgttgccatc acaagggcca agaaaggcat attatgtata 17100

atgtgcgata ggtccctttt tgatgtgctt aaattctttg agcttaaatt gtctgatttg 17160

caggctaatg agggttgtgg tctttttaaa gactgtagca gaggtgatga tctgttgcca 17220

ccatctcacg ctaacacctt catgtcttta gcggacaatt ttaagactga tcaagatctt 17280

gctgttcaaa taggtgttaa tggacccatt aaatatgagc atgttatctc gtttatgggt 17340

ttccgttttg atatcaacat acccaaccat catactctct tttgcacacg cgactttgcc 17400

atgcgcaatg ttagaggttg gttaggcttt gacgttgaag gagcacatgt tgttggctct 17460

aacgtcggta caaatgtccc attgcaatta gggttttcta acggtgttga ttttgttgtc 17520

agacctgaag gttgcgttgt aacagagtct ggtgactaca ttaaacccgt cagagctcgt 17580

gctccaccag gggaacaatt cgcacacctt ttgcctttac ttaaacgcgg ccaaccatgg 17640

gatgttgtcc gcaaacgtat agtgcagatg tgtagtgact acctggccaa cctatcagac 17700

atactaattt ttgtgttgtg ggctggtggt ttggagttga caactatgcg ttattttgtc 17760

aagattggac caagtaagag ttgtgattgt ggtaaggttg ctacttgtta caatagtgcg 17820

ctgcatacgt actgttgttt caaacatgcc cttggttgtg attatctgta taacccatac 17880

tgtattgata tacagcagtg gggatacaag ggatcactta gccttaacca ccatgagcat 17940

tgtaatgtac atagaaacga gcatgtggct tctggtgatg ccataatgac tcgctgtctg 18000

gccatacatg attgctttgt caagaacgtt gactggtcca tcacataccc atttattggt 18060

aatgaggctg ttattaataa gagcggccga attgtgcaat cacacactat gcggtcagtt 18120

cttaagttat acaatccgaa agccatatat gatattggca atcctaaggg cattagatgt 18180

gccgtaacgg atgctaagtg gttttgcttt gacaagaatc ctactaattc taatgtcaag 18240

acattggagt atgactatat aacacatggc caatttgatg ggttgtgctt gttttggaat 18300

tgcaatgtag acatgtatcc agaattttct gtggtctgtc gttttgatac tcgctgtagg 18360

tcaccactca acttggaggg ttgtaatggt ggttcactgt atgttaataa tcatgcattc 18420

catacaccgg cttttgacaa gcgtgctttt gctaagttga agccaatgcc atttttcttt 18480

tatgatgata ctgagtgtga caagttacag gactccataa actatgttcc tcttagggct 18540

agtaactgca ttactaaatg taatgttggt ggtgctgtct gtagtaagca ttgtgctatg 18600

tatcatagct atgttaatgc ttacaacact tttacgttgg cgggctttac tatttgggtg 18660

cctacttcgt ttgacaccta taatctgtgg cagacattta gtaacaattt gcaaggtctt 18720

gagaacattg ctttcaatgt cgtaaagaaa ggatcttttg ttggtgccga aggtgaactt 18780

cctgtagctg tggttaatga caaagtgctc gttagagatg gtactgttga tactcttgtt 18840

tttacaaaca agacatcact acccactaac gtagcttttg agttgtatgc caagcgtaag 18900

gtaggactca ccccacccat tacgatccta cgtaacttgg gtgtagtttg tacatctaag 18960

tgtgtcattt gggactatga agccgaacgt ccacttacta cttttacaaa ggatgtttgt 19020

aaatataccg actttgaggg tgacgtctgt acactctttg ataacagcat tgttggttca 19080

ttagagcgat tctccatgac ccaaaatgct gtgcttatgt cacttacagc tgttaaaaag 19140

cttactggca taaagttaac ttatggttat cttaatggtg tcccagttaa cacacatgaa 19200

gataaacctt ttacttggta tatttacact aggaagaacg gcaagttcga ggaccatcct 19260

gatagctatt ttacccaagg tagaacaacc gctgatttta gccctcgtag cgacatggaa 19320

aaggacttcc taagtatgga tatgggtctg tttattaaca agtacggact tgaggattac 19380

ggctttgagc acgttgtgta tggtgatgtt tcaaaaacca cccttggtgg tttgcatcta 19440

ctaatttcgc aggtgcgtct ggcctgtatg ggtgtgctca aaatagacga gtttgtgtct 19500

agtaatgata gcacgttaaa gtcttgtact gttacatatg ctgataaccc tagtagtaag 19560

atggtttgta cgtatatgga tctcctgctt gacgattttg tcagcattct taaatctttg 19620

gatttgggcg ttgtatctaa agttcatgaa gttatggtcg attgtaaaat gtggaggtgg 19680

atgttgtggt gtaaggatca taaactccag acattttatc cgcaacttca ggccagtgaa 19740

tggaagtgtg gttattccat gccttctatt tacaagatac aacgtatgtg tttagaacct 19800

tgcaatctct acaactatgg tgctggtatt aagttacctg atggcattat gtttaacgta 19860

gttaaataca cacagctttg tcaatatctc aatagcacca caatgtgtgt accccatcac 19920

atgcgtgtgc tacatcttgg tgctggctcc gacaagggtg ttgcacctgg cacggctgtc 19980

ttacgacgtt ggttgccact ggatgccatt atagttgaca atgatagtgt ggattacgtt 20040

agcgatgctg attatagtgt tacaggagat tgctctacct tatacctgtc agataagttt 20100

gatttagtta tatctgatat gtatgatggt aagattaaaa gttgtgatgg ggagaacgtg 20160

tctaaagaag gcttctttcc ctatattaat ggtgtcatca ccgaaaagtt ggcacttggt 20220

ggtactgtag ctattaaggt gacggagttt agttggaata agaagttgta tgaactcatt 20280

cagaggtttg agtattggac aatgttctgt accagtgtta acacgtcatc gtcagaggca 20340

ttcttaattg gtgttcacta tttaggtgat tttgcaagtg gcgctgtgat tgacggcaac 20400

actatgcatg ccaattatat cttctggcgt aattccacaa ttatgactat gtcttacaat 20460

agtgtacttg atttaagcaa gttcaattgt aagcataagg ctacagttgt cattaattta 20520

aaagattcat ccattagtga tgttgtgtta ggtttgttga agaatggtaa gttgctagtg 20580

cgtaataatg acgccatttg tggtttttct aatcatttgg tcaacgtaac caaatgaagt 20640

ctttaaccta cttctggttg ttcttaccag tactttcaac acttagccta ccacaagatg 20700

tcaccaggtg ctcagctaac actaatttta ggcggttctt ttcaaaattt aatgttcagg 20760

cgcctgcagt tgttgtactg ggcggttatc tacctattgg tgaaaaccag ggtgtcaatt 20820

caacttggta ctgtgctggc caacatccaa ctgctagtgg cgttcatggt atctttgtta 20880

gccatattag aggtggtcat ggctttgaga ttggcatttc gcaagagcct tttgacccta 20940

gtggttacca gctttattta cataaggcta ctaacggtaa cactaatgct actgcgcgac 21000

tgcgcatttg ccagtttcct agcattaaac cattgggccc cactgctaat aatgatgtta 21060

caacaggtcg taattgccta tttaacaaag ccatcccagc ttatatgagt gaacatagtg 21120

ttgtcggcat aacatgggat aatgatcgtg tcactgtctt ttctgacaag atctattatt 21180

tttattttaa aaatgattgg tcccgtgttg cgacaaagtg ttacaacagt ggaggttgtg 21240

ctatgcaata tgtttacgaa cccacctatt acattcttaa tgttactagt gctggtgagg 21300

atggtatttc ttatcaaccc tgtacagcta attgcattgg ttatgctgcc aatgtatttg 21360

ctactgagcc caatggccac ataccagaag gttttagttt taataattgg tttcttttgt 21420

ccaatgattc cactttggtg catggtaagg tggtttccaa ccaaccattg ttggtcaatt 21480

gtcttttggc cattcctaag atttatggac taggccaatt tttctccttt aatcaaacga 21540

tcgatggtgt ttgtaatgga gctgctgtgc agcgtgcacc agaggctctg aggtttaata 21600

ttaatgacac ctctgtcatt cttgctgaag gctcaattgt acttcatact gctttaggaa 21660

caaatttttc ttttgtttgc agtaattcct caaatcctca cttagccacc ttcgccatac 21720

ctttgggtgc tacccaagta ccttattatt gtttttttaa agtggatact tacaactcca 21780

ctgtttataa atttttggct gttttacctc ctaccgtcag ggaaattgtc atcaccaagt 21840

atggtgatgt ttatgtcaat gggtttggat acttgcatct cggtttgttg gatgctgtca 21900

caattaattt cactggtcat ggcactgacg atgatgtttc tggtttttgg accatagcat 21960

cgactaattt tgttgatgca ctcatcgaag ttcaaggaac caccattcag cgtattcttt 22020

attgtgatga tcctgttagc caactcaagt gttctcaggt tgcttttgac cttgacgatg 22080

gtttttacac tatttcttct agaaaccttc tgagtcatga acagccaatt tcttttgtta 22140

ctctgccatc atttaatgat cattcttttg ttaacattac tgtatctgct tcctttggtg 22200

gtcatagtgg tgccaacctt attgcatctg acactactat caatgggttt agttctttct 22260

gtgttgacac tagacaattt accatttcac tgttttataa cgttacaaac agttatggtt 22320

atgtgtctaa atcacaggac agtaattgcc ctttcacctt gcaatctgtt aatgattacc 22380

tgtcttttag caaattttgt gtttccacca gccttttggc tagtgcctgt accatagatc 22440

tttttggtta ccctgagttt ggtagtggtg ttaagtttac gtccctttac tttcaattca 22500

caaagggtga gttgattact ggcacgccta aaccacttga aggtgtcacg gacgtttctt 22560

ttatgactct ggatgtgtgt accaagtata ctatctatgg ctttaaaggt gagggtatca 22620

ttacccttac aaattctagc tttttggcag gtgtttatta cacatctgat tctggacagt 22680

tgttagcctt taagaatgtc actagtggtg ctgtttattc tgttacgcca tgttcttttt 22740

cagagcaggc tgcatatgtt gatgatgata tagtgggtgt tatttctagt ttgtctagct 22800

ccacttttaa cagtactagg gagttgcctg gtttcttcta ccattctaat gatggctcta 22860

attgtacaga gcctgtgttg gtgtatagta acataggtgt ttgtaaatct ggcagtattg 22920

gctacgtccc atctcagtct ggccaagtca agattccacc cacggttact gggaatatta 22980

gtattcccac caactttagt atgagtatta ggacagaata tttacagctt tacaacacgc 23040

ctgttagtgt tgattgtgcc acatatgttt gtaatggtaa ctctcgttgt aaacaattac 23100

tcacccatta cactgcagca tgtaagacca tagagtcagc attacaactc agcgctaggc 23160

ttgagtctgt tgaagttaac tctatgctta ctatttctga tgaggctcta cagttagcta 23220

ccattagttc gtttaatggt gatggatata attttactaa tgtgctgggt gtttctgtgt 23280

atgatcctgc aagtggcagg gtggtacaaa aagggtcttt tattgaagac ctgcttttta 23340

ataaagtggt tactaatggc cttggtactg ttgatgaaga ctataagcgc tgttctaatg 23400

gtcgctctgt ggcagatcta gtctgtgcac agtattactc tggtgtcatg gtactacctg 23460

gtgttgttga cgctgagaag cttcacatgt atagtgcgtc tctcaccggt ggtatggtgc 23520

taggaggttt tacttctgca gcggcattgc cttttagcga tgctgttcaa gctagactca 23580

attatcttgc tctacagacg gatgttctac agcggaacca gcaattgctt gctgagtctt 23640

ttaactctgc tattggtaat ataacttcag cctttgagag tgttaaagag gctattagtc 23700

aaacttccaa gggtttgaac actgtggctc atgcgcttac taaggttcaa gaggttgtta 23760

actcgcaggg tgcagctttg actcaactta ccgtacagct gcaacacaac ttccaagcca 23820

tttctagttc tattgatgac atttactctc gactggacat tctttcagcc gatgctcagg 23880

ttgaccgtct catcgccggc agattatcag cacttaatgc ttttgttgct caaaccctca 23940

ctaagtatac tgaggttcag gctagcagga agttagcaca gcaaaaggtt aatgagtgcg 24000

ttaaatcgca atctcagcgt tatggttttt gtggtggtga tggcgagcac attttctctc 24060

tggtacaggc agcacctcag ggcctgctgt ttttacatac agtacttgta ccgagtgatt 24120

ttgtagatgt tattgccatc gctggcttat gcgttaacga tgaaattgcc ttgactctac 24180

gtgagcctgg cttagtcttg tttacgcatg aacttcaaaa tcatactgcg acggaatatt 24240

ttgtttcatc gcgacgtatg tttgaaccta gaaaacctac cgttagtgat tttgttcaaa 24300

ttgagagttg tgtggtcacc tatgtcaatt tgactagaga ccaactacca gatgtaatcc 24360

cagattacat cgatgttaac aaaacacttt atgagatttt agcttctctg cccaatagca 24420

ctggtccaag tctttcttta gatgttttta atgccactta tcttaatctc actggtgaaa 24480

ttgcagattt agagcagcgt tcagagtctc tccgtaatac tacagaggag ctccaaagtc 24540

ttatatataa tatcaacaac acactagttg accttgagtg gctcaaccga gttgagacat 24600

atatcaagtg gccgtggtgg gtttggttga ttattttcat tgttctcatc tttgttgtgt 24660

cattactagt gttctgctgc atttccacgg gttgttgtgg atgctgcggc tgctgctgtg 24720

cttgtttctc aggttgttgt aggggtccta gacttcaacc ttacgaagtt tttgaaaagg 24780

tccacgtgca gtgatgtttc ttggactttt ttcaatacac gattgacaca gttgtcaaag 24840

atgtctcaaa gtctgctaac ttgtctttgg atgctgtcca agagttggag ctcaatgtag 24900

ttccaattag acaagcttca aatgtgacgg gttttctttt caccagtgtt tttatctact 24960

tctttgcact gtttaaagcg tcttctttga ggcgcaatta tattatgttg gcagcgcgtt 25020

ttgctgtcat tgttctttat tgcccacttt tatattattg tggtgcattt ttagatgcaa 25080

ctattatttg ttgcacactt attggcaggc tttgtttagt ctgcttttac tcctggcgct 25140

ataaaaatgc gctctttatt atttttaata ctacgacact ttctttcctc aatggtaaag 25200

cagcttatta tgacggcaaa tccattgtga ttttagaagg tggtgaccat tacatcactt 25260

ttggcaactc ttttgttgct tttgttagta gcatcgactt gtgtctagct atacgtgggc 25320

ggcaggaagc tgacctacag ctgttgcgaa ctgttgagct tcttgatggc aagaagcttt 25380

atgtcttttc gcaacatcaa attgttggca ttactaatgc tgcatttgac tcaattcaac 25440

tagacgagta tgctacaatt agtgaatgat aatggtctag tagttaatgt tatactttgg 25500

cttttcgtac tctttttcct gcttattata agcattactt tcgtccaatt ggttagtctg 25560

tgcttcactt gtcaccggtt gtgtaatagc gcagtttaca cacctatagg gcgtttgtat 25620

agagtttata agtcttacat gcaaatagac cccctctcta gtactgttat tgacgtataa 25680

acgaaatatg tctaacggtt ctattcccgt tggtgaggtg atactcggca gtatcattca 25740

acaccttaga aactggaatt tcacatggaa tatcatactg acgatactac ttgtagtgct 25800

tcagtatggc cattacaagt actctgcgtt cttgtatggt gtcaagatgg ctattctatg 25860

gatactttgg cctcttgtgt tagcactgtc actttttgat gcatgggcta gctttcaggt 25920

caattgggtc ttttttgctt tcagcatcct tatggcttgc atcactctta tgctgtggat 25980

aatgtacttt gtcaatagca ttcggttgtg gcgcaggaca cattcttggt ggtctttcaa 26040

tcctgaaaca gacgcgcttc tcactacttc tgtgatgggc cgacaggtct gcattccagt 26100

gcttggagca ccaactggtg taacgctaac actccttagt ggtacattgc ttgtagaggg 26160

ctataaggtt gctactggcg tacaggtaag tcaattacct aatttcgtca cagtcgccaa 26220

ggccactaca acaattgtct acggacgtgt tggtcgttca gtcaatgctt catctggcac 26280

tggttgggct ttctatgtcc ggtccaaaca cggcgactac tcagctgtga gtaatccgag 26340

ttcggttctc acagatagtg agaaagtgct tcatttagtc taaacagaaa ctttatggct 26400

tctgtcagtt ttcaggatcg tggccgcaaa cgggtgccat tatccctcta tgcccctctt 26460

agggttacta atgacaaacc cctttctaag gtacttgcaa ataatgctgt acccactaat 26520

aaaggaaata aggaccagca aattggatac tggaatgagc aaattcgctg gcgcatgcgc 26580

cgtggtgagc gaattgaaca accttccaat tggcatttct actacctcgg aacaggacct 26640

cacgccgacc tccgctatag gactcgtact gagggtgttt tctgggttgc taaagaaggc 26700

gcaaagactg aacccactaa cctgggtgtc agaaaggcgt ctgaaaagcc aattattcca 26760

aatttctctc aacagcttcc cagcgtagtt gagattgttg aacctaacac acctcctact 26820

tcacgtgcaa attcacgtag caggagtcgt ggtaatggca acaacaggtc cagatctcca 26880

agtaacaaca gaggcaataa ccagtcccgc ggtaattcac agaatcgtgg aaataaccag 26940

ggtcgtggag cgtctcagaa cagaggaggc aataataata acaataacaa gtctcgtaac 27000

cagtccaaga acagaaacca gtcaaatgac cgtggtggtg taacatcacg cgatgatctg 27060

gtggctgctg tcaaggatgc ccttaaatct ttgggtattg gtgaaaaccc tgataagctt 27120

aagcaacagc agaagcccaa acaggaaagg tctgacagca gcggcaaaaa tacacctaag 27180

aagaacaaat ccagagccac ttcgaaagaa cgtgacctca aagacatccc agagtggagg 27240

agaattccca agggcgaaaa tagcgtagca gcttgcttcg gacccagggg aggcttcaaa 27300

aattttggag atgcggaatt tgtcgaaaaa ggtgttgatg cctcaggcta tgctcagatc 27360

gccagtttag caccaaatgt tgcagcattg ctctttggtg gtaatgtggc tgttcgtgag 27420

ctagcggact cttacgagat tacatataat tataaaatga ctgtgccaaa gtctgatcca 27480

aatgtagagc ttcttgtttc acaggtggat gcatttaaaa ctgggaatgc aaaaccccag 27540

agaaagaagg acaagaagaa caagcgtgaa accacgcagc agctgaatga agaggccatc 27600

tacgatgatg tgggtgtgcc atctgatgtg actcatgcca atttggaatg ggacacagct 27660

gttgatggtg gtgacacggc cgttgaaatt atcaacgaga tctttgacac aggaaattaa 27720

acaatgtttg aatggcttat cctggctatg tcccagggta gtgccattac acttttatta 27780

ctgagtgttt ttctagcgac ttggctgctg ggctatggct ttgccctcta actagcggtc 27840

ttggtcttgc acacaacggt aagccagtgg taatgtcagt gcaagaagga tattaccata 27900

gcactgtcac gaggggaacg cagtaccttt tcatctaaac ctttgcacga gtaatcaaag 27960

atccgcttga cgagcctata tggaagagcg tgccaggtat ttgactcagg gactgttagt 28020

aactgaagac c 28031

<210> 38

<211> 676

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

atgtttcttg gacttttttc aatacacgat tgacacagtt gtcaaagatg tctcaaagtc 60

tgctaacttg tctttggatg ctgtccaaga gttggagctc aatgtagttc caattagaca 120

agcttcaaat gtgacgggtt ttcttttcac cagtgttttt atctacttct ttgcactgtt 180

taaagcgtct tctttgaggc gcaattatat tatgttggca gcgcgttttg ctgtcattgt 240

tctttattgc ccacttttat attattgtgg tgcattttta gatgcaacta ttatttgttg 300

cacacttatt ggcaggcttt gtttagtctg cttttactcc tggcgctata aaaatgcgct 360

ctttattatt tttaatacta cgacactttc tttcctcaat ggtaaagcag cttattatga 420

cggcaaatcc attgtgattt tagaaggtgg tgaccattac atcacttttg gcaactcttt 480

tgttgctttt gttagtagca tcgacttgtg tctagctata cgtgggcggc aggaagctga 540

cctacagctg ttgcgaactg ttgagcttct tgatggcaag aagctttatg tcttttcgca 600

acatcaaatt gttggcatta ctaatgctgc atttgactca attcaactag acgagtatgc 660

tacaattagt gaatga 676

<210> 39

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

atgtctaacg gttctattcc cgttggtgag gtgatactcg gcagtatcat tcaacacctt 60

agaaactgga atttcacatg gaatatcata ctgacgatac tacttgtagt gcttcagtat 120

ggccattaca agtactctgc gttcttgtat ggtgtcaaga tggctattct atggatactt 180

tggcctcttg tgttagcact gtcacttttt gatgcatggg ctagctttca ggtcaattgg 240

gtcttttttg ctttcagcat ccttatggct tgcatcactc ttatgctgtg gataatgtac 300

tttgtcaata gcattcggtt gtggcgcagg acacattctt ggtggtcttt caatcctgaa 360

acagacgcgc ttctcactac ttctgtgatg ggccgacagg tctgcattcc agtgcttgga 420

gcaccaactg gtgtaacgct aacactcctt agtggtacat tgcttgtaga gggctataag 480

gttgctactg gcgtacaggt aagtcaatta cctaatttcg tcacagtcgc caaggccact 540

acaacaattg tctacggacg tgttggtcgt tcagtcaatg cttcatctgg cactggttgg 600

gctttctatg tccggtccaa acacggcgac tactcagctg tgagtaatcc gagttcggtt 660

ctcacagata gtgagaaagt gcttcattta gtctaa 696

Claims (4)

1.一株G2b亚型猪流行性腹泻病毒弱毒株JSX2014/ATT，它的保藏号是CCTCCNO.V201865。

2.权利要求1所述的G2b亚型猪流行性腹泻病毒弱毒株JSX2014/ATT的基因组，其序列如SEQ ID NO.37所示。

3.权利要求1所述G2b亚型猪流行性腹泻病毒弱毒株JSX2014/ATT的ORF3基因和M基因作为区分弱毒株JSX2014/ATT和野毒株的分子标记的应用；所述ORF3基因的序列如SEQ IDNO.38所示；所述M基因的序列如SEQ ID NO.39所示。。

4.权利要求1所述的G2b亚型猪流行性腹泻病毒弱毒株JSX2014/ATT在制备G2b亚型猪流行性腹泻病毒变异毒株弱毒疫苗中的应用。