CN112852758B - 一种表达鸡传染性支气管炎病毒s蛋白的重组新城疫病毒及其制备方法与应用 - Google Patents

一种表达鸡传染性支气管炎病毒s蛋白的重组新城疫病毒及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种表达鸡传染性支气管炎病毒S蛋白的重组新城疫病毒及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。为了提高鸡传染性疾病的免疫率。本发明提供一种表达鸡传染性支气管炎病毒S蛋白的重组新城疫病毒是同时表达基因VII型新城疫病毒F蛋白、HN蛋白和传染性支气管炎病毒GI‑19基因型毒株纤突蛋白的疫苗株，命名为rLa‑FHN‑OPSFTM，保藏号是：CGMCC NO.20131。筛选获得蛋白表达水平高、免疫原性好、能够对我国新城疫病毒和传染性支气管炎病毒流行强毒株提供坚实保护的重组病毒。本发明获得的重组病毒可作为预防新城疫和传染性支气管炎的二价疫苗的候选毒株，具有重要的实际应用价值。

Description

一种表达鸡传染性支气管炎病毒S蛋白的重组新城疫病毒及 其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种表达鸡传染性支气管炎病毒S蛋白的重组新城疫病毒及其制备方法与应用。
背景技术
新城疫(Newcastle Disease，ND)和鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是除高致病性禽流感之外世界各国养禽业面临的2种最重要的疫病，每年给养禽业造成重大经济损失，同时也给人类公共卫生造成重要挑战，是世界各国面临的重大问题。新城疫是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的一种禽类的急性、高度接触性传染病，严重威胁世界范围内的家禽养殖业(Alexander,Aldous et al.2012；Ganar,Das etal.2014；Dimitrov,Afonso et al.2017)。新城疫是由新城疫病毒引起的一种禽类烈性传染病，严重危害世界范围内的家禽养殖业，疫苗免疫是控制该病的有效措施。新城疫病毒存在多种基因型，世界范围内应用最为广泛的疫苗株属于基因II型，而当前我国以及世界众多地区优势流行的强毒株属于基因VII型，疫苗毒株与流行强毒株之间的遗传和抗原性差异导致疫苗不能对流行强毒株提供有效的保护。目前已有商品化针对基因VII型新城疫病毒的灭活疫苗，但该疫苗不能用于雏鸡的首次免疫。研制能够用于所有日龄鸡免疫且与基因VII型流行强毒株抗原性匹配的新型活疫苗尤为必要。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种所有日龄鸡均可免疫且与基因VII型流行强毒株抗原性匹配的新型活疫苗，为了提高鸡传染性疾病的免疫率，本发明提供了一种表达鸡传染性支气管炎病毒S蛋白的重组新城疫病毒，所述重组新城疫病毒是同时表达基因VII型新城疫病毒F蛋白、HN蛋白和传染性支气管炎病毒GI-19基因型毒株纤突蛋白的疫苗株，命名为rLa-FHN-OPSFTM，保藏号是：CGMCC NO.20131。(建议分类命名为：表达鸡传染性支气管炎病毒S蛋白的重组新城疫病毒)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年01月13日。
本发明还提供了上述的重组新城疫病毒在制备预防鸡病毒性传染病疫苗中的应用。
进一步地限定，所述鸡病毒性传染病疫苗为预防新城疫和传染性支气管炎的二价疫苗。
本发明还提供了上述的重组新城疫病毒的制备方法，所述构建方法的具体步骤如下：
步骤1：构建表达基因VII型新城疫病毒F和HN蛋白的重组病毒载体：
1)构建重组质粒pNDFL-rF：根据含有基因II型新城疫病毒La Sota株全长cDNA的质粒pNDFL序列以及基因VII型NDV毒株CK/CH/HLJ/1/06的基因组序列，通过同源重组的方法将质粒pNDFL中位于6489-8150nt的F基因的CDS替换NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因的CDS，构建获得质粒pNDFL-rF；所述NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因的CDS序列如SEQ ID NO:25所示；
2)构建重组质粒pNDFL-mF：在质粒pNDFL-rF基础上，利用定点突变技术将NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株的F基因裂解位点的编码序列突变为La Sota毒株的F基因裂解位点的编码序列，构建获得质粒pNDFL-mF；所述La Sota毒株的F基因裂解位点的编码序列如SEQ IDNO:1所示；
3)构建获得重组质粒pNDFL-mFHN：在质粒pNDFL-mF基础上，通过同源重组的方法将pNDFL-mF中位于8357-10090nt的HN基因的CDS替换为NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因的CDS，构建获得质粒pNDFL-mFHN；所述NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因的CDS如如SEQ IDNO:26所示；
步骤2：构建含有GI-19基因型传染性支气管炎病毒S基因的重组病毒载体pNDFL-mFHN-OPSFTM：在构建的质粒pNDFL-mFHN基础上，将含有IBV ck/CH/LDL/091022毒株的S蛋白膜外区的1-3294nt序列与NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因中1501-1662nt通过基因合成构建一个长度为3456nt的嵌合片段OPSFTM，将含有OPSFTM序列插入pNDFL-mFHN质粒中P和M基因之间，构建获得质粒pNDFL-mFHN-OPSFTM；所述OPSFTM的序列如SEQ ID NO:14所示；
步骤3：拯救病毒：pNDFL-mFHN-OPSFTM与编码La Sota毒株NP、P和L蛋白的辅助质粒pCI-NP-K、pCI-P-K和pCI-L-K共同转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR T7/5细胞，获得了重组新城疫病毒rLa-FHN-OPSFTM。
进一步地限定，步骤1中的1)所述构建重组质粒pNDFL-rF的具体方法为：
(1)引物rF-1和引物rF-2以pNDFL质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得pNDFL质粒中5155-6488nt，末端带有NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因CDS的1-30nt，得到片段1；
(2)提取NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株的RNA用引物rF-3进行反转录获得cDNA，引物rF-3和引物rF-4以上述cNDA为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得含有pNDFL质粒中6459-6488nt、NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因完整CDS序列以及pNDFL质粒中8151-8180nt的片段，得到片段2；
(3)引物rF-5和引物rF-6以pNDFL质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得含有NDVCK/CH/HLJ/1/06F CDS中1633-1662nt以及pNDFL质粒中8151-10812nt的片段，得到片段3；
(4)回收步骤(1)-步骤(3)中的三个片段用KOD酶进行融合PCR并回收5657nt的片段；同时用Pme I和BsiWI内切酶对pNDFL质粒进行酶切，回收11932nt的载体片段；将回收后的融合PCR产物与Pme I和BsiWI酶切后的pNDFL质粒用In-fusion试剂盒连接转化至DH5α感受态细胞中，挑取单个克隆提取质粒进行测序鉴定，获得F基因CDS替换为NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因CDS的重组质粒pNDFL-rF。
进一步地限定，步骤2中2)所述构建重组质粒pNDFL-mF的具体步骤为：
(1)引物rF-1和引物mF-1以pNDFL-rF质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得pNDFL-rF质粒中5155-6860nt，其中6822-6839nt突变为La Sota裂解位点GGGAGACAGGGGCGCCTT，得到片段1；
(2)引物mF-2和引物rF-6以pNDFL-rF质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得pNDFL-rF质粒中6801nt-10812nt，得到片段2；
(3)回收步骤(1)和步骤(2)中二个片段用KOD酶进行融合PCR并回收5657nt的片段；同时用Pme I和BsiWI内切酶对pNDFL-rF质粒进行酶切，回收11932nt的载体片段；将回收后的融合PCR产物与Pme I和Bsi WI酶切后的pNDFL-rF质粒用In-fusion试剂盒连接转化至DH5α感受态细胞中，挑取单个克隆提取质粒进行测序鉴定，获得F基因裂解位点编码序列突变为La Sota裂解位点编码序列的重组质粒pNDFL-mF。
进一步地限定，步骤3中3)所述构建获得重组质粒pNDFL-mFHN的具体步骤为：
(1)引物rF-1和引物rHN-1以pNDFL-mF质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得pNDFL质粒中5155-8356nt，末端带有NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因CDS的1-30nt，得到片段1；
(2)提取NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株的RNA用引物rHN-2进行反转录获得cDNA，rHN-2和引物rHN-3以该cNDA为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得含有pNDFL-mF质粒中8327-8356nt、NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因完整CDS序列以及pNDFL-mF质粒中10091-10120nt的片段，得到片段2；
(3)引物rHN-4和引物rF-6以pNDFL质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得含有NDVCK/CH/HLJ/1/06HN CDS中1687-1716nt以及pNDFL-mF质粒中10091-10812nt的片段，得到片段3；
(4)回收步骤(1)-步骤(3)中三个片段用KOD酶进行融合PCR并回收5639nt的片段；同时用Pme I和Bsi WI内切酶对pNDFL-mF质粒进行酶切，回收11932nt的载体片段；将回收后的融合PCR产物与Pme I和Bsi WI酶切后的pNDFL-mF质粒用In-fusion试剂盒连接转化至DH5α感受态细胞中，挑取单个克隆提取质粒进行测序鉴定，获得HN基因CDS替换为NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因CDS的重组质粒pNDFL-mFHN。
进一步地限定，步骤2所述构建重组病毒载体pNDFL-mFHN-OPSFTM的具体步骤为：
(1)引物OPS-F和引物S-FTM-R以pMD18-T-OPSFTM质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得带有P基因的终止序列为TAAGAAAAAA、P和M基因之间的间隔序列为T、M基因的起始序列为ACGGGTAGAA和kozak序列为GCCACC的OPSFTM的转录盒；
(2)用Pme I内切酶对pNDFL-mFHN质粒进行酶切，回收17542nt的载体片段；将(1)中扩增获得的转录盒与(2)中Pme I酶切后的pNDFL-mFHN质粒用In-fusion试剂盒连接转化至DH5α感受态细胞中，挑取单个克隆提取质粒进行测序鉴定，获得含有密码子优化的GI-19型IBV ck/CH/LDL/091022毒株S基因膜外区的重组质粒pNDFL-mFHN-OPSFTM。
有益效果：本发明通过反向遗传学技术以广泛应用且安全性良好的新城疫病毒疫苗La Sota株为骨架，将其主要保护性抗原F和HN蛋白的编码区替换为我国优势流行的基因VII型新城疫病毒株F和HN蛋白的编码区，并将F蛋白裂解位点突变为La Sota株的F蛋白裂解位点。在此基础上插入野生型以及密码子优化的GI-19型传染性支气管炎病毒强毒株主要保护性抗原S蛋白的编码序列，拯救获得1株与我国优势流行的基因VII型新城疫病毒抗原性匹配且表达GI-19型传染性支气管炎病毒强毒株S蛋白的重组病毒，筛选获得蛋白表达水平高、免疫原性好、能够对我国新城疫病毒和传染性支气管炎病毒流行强毒株提供坚实保护的重组病毒。本发明获得的重组病毒可作为预防新城疫和传染性支气管炎的二价疫苗的候选毒株，具有重要的实际应用价值。
附图说明
图1为拯救病毒的遗传稳定性评价图；
图2拯救病毒的生长动力学特性图，其中横坐标是时间，纵坐标是病毒滴度；
图3免疫荧光(IFA)检测病毒感染细胞中S蛋白的表达图；
图4蛋白免疫印迹(Western blot)检测病毒中S蛋白的表达图；
图5为pNDFL-mFHN质粒图谱；
图6为pNDFL-mFHN-S质粒图谱；
图7为pNDFL-mFHN-SFTM质粒图谱；
图8为pNDFL-mFHN-OPS质粒图谱；
图9为pNDFL-mFHN-OPSFTM质粒图谱。
具体实施例
含有基因II型NDV毒株La Sota全长cDNA的质粒pNDFL由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存(质粒pNDFL已记载在文献：Sun J,Han Z,Qi T,Zhao R,Liu S.Chickengalectin-1B inhibits Newcastle disease virus adsorption and replicationthrough binding to hemagglutinin-neuraminidase(HN)glycoprotein.J BiolChem.2017；292:20141-20161中)。基因VII型NDV毒株CK/CH/HLJ/1/06(GenBankaccession：KU140419)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离、鉴定并保存(毒株CK/CH/HLJ/1/06已记载在文献：“新城疫病毒单克隆抗体制备及部分NP蛋白抗原表位鉴定分析，刘培欣，2011年，东北农业大学博士论文”中)。
编码La Sota毒株NP、P和L蛋白的辅助质粒pCI-NP-K、pCI-P-K和pCI-L-K由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存(质粒pCI-NP-K、pCI-P-K和pCI-L-K已记载在文献：Sun J,Han Z,Qi T,Zhao R,Liu S.Chicken galectin-1B inhibits Newcastle disease virusadsorption and replication through binding to hemagglutinin-neuraminidase(HN)glycoprotein.J Biol Chem.2017；292:20141-20161中)。
实施例1.构建同时表达基因VII型新城疫病毒F蛋白、HN蛋白和传染性支气管炎病毒GI-19基因型毒株纤突蛋白的新城疫重组疫苗株的方法
1.构建表达基因VII型NDVF和HN蛋白的重组病毒载体：
构建重组质粒pNDFL-rF：根据含有基因II型NDV毒株La Sota全长cDNA(GenBankaccession：AF077761)的质粒pNDFL序列以及基因VII型NDV毒株CK/CH/HLJ/1/06的基因组序列(GenBank accession：KU140419)设计引物，通过同源重组的方法将质粒pNDFL中位于6489-8150nt的F基因编码区(CDS)(GenBank accession：AF077761)替换为NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因的CDS(GenBank accession：KU140419，序列如SEQ ID NO:25所示)，构建获得质粒pNDFL-rF。
(1)引物rF-1(序列如SEQ ID NO:2所示，引物碱基组成：pNDFL质粒中5155-5184nt)和引物rF-2(序列如SEQ ID NO:4所示，引物碱基组成：rF-3的反向互补序列)以pNDFL质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得pNDFL质粒中5155-6488nt，末端带有NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因CDS的1-30nt，得到片段1；
(2)提取NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株的RNA用引物rF-3(序列如SEQ ID NO:3所示，引物碱基组成：pNDFL质粒中6459-6488nt+CK/CH/HLJ/1/06F CDS的1-30nt)进行反转录获得cDNA，引物rF-3和引物rF-4(序列如SEQ ID NO:6所示，引物碱基组成：rF-5的反向互补序列)以该cNDA为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得含有pNDFL质粒中6459-6488nt、NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因完整CDS序列以及pNDFL质粒中8151-8180nt的片段，得到片段2；
(3)引物rF-5(序列如SEQ ID NO:5所示，引物碱基组成：CK/CH/HLJ/1/06FCDS1633-1662nt+pNDFL质粒中8151-8180nt)和引物rF-6(序列如SEQ ID NO:7所示，引物碱基组成：pNDFL质粒中10783-10812nt的反向互补序列)以pNDFL质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得含有NDV CK/CH/HLJ/1/06F CDS中1633-1662nt以及pNDFL质粒中8151-10812nt的片段，得到片段3；
上述PCR扩增获得的三个片段之间互相有60nt的重叠序列，回收上述三者PCR产物用KOD酶进行融合PCR并回收5657nt的片段；同时用Pme I和Bsi WI内切酶对pNDFL质粒进行酶切，回收11932nt的载体片段；将回收后的融合PCR产物与Pme I和Bsi WI酶切后的pNDFL质粒用In-fusion试剂盒连接转化至DH5α感受态细胞中，挑取单个克隆提取质粒进行测序鉴定，获得F基因CDS替换为NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因CDS的重组质粒pNDFL-rF。
构建重组质粒pNDFL-mF：在质粒pNDFL-rF基础上，利用定点突变技术将其F基因裂解位点的编码序列突变为La Sota毒株的F基因裂解位点的编码序列，构建获得质粒pNDFL-mF。
(1)引物rF-1和引物mF-1(序列如SEQ ID NO:9所示，引物碱基组成：mF-2的反向互补序列)以pNDFL-rF质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得pNDFL-rF质粒中5155-6860nt，其中6822-6839nt突变为La Sota裂解位点GGGAGACAGGGGCGCCTT(序列如SEQ ID NO:1所示)，得到片段1；
(2)引物mF-2(序列如SEQ ID NO:8所示，引物碱基组成：pNDFL-rF中6801-6860nt，其中6822-6839nt突变为La Sota裂解位点编码序列)和引物rF-6以pNDFL-rF质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得pNDFL-rF质粒中6801nt-10812nt，得到片段2；
上述PCR扩增获得的两个片段之间互相有60nt的重叠序列，回收上述二者PCR产物用KOD酶进行融合PCR并回收5657nt的片段；同时用Pme I和Bsi WI内切酶对pNDFL-rF质粒进行酶切，回收11932nt的载体片段；将回收后的融合PCR产物与Pme I和Bsi WI酶切后的pNDFL-rF质粒用In-fusion试剂盒连接转化至DH5α感受态细胞中，挑取单个克隆提取质粒进行测序鉴定，获得F基因裂解位点编码序列突变为La Sota裂解位点编码序列的重组质粒pNDFL-mF。
构建获得重组质粒pNDFL-mFHN：在质粒pNDFL-mF基础上，通过同源重组的方法将质粒pNDFL-mF中位于8357-10090nt的HN基因(GenBank accession：AF077761)CDS替换为NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因的CDS(GenBank accession：KU140419，序列如SEQ ID NO:26所示)，构建获得质粒pNDFL-mFHN(载体图如图5所示)。
(1)引物rF-1和引物rHN-1(序列如SEQ ID NO:11所示，引物碱基组成：rHN-2的反向互补序列)以pNDFL-mF质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得pNDFL质粒中5155-8356nt，末端带有CK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因CDS的1-30nt，得到片段1；
(2)提取NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株的RNA用引物rHN-2(序列如SEQ ID NO:10所示，引物碱基组成：质粒pNDFL-mF中8327-8356nt+CK/CH/HLJ/1/06的HN CDS的1-30nt)进行反转录获得cDNA，rHN-2和引物rHN-3(序列如SEQ ID NO:13所示，引物碱基组成：rHN-4的反向互补序列)以该cNDA为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得含有pNDFL-mF质粒中8327-8356nt、NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因完整CDS序列以及pNDFL-mF质粒中10091-10120nt的片段，得到片段2；
(3)引物rHN-4(序列如SEQ ID NO:12所示，引物碱基组成：CK/CH/HLJ/1/06的HNCDS1687-1716nt+质粒pNDFL-mF中10091-10120nt)和引物rF-6以pNDFL质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得含有NDV CK/CH/HLJ/1/06HN CDS中1687-1716nt以及pNDFL-mF质粒中10091-10812nt的片段，得到片段3；
上述PCR扩增获得的三个片段之间互相有60nt的重叠序列，回收上述三者PCR产物用KOD酶进行融合PCR并回收5639nt的片段；同时用Pme I和Bsi WI内切酶对pNDFL-mF质粒进行酶切，回收11932nt的载体片段；将回收后的融合PCR产物与Pme I和Bsi WI酶切后的pNDFL-mF质粒用In-fusion试剂盒连接转化至DH5α感受态细胞中，挑取单个克隆提取质粒进行测序鉴定，获得HN基因CDS替换为CK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因CDS的重组质粒pNDFL-mFHN。
2.构建含有GI-19基因型传染性支气管炎病毒S基因的重组病毒载体pNDFL-mFHN-OPSFTM：GI-19型IBV ck/CH/LDL/091022毒株S蛋白全长包含1165个氨基酸，其中1-1098位氨基酸为膜外区、1099-1119位氨基酸为跨膜区、1120-1165位氨基酸为胞质区；NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F蛋白全长包含553个氨基酸，其中1-500位氨基酸为膜外区、501-521位氨基酸为跨膜区、522-553位氨基酸为胞质区。编码IBV ck/CH/LDL/091022毒株S蛋白膜外区1-1098位氨基酸的核苷酸序列为S CDS中的1-3294nt；编码NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F蛋白跨膜区和胞质区的501-553位氨基酸的核苷酸序列为F CDS中的1501-1662nt；
将密码子优化的编码GI-19型IBV ck/CH/LDL/091022毒株S蛋白膜外区的1-3294nt与NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F CDS中编码跨膜区和胞质区的1501-1662nt通过基因合成构建一个长度为3456nt的嵌合片段OPSFTM(序列如SEQ ID NO:14)，将其克隆至pMD18-T载体中，获得质粒pMD18-T-OPSFTM。在质粒pNDFL-mFHN基础上，通过同源重组的方法将含有OPSFTM序列的转录盒插入pNDFL-mFHN质粒中P和M基因之间非编码区域的Pme I酶切位点处，构建获得质粒pNDFL-mFHN-OPSFTM。
(1)引物OPS-F(序列如SEQ ID NO:15，引物碱基组成：pNDFL-mFHN中5155-5169nt+AAAC+基因终止序列，间隔序列以及基因起始序列+kozak+OPS序列的1-40nt)和引物S-FTM-R(序列如SEQ ID NO:16，引物碱基组成：S-FTM序列的3417-3456nt+A+GTTT以及pNDFL-mFHN中5170-5184nt的反向互补序列)以pMD18-T-OPSFTM质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得带有P基因的终止序列(TAAGAAAAAA)、P和M基因之间的间隔序列(T)、M基因的起始序列(ACGGGTAGAA)和kozak序列(GCCACC)的OPSFTM的转录盒；
(2)用Pme I内切酶对pNDFL-mFHN质粒进行酶切，回收17542nt的载体片段；将(1)中扩增获得的转录盒与(2)中Pme I酶切后的pNDFL-mFHN质粒用In-fusion试剂盒连接转化至DH5α感受态细胞中，挑取单个克隆提取质粒进行测序鉴定，获得含有密码子优化的GI-19型IBV ck/CH/LDL/091022毒株S基因膜外区的重组质粒pNDFL-mFHN-OPSFTM(载体图如图9所示)。
3.表达GI-19型IBV ck/CH/LDL/091022毒株S蛋白的重组新城疫病毒的拯救：
(1)参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书方法分别将构建的pNDFL-mFHN-OPSFTM质粒8μg与辅助质粒pCI-NP-K(4μg)、pCI-P-K(2μg)、pCI-L-K(2μg)以4:2:1:1的比例共转染BSR-T7/5细胞；
(2)转染6h后，更换为含10％血清的DMEM培养基并加入TPCK-trypsin(1μg/mL)；
(3)37℃继续培养72h，收集细胞及细胞上清；
(4)将细胞及上清反复冻融3次后，接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔；
(5)继续培养鸡胚72h，取鸡胚尿囊液进行血凝试验(HA)，收获HA阳性的鸡胚尿囊液用NDV阳性血清通过血凝抑制试验(HI)进行鉴定；
(6)HA和HI鉴定为阳性的病毒尿囊液提取RNA，通过RT-PCR扩增所插入的基因片段并进行序列测定。最终拯救获得了表达密码子优化的GI-19型IBV ck/CH/LDL/091022毒株S蛋白膜外区的重组新城疫病毒，命名为rLa-FHN-OPSFTM。
对比例1.
1.构建表达基因VII型NDVF和HN蛋白的重组病毒载体：参照实施例1的步骤1的方法；构建获得质粒pNDFL-mFHN。
2.构建含有GI-19基因型传染性支气管炎病毒S基因的重组病毒载体pNDFL-mFHN-S：在质粒pNDFL-mFHN基础上，设计引物通过同源重组的方法将含有GI-19型IBV ck/CH/LDL/091022毒株S基因完整CDS序列(序列如SEQ ID NO:17)的转录盒插入pNDFL-mFHN质粒中P和M基因之间非编码区域的Pme I酶切位点处，构建获得质粒pNDFL-mFHN-S。由于Pme I酶切位点位于pNDFL-mFHN质粒中P基因的基因终止序列之前，因此在所插入的S基因CDS序列之前补充了P基因的终止序列、P和M基因之间的间隔序列以及M基因的起始序列，并且在S基因CDS序列起始密码子前补充了能够提高转录效率的kozak序列；此外，在S基因CDS序列之后补加了一个碱基A，使得最终插入的转录盒的序列碱基数是6的倍数，以保证所插入的S基因能够被正确转录。
(1)引物S-F(序列如SEQ ID NO:18所示，引物碱基组成：pNDFL-mFHN中5155-5169nt+AAAC+基因终止序列，间隔序列以及基因起始序列+kozak序列+ck/CH/LDL/091022SCDS的1-40nt)和引物S-R(序列如SEQ ID NO:19所示，引物碱基组成：ck/CH/LDL/091022SCDS的3459-3498nt+A+GTTT+pNDFL-mFHN中5170-5184nt的反向互补序列)以pUS10-S质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得带有P基因的终止序列(TAAGAAAAAA)、P和M基因之间的间隔序列(T)、M基因的起始序列(ACGGGTAGAA)和kozak序列(GCCACC)的GI-19型IBV ck/CH/LDL/091022毒株S基因完整CDS的转录盒；
(2)用Pme I内切酶对pNDFL-mFHN质粒进行酶切，回收17542nt的载体片段；将(1)中扩增获得的转录盒与(2)中Pme I酶切后的pNDFL-mFHN质粒用In-fusion试剂盒连接转化至DH5α感受态细胞中，挑取单个克隆提取质粒进行测序鉴定，获得含有野生型GI-19型IBVck/CH/LDL/091022毒株S基因的重组质粒pNDFL-mFHN-S(载体图如图6所示)。
3.病毒拯救：
(1)参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书方法分别将构建的pNDFL-mFHN-S质粒8μg与辅助质粒pCI-NP-K(4μg)、pCI-P-K(2μg)、pCI-L-K(2μg)以4:2:1:1的比例共转染BSR-T7/5细胞；
(2)转染6h后，更换为含10％血清的DMEM培养基并加入TPCK-trypsin(1μg/mL)；
(3)37℃继续培养72h，收集细胞及细胞上清；
(4)将细胞及上清反复冻融3次后，接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔；
(5)继续培养鸡胚72h，取鸡胚尿囊液进行血凝试验(HA)，收获HA阳性的鸡胚尿囊液用NDV阳性血清通过血凝抑制试验(HI)进行鉴定；
(6)HA和HI鉴定为阳性的病毒尿囊液提取RNA，通过RT-PCR扩增所插入的基因片段并进行序列测定。最终拯救获得了表达野生型GI-19型IBV ck/CH/LDL/091022毒株S蛋白的重组新城疫病毒，命名为rLa-FHN-S。
对比例2.
1.构建表达基因VII型NDVF和HN蛋白的重组病毒载体：参照实施例1的步骤1的方法；构建获得质粒pNDFL-mFHN。
2.构建含有GI-19基因型传染性支气管炎病毒S基因的重组病毒载体pNDFL-mFHN-SFTM：将IBV ck/CH/LDL/091022毒株S CDS中的1-3294nt与NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F CDS中的1501-1662nt通过基因合成构建一个长度为3456nt的嵌合片段SFTM(序列如SEQ IDNO:21)，将其克隆至pMD18-T载体中，获得质粒pMD18-T-SFTM。
在质粒pNDFL-mFHN基础上，设计引物通过同源重组的方法将含有嵌合片段SFTM序列的转录盒插入pNDFL-mFHN质粒中P和M基因之间非编码区域的Pme I酶切位点处，构建获得质粒pNDFL-mFHN-SFTM。由于Pme I酶切位点位于pNDFL-mFHN质粒中P基因的基因终止序列之前，因此在所插入的SFTM序列之前补充了P基因的终止序列、P和M基因之间的间隔序列以及M基因的起始序列，并且在SFTM序列起始密码子前补充了能够提高转录效率的kozak序列；此外，在SFTM序列之后补加了一个碱基A，使得最终插入的转录盒的序列碱基数是6的倍数，以保证所插入的SFTM序列能够被正确转录。
(1)引物S-F和引物S-FTM-R以pMD18-T-SFTM质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得带有P基因的终止序列(TAAGAAAAAA，序列如SEQ ID NO:22)、P和M基因之间的间隔序列(T)、M基因的起始序列(ACGGGTAGAA，序列如SEQ ID NO:23)和kozak序列(GCCACC)的SFTM的转录盒；
(2)用Pme I内切酶对pNDFL-mFHN质粒进行酶切，回收17542nt的载体片段；将(1)中扩增获得的转录盒与(2)中Pme I酶切后的pNDFL-mFHN质粒用In-fusion试剂盒连接转化至DH5α感受态细胞中，挑取单个克隆提取质粒进行测序鉴定，获得含有野生型GI-19型IBVck/CH/LDL/091022毒株S基因膜外区的重组质粒pNDFL-mFHN-SFTM(载体图如图7所示)。
3.病毒拯救：
(1)参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书方法分别将构建的pNDFL-mFHN-SFTM质粒8μg与辅助质粒pCI-NP-K(4μg)、pCI-P-K(2μg)、pCI-L-K(2μg)以4:2:1:1的比例共转染BSR-T7/5细胞；
(2)转染6h后，更换为含10％血清的DMEM培养基并加入TPCK-trypsin(1μg/mL)；
(3)37℃继续培养72h，收集细胞及细胞上清；
(4)将细胞及上清反复冻融3次后，接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔；
(5)继续培养鸡胚72h，取鸡胚尿囊液进行血凝试验(HA)，收获HA阳性的鸡胚尿囊液用NDV阳性血清通过血凝抑制试验(HI)进行鉴定；
(6)HA和HI鉴定为阳性的病毒尿囊液提取RNA，通过RT-PCR扩增所插入的基因片段并进行序列测定。最终拯救获得了表达野生型GI-19型IBV ck/CH/LDL/091022毒株S蛋白膜外区的重组新城疫病毒，命名为rLa-FHN-SFTM。
对比例3.
1.构建表达基因VII型NDVF和HN蛋白的重组病毒载体：参照实施例1的步骤1的方法；构建获得质粒pNDFL-mFHN。
2.构建含有GI-19基因型传染性支气管炎病毒S基因的重组病毒载体pNDFL-mFHN-OPS：通过生物信息学技术对编码GI-19型IBV ck/CH/LDL/091022毒株S蛋白的核苷酸序列进行密码子优化，使其适合在鸡源细胞中表达，合成优化后的核苷酸序列OPS(序列如SEQID NO:20)，将其克隆至pMD18-T载体中，获得质粒pMD18-T-OPS。在质粒pNDFL-mFHN基础上，设计引物通过同源重组的方法将含有OPS序列的转录盒插入pNDFL-mFHN质粒中P和M基因之间非编码区域的Pme I酶切位点处，构建获得质粒pNDFL-mFHN-OPS。
(1)引物OPS-F和引物OPS-R(序列如SEQ ID NO:24所示，引物碱基组成：OPS序列3459-3498nt+A+GTTT以及pNDFL-mFHN中5170-5184nt的反向互补序列)以pMD18-T-OPS质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得带有P基因的终止序列(TAAGAAAAAA)、P和M基因之间的间隔序列(T)、M基因的起始序列(ACGGGTAGAA)和kozak序列(GCCACC)的OPS的转录盒；
(2)用Pme I内切酶对pNDFL-mFHN质粒进行酶切，回收17542nt的载体片段；将(1)中扩增获得的转录盒与(2)中Pme I酶切后的pNDFL-mFHN质粒用In-fusion试剂盒连接转化至DH5α感受态细胞中，挑取单个克隆提取质粒进行测序鉴定，获得含有密码子优化的GI-19型IBV ck/CH/LDL/091022毒株S基因的重组质粒pNDFL-mFHN-OPS(载体图如图8所示)。
3.病毒拯救：
(1)参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书方法分别将构建的pNDFL-mFHN-OPS质粒8μg与辅助质粒pCI-NP-K(4μg)、pCI-P-K(2μg)、pCI-L-K(2μg)以4:2:1:1的比例共转染BSR-T7/5细胞；
(2)转染6h后，更换为含10％血清的DMEM培养基并加入TPCK-trypsin(1μg/mL)；
(3)37℃继续培养72h，收集细胞及细胞上清；
(4)将细胞及上清反复冻融3次后，接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔；
(5)继续培养鸡胚72h，取鸡胚尿囊液进行血凝试验(HA)，收获HA阳性的鸡胚尿囊液用NDV阳性血清通过血凝抑制试验(HI)进行鉴定；
(6)HA和HI鉴定为阳性的病毒尿囊液提取RNA，通过RT-PCR扩增所插入的基因片段并进行序列测定。最终拯救获得了表达密码子优化的GI-19型IBV ck/CH/LDL/091022毒株S蛋白的重组新城疫病毒，命名为rLa-FHN-OPS。
利用以下实验验证实验效果：
一、表达GI-19型IBV ck/CH/LDL/091022毒株S蛋白的重组新城疫病毒的生物学特性
①鸡胚平均死亡时间(MDT)的测定
将rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS和rLa-FHN-OPSFTM病毒用无血清DMEM作10倍倍比递增稀释，选取4个稀释度(10-6～10-9)，每个稀释度接种5枚9日龄SPF鸡胚，每胚接种0.1mL，置37℃培养。每天照蛋3次，弃掉24h内死亡的鸡胚，连续观察7d，收集死亡鸡胚尿囊液测定HA并记录死亡时间。致使所有鸡胚死亡的病毒最高稀释倍数为病毒最小致死量，根据最小致死量致死鸡胚时间计算鸡胚平均死亡时间(MDT)值，计算方法如下：MDT＝(Xh死亡胚数×X h+Yh死亡胚数×Yh)/总胚数。结果显示重组病毒rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS和rLa-FHN-OPSFTM的最小致死量致死鸡胚平均死亡时间(MDT)均大于120h，表明上述4株重组病毒均为低毒力毒株。
②鸡胚半数感染量(EID50)的测定
将rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS和rLa-FHN-OPSFTM病毒用无血清DMEM进行10倍倍比稀释，选取4个稀释度(10-7～10-10)各接种于5枚9日龄SPF鸡胚，每胚接种0.1mL，37℃孵育培养，每天照蛋两次观察鸡胚变化，弃掉24h内死亡的鸡胚，6d后测定各鸡胚HA效价，采用Reed-Muench方法计算病毒的EID50：结果显示rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS和rLa-FHN-OPSFTM病毒的EID50分别为108.5/0.1mL、108.33/0.1mL、108.66/0.1mL、108.75/0.1mL，与疫苗株La Sota的EID50(108.85/0.1mL)无显著差异。
③拯救病毒的遗传稳定性评价
将rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS和rLa-FHN-OPSFTM病毒在SPF鸡胚上进行连续传代15代，收获每代鸡胚尿囊液。第1、5、10、15代的SPF鸡胚尿囊液病毒，提取RNA，进行RT-PCR扩增插入的转录盒序列，由北京华大基因有限公司进行序列测定。结果如图1所示，拯救的rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS和rLa-FHN-OPSFTM病毒第1、5、10、15代中所插入的转录盒均稳定存在，表明拯救的病毒在鸡胚中经多次传代具有良好的遗传稳定性。
④拯救病毒的生长动力学特性
为测定病毒在鸡胚中的生长特性，将rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS和rLa-FHN-OPSFTM病毒和亲本病毒La Sota按100EID50/0.1mL的剂量接种SPF鸡胚(0.1mL/胚)，在接种后每隔24h随机抽取5枚鸡胚收集尿囊液，将收集的尿囊液混匀，测定每个时间点病毒尿囊液的HA效价，绘制生长动力学曲线。结果如图2所示，rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS和rLa-FHN-OPSFTM病毒和亲本病毒La Sota呈现相似的生长模式，不同时间的病毒滴度与亲本病毒无显著差异。
⑤重组病毒表达S蛋白的检测
应用间接免疫荧光(IFA)检测病毒感染细胞中S蛋白的表达：将鸡成纤维细胞DF-1传至12孔板中，待细胞密度达到80％左右时，弃掉细胞培养液，用DMEM清洗3次。将rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS、rLa-FHN-OPSFTM和亲本病毒La Sota以感染复数(MOI)＝0.1的剂量接种12孔板的DF-1细胞，37℃细胞培养箱中培养1h后，弃去培养基，并用DMEM洗涤三次，每孔加入1ml含10％胎牛血清、1μl TPCK处理的胰酶的DMEM培养基。接种后48h，弃去细胞液，PBS清洗3次，用多聚甲醛固定细胞，于4℃放置30min后，弃去固定液，加入PBS清洗3次，以1％BSA稀释的鸡抗ck/CH/LDL/091022型血清为一抗，FITC标记的兔抗鸡IgG为二抗进行免疫荧光试验，倒置荧光显微镜进行观察。结果如图3所示，rLa-FHN-SFTM和rLa-FHN-OPSFTM感染的DF-1细胞中能够观察到绿色荧光，且rLa-FHN-OPSFTM感染的DF-1细胞中的荧光强度明显高于rLa-FHN-SFTM；而rLa-FHN-S、rLa-FHN-OPS以及La Sota感染的DF-1细胞中未观察到绿色荧光。
应用蛋白免疫印迹(Western blot)检测病毒中S蛋白的表达：取相同血凝单位(HA＝7)的rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS、rLa-FHN-OPSFTM和亲本病毒La Sota的尿囊液，加入1/4体积5×SDS上样缓冲液，沸水浴煮沸10min，冰上放置5min。进行蛋白质的SDS-PAGE电泳。电泳结束后按照常规方法将蛋白转印至硝酸纤维膜(NC膜)上。将转印后的NC膜置于含5％脱脂乳的PBS中，37℃封闭1h，PBST洗涤3次，每次10min；以鸡抗ck/CH/LDL/091022型血清为一抗，37℃孵育1h后，PBST洗涤3次，每次10min；以驴抗鸡IRDye800(1:5000)为二抗，37℃孵育1h后，PBST洗涤3次，每次10min，用Odyssey红外荧光扫描成像系统进行扫描。结果如图4所示，rLa-FHN-SFTM和rLa-FHN-OPSFTM的尿囊液病毒中检测到了S蛋白的表达，且rLa-FHN-OPSFTM的尿囊液病毒中的S蛋白的表达水平明显高于rLa-FHN-SFTM；而rLa-FHN-S、rLa-FHN-OPS以及La Sota的尿囊液病毒中检测不到相应的蛋白条带。
二、重组病毒对基因VII型新城疫病毒强毒株的免疫效果应用评价
将重组病毒rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS、rLa-FHN-OPSFTM和新城疫病毒疫苗株La Sota以106EID50/0.1mL的剂量，滴鼻点眼途径分别接种10只2周龄SPF鸡，另外10只鸡接种无菌的PBS作为对照。21天后以滴鼻点眼途径接种105EID50剂量的基因VII型新城疫病毒强毒株CK/CH/HLJ/1/06，观察20天，统计发病率和死亡率。攻毒后每4天采集口腔和泄殖腔拭子，通过接种鸡胚分离病毒的方法检测拭子中的排毒情况。
试验结果：攻毒后，对照组中的10只鸡在攻毒后8天之内全部死亡(结果详见表1，其中dpc表示攻毒后的天数)。重组病毒rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS、rLa-FHN-OPSFTM和疫苗株La Sota免疫后针对基因VII型新城疫病毒强毒株CK/CH/HLJ/1/06保护率均为100％。此外，rLa-FHN-S免疫组中，攻毒后4dpc和8dpc时存活鸡咽拭子中的排毒率分别是10％和0％，存活鸡泄殖腔拭子中的排毒率分别是30％和20％；rLa-FHN-SFTM免疫组中，攻毒后4dpc和8dpc时存活鸡咽拭子中的排毒率分别是10％和0％，存活鸡泄殖腔拭子中的排毒率分别是20％和10％；rLa-FHN-OPS免疫组中，攻毒后4dpc和8dpc时存活鸡咽拭子中的排毒率分别是10％和0％，存活鸡泄殖腔拭子中的排毒率分别是30％和10％；rLa-FHN-OPSFTM免疫组中，攻毒后4dpc和8dpc时存活鸡咽拭子中的排毒率分别是10％和0％，存活鸡泄殖腔拭子中的排毒率分别是20％和10％；La Sota免疫组中，攻毒后4dpc和8dpc时存活鸡咽拭子中的排毒率分别是30％和10％，存活鸡泄殖腔拭子中的排毒率分别是60％和30％；12dpc后，所有免疫组中均检测不到排毒。
表1rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS、rLa-FHN-OPSFTM对基因VII型新城疫病毒强毒株的免疫保护效果
Figure BDA0002938595960000121
Figure BDA0002938595960000131
试验结果表明，本发明构建的重组病毒rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS、rLa-FHN-OPSFTM免疫鸡后能够对基因VII型新城疫病毒强毒株的攻击提供完全保护，且本发明构建的重组病毒免疫后的鸡排毒的比例要明显低于疫苗株La Sota免疫的鸡，说明本发明具有良好的应用价值。
三、重组病毒对GI-19型鸡传染性支气管炎病毒强毒株的免疫效果应用评价
将重组病毒rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS、rLa-FHN-OPSFTM和传染性支气管炎病毒致弱毒LDL-C株以103.5EID50/0.1mL的剂量，滴鼻点眼途径分别接种10只2周龄SPF鸡，另外10只鸡接种无菌的PBS作为对照。21天后以滴鼻点眼途径接种105.5EID50剂量的GI-19型鸡传染性支气管炎病毒强毒株ck/CH/LDL/091022，观察20天，统计发病率和死亡率。攻毒后每5天采集口腔拭子，通过接种鸡胚分离病毒的方法检测拭子中的排毒情况。
试验结果：攻毒后，对照组中的10只鸡在攻毒后8天之内全部发病(结果详见表2，其中dpc表示攻毒后的天数)。重组病毒rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS、rLa-FHN-OPSFTM和弱毒株LDL-C株免疫后针对GI-19型鸡传染性支气管炎病毒强毒株ck/CH/LDL/091022临床保护率依次分别为40％、70％、50％、90％和90％。此外，rLa-FHN-S免疫组中，攻毒后5dpc时存活鸡咽拭子中的排毒率别是70％；rLa-FHN-SFTM免疫组中，攻毒后5dpc时存活鸡咽拭子中的排毒率是40％；rLa-FHN-OPS免疫组中，攻毒后5dpc时存活鸡咽拭子中的排毒率是50％；rLa-FHN-OPSFTM免疫组中，攻毒后5dpc时存活鸡咽拭子中的排毒率是20％；LDL-C株免疫组中，攻毒后5dpc时存活鸡咽拭子中的排毒率是10％。
表2rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS、rLa-FHN-OPSFTM对GI-19型鸡传染性支气管炎病毒强毒株的免疫保护效果
Figure BDA0002938595960000132
试验结果表明，本发明构建的重组病毒rLa-FHN-S、rLa-FHN-SFTM、rLa-FHN-OPS、rLa-FHN-OPSFTM免疫鸡后能够对GI-19型鸡传染性支气管炎病毒强毒株的攻击提供不同程度的免疫保护，尤其是本发明优选的构建的重组病毒rLa-FHN-OPSFTM免疫后临床保护排毒的比例与传统的活疫苗相当，有替代传统活疫苗的潜力，说明本发明具有良好的应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110>
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分
中心)
<120> 一种表达鸡传染性支气管炎病毒S蛋白的重组新城疫病毒及其制备方法与应用
<130>
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> La Sota裂解位点
<400> 1
gggagacagg ggcgcctt 18
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> rF-1
<400> 2
cgcgtaaccg tgtttaaact agctacattt 30
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> rF-3
<400> 3
ggatcccggt tggcgccctc caggtgcaag atgggctcca aaccttctac caggatccca 60
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> rF-2
<400> 4
tgggatcctg gtagaaggtt tggagcccat cttgcacctg gagggcgcca accgggatcc 60
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> rF-5
<400> 5
gatcagatga aagccactgc aagagcatga acacagatga ggaacgaagg tttccctaat 60
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> rF-4
<400> 6
attagggaaa ccttcgttcc tcatctgtgt tcatgctctt gcagtggctt tcatctgatc 60
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> rF-6
<400> 7
atgccggatc cgtacgaatg ctgctgaact 30
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> mF-2
<400> 8
tctgtgtcca cgtctggagg agggagacag gggcgcctta taggtgctgt tattggcagt 60
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> mF-1
<400> 9
actgccaata acagcaccta taaggcgccc ctgtctccct cctccagacg tggacacaga 60
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> rHN-2
<400> 10
ctaccgcttc accgacaaca gtcctcaatc atggaccgcg cggttaacag agtcgtgctg 60
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> rHN-1
<400> 11
cagcacgact ctgttaaccg cgcggtccat gattgaggac tgttgtcggt gaagcggtag 60
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> rHN-4
<400> 12
gttgagatcc tcaaggatga tagagtttaa ttgagtcaat tataaaggag ttggaaagat 60
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> rHN-3
<400> 13
atctttccaa ctcctttata attgactcaa ttaaactcta tcatccttga ggatctcaac 60
<210> 14
<211> 3456
<212> DNA
<213> OPSFTM
<400> 14
atgctgggca agagcctgtt cctggtgacc attctgtgcg ctctgtgcag cgctaacctg 60
ttcgatagcg ccaacaacta cgtgtactac taccagagcg ccttcagacc accaaatggc 120
tggcacctgc agggcggagc ttatgctgtg gtgaacagca ccaactacac cagcaacgcc 180
ggaagcgcta gcgaatgtac agtgggcgtg atcaaggatg tgtacaacca gagcgctgcc 240
agcattgcta tgaccgctcc accacaagga atggcttgga gcaagagcca gttctgtagc 300
gcccactgta acttcagcga gatcaccgtg ttcgtgaccc actgttacag cagcggcaca 360
ggaagctgtc ccatcacagg catgatcgcc agagatcaca tcagaatcag cgccatgaag 420
aacggcagcc tgttctacaa cctgaccgtg agcgtgagca agtacagcag cttcaagagc 480
ttccagtgcg tgaacaactt caccagcgtg tacctgaacg gcgatctggt gttcaccagc 540
aacaagacca ccgatgtgac aagcgctggc gtgtatttta aggctggcgg cccagtgaat 600
tacagcgtga tgaaggagtt caaggtgctg gcctacttcg ttaatggcac cgcccaagat 660
gtgatcctgt gcgataacag ccccaaggga ctgctggctt gccaatacaa caccggcaac 720
ttcagcgatg gcttctaccc cttcaccaac agcaccctgg tgagagataa gttcatcgtg 780
tacagagaga gcagcgtgaa cacaaccctg accctgacca acttcacctt caccaacgtg 840
tctaccgccc agccaaattc tggaggcgtg agcacattcc atctgtacca gacccagaca 900
gctcagagcg gctactacaa cttcaacctg agcttcctga gccagttcgt gtacaaggcc 960
agcgatttca tgtacggcag ctaccacccc agatgcagct ttagacccga gacaatcaat 1020
agcggcctgt ggttcaatag cctgagcgtg agcctgacat atggacctct gcagggcgga 1080
tgtaaacaga gcgtgttcag cggcaaagcc acctgttgct acgcctacag ctacaatggc 1140
cccagagcct gtaaaggagt gtacagcggc gaactgagca agaccttcga atgcggcctg 1200
ctggtgtatg tgaccaagag cgatggcagc agaatccaga ccagaaccga gccactggtg 1260
ctgatgcagc acaactacaa caacatcacc ctggataagt gcgtggccta caacatctac 1320
ggcagagtgg gccaaggctt catcaccaac gtgaccgata gcgccgccaa ctttagctac 1380
ctggccgatg gaggactggc catcctggat acaagcggcg ccatcgatgt gtttgtggtg 1440
cagggcagct atggcctgaa ctactacaag gtgaacccct gcgaggatgt gaaccagcag 1500
ttcgttgtga gcggcggcaa tattgtgggc atcctgacca gcagaaacga aaccggaagc 1560
gagcaagtgg agaaccagtt ctacgtgaag ctgaccaaca gcagccacag aagaagaaga 1620
agcatcggcc agaacgtgac cagctgcagc tatgtgagct acggcagatt ctgcatcgaa 1680
cccgatggca gcctgaaact gattgtgccc gaggagctga aacaattcgt ggcccccctg 1740
ctgaatatta ccgagagcgt gctgatcccc aacagcttca acctgaccgt gaccgatgag 1800
tacatccaga ccagaatgga taaggtgcag atcaactgcc tgcagtacgt gtgcggaaac 1860
agcctggagt gcagaaagct gttccagcag tatggccccg tgtgcgataa tatcctgagc 1920
gtggtgaata gcgtgggcca gaaggaggat atggagctgc tgagcttcta cagcagcacc 1980
aaacccgccg gatataatgc tcccgtgttc agcaatatca gcaccggcga tttcaacatc 2040
agcctgctgt tgaccccccc atctagccca tctggaagaa gcttcatcga ggatctgctg 2100
ttcaccagcg tggaaacagt gggcctgcca acagatgccg agtacaagaa gtgtaccgct 2160
ggacccctgg gaacactgaa ggatctgatc tgcgccagag agtacaacgg actgttggtg 2220
ctgcccccaa ttatcacagc cgatatgcag accatgtaca ccgctagcct ggttggagct 2280
atggcctttg gcggaattac agctgccgga gccattccat tcgccaccca gattcaggcc 2340
agaatcaacc acctgggcat cacacagagc ctgctgctga agaaccagga gaagatcgcc 2400
gccagcttca acaaagccat cggccatatg caggagggct tcagatctac cagcctggct 2460
ctgcagcagg tgcaagatgt ggtgaacaag cagagcgcca tcctgaccga gacaatgaac 2520
agcctgaaca agaacttcgg cgccatcagc agcgtgatcc aggatatcta cgcccagctg 2580
gatgccattc aagccgatgc ccaggtggat agactgatca ccggcagact gagcagcttg 2640
agcgtgttgg ctagcgctaa gcacagcgag tacatcagag tgagccagca gagagaactg 2700
gccacccaga agatcaacga gtgcgtgaag agccagagca acagatacgg cttctgcggc 2760
tctggaagac acgtgctgag cattccccaa aatgccccca acggcatcgt gttcatccac 2820
ttcagctaca cccccgagag cttcgttaat gtgaccgcca tcgtgggctt ttgtgtgcaa 2880
ccagccaacg ctagccagta tgccatcgtg cccgtgaatg gcagaggcat cttcatccag 2940
gtgaacggca gctactacat caccgccaga gatatgtaca tgcccagaga tatcaccgcc 3000
ggcgatatcg ttacactgac cagctgccaa gccaactacg tgaacgtgaa caagaccgtg 3060
atcaccacct tcgtggagga tgatgatttc gatttcgatg atgagctgag caagtggtgg 3120
aacgatacca agcacgagct gcccgatttc gatgatttca actacaccgt gcccatcctg 3180
aacatcagcg gcgagatcga tcatatccag ggcgtgatcc agggactgaa cgatagcctg 3240
atcaacctgg aggagctgag catcctgaag acctacatca agtggccctg gtacctcatt 3300
acctatattg ttctaactgt catttctcta gttttcggtg cacttagtct gggtttagcg 3360
tgttacctga tgtacaaaca gaaggcacaa caaaagacct tgctatggct tgggaataat 3420
gcccttgatc agatgaaagc cactgcaaga gcatga 3456
<210> 15
<211> 86
<212> DNA
<213> OPS-F
<400> 15
cgcgtaaccg tgtttaaact aagaaaaaat acgggtagaa gccaccatgc tgggcaagag 60
cctgttcctg gtgaccattc tgtgcg 86
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> S-FTM-R
<400> 16
aaatgtagct agtttaaact tcatgctctt gcagtggctt tcatctgatc aagggcatta 60
<210> 17
<211> 3498
<212> DNA
<213> GI-19型IBV ck/CH/LDL/091022毒株S基因完整CDS序列
<400> 17
atgttgggga agtcactgtt tttagtgacc attttgtgtg cactatgtag tgcaaatttg 60
tttgattctg ccaataatta tgtgtactac taccaaagtg cctttaggcc tccaaatgga 120
tggcatctgc aagggggtgc ttatgcagta gtgaattcta ctaattatac tagtaatgcc 180
ggttctgcaa gtgagtgcac tgttggtgtt attaaggacg tctataatca aagtgcggct 240
tccatagcta tgacagcacc tcctcagggt atggcttggt ctaagtcaca gttttgtagt 300
gcacactgta acttttctga aattacagtc tttgtcacac attgttatag tagtggtaca 360
gggtcttgtc ctataacagg catgattgca cgtgatcata ttcgtatttc cgcaatgaaa 420
aatggttctt tattttataa tttaacagtt agcgtatcta aatactctag ttttaagtct 480
tttcaatgtg ttaacaactt cacatctgtt tatttaaatg gtgatcttgt ttttacttcc 540
aataaaacta ctgatgttac gtcagcaggt gtgtatttta aagcaggtgg acctgtaaat 600
tatagtgtta tgaaagaatt taaggttctt gcttactttg ttaatggtac agcacaagat 660
gtaattttgt gtgacaattc ccctaagggt ttgctagcct gtcaatataa cactggcaat 720
ttttcagacg gcttctatcc ttttactaat agtactttag ttagggacaa gttcattgtc 780
tatcgtgaaa gtagtgttaa tactactttg acgttaacta atttcacttt tactaatgta 840
agtactgcac agcctaatag tggtggtgtt agtacttttc atttatatca aacacaaaca 900
gctcagagtg gttattataa ttttaatttg tcatttctga gtcagtttgt gtataaggca 960
agtgatttta tgtatgggtc ttatcaccct aggtgttctt ttagaccaga aaccattaat 1020
agtggtttat ggtttaattc cttgtcagtt tctcttactt atggacccct acagggaggg 1080
tgtaagcaat ctgtttttag tggtaaggca acgtgttgtt atgcctactc ttataatggc 1140
ccaagggcat gtaaaggtgt ttattcaggt gaattaagca agacttttga atgtggattg 1200
ctggtttatg ttactaagag tgatggctct cgtatacaga ctagaacgga gcccttagta 1260
ttaatgcaac acaattataa taatattact ttagataagt gtgttgccta taatatatat 1320
ggcagagtgg gccaaggttt tattactaat gtgactgatt ctgctgctaa ttttagttat 1380
ttagcagatg gtgggttagc tattttagac acttcgggtg ccatagatgt ttttgttgta 1440
cagggcagct atggtcttaa ttattacaag gtcaatcctt gtgaagatgt taaccaacag 1500
tttgtagtgt ctggtggcaa tatagttggc attcttactt ctagaaatga aacaggttct 1560
gaacaggttg agaaccagtt ttatgttaag ttaaccaata gctcacatcg tcgtaggcgt 1620
tctattggcc aaaatgtaac aagttgttct tatgttagtt atggcagatt ttgtattgaa 1680
ccagatggtt cgttaaagct gatagtgcca gaagaattga agcagtttgt ggcaccttta 1740
cttaatatta ctgaaagtgt actcatacct aacagtttta atttgactgt tacagatgag 1800
tacatacaaa cacgtatgga taaggtccaa atcaattgcc ttcaatatgt ttgcggcaat 1860
tctttggagt gtagaaaatt gtttcaacaa tatggtccgg tttgtgataa catattgtct 1920
gttgtaaata gtgttggtca aaaagaagat atggaacttt taagtttcta ttcttctact 1980
aaaccagctg gttataatgc acctgtcttt agtaatatta gtactggtga ttttaatatt 2040
tctcttttat taacaccacc tagcagtcct agcggtcgtt cttttataga agatttgtta 2100
tttacaagtg ttgaaacagt tggtttgcca actgatgctg aatataaaaa atgcacagca 2160
ggacctttag gtactcttaa ggatcttatc tgtgctaggg aatataatgg tttattagtg 2220
ttgcctccaa ttattacggc ggatatgcaa acaatgtata ctgcttcttt agttggtgcc 2280
atggcttttg gtggtattac agcagcaggt gccataccat ttgcaactca gatacaagcc 2340
agaattaatc atttgggtat tacacagtct ctgttattga aaaatcaaga gaaaattgca 2400
gcttccttta ataaggccat tggtcatatg caggaaggtt ttagaagcac ttcgctagca 2460
ttacaacagg ttcaagacgt tgttaataag cagagtgcta ttcttactga aactatgaat 2520
tctcttaata agaattttgg tgctatttca tcagtaattc aagacattta tgcgcaactt 2580
gatgcaattc aagcagatgc acaagttgac cgtcttatta ctggcagact ctcttctctc 2640
tcagtgctag cctctgctaa gcattctgag tacatcagag tttcccaaca acgtgaatta 2700
gccactcaaa aaattaatga gtgtgttaaa tcacaatcta ataggtatgg tttttgtggt 2760
agtggaagac atgttctttc gataccacaa aatgcaccta atggtatagt gtttatacac 2820
tttagttaca ctccagagag ttttgttaat gttactgcaa tagtaggttt ttgtgtacag 2880
cctgctaatg ctagtcagta tgcaatagtg cctgttaatg gtagaggtat ttttatacaa 2940
gttaatggta gttactatat cactgcacgt gatatgtata tgcctagaga cattactgca 3000
ggagatatag ttactcttac ttcttgtcaa gcaaattatg ttaatgtaaa taaaaccgtc 3060
attactacat ttgtggaaga tgacgatttt gattttgatg atgagttgtc gaaatggtgg 3120
aatgatacta agcatgagct accagacttt gacgacttca attatacagt acccatactt 3180
aatattagtg gtgaaattga tcatattcaa ggtgttatac agggtcttaa tgactccctt 3240
ataaaccttg aagaactttc aatacttaaa acttatatta agtggccttg gtatgtttgg 3300
ctagccatag gctttgctat tattattttt atccttattt taggatgggt gtttttcatg 3360
acaggttgtt gtggttgttg ttgtggatgc tttggtatca ttcctctaat gagtaagtgt 3420
ggtaagaaat catcttatta cacgactttt gataatgatg tggtgactga acaatacaga 3480
cctaaaaagt ctgtttaa 3498
<210> 18
<211> 86
<212> DNA
<213> S-F
<400> 18
cgcgtaaccg tgtttaaact aagaaaaaat acgggtagaa gccaccatgt tggggaagtc 60
actgttttta gtgaccattt tgtgtg 86
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> S-R
<400> 19
aaatgtagct agtttaaact ttaaacagac tttttaggtc tgtattgttc agtcaccaca 60
<210> 20
<211> 3498
<212> DNA
<213> OPS
<400> 20
atgctgggca agagcctgtt cctggtgacc attctgtgcg ctctgtgcag cgctaacctg 60
ttcgatagcg ccaacaacta cgtgtactac taccagagcg ccttcagacc accaaatggc 120
tggcacctgc agggcggagc ttatgctgtg gtgaacagca ccaactacac cagcaacgcc 180
ggaagcgcta gcgaatgtac agtgggcgtg atcaaggatg tgtacaacca gagcgctgcc 240
agcattgcta tgaccgctcc accacaagga atggcttgga gcaagagcca gttctgtagc 300
gcccactgta acttcagcga gatcaccgtg ttcgtgaccc actgttacag cagcggcaca 360
ggaagctgtc ccatcacagg catgatcgcc agagatcaca tcagaatcag cgccatgaag 420
aacggcagcc tgttctacaa cctgaccgtg agcgtgagca agtacagcag cttcaagagc 480
ttccagtgcg tgaacaactt caccagcgtg tacctgaacg gcgatctggt gttcaccagc 540
aacaagacca ccgatgtgac aagcgctggc gtgtatttta aggctggcgg cccagtgaat 600
tacagcgtga tgaaggagtt caaggtgctg gcctacttcg ttaatggcac cgcccaagat 660
gtgatcctgt gcgataacag ccccaaggga ctgctggctt gccaatacaa caccggcaac 720
ttcagcgatg gcttctaccc cttcaccaac agcaccctgg tgagagataa gttcatcgtg 780
tacagagaga gcagcgtgaa cacaaccctg accctgacca acttcacctt caccaacgtg 840
tctaccgccc agccaaattc tggaggcgtg agcacattcc atctgtacca gacccagaca 900
gctcagagcg gctactacaa cttcaacctg agcttcctga gccagttcgt gtacaaggcc 960
agcgatttca tgtacggcag ctaccacccc agatgcagct ttagacccga gacaatcaat 1020
agcggcctgt ggttcaatag cctgagcgtg agcctgacat atggacctct gcagggcgga 1080
tgtaaacaga gcgtgttcag cggcaaagcc acctgttgct acgcctacag ctacaatggc 1140
cccagagcct gtaaaggagt gtacagcggc gaactgagca agaccttcga atgcggcctg 1200
ctggtgtatg tgaccaagag cgatggcagc agaatccaga ccagaaccga gccactggtg 1260
ctgatgcagc acaactacaa caacatcacc ctggataagt gcgtggccta caacatctac 1320
ggcagagtgg gccaaggctt catcaccaac gtgaccgata gcgccgccaa ctttagctac 1380
ctggccgatg gaggactggc catcctggat acaagcggcg ccatcgatgt gtttgtggtg 1440
cagggcagct atggcctgaa ctactacaag gtgaacccct gcgaggatgt gaaccagcag 1500
ttcgttgtga gcggcggcaa tattgtgggc atcctgacca gcagaaacga aaccggaagc 1560
gagcaagtgg agaaccagtt ctacgtgaag ctgaccaaca gcagccacag aagaagaaga 1620
agcatcggcc agaacgtgac cagctgcagc tatgtgagct acggcagatt ctgcatcgaa 1680
cccgatggca gcctgaaact gattgtgccc gaggagctga aacaattcgt ggcccccctg 1740
ctgaatatta ccgagagcgt gctgatcccc aacagcttca acctgaccgt gaccgatgag 1800
tacatccaga ccagaatgga taaggtgcag atcaactgcc tgcagtacgt gtgcggaaac 1860
agcctggagt gcagaaagct gttccagcag tatggccccg tgtgcgataa tatcctgagc 1920
gtggtgaata gcgtgggcca gaaggaggat atggagctgc tgagcttcta cagcagcacc 1980
aaacccgccg gatataatgc tcccgtgttc agcaatatca gcaccggcga tttcaacatc 2040
agcctgctgt tgaccccccc atctagccca tctggaagaa gcttcatcga ggatctgctg 2100
ttcaccagcg tggaaacagt gggcctgcca acagatgccg agtacaagaa gtgtaccgct 2160
ggacccctgg gaacactgaa ggatctgatc tgcgccagag agtacaacgg actgttggtg 2220
ctgcccccaa ttatcacagc cgatatgcag accatgtaca ccgctagcct ggttggagct 2280
atggcctttg gcggaattac agctgccgga gccattccat tcgccaccca gattcaggcc 2340
agaatcaacc acctgggcat cacacagagc ctgctgctga agaaccagga gaagatcgcc 2400
gccagcttca acaaagccat cggccatatg caggagggct tcagatctac cagcctggct 2460
ctgcagcagg tgcaagatgt ggtgaacaag cagagcgcca tcctgaccga gacaatgaac 2520
agcctgaaca agaacttcgg cgccatcagc agcgtgatcc aggatatcta cgcccagctg 2580
gatgccattc aagccgatgc ccaggtggat agactgatca ccggcagact gagcagcttg 2640
agcgtgttgg ctagcgctaa gcacagcgag tacatcagag tgagccagca gagagaactg 2700
gccacccaga agatcaacga gtgcgtgaag agccagagca acagatacgg cttctgcggc 2760
tctggaagac acgtgctgag cattccccaa aatgccccca acggcatcgt gttcatccac 2820
ttcagctaca cccccgagag cttcgttaat gtgaccgcca tcgtgggctt ttgtgtgcaa 2880
ccagccaacg ctagccagta tgccatcgtg cccgtgaatg gcagaggcat cttcatccag 2940
gtgaacggca gctactacat caccgccaga gatatgtaca tgcccagaga tatcaccgcc 3000
ggcgatatcg ttacactgac cagctgccaa gccaactacg tgaacgtgaa caagaccgtg 3060
atcaccacct tcgtggagga tgatgatttc gatttcgatg atgagctgag caagtggtgg 3120
aacgatacca agcacgagct gcccgatttc gatgatttca actacaccgt gcccatcctg 3180
aacatcagcg gcgagatcga tcatatccag ggcgtgatcc agggactgaa cgatagcctg 3240
atcaacctgg aggagctgag catcctgaag acctacatca agtggccctg gtacgtgtgg 3300
ttggctatcg gcttcgccat catcatcttc atcctgatcc tgggctgggt gttctttatg 3360
accggctgct gcggctgttg ttgtggctgc tttggcatca tccccctgat gagcaagtgc 3420
ggcaagaaga gcagctacta caccaccttc gataacgatg tggtgaccga gcagtacaga 3480
cccaagaaga gcgtgtaa 3498
<210> 21
<211> 3456
<212> DNA
<213> SFTM
<400> 21
atgttgggga agtcactgtt tttagtgacc attttgtgtg cactatgtag tgcaaatttg 60
tttgattctg ccaataatta tgtgtactac taccaaagtg cctttaggcc tccaaatgga 120
tggcatctgc aagggggtgc ttatgcagta gtgaattcta ctaattatac tagtaatgcc 180
ggttctgcaa gtgagtgcac tgttggtgtt attaaggacg tctataatca aagtgcggct 240
tccatagcta tgacagcacc tcctcagggt atggcttggt ctaagtcaca gttttgtagt 300
gcacactgta acttttctga aattacagtc tttgtcacac attgttatag tagtggtaca 360
gggtcttgtc ctataacagg catgattgca cgtgatcata ttcgtatttc cgcaatgaaa 420
aatggttctt tattttataa tttaacagtt agcgtatcta aatactctag ttttaagtct 480
tttcaatgtg ttaacaactt cacatctgtt tatttaaatg gtgatcttgt ttttacttcc 540
aataaaacta ctgatgttac gtcagcaggt gtgtatttta aagcaggtgg acctgtaaat 600
tatagtgtta tgaaagaatt taaggttctt gcttactttg ttaatggtac agcacaagat 660
gtaattttgt gtgacaattc ccctaagggt ttgctagcct gtcaatataa cactggcaat 720
ttttcagacg gcttctatcc ttttactaat agtactttag ttagggacaa gttcattgtc 780
tatcgtgaaa gtagtgttaa tactactttg acgttaacta atttcacttt tactaatgta 840
agtactgcac agcctaatag tggtggtgtt agtacttttc atttatatca aacacaaaca 900
gctcagagtg gttattataa ttttaatttg tcatttctga gtcagtttgt gtataaggca 960
agtgatttta tgtatgggtc ttatcaccct aggtgttctt ttagaccaga aaccattaat 1020
agtggtttat ggtttaattc cttgtcagtt tctcttactt atggacccct acagggaggg 1080
tgtaagcaat ctgtttttag tggtaaggca acgtgttgtt atgcctactc ttataatggc 1140
ccaagggcat gtaaaggtgt ttattcaggt gaattaagca agacttttga atgtggattg 1200
ctggtttatg ttactaagag tgatggctct cgtatacaga ctagaacgga gcccttagta 1260
ttaatgcaac acaattataa taatattact ttagataagt gtgttgccta taatatatat 1320
ggcagagtgg gccaaggttt tattactaat gtgactgatt ctgctgctaa ttttagttat 1380
ttagcagatg gtgggttagc tattttagac acttcgggtg ccatagatgt ttttgttgta 1440
cagggcagct atggtcttaa ttattacaag gtcaatcctt gtgaagatgt taaccaacag 1500
tttgtagtgt ctggtggcaa tatagttggc attcttactt ctagaaatga aacaggttct 1560
gaacaggttg agaaccagtt ttatgttaag ttaaccaata gctcacatcg tcgtaggcgt 1620
tctattggcc aaaatgtaac aagttgttct tatgttagtt atggcagatt ttgtattgaa 1680
ccagatggtt cgttaaagct gatagtgcca gaagaattga agcagtttgt ggcaccttta 1740
cttaatatta ctgaaagtgt actcatacct aacagtttta atttgactgt tacagatgag 1800
tacatacaaa cacgtatgga taaggtccaa atcaattgcc ttcaatatgt ttgcggcaat 1860
tctttggagt gtagaaaatt gtttcaacaa tatggtccgg tttgtgataa catattgtct 1920
gttgtaaata gtgttggtca aaaagaagat atggaacttt taagtttcta ttcttctact 1980
aaaccagctg gttataatgc acctgtcttt agtaatatta gtactggtga ttttaatatt 2040
tctcttttat taacaccacc tagcagtcct agcggtcgtt cttttataga agatttgtta 2100
tttacaagtg ttgaaacagt tggtttgcca actgatgctg aatataaaaa atgcacagca 2160
ggacctttag gtactcttaa ggatcttatc tgtgctaggg aatataatgg tttattagtg 2220
ttgcctccaa ttattacggc ggatatgcaa acaatgtata ctgcttcttt agttggtgcc 2280
atggcttttg gtggtattac agcagcaggt gccataccat ttgcaactca gatacaagcc 2340
agaattaatc atttgggtat tacacagtct ctgttattga aaaatcaaga gaaaattgca 2400
gcttccttta ataaggccat tggtcatatg caggaaggtt ttagaagcac ttcgctagca 2460
ttacaacagg ttcaagacgt tgttaataag cagagtgcta ttcttactga aactatgaat 2520
tctcttaata agaattttgg tgctatttca tcagtaattc aagacattta tgcgcaactt 2580
gatgcaattc aagcagatgc acaagttgac cgtcttatta ctggcagact ctcttctctc 2640
tcagtgctag cctctgctaa gcattctgag tacatcagag tttcccaaca acgtgaatta 2700
gccactcaaa aaattaatga gtgtgttaaa tcacaatcta ataggtatgg tttttgtggt 2760
agtggaagac atgttctttc gataccacaa aatgcaccta atggtatagt gtttatacac 2820
tttagttaca ctccagagag ttttgttaat gttactgcaa tagtaggttt ttgtgtacag 2880
cctgctaatg ctagtcagta tgcaatagtg cctgttaatg gtagaggtat ttttatacaa 2940
gttaatggta gttactatat cactgcacgt gatatgtata tgcctagaga cattactgca 3000
ggagatatag ttactcttac ttcttgtcaa gcaaattatg ttaatgtaaa taaaaccgtc 3060
attactacat ttgtggaaga tgacgatttt gattttgatg atgagttgtc gaaatggtgg 3120
aatgatacta agcatgagct accagacttt gacgacttca attatacagt acccatactt 3180
aatattagtg gtgaaattga tcatattcaa ggtgttatac agggtcttaa tgactccctt 3240
ataaaccttg aagaactttc aatacttaaa acttatatta agtggccttg gtatctcatt 3300
acctatattg ttctaactgt catttctcta gttttcggtg cacttagtct gggtttagcg 3360
tgttacctga tgtacaaaca gaaggcacaa caaaagacct tgctatggct tgggaataat 3420
gcccttgatc agatgaaagc cactgcaaga gcatga 3456
<210> 22
<211> 10
<212> DNA
<213> P基因的终止序列
<400> 22
taagaaaaaa 10
<210> 23
<211> 10
<212> DNA
<213> M基因的起始序列
<400> 23
acgggtagaa 10
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> OPS-R
<400> 24
aaatgtagct agtttaaact ttacacgctc ttcttgggtc tgtactgctc ggtcaccaca 60
<210> 25
<211> 1662
<212> DNA
<213> NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因的CDS
<400> 25
atgggctcca aaccttctac caggatccca gcacctctga tgctggtcac ccggattatg 60
ctgatattgg gctgtattcg ttcgacaagc tcccttgatg gcaggcctct tgcagctgca 120
ggaattgtag taacaggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180
atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agggataagg aggcgtgtgc gaaagcccca 240
ttagaggcat ataacagaac actgactact ttgctcactc ctcttggcga ctccatccgc 300
aagattcaag ggtctgtgtc cacgtctgga ggagggagac aggggcgcct tataggtgct 360
gttattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420
ctaatacaag ccaacaagaa tgctgccaac atccttcggc ttaaggagag cattgctgca 480
accaatgaag ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540
aagatgcagc agtttgtcaa tgaccagttt aataatacgg cgcgagaatt ggactgtata 600
aaaatcacac aacaggttgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta 660
ttcgggccac agatcacctc tcctgcatta actcagctga ccatccaggc actttataat 720
ttagctggtg gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtatagggaa caatcaactc 780
agctcattaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta tactgtatga ctcacagact 840
caactcttgg gcatacaagt gaatttgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900
acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc acttgtcccg 960
aaagtagtga cacaagtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020
tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttat 1080
tcctgtttga gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcact 1140
acgccgtata tggcccttaa aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacatgtaga 1200
tgtacagacc ctcctggcat catatcgcaa aattatggag aagctgtatc cctgatagat 1260
agacattcgt gcaatgtctt atcattagac gggataactc tgaggctcag cggagaattt 1320
gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ctagattctc aagtcatcgt gacaggcaat 1380
cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggataag 1440
ttggcagaaa gcaacagtaa gctagaaaaa gtcaatgtca gattaaccag cacatctgct 1500
ctcattacct atattgttct aactgtcatt tctctagttt tcggtgcact tagtctgggt 1560
ttagcgtgtt acctgatgta caaacagaag gcacaacaaa agaccttgct atggcttggg 1620
aataatgccc ttgatcagat gaaagccact gcaagagcat ga 1662
<210> 26
<211> 1716
<212> DNA
<213> NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因的CDS
<400> 26
atggaccgcg cggttaacag agtcgtgctg gagaatgagg aaagagaagc aaagaacaca 60
tggcgcctgg ttttccggat cgcagtctta cttttaatgg taatgactct agctatctcc 120
gcagctgccc tggcatacag tatggaggcc agtacgccgc acgatcttgc aggcatatcg 180
actgtgatct ctaagacaga agataaggtt acgtctttac tcagttcgag tcaagatgtg 240
atagatagga tatacaagca ggtggctctt gaatccccgc tggcgctact aaacactgaa 300
tctacaatta tgaatgcaat aacctctctt tcttatcaaa ttaacggggc tgcgaacaat 360
agcggatgtg gggcgcctgt tcatgaccca gattatatcg gggggatagg caaagaactc 420
atagtggacg acatcagtga tgtcacatca ttttatcctt ctgcatatca agaacacctg 480
aatttcatcc cggcgcctac tacaggatcc ggttgcactc ggataccctc atttgacatg 540
agcaccaccc attattgtta tactcacaat gtaatactat ccggttgcag agatcactca 600
cactcacatc aatacttagc gcttggtgtg cttcggacat ctgcaacagg gagggtattc 660
ttctctactc tgcgctccat caatttagat gatacccaaa atcggaagtc ctgcagtgtg 720
agtgcaaccc ctttaggttg tgatatgctg tgctctaagg tcacagggac tgaagaggag 780
gattacaagt cagctgcccc aacatcaatg gtgcacggaa ggctagggtt tgacggtcaa 840
taccatgaga aggacttaga caccacggtc ttatttaagg attgggtggc aaattaccca 900
ggagtgggag gagggtcttt tattgacgac cgtgtatggt tcccagttta cggagggctc 960
aaacccaatt cacccagtga cactgcacaa gaagggaaat atgtaatata caagcgccat 1020
aacaacacat gccccgatgg acaagattac caaattcgga tggctaagtc ttcatataaa 1080
cccgggcgat ttggtggaaa gcgcgtacag caagccatat tatccatcaa agtgtcaaca 1140
tccttgggta aggacccggt gctgactatt ccacctaata caatcacact catgggagcc 1200
gaaggcagaa tcctcacagt agggacatct cacttcttgt accaacgagg gtcttcatat 1260
ttctcccctg ccttattata tcccatgaca gtaaataaca aaacggctac actccatagt 1320
ccttatacgt ttaatgcttt cactcggcca ggtagtgtcc cttgccaggc atcagcaaga 1380
tgccccaact catgcatcac tggggtctat actgatccat atcccttaat cttctatagg 1440
aatcatactc tacgaggggt ctttgggacg atgcttgatg atgaacaagc gagacttaac 1500
cccgtatctg cagtattcga caacatatcc cgcagtcgtg tcacccgggt gagttcaagc 1560
agcaccaagg cagcatacac gacatcgaca tgttttaaag ttgtcaagac caataaagct 1620
tattgtctta gtattgcaga gatatccaat accctattcg gggaatttag gatcgttccc 1680
ttattagttg agatcctcaa ggatgataga gtttaa 1716

Claims (7)

1.一种表达鸡传染性支气管炎病毒S蛋白的重组新城疫病毒，其特征在于，所述重组新城疫病毒是同时表达基因VII型新城疫病毒F蛋白、HN蛋白和传染性支气管炎病毒GI-19基因型毒株纤突蛋白的疫苗株，命名为rLa-FHN-OPSFTM，保藏号是：CGMCC NO. 20131；
所述表达基因VII型新城疫病毒F蛋白：基因II型新城疫病毒La Sota株全长cDNA中F基因的CDS替换NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因的CDS，所述NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因的CDS序列如SEQ ID NO:25所示；利用定点突变技术将NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株的F基因裂解位点的编码序列突变为La Sota毒株的F基因裂解位点的编码序列，所述La Sota毒株的F基因裂解位点的编码序列如SEQ ID NO:1所示；
所述表达HN蛋白：将重组新城疫病毒中HN基因的CDS替换为NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因的CDS，所述NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因的CDS如SEQ ID NO:26所示；
所述表达传染性支气管炎病毒GI-19基因型毒株纤突蛋白：将含有IBV ck/CH/LDL/091022毒株的S蛋白膜外区的1-3294nt序列与NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因中1501-1662nt通过基因合成构建一个长度为3456nt的嵌合片段OPSFTM，将含有OPSFTM序列插入基因II型新城疫病毒La Sota株全长cDNA的P和M基因之间得到的序列如SEQ ID NO:14所示。
2.权利要求1所述的重组新城疫病毒在制备预防新城疫和传染性支气管炎的二价疫苗中的应用。
3.权利要求1所述的重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于，所述构建方法的具体步骤如下：
步骤1：构建表达基因VII型新城疫病毒F和HN蛋白的重组病毒载体：
1）构建重组质粒pNDFL-rF：根据含有基因II型新城疫病毒La Sota株全长cDNA的质粒pNDFL序列以及基因VII型NDV毒株CK/CH/HLJ/1/06的基因组序列，通过同源重组的方法将质粒pNDFL中位于6489-8150nt的F基因的CDS替换NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因的CDS，构建获得质粒pNDFL-rF；所述NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因的CDS序列如SEQ ID NO:25所示；
2）构建重组质粒pNDFL-mF：在质粒pNDFL-rF基础上，利用定点突变技术将NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株的F基因裂解位点的编码序列突变为La Sota毒株的F基因裂解位点的编码序列，构建获得质粒pNDFL-mF；所述La Sota毒株的F基因裂解位点的编码序列如SEQ ID NO:1所示；
3）构建获得重组质粒pNDFL-mFHN：在质粒pNDFL-mF基础上，通过同源重组的方法将pNDFL-mF中位于8357-10090nt的HN基因的CDS替换为NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因的CDS，构建获得质粒pNDFL-mFHN；所述NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因的CDS如SEQ ID NO:26所示；
步骤2：构建含有GI-19基因型传染性支气管炎病毒S基因的重组病毒载体pNDFL-mFHN-OPSFTM：在构建的质粒pNDFL-mFHN基础上，将含有IBV ck/CH/LDL/091022毒株的S蛋白膜外区的1-3294nt序列与NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因中1501-1662nt通过基因合成构建一个长度为3456nt的嵌合片段OPSFTM，将含有OPSFTM序列插入pNDFL-mFHN质粒中P和M基因之间，构建获得质粒pNDFL-mFHN-OPSFTM；所述OPSFTM的序列如SEQ ID NO:14所示；
步骤3：拯救病毒：pNDFL-mFHN-OPSFTM与编码La Sota毒株NP、P和L蛋白的辅助质粒pCI-NP-K、pCI-P-K和pCI-L-K共同转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR T7/5细胞，获得了重组新城疫病毒rLa-FHN-OPSFTM。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤1中的1）所述构建重组质粒pNDFL-rF的具体方法为：
（1）引物rF-1和引物rF-2以pNDFL质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得pNDFL质粒中5155-6488nt，末端带有NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因CDS的1-30nt，得到片段1；
（2）提取NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株的RNA用引物rF-3进行反转录获得cDNA，引物rF-3和引物rF-4以上述cNDA为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得含有pNDFL质粒中6459-6488nt、NDVCK/CH/HLJ/1/06毒株F基因完整CDS序列以及pNDFL质粒中8151-8180nt的片段，得到片段2；
（3）引物rF-5和引物rF-6以pNDFL质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得含有NDV CK/CH/HLJ/1/06 F CDS中1633-1662nt以及pNDFL质粒中8151-10812nt的片段，得到片段3；
（4）回收步骤（1）-步骤（3）中的三个片段用KOD酶进行融合PCR并回收5657nt的片段；同时用Pme I和Bsi WI内切酶对pNDFL质粒进行酶切，回收11932nt的载体片段；将回收后的融合PCR产物与Pme I和Bsi WI酶切后的pNDFL质粒用In-fusion试剂盒连接转化至DH5α感受态细胞中，挑取单个克隆提取质粒进行测序鉴定，获得F基因CDS替换为NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株F基因CDS的重组质粒pNDFL-rF。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤1中的2）所述构建重组质粒pNDFL-mF的具体步骤为：
（1）引物rF-1和引物mF-1以pNDFL-rF质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得pNDFL-rF质粒中5155-6860nt，其中6822-6839nt突变为La Sota裂解位点GGGAGACAGGGGCGCCTT，得到片段1；
（2）引物mF-2和引物rF-6以pNDFL-rF质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得pNDFL-rF质粒中6801nt-10812nt，得到片段2；
（3）回收步骤（1）和步骤（2）中二个片段用KOD酶进行融合PCR并回收5657nt的片段；同时用Pme I和Bsi WI内切酶对pNDFL-rF质粒进行酶切，回收11932nt的载体片段；将回收后的融合PCR产物与Pme I和Bsi WI酶切后的pNDFL-rF质粒用In-fusion试剂盒连接转化至DH5α感受态细胞中，挑取单个克隆提取质粒进行测序鉴定，获得F基因裂解位点编码序列突变为La Sota裂解位点编码序列的重组质粒pNDFL-mF。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤1中的3）所述构建获得重组质粒pNDFL-mFHN的具体步骤为：
（1）引物rF-1和引物rHN-1以pNDFL-mF质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得pNDFL质粒中5155-8356nt，末端带有NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因CDS的1-30nt，得到片段1；
（2）提取NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株的RNA用引物rHN-2进行反转录获得cDNA，rHN-2和引物rHN-3以该cNDA为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得含有pNDFL-mF质粒中8327-8356nt、NDVCK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因完整CDS序列以及pNDFL-mF质粒中10091-10120nt的片段，得到片段2；
（3）引物rHN-4和引物rF-6以pNDFL质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得含有NDV CK/CH/HLJ/1/06 HN CDS中1687-1716nt以及pNDFL-mF质粒中10091-10812nt的片段，得到片段3；
（4）回收步骤（1）-步骤（3）中三个片段用KOD酶进行融合PCR并回收5639nt的片段；同时用Pme I和Bsi WI内切酶对pNDFL-mF质粒进行酶切，回收11932nt的载体片段；将回收后的融合PCR产物与Pme I和Bsi WI酶切后的pNDFL-mF质粒用In-fusion试剂盒连接转化至DH5α感受态细胞中，挑取单个克隆提取质粒进行测序鉴定，获得HN基因CDS替换为NDV CK/CH/HLJ/1/06毒株HN基因CDS的重组质粒pNDFL-mFHN。
7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤2所述构建重组病毒载体pNDFL-mFHN-OPSFTM的具体步骤为：
（1）引物OPS-F和引物S-FTM-R以pMD18-T-OPSFTM质粒为模板，用KOD酶通过PCR扩增获得带有P基因的终止序列为TAAGAAAAAA、P和M基因之间的间隔序列为T、M基因的起始序列为ACGGGTAGAA和kozak序列为GCCACC的OPSFTM的转录盒；
（2）用Pme I内切酶对pNDFL-mFHN质粒进行酶切，回收17542nt的载体片段；将（1）中扩增获得的转录盒与（2）中Pme I酶切后的pNDFL-mFHN质粒用In-fusion试剂盒连接转化至DH5α感受态细胞中，挑取单个克隆提取质粒进行测序鉴定，获得含有密码子优化的GI-19型IBV ck/CH/LDL/091022毒株S基因膜外区的重组质粒pNDFL-mFHN-OPSFTM。
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