CN110846287B - 一种基因vii型新城疫病毒弱毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种自然分离的基因VII型新城疫病毒弱毒株，该毒株未进行任何基因改造，保持了该病毒作为流行毒株所具备的天然的免疫原性。本发明所提供的基因VII型弱毒株，其保藏号为：V201968。本发明分离的基因VII型新城疫病毒弱毒株NDV‑VII用于制备疫苗。本发明毒株是自然分离得到的，该毒株对鸡胚最小致死量的平均致死时间为138h，1日龄雏鸡脑内接种致病指数为0.16，6周龄鸡静脉接种致病指数为0，本发明毒株具有稳定遗传性，在鸡胚上连续传代15代，其F基因并未发生致病力增强的突变。传统疫苗株LaSota株免疫保护效力比对试验证明，本发明毒株制备活疫苗免疫后抗体产生水平高于对照组，免疫后攻毒实验证明该毒株能够对鸡只提供完全保护。

Description

一种基因VII型新城疫病毒弱毒株及其应用

技术领域

本发明涉及兽医病毒分子生物学与免疫学领域，具体涉及一株基因VII型新城疫病毒弱毒株。

技术背景

新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的一种高度接触性、急性烈性传染病，对世界养禽业危害严重，曾被国际兽疫局(OIE)列为A类病。该病毒基因组为单股负链RNA，宿主范围广，其中以鸡的易感性最高，且幼龄鸡的发病率和死亡率明显高于成年鸡，该病一年四季均可流行。

NDV只有一个血清型，利用F基因进行遗传进化分析，可分为Class I和Class Ⅱ两大类群，Class I类群分为18个基因型，几乎包含所有强毒株及广泛流行毒株。中国动物卫生与流行病学中心吴延功等人对我国2010年以前分离的535株禽源NDV进行流行病学调查分析，发现我国鸡群流行NDV基因型主要为基因VII型。2013年刘华雷等人对全国20省共8510份家禽样品进行流行病学调查发现，我国NDV流行毒株主要为基因VII型。吉林大学薛聪等对2013-2017年东北地区禽源NDV分离株基因分析，NDV主要流行毒株基因型为基因VII型。此外中国周边的韩国和日本流行的NDV也大都为基因VII型。综上所述，有效防控基因VII型NDV的流行对我国ND的净化及活禽市场健康发展具有重要意义。

疫苗是防控传染病最经济有效的手段，自ND流行以来，最初使用灭活疫苗，但该种疫苗存在生产成本高，粘膜免疫及细胞免疫效果差等局限，随着越来越多弱毒株的分离，活疫苗所占份额持续增加。当前我国对ND防控主要使用的LaSota株等多为基因II型毒株，与基因VII型毒株遗传距离较大，抗原交叉保护力较低，不能对新城疫病毒基因VII型流行株提供完全有效的保护。由于绝大多数分离到的基因VII型NDV流行毒株均为强毒株，虽然能够迅速产生抗体，但是免疫鸡易产生食欲不振、产蛋下降、带毒散毒等不良反应，对生态环境造成危害，因此强毒并不适合制备疫苗，因此获得基因VII型弱毒株是疫苗制备的关键。而且当前获得弱毒株的手段主要是通过反向遗传技术对强毒株进行改造，获得的重组毒经过基因改造，有毒力返强的风险，且毒力很难完全致弱。而自然弱毒株是病毒在长期的自然演化过程中形成的，遗传稳定性好，克服了人工改造毒株毒力易返强的缺点，应用前景更好。

发明内容

本发明的目的是提供一种自然分离的基因VII型新城疫病毒弱毒株，该毒株未进行任何基因改造，保持了该病毒作为流行毒株所具备的天然的免疫原性，能用于制备基因VII型新城疫病毒疫苗，为我国提供可靠的基因VII型弱毒活疫苗候选疫苗。

本发明提供一种自然分离到的基因VII型新城疫病毒NDV-VII株，于2019年10月15日保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:V201968。

本发明分离的基因VII型新城疫病毒弱毒株NDV-VII用于制备疫苗；

所述的疫苗，优选为活疫苗。

本发明再一个方面提供一种疫苗，其中抗原为上述的基因VII型新城疫病毒弱毒株NDV-VII株。

本发明还提供NDV-VII株的F基因，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2,一种编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1,

本发明还提供NDV-VII株的全基因组，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明毒株是自然分离得到的，该毒株对鸡胚最小致死量的平均致死时间(MDT)为138h，1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为0.16，6周龄鸡翅静脉接种致病指数(IVPI)为0，本发明毒株具有稳定遗传性，在鸡胚上连续传代15代，其F基因并未发生致病力增强的突变。传统疫苗株LaSota株免疫保护效力比对试验证明，本发明毒株制备活疫苗免疫后抗体产生水平高于对照组，免疫后攻毒实验证明该毒株能够对鸡只提供完全保护。

附图说明

图1：NDV-VII株F片段PCR鉴定结果；

图2：NDV-VII株全基因组9个片段PCR扩增电泳图；

图3：对F片段构建的系统发育树。

具体实施方式

本发明所涉及生物材料：LaSota活疫苗由青岛易邦生物工程有限公司提供；基因NVII型强毒株JS06/02株由本公司保存；H5、H7、H9亚型AI及ND标准阳性血清均购自中国兽医药品监察所。

实施例1.NDV弱毒株的筛选及MDT、ICPI、IVPI的测定

2019年4月份从山东某地区临床送检鸡病料中分离到一株疑似NDV毒株，命名为NDV-VII株。接种鸡胚收取尿囊液，测定HA效价。连续传代20代，HA效价测定结果显示，该株病毒鸡胚尿囊液的HA效价在鸡胚中传代4代后稳定在9log2。收获的尿囊液进行微量血凝抑制试验(HI)，结果表明，尿囊液样品只与NDV标准阳性血清反应，与H5、H7、H9阳性血清反应阴性。

MDT是指最小致死量所能使鸡胚死亡的平均时间，MDT低于60h为强毒力NDV毒株；MDT值在60h-90h之间为中等毒力毒株；MDT大于90h为弱毒株。用无菌生理盐水将新鲜收获的含毒尿囊液作10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-8和10^-9共4个稀释度，分别接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每胚尿囊腔内注射0.1mL。连续观察7日，每天上午和下午各照胚一次，记录每一鸡胚的死亡时间，连续观察7日(结果见表1)。MDT计算公式为：

1日龄SPF雏鸡脑内致病指数(ICPI)测定试验：取1日龄SPF雏鸡10只，各脑内注射10^-1稀释的新鲜含毒尿囊液0.05mL。以同样方法注射相同剂量的无菌生理盐水作为对照，每组5只。接种后，连续观察8日，每日在相应接种的时间观察，记录雏鸡的情况，分正常(活动灵活，行动无共济失调现象)、发病(包括麻痹、卧地不起，但不包括只表现迟钝的鸡)和死亡，结果见表2。

6周SPF龄雏鸡静脉接种致病指数(IVPI)测定试验：PBS 10倍稀释新鲜感染尿囊液，取6周龄SPF小鸡10只，各翅静脉接种0.1mL。以同样方法注射相同剂量的无菌生理盐水作为对照，每组5只。接种后，连续观察10日，每日在相应接种的时间观察，记录雏鸡的情况，分正常(活动灵活，行动无共济失调现象)、发病(包括瘫痪、卧地不起，但不包括只表现迟钝的鸡)和死亡，结果见表3。

表1：NDV-VII株MDT的测定

表2：NDV NDV-VII株ICPI的测定

表3：NDV NDV-VII株IVPI测定

表1～表3显示，NDV-VII株的MDT为138h，ICPI为0.16，IVPI为0，符合NDV弱毒特征，证明本次分离到的NDV-VII株为弱毒株。

对本次筛选获得的基因VII型弱毒株NDV-VII株，于2019年10月15日保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:V201968。

实施例2：NDV-Ⅶ弱毒株F基因鉴定及进化树分析

根据NCBI公布的NDV的F基因序列设计引物，上游引物：NDV F-F：ATGGGCTCCAAACCTTCTACCAG；下游引物：NDV F-R：AAACTGCTGCATCTTCCCAACCG，进行NDV F片段扩增鉴定，目的片段约550bp。取鸡胚传代收获的尿囊液200uL按常规方法提取RNA，反转录，F片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。核酸电泳后，切取阳性条带，回收，连接T载体测序。取F基因47nt-420nt之间的序列绘制基因进化树，结果如图2。

结果显示，该分离株NDV-VII株属于ClassⅡ亚群，基因Ⅶ型新城疫毒株，与近年我国多地流行株处于同一进化分支，同属于Ⅶd亚型。

实施例3：NDV NDV-VII株全基因组序列的测定

根据NCBI公布的NDV基因序列，设计9对引物，相邻扩增片段之间有部分核酸序列相互重叠。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表4。

表4：扩增NDV NDV-VII株全基因组的引物序列

常规柱提法提取病毒RNA，随机引物进行反转录，用上述引物进行PCR扩增，全基因组电泳扩增结果见图3。将目的片段切胶回收后连接PMD 19-T载体，转化测序，序列在NCBI网站比对，用Lasergene软件拼接，获得NDV-VII株全基因序列(SEQ ID NO:3)。F基因全长1662bp，裂解位点处氨基酸序列为¹¹²G-R-Q-G-R-L¹¹⁷，符合弱毒株裂解位点特征。

根据序列可知，NDV-VII株基因组全长15186bp，与常规分离的基因Ⅶ型NDV基因组全长(15192bp)不一致，推测NDV-VII株在临床长期的流行过程中发生过重组，并最终稳定遗传。该病毒F基因裂解位点处氨基酸特征与毒力有密切的关系，根据全基因组序列可知，该毒株F基因裂解位点处氨基酸序列为¹¹²G-R-Q-G-R-L¹¹⁷，符合弱毒株裂解位点的普遍特征，说明该分离株NDV-VII具有弱毒的特征。

实施例4：NDV-VII株鸡胚传代稳定性试验

将NDV-VII株通过鸡胚进行连续传代试验，每隔5代测定病毒MDT及ICPI，并测定F基因、分析裂解位点氨基酸序列，传至20代。结果发现，经过连续20代鸡胚传代，该毒株MDT始终大于120h，F基因裂解位点氨基酸序列并无突变，证明该毒株虽然可能是自然重组毒株，但遗传性能稳定，适合作为疫苗株候选株(表5)。

表5：NDV-VII株MDT及F基因裂解位点

实施例5：NDV-VII株保存期稳定性试验

将收获的传代20代NDV-VII株新鲜病毒尿囊液(EID₅₀为10^9.17/0.1mL)等量分成若干份置于-80℃保存，分别于保存期内1天、7天、14天、28天、2月、4月、6月取出，4℃溶化后测定HA效价，并同时接种9-11日龄SPF鸡胚，0.1mL/枚，37℃培养至120h，收取尿囊液测定HA效价，检验病毒的保存稳定性。

结果显示，病毒尿囊液保存至-80℃条件下6个月，HA并无显著性下降，第21代收获的尿囊液HA无明显下降，说明该代次病毒在-80℃条件下较为稳定，至少能够保存6个月(表6)。

表6：NDV-VII株保存期内HA测定结果

实施例6：NDV-VII株活疫苗的制备及安全性试验、无菌检验

用5％蔗糖脱脂乳1:1加入至稀释的尿囊液中，定量稀释后的病毒含量为10^7.0EID₅₀/0.1mL，充分混匀后冻干制备活疫苗。制备的活疫苗按2010年版《中国兽药典》附录进行无菌检验，结果符合标准，无细菌污染。

用1～3日龄SPF鸡10只，PBS对照组5只，每只免疫10^7.0EID₅₀，免疫方式为滴鼻点眼，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床表现。结果显示，免疫后鸡只没有出现精神沉郁、食欲不振、嗜睡麻痹及全身不良反应，鸡只健康，证明制备的NDV-VII活疫苗安全。

取制备的NDV-VII株冻干活疫苗，按2010年版《中国兽药典》附录进行无菌检验，结果符合标准，无细菌污染。

实施例7、NDV-VII株活疫苗免疫效果评价

用21日龄SPF鸡30只，随机分为3组，每组10只，一组为NDV-VII株冻干活疫苗组，一组为LaSota株活疫苗组，以及PBS对照组10只，滴鼻点眼免疫，0.1mL/只，免疫后每组隔离饲养，分别于免后14天、21天、28天采血，测定抗体。28天采血后，用基因VII型强毒株JS06/02株攻毒，攻毒方式为滴鼻点眼，剂量为10⁶EID₅₀/只，隔离器饲养，观察14天，每天记录鸡的发病和死亡情况；攻毒后第3天及第五天，分别采集各免疫组鸡的喉拭子和泄殖腔拭子接胚，检测排毒情况。

结果显示，免疫组免疫14天即可产生较高水平抗体，21天、28天抗体水平升高，结果见表7所示。免疫攻毒后，NDV-VII组、LaSota组均没有鸡只死亡，阴性对照组鸡全部死亡。排毒试验显示，NDV-VII组没有出现排毒，而LaSota免疫组在第五天在喉气管及泄殖腔均有排毒，见表8和表9所示。

表7：免疫后抗体效价测定表

表8：免疫效力实验结果表

表9:攻毒后第3天、5天病毒分离结果

综上所述，本发明所构建的NDV-VII株，具有良好的免疫原性，做成活疫苗免疫动物发现，该疫苗对鸡只安全，能够诱导产生较高的中和抗体，并且能够保护当前流行的基因VII型强毒株的攻击，产生理想的保护效果，有广阔的应用前景。

序列表

<110> 青岛易邦生物工程有限公司

<120> 一种基因VII型新城疫病毒弱毒株及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 1662

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggctcca aaccttctac caggatccca gcacctctaa tgctgatcac tcggattatg 60

ctgatattga gctgtatccg tctgacaagc tctcttgacg gcaggcccct tgcagctgca 120

ggaattgtag taacaggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180

atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agagataagg aggcatgtgc aaaagcccca 240

ttggaggcat ataacagaac actgactact ctgctcactc ctcttggcga ctccatccgc 300

aagatccaag ggtctgtgtc cacgtccgga ggagggagac aaggacgcct tataggtgct 360

gttattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420

ctaatacaag ccaaacagaa tgccgccaac atcctccggc ttaaggagag cattgctgca 480

accaatgaag ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540

aagatgcagc agtttgtcaa tgaccagtta aataatacgg cgcgagaatt ggactgtata 600

aaaatcacac aacaggtcgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta 660

ttcgggccac agatcacctc ccctgcatta actcagctga ccatccaggc actttataat 720

ttagctggtg gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtataggaaa caatcaactc 780

agctcattaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta tactgtatga ctcacatact 840

caactcttgg gcatacaagt aaatctgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900

acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc acttgtcccg 960

aaagtagtga cacaagtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020

tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttat 1080

tcctgtttga gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcact 1140

acgccgtata tggcccttag aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacatgcaga 1200

tgtacagacc ctcctggtat catatcgcaa aattacggag aagctgtatc cctgatagat 1260

agacattcat gcaatgtctt atcattagac ggaataactc tgaggctcag tggggaattt 1320

gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ttagattctc aagtcatcgt gacaggcaat 1380

cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggatagg 1440

ttggcagaaa gcaacagcaa gctagaaaaa gtcaatgtca gactaactag cacatctgct 1500

ctcattacct atattgttct aactgtcatt tccctaattt tcggtgcact tagtctggtt 1560

ttagcgtgtt acctgatgta caaacagaag gcacaacaga agaccttgct atggcttggg 1620

aataataccc tcgatcagat gagagccacc acaagagcat ga 1662

<210> 4

<211> 553

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Ser Lys Pro Ser Thr Arg Ile Pro Ala Pro Leu Met Leu Ile

1 5 10 15

Thr Arg Ile Met Leu Ile Leu Ser Cys Ile Arg Leu Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys

35 40 45

Ala Val Asn Val Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys

50 55 60

Leu Leu Pro Asn Met Pro Arg Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro

65 70 75 80

Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly

85 90 95

Asp Ser Ile Arg Lys Ile Gln Gly Ser Val Ser Thr Ser Gly Gly Gly

100 105 110

Arg Gln Gly Arg Leu Ile Gly Ala Val Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly

115 120 125

Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gln Ala

130 135 140

Lys Gln Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala

145 150 155 160

Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ser

165 170 175

Val Ala Val Gly Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Leu Asn Asn

180 185 190

Thr Ala Arg Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Thr Gln Gln Val Gly Val

195 200 205

Glu Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln

210 215 220

Ile Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn

225 230 235 240

Leu Ala Gly Gly Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Ile Gly

245 250 255

Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr Gly Tyr

260 265 270

Pro Ile Leu Tyr Asp Ser His Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Val Asn

275 280 285

Leu Pro Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu

290 295 300

Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Lys Gly Tyr Ala Ser Ala Leu Val Pro

305 310 315 320

Lys Val Val Thr Gln Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser

325 330 335

Tyr Cys Ile Glu Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr

340 345 350

Phe Pro Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr Ser

355 360 365

Ala Cys Met Tyr Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met

370 375 380

Ala Leu Arg Gly Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Ile Thr Thr Cys Arg

385 390 395 400

Cys Thr Asp Pro Pro Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val

405 410 415

Ser Leu Ile Asp Arg His Ser Cys Asn Val Leu Ser Leu Asp Gly Ile

420 425 430

Thr Leu Arg Leu Ser Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln Lys Asn Ile

435 440 445

Ser Ile Leu Asp Ser Gln Val Ile Val Thr Gly Asn Leu Asp Ile Ser

450 455 460

Thr Glu Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Arg

465 470 475 480

Leu Ala Glu Ser Asn Ser Lys Leu Glu Lys Val Asn Val Arg Leu Thr

485 490 495

Ser Thr Ser Ala Leu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Thr Val Ile Ser Leu

500 505 510

Ile Phe Gly Ala Leu Ser Leu Val Leu Ala Cys Tyr Leu Met Tyr Lys

515 520 525

Gln Lys Ala Gln Gln Lys Thr Leu Leu Trp Leu Gly Asn Asn Thr Leu

530 535 540

Asp Gln Met Arg Ala Thr Thr Arg Ala

545 550

<210> 2

<211> 15186

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accaaacaga gaatccgtaa ggtacgatag aaggcgaagg agcaatcgaa gtcgtacggg 60

tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg aagctcaaac tcgagagagc cttctgccaa 120

aatgtcttct gtattcgatg agtacgagca gctcctcgcg gctcagactc gccccaatgg 180

agctcatggc ggaggagaga aggggagcac cttaaaggta gaagtcccgg tattcactct 240

caacagtgat gacccagaag atagatggaa ctttgcagtg ttttgtcttc ggattgctgt 300

tagcgaggat gccaacaaac cacttaggca aggtgctctc atatctctct tatgttccca 360

ctctcaagtg atgaggaacc atgttgccct tgcggggaaa cagaatgagg ccacactggc 420

tgttcttgag atcgatggtt ttaccaacgg cgtgccccag ttcaacaaca ggagtggagt 480

gtctgaagag agagcacaga gatttatgat gatagcaggg tctctccctc gggcatgcag 540

caacggtacc ccgttcgtca cagctggggt tgaagatgat gcaccagaag acattactga 600

taccctggag aggatcctct ctatccaggc tcaagtatgg gtcacggtgg caaaggccat 660

gactgcatat gagacagcag atgagtcaga aacaagaaga atcaataagt acatgcagca 720

aggcagggtc cagaagaagt acatcctcca ccccgtatgc aggagcgcaa tccaactcac 780

aatcagacag tctctggcgg tccgcatctt tttggttagc gagcttaaga gaggccgcaa 840

cacggcaggt gggacctcca cctattacaa cttggtgggg gatgtagact catacatcag 900

gaacactggg ctaactgcat tcttcctgac acttaaatat ggaattaaca ccaagacatc 960

agcccttgca cttagcagcc tctcaggcga tatccagaaa atgaagcagc tcatgcgctt 1020

gtatcggatg aaaggagata atgcgccgta catgacattg ctcggtgaca gtgaccagat 1080

gagctttgca cctgccgagt atgcacaact ttactccttt gccatgggta tggcatcagt 1140

cctagataaa ggaactagca aataccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg 1200

gagacttgga gtagagtacg ctcaggctca aggaagtagc atcaatgagg atacggccgc 1260

cgagctaaag ctaaccccag cagcaaggag aggcctggca gctgctgccc aaagagtgtc 1320

tgaggagacc agcagcatgg acatgcccac ccaacaagcc ggggtcctca ctggactcag 1380

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cggggatggg gagacccaat ttctggatct gatgagagcg gtggcaaata gcatgagaga 1500

agcgccaaac tctgcgcagg gcacccctca accggggcct cccccaaccc ctgggccctc 1560

tcaagacaat gacaccgact gggggtactg accgacagca cccagtttgc ttctatgagg 1620

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cacaaacgaa cccccctgtc tccctcctct cccccagccc cacaacccca cctgcccagg 1740

gcaacatagg tacaatgcga cccactaata atcaatacag ggccaaagaa attagaaaaa 1800

agtacgggta gaagggagac attcagagat cagggcgagt cacccgggtc tctgctctcc 1860

cttctaccta gtggattagg atggagatgg ccacctttac agatgcggag atcgacgagc 1920

tatttgagac cagtggaact gtcattgaca gcataattac ggcccaggga aaaccagtag 1980

agactgttgg aaggagtgca atcccacaag gcaaaactaa ggctttgagc gcagcatggg 2040

agaagcatgg gagcatccag tcaccagcca gccaagacac ccctgatcga caggacagat 2100

cagataaaca actgtccaca cccgagcaag cgagtccaaa cgacagcccc ccagccacat 2160

ccactgacca gcctcccact caggctgcag atgaggccgg cgatacacag ctcaagaccg 2220

gagcaagcaa ctctctgctg tcgatgcttg ataaactcag caataagtca tctaatgcta 2280

aaaagggccc agggtcgagc cctcaagaaa ggcatcatca acgtctgact caacaacagg 2340

ggagtcaaca aagccgcgga aacagccaag agagaccgca gaaccaggcc aaggccatcc 2400

ctggaaacca ggtcacagac gcgaacacag catatcatgg acaatgggag gagtcacaac 2460

tatcagctgg tgcaacccat catgctctcc gatcagagca gagccaagac aatactcctg 2520

cacctgtgga tcatgtccag ctacctgtcg actttgtgca ggcgatgatg tctatgatgg 2580

aggcgatatc acagagggta agtaaagttg actatcagct ggaccttgtc ttgaaacaga 2640

catcttctat ccccatgatg cggtctgaaa tccagcagct gaaaacgtct gttgcggtca 2700

tggaagccaa tttgggcatg atgaagatcc tggaccctgg ttgtgccaac gtttcatctc 2760

taagtgatct acgggcagtt gcccgatccc acccggtttt aatttctggc cccggagacc 2820

catctcctta tgtgacccaa gggggcgaaa tggcactcaa taaactttcg caaccggtgc 2880

aacacccctc tgaattgatt aaacccgcca cggcaagcgg gcctgatata ggagtggaga 2940

aagacactgt ccgtgcattg atcatgtcac gccctatgca tccgagctct tcagctaggc 3000

tcttgagcaa actggacgca gccggatcga ttgaggaaat cagaaaaatc aagcgccttg 3060

cactgaatgg ctaatcacca ccgcaacccg cagcagatcc ctgtccaccc agcaccacac 3120

ggtatctgca ccaagctcct ctctgcaaac ccaaggtcca acaccccgag cgacaaccct 3180

gtcctgcttc ctctgcccca ctaaatgatc gcgcagctgc aatcaattca gctatattaa 3240

ggattaagaa aaaatacggg tagaatcgga gtgccccgat tgtgccaaga tggactcatc 3300

taggacaatc gggctgtact ttgattctac ccttccttct agcaacctgc tagcattccc 3360

gatagtccta caagacacag gggacgggaa gaagcaaatc gccccgcaat acaggatcca 3420

gcgtcttgac tcgtggacag acagcaaaga agactcggta ttcatcacca cctatggatt 3480

catctttcag gttgggaatg aagaagccac tgtcggcatg atcaatgata atcccaagcg 3540

cgagttactt tccactgcca tgctatgcct agggagtgta ccaaatgtcg gagatcttgt 3600

tgagctggca agggcctgcc tcactatggt ggtaacatgc aagaagagtg caactaacac 3660

cgagagaatg gtcttctcag tagtgcaggc accccaggtg ctgcaaagct gtagggttgt 3720

ggcaaacaaa tactcgtcgg tgaatgcagt caagcacgtg aaagcaccag agaagattcc 3780

tgggagcgga accctagagt acaaagtgaa ctttgtctct ctgaccgtgg tgccaagaaa 3840

ggacgtctac aagataccaa ctgcagcact taaggtctct ggctcaagtc tgtacaatct 3900

tgcgctcaat gtcactattg atgtggaggt agacccgaag agcccgttgg tcaaatccct 3960

ttccaagtcc gacagtgggt actatgctaa tctcttctta catattgggc ttatgtccac 4020

tgtagataag aaggggaaga aagtgacatt tgacaagctg gaaaggaaga taaggagact 4080

tgatctatct gtagggctta gtgacgtgct cggaccttcc gtgcttgtaa aggcgagagg 4140

tgcacggact aagctgctgg cacctttctt ctctagcagt gggacagcct gctatcccat 4200

agcaaatgcc tctcctcagg tggccaagat actctggagc caaaccgcgt acctgcggag 4260

tgtaaaagtc attatccaag cgggcaccca gcgtgctgtc gcagtgaccg ccgaccacga 4320

ggttacctct actaagctgg agaaggggca taccattgcc aaatacaatc ccttcaagaa 4380

ataggctgca tctctgagat tgcactccgc ccatcttccc ggatcaccat gacactaaat 4440

aatgatctgt cttgattact tatagttagt tcgcctgtct atcaaattag aaaaaacacg 4500

ggtagaagag tctggatccc gaccggcaca ttcaggacac agcatgggct ccaaaccttc 4560

taccaggatc ccagcacctc taatgctgat cactcggatt atgctgatat tgagctgtat 4620

ccgtctgaca agctctcttg acggcaggcc ccttgcagct gcaggaattg tagtaacagg 4680

agataaggca gtcaatgtat acacctcgtc tcagacaggg tcaatcatag tcaagttgct 4740

cccgaatatg cccagagata aggaggcatg tgcaaaagcc ccattggagg catataacag 4800

aacactgact actctgctca ctcctcttgg cgactccatc cgcaagatcc aagggtctgt 4860

gtccacgtcc ggaggaggga gacaaggacg ccttataggt gctgttattg gcagtgtagc 4920

tcttggggtt gcaacagcgg cacagataac agcagctgcg gccctaatac aagccaaaca 4980

gaatgccgcc aacatcctcc ggcttaagga gagcattgct gcaaccaatg aagctgtgca 5040

tgaagtcacc gacggattat cacaactatc agtggcagtt gggaagatgc agcagtttgt 5100

caatgaccag ttaaataata cggcgcgaga attggactgt ataaaaatca cacaacaggt 5160

cggtgtagaa ctcaacctat acctaactga attgactaca gtattcgggc cacagatcac 5220

ctcccctgca ttaactcagc tgaccatcca ggcactttat aatttagctg gtggcaatat 5280

ggattactta ttaactaagt taggtatagg aaacaatcaa ctcagctcat taattggtag 5340

cggcctgatc actggttacc ctatactgta tgactcacat actcaactct tgggcataca 5400

agtaaatctg ccctcagtcg ggaacttaaa taatatgcgt gccacctatt tggagacctt 5460

atctgtaagt acaaccaaag gatatgcctc agcacttgtc ccgaaagtag tgacacaagt 5520

cggttctgtg atagaagagc ttgacacctc atactgtata gagtccgatc tggatttata 5580

ttgtactaga atagtgacat tccccatgtc cccaggtatt tattcctgtt tgagcggcaa 5640

cacatcagct tgcatgtatt caaagactga aggcgcactc actacgccgt atatggccct 5700

tagaggctca gttattgcca attgtaagat aacaacatgc agatgtacag accctcctgg 5760

tatcatatcg caaaattacg gagaagctgt atccctgata gatagacatt catgcaatgt 5820

cttatcatta gacggaataa ctctgaggct cagtggggaa tttgatgcaa cttatcaaaa 5880

gaacatctca atattagatt ctcaagtcat cgtgacaggc aatcttgata tatcaactga 5940

acttggaaac gtcaacaatt caatcagcaa tgccttggat aggttggcag aaagcaacag 6000

caagctagaa aaagtcaatg tcagactaac tagcacatct gctctcatta cctatattgt 6060

tctaactgtc atttccctaa ttttcggtgc acttagtctg gttttagcgt gttacctgat 6120

gtacaaacag aaggcacaac agaagacctt gctatggctt gggaataata ccctcgatca 6180

gatgagagcc accacaagag catgaatgca gataagaggt ggacagatac ccaacagcag 6240

cctgtgtgtc aattccgata acctgtcaag tagaagactt aagaaaaaat tactgggaac 6300

aagcaaccaa agagcaatgc acgggtagaa cggtcgggga ggccgtccct caatcgggag 6360

ccgggcctca caacatccgt tctaccgcat caccaatagc agttttcagt catggaccgc 6420

gcagttagcc aagttgcgct agagaatgat gaaagagagg caaagaatac atggcgcttg 6480

gtattccgga tcgcaatcct actctcaacg gtggtgacct tagccatctc tgcagccgcc 6540

cttgcatata gcatggaggc cagcacacct agcgatcttg taggcatacc gactgcgatc 6600

tctagagcag aggaaaagat tacatctgca ctcggttcca atcaagatgt agtagatagg 6660

atatataagc aggtggccct cgaatctcca ctggcattgc taaacaccga atctacaatt 6720

atgaacgcaa taacgtctct ctcttatcga atcaatgggg ccgcaaatag cagcggatgt 6780

ggagcaccca ttcatgatcc agattatatt ggaggaatag gtaaagaact tattgtagat 6840

gatgctagcg acgtcacatc atactatccc tctgcgttcc aagaacacct gaactttatc 6900

ccggcgccta ctacaggatc aggttgcact cggataccct catttgacat gagcgctacc 6960

cactactgtt atactcacaa tgtgatatta tctggctgca gagatcactc gcactcacat 7020

caatatttag cacttggtgt gcttcggaca tctgcaacag ggagggtatt cttttccact 7080

ctgcgttcca tcaatctgga tgacacccaa aatcggaagt cttgcagtgt gagtgcaacc 7140

cccttgggtt gtgatatgct gtgctctaaa gtcacagaga ctgaagaaga ggattataac 7200

tcagctatcc ccacgtcgat ggtacatgga aggttagggt tcgacggcca ataccacgag 7260

aaggacctag atgtcacaac actattcgag gactgggtgg caaactaccc aggagtaggg 7320

ggcgggtctt ttattgacaa ccgcgtatgg ttcccagttt acggagggct aaaacccaat 7380

tcgcccagtg acaccgcaca agaagggaaa tatgtaatat acaagcgata caatgacaca 7440

tgtccagatg agcaagatta tcagattcaa atggctaagt cttcatataa gcctgggcgg 7500

tttggaggga aacgcgtaca gcaggccatc ttatctatca aagtgtcaac atccttgggc 7560

gaggacccgg tactgactgt accgcccaac acagtaacac tcatgggggc cgaaggcaga 7620

gttctcacag tagggacatc tcatttcctt tatcagcgag ggtcatcata cttctcccct 7680

gccctactat atcctatgat agtcagcaac aaaacagcca ctcttcatag tccttataca 7740

ttcaatgcct tcactcgacc aggtagtgtc ccttgccagg cttcagcaag atgccctaac 7800

tcatgtgtta ccggagtcta tactgatcca tatcccttgg tcttctatag gaaccacacc 7860

ttgcgagggg tattcgggac gatgcttgat gataaacaag caagactcaa ccctgtatct 7920

gcagtatttg acagcatatc ccgcagtcgc ataacccggg tgagttcaag cagcaccaag 7980

gcagcataca caacatcaac atgttttaaa gttgtaaaga ccaataaaac ctattgtctc 8040

agcattgccg aaatatccaa taccctcttc ggggaattca gaatcgtccc tttactagtt 8100

gagattctca aggatgatgg ggttagagaa gccaggtcta gccggttgag tcaactgcga 8160

gagggttgga aagatgacat tgtatcacct atcttttgcg acgccaagaa tcaaactgaa 8220

taccggcgcg agctcgagtc ctacgctgcc agttggccat aatcagctag tgctaatgtg 8280

attagattaa gtcttgtcgg tagtcacttg attaagaaaa aatgtgggtg gtagcgggat 8340

ataaggcaaa acaactcaag gaggatagca cgggtaggac atggcgagct ccggtcccga 8400

gagggcggag catcagatta tcctaccaga gtcacacctg tcttcaccat tagtcaagca 8460

caaactactc tattactgga aattaactgg gctaccactc cctgacgagt gtgacttcga 8520

ccacctcatt ctcagccgac aatggaagaa aatacttgaa tcggcctccc ctgacactga 8580

gagaatgata aaacttggaa gggcagtgca ccagactctc aaccacaatt ccaagataac 8640

cggagtactc catcccaggt gtttagaaga attggctagt attgaggttc ctgactcaac 8700

caacaagttt cggaagatcg agaagaaaat ccaaattcac aacacaaggt atggagaact 8760

gttcacaaga ctgtgcacgc atgtagagaa gaaattgttg ggatcatctt ggtctaataa 8820

tgtcccccgg tcagaagagt tcaacagcat ccgtacagat ccggcattct ggtttcactc 8880

aaaatggtcc acaactaagt ttgcatggct ccatataaaa cagattcaaa ggcatctgat 8940

tgtggcagca agaacaaggt ccgcagccaa caaattggtg acgctgaccc ataaggtagg 9000

ccaagtcttt gttactcctg agcttgtcat tgtgacacat acagatgaga acaagttcac 9060

gtgtcttacc caggaacttg tgttgatgta tgcagatatg atggagggca gagatatggt 9120

caacataata tcatccacgg cggcacatct caggagccta tcagagaaaa ttgatgacat 9180

tctgcggtta gtagatgccc tggcaaaaga tctgggtaat caagtctacg atgttgtagc 9240

actcatggag ggatttgcat acggcgccgt ccagctgctt gagccgtcag gtacattcgc 9300

aggggatttc ttcgcattca acctgcagga gctcaaagac actttgatcg gcctccttcc 9360

taaggatata gcagaatctg tgactcacgc aatagccact gtattctctg gcttagaaca 9420

aaatcaagcg gctgagatgc tgtgcctgtt gcgtctatgg ggccacccat tacttgagtc 9480

ccgtattgcg gcaaaagcag taaggagcca aatgtgcgca ccaaaaatgg tagactttga 9540

tatgatcctc caggtattgt ctttctttaa aggaacaatc atcaacggat acagaaagaa 9600

gaatgcaggt gtttggccac gtgtcaaagt agatacgata tacgggaagg tcattgggca 9660

gctacacgct gattcagcgg agatttcaca cgatatcatg ttgagagagt acaagagttt 9720

atctgcgctt gaattcgagc catgtataga atacgaccct atcaccaatc tgagcatgtt 9780

tctaaaagac aaggcgatcg cacacccgaa agacaactgg ctcgccgcgt ttaggcgaaa 9840

ccttctctct gaggaccaga agaaacatgt aaaggaggca acctctacta accgtctctt 9900

gatagagttc ttagagtcaa atgattttga tccatataag gagatggaat atctgacgac 9960

ccttgagtac ctaagagatg acaatgtggc agtatcatac tcgctcaagg agaaggaagt 10020

gaaggttaat gggcggattt ttgctaagct aacaaagaaa ttaaggaact gtcaagtgat 10080

ggcggaaggg atcttagctg accagattgc acctttcttt caagggaatg gggtcattca 10140

ggatagcata tctttaacca agagtatgct agcgatgagt caattgtctt tcaacagcaa 10200

taagaaacgt atcactgact gcaaagaaag agtagcctca aaccgcaatc acgatcaaaa 10260

gagcaagaat cgtcggagag ttgccacttt tataacgact gacctgcaaa agtactgtct 10320

taattggaga tatcagacaa tcaaactgtt cgctcatgcc atcaatcagc tgatgggctt 10380

acctcacttc ttcgaatgga ttcatctaag actaatggat actacgatgt ttgtaggaga 10440

ccctttcaat cccccaagtg acccaactga ctgtgatctc tcaagagtcc caaatgatga 10500

catatatatt gtcagtgcta gagggggtat tgagggatta tgtcagaagc tatggacaat 10560

gatctcaatt gctgcaatcc aacttgctgc agcaagatca cattgtcgcg tcgcctgtat 10620

ggtacagggt gacaatcaag taatagctgt aacgagagag gtaaggtcag atgactcccc 10680

ggaaatggtg ttaacacaat tgcatcaagc cagtgataat ttcttcaagg aattgattca 10740

tgttaatcat ttgattggcc ataatttgaa ggatcgtgaa acaatcagat cagacacatt 10800

cttcatatac agcaaacgaa tattcaaaga tggagcaata ctcagtcaag tcctcaaaaa 10860

ttcatctaaa ttagtgctaa tatcaggcga ccttagtgaa aacaccgtaa tgtcctgtgc 10920

caacattgca tctactatag cacggctgtg cgagaacggg cttccaaagg atttctgtta 10980

ttacttaaac tacctgatga gttgcgtgca gacatacttt gattctgagt tttccatcac 11040

taacagctcg caccccgatt ctaaccagtc gtggattgaa gacatctctt ttgtgcactc 11100

atatgtcctg acccctgccc agctaggggg actgagcaac ctccaatact caaggctcta 11160

cacgaggaac atcggtgacc cgggaactac tgcttttgca gagatcaagc gattagaagc 11220

agtggggtta ctaagtccta gtattatgac taacatctta actaggccgc ctggaaatgg 11280

agattgggcc agtctgtgta acgaccctta ctctttcaat tttgagactg tcgcgagtcc 11340

aaatattgtc cttaagaaac atacacaaag agtcctattt gaaacttgtt caaatccctt 11400

attatctggc gtgcatacag aggataatga ggcagaagag aaggcgttgg ctgaattttt 11460

actcaatcaa gaagtaattc atccacgtgt cgcacatgct atcatggaag caagctctat 11520

aggtaggagg aagcagattc aagggcttgt tgacacaaca aacaccgtaa tcaagattgc 11580

attgactagg aggccacttg gcatcaagag gctgatgcgg atagttaact actcgagcat 11640

gcatgcaatg ctgtttagag acgatgtttt ctcatctaac aggtctaacc accccttagt 11700

ttcctctaat atgtgttctc tgacgctagc agactatgca cggaatagaa gctggtcacc 11760

attgacgggg ggtagaaaga tactgggtgt atctaatcct gatactatag aacttgtaga 11820

gggtgagatc cttagcgtca gcggaggatg cacaagatgt gacagcggag atgaacaatt 11880

cacttggttc catcttccga gcaatataga actgaccgat gacaccagca agaatcctcc 11940

gatgagagtg ccgtacctcg ggtcaaagac tcaagagagg agggccgcct cgcttgcgaa 12000

aatagctcat atgtcaccac atgtgaaagc tgctctaagg gcatcatccg tgttgatctg 12060

ggcttatgga gacaacgaag taaattggac tgctgctctt aaaattgcaa gatctcggtg 12120

caatataaac tcagagtatc ttcgactatt gtccccctta cccacagctg ggaatctcca 12180

acatagactg gatgacggca taactcagat gacattcacc cctgcatctc tctacagggt 12240

gtcaccttat attcacatat ccaatgattc tcaaaggtta ttcacggaag aaggagtcaa 12300

agagggaaat gtagtttatc agcaaatcat gctcttgggt ttatctctaa tcgaatcact 12360

cttcccgatg acgacaacca ggacatacga tgagatcaca ttgcacctcc acagtaaatt 12420

tagctgctgt atcagggaag caccggttgc agttcctttc gagttactcg ggatggcacc 12480

agaactaagg acagtgacct caaataagtt tatgtatgat cctagtcctg tatcggaggg 12540

tgactttgcg agacttgact tagctatctt taagagttat gagcttaatc tagaatcata 12600

tcccacaata gagctaatga acattctttc aatatccagc gggaagttaa tcggccagtc 12660

tgtggtttct tatgatgaag atacctccat aaagaatgac gccataatag tgtatgacaa 12720

cacccggaat tggatcagcg aagctcagaa ttcagatgtg gtccgcctat tcgagtatgc 12780

agcacttgaa gtgcttctcg actgttctta tcagctctac tatctgagag taagaggcct 12840

agacaatatc gtgttgtata tgagtgactt atataagaat atgccaggaa ttctactttc 12900

caacattgca gctacaatat ctcatcccat cattcattca agattgcatg cagtaggcct 12960

ggtcaatcac gacgggtcac accaacttgc agacacagat ttcatcgaaa tgtctgcaaa 13020

actattagtc tcttgcactc gacgcgtggt ctcaggttta tatgcaggga ataagtatga 13080

tctgctgttc ccgtctgtct tagatgataa cctgagtgag aagatgcttc agctgatatc 13140

tcggttatgc tgcctgtata cggtgctctt tgctacaaca agagagatcc cgaaaataag 13200

aggcttatct gcagaagaga agtgttcagt acttactgag tacctactgt cagatgctgt 13260

gaaaccatta cttagttctg agcaagtgag ctctatcatg tctcctaaca tagttacgtt 13320

cccagctaat ctatattaca tgtctcggaa gagccttaat ttgattaggg aaagagagga 13380

cagggacact atcttggcat tgttgttccc ccaagagcca ctacttgagt tccccttagt 13440

acaagatatt ggcgctcgag tgaaagatcc attcacccga caacctgcgg cgtttttaca 13500

agaattagat ttgagcgctc cagcaaggta tgacgcattt acacttagtc aggttcattc 13560

tgaacacaca tcaccaaatc cggaggacga ctacttagta cgatacctgt tcagaggaat 13620

agggaccgcg tcctcctctt ggtataaggc atctcacctt ctttctgtac ctgaggtcag 13680

atgtgcaagg cacgggaatt ccttatactt ggcagaagga agcggagcca ttatgagtct 13740

tctcgaactg catgtgccgc atgagactat ctattacaat acgctcttct caaacgagat 13800

gaacccccca cagcggcatt tcggaccgac cccaacacag tttctgaatt cagttgttta 13860

taggaatcta caggcggagg taccatgtaa ggatggattt gtccaggagt tccgtccatt 13920

atggagagag aatacagaag aaagcgatct gacctcagat aaagcagtgg gttacatcac 13980

atctgcagtg ccctaccggt ctgtatcatt gctgcactgt gacattgaga ttcctccagg 14040

atccaatcaa agcttactgg atcaactggc taccaatctg tctctgattg ccatgcattc 14100

tgtaagggag ggcggggtcg tgatcatcaa agtgttgtat gcaatgggat attacttcca 14160

tctactcatg aacttgttca ctccgtgttc tacgaaagga tatattctct ctaatggcta 14220

tgcatgtaga ggggatatgg agtgttacct ggtatttgtc atgggctatc gaggtgggcc 14280

tacatttgta catgaggtag tgaggatggc aaaaactcta gtgcagcggc acggtacact 14340

tttgtccaaa tcagatgaga tcacactgac taggttattt acctcacagc ggcagcgtgt 14400

aacagacatc ctatccagtc ctttaccgag actaataaag ttcttgagaa agaatatcga 14460

tactgcgcta attgaagccg ggggacaacc cgtccgtcca ttctgtgcag agagcttggt 14520

gaggacacta gcggacacaa ctcagatgac ccagatcatc gctagtcaca ttgacacagt 14580

cattcgatct gtgatctaca tggaggctga gggtgatctc gccgacacag tgttcttatt 14640

taccccctac aatctctcta cagacggtaa aaagagaaca tcacttaaac agtgcacaag 14700

gcagatctta gaggtcacaa tattgggtct tagagttgaa aatctcaata aagtaggtga 14760

tgtagtcagt ctagtactta aaggtatgat ttctctggag gacctgatcc ctctaagaac 14820

atacttgaag cgtagtacct gccctaagta tttgaagtct gttctaggta ttactaaact 14880

caaagaaatg tttacagaca cctctttatt atacttgact cgtgctcaac aaaaattcta 14940

catgaaaact ataggcaacg cagtcaaggg atactacagt aactgtgact cttaaagata 15000

atcacatatt aataggctcc ttttctagtt aactgagccc ttgttgattt aatgatacta 15060

tattagaaaa aagttgcact ccgatccttt aggactcgtg ttcgaattca aataattgtc 15120

ttagaaaaaa gttgcgcgta attgttcttg aatgtagtcc tgtcattcac caaatctttg 15180

tttggt 15186

Claims (4)

1.一种基因VII型弱毒株，其特征在于，所述的弱毒株的保藏编号为CCTCC NO:V201968。

2.权利要求1所述的弱毒株在制备疫苗中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为活毒疫苗。

4.一种疫苗，其特征在于，所述的疫苗中的抗原为权利要求1所述的弱毒株。

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