CN104988124A - 基因vii型新城疫病毒标记疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基因VII型新城疫病毒标记疫苗株及其应用，属于基因VII型新城疫病毒标记疫苗株的拯救及应用领域。本发明利用已建立的新城疫病毒反向遗传操作平台，将G7株的NP蛋白缺失18个氨基酸并将F蛋白裂解位点进行突变，通过筛选救获一株毒力高度致弱、病毒滴度高的基因VII型新城疫病毒标记疫苗株MG7-NPΔ18+F^mut，其微生物保藏编号为：CCTCC NO：V201505。本发明标记疫苗株在鸡胚中具有高生长滴度和低致病力的生物学特性且遗传稳定。免疫保护试验结果表明，该标记疫苗株免疫原性好，可诱导高水平的保护性抗体，对免疫鸡只实现完全保护，能用于防控目前流行的基因VII型新城疫病毒，并为鉴别疫苗免疫和野毒感染奠定基础。

Description

基因VII型新城疫病毒标记疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及基因VII型新城疫病毒，尤其涉及基因VII型新城疫病毒标记疫苗株MG7-NP△18+F^mut，本发明还涉及所述MG7-NP△18+F^mut株在制备基因VII型新城疫疫苗中的应用，属于基因VII型新城疫病毒标记疫苗株的拯救及应用领域。

背景技术

新城疫是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的一种急性、高度传染性禽类疾病，主要侵害鸡和火鸡，是世界公认的最重要的两大禽类传染病之一。

当前防控新城疫主要使用LaSota和Hitcher B1两种弱毒疫苗或其灭活疫苗，并且它们作为疫苗毒株已经应用了几十年。LaSota和Hitcher B1两毒株都属于基因II型，而中国当前流行的毒株主要是基因VII型NDV。因此，上述两种疫苗不能在临床应用上提供坚强的免疫保护，这也解释了新城疫依旧在一些地区流行的原因。

不仅基因VII型NDV灭活疫苗的研制可为当前新城疫提供有效的保护，而且国家中长期动物疫病防治规划中明确了新城疫是重点防治对象，最终通过区分感染与免疫的方法达到新城疫净化的目标。因此，研制基因VII型新型NDV标记疫苗具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是构建并获得一株基因VII型NDV标记疫苗株，该标记疫苗株的毒力高度减弱，在鸡胚上具有高繁殖能力，免疫原性好，不仅能够用于制造防控目前流行的基因VII型NDV，而且能够区分野毒感染和疫苗免疫。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明利用NDV反向遗传操作平台，将具有高繁殖性能的NDV G7分离株的NP蛋白443-460位置缺失18个氨基酸并将F蛋白裂解位点112-117位置进行突变，通过筛选，最终获救一株毒力高度致弱且毒价高的基因VII型NDV标记疫苗株MG7-NP△18+F^mut。

本发明将获得的基因VII型NDV标记疫苗株MG7-NP△18+F^mut提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CCTCC NO：V201505；分类命名为：基因VII型新城疫病毒NDV MG7-NP△18+F^mut。保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏时间是2015年1月14日；保藏地址：中国武汉武汉大学。

本发明还公开了一种所述基因VII型NDV标记疫苗株MG7-NP△18+F^mut的构建方法，包括以下步骤：

(1)构建基因VII型NDV G7株基因组全长cDNA质粒prG7；

(2)在prG7基础上将NP蛋白第443-460位18个氨基酸进行缺失突变，且将F蛋白裂解位点第112-117位的氨基酸序列突变为GRQGRL，构建突变质粒pMG7-NP△18+F^mut；

(3)将突变质粒pMG7-NP△18+F^mut与辅助质粒pBSK-NP、pBSK-P和pBSK-L共转染痘病毒感染后的BHK-21细胞，培养72h；然后将细胞刮下，与细胞上清混合过滤后，接种9-11日龄SPF鸡胚，收获病毒液，即得。

其中，步骤(3)中选用0.1MOI剂量的痘病毒感染BHK-21细胞；所述培养方式为37℃的CO₂培养箱中培养72h。

本发明首先构建NDV G7株基因组全长cDNA，在全长cDNA片段的5’末端前添加T7RNA聚合酶启动子，在全长cDNA片段末端加入具有自我催化功能的丁肝病毒核酶序列和T7转录终止信号；本发明同时在T7RNA聚合酶启动子与全长基因组cDNA的5’末端之间引入两个多余的G，这有助于副粘病毒反向遗传操作的病毒拯救，构建完成的质粒命名为prG7；在此基础上，利用重叠PCR方法，分别将G7株NP蛋白443-460aa进行缺失和449-452aa进行突变，获得突变质粒pMG7-NP△18和pMG7-NP^mut3，然后分别与pBSK-NP、pBSK-P和pBSK-L三个真核表达质粒共转染BHK-21细胞，获得病毒株MG7-NP△18和MG7-NP^mut3株。病毒毒力指标检测结果表明，获得的MG7-NP△18株、MG7-NP^mut3株与G7株相比，病毒毒力没有明显减弱。

研究表明，NDV的毒力主要由F蛋白决定，强毒株F蛋白裂解位点为RRQKRF，而弱毒株LaSota的F蛋白裂解位点为GRQGRL。因此，本发明在pMG7-NP△18的基础上，将F蛋白裂解位点RRQKRF进行突变，分别突变为GRQGRL、GRQKRF、RRQGRF和RRQKRL，获得突变质粒pMG7-NP△18+F^mut、pMG7-NP△18+F^mut-1、pMG7-NP△18+F^mut-2和pMG7-NP△18+F^mut-3，然后分别与pBSK-NP、pBSK-P和pBSK-L三个真核表达质粒共转染BHK-21细胞，救获标记疫苗株4株，分别命名为MG7-NP△18+F^mut、MG7-NP△18+F^mut-1、MG7-NP△18+F^mut-2和MG7-NP△18+F^mut-3。

获救病毒在鸡胚的生长特性及致病特性检测结果表明，MG7-NP△18+F^mut株以10⁶EID₅₀剂量尿囊腔内接种9日龄SPF鸡胚，在96小时内无死胚；并在鸡胚内达到与G7株相似的生长滴度，HA为2⁹，EID₅₀为5.62×10⁹/mL；而其它突变株接种9日龄SPF鸡胚后，鸡胚均在60h内死亡。

病毒毒力指数测定结果表明，MG7-NP△18+F^mut株的毒力明显减弱，测得MDT＞120h，ICPI为0.49，IVPI为0；而其它突变株与G7株相比，毒力没有明显减弱。由此可知，本发明获得一株减毒标记疫苗株，为MG7-NP△18+F^mut。

对减毒标记疫苗株MG7-NP△18+F^mut遗传稳定性进行分析，结果表 明，MG7-NP△18+F^mut株用9日龄SPF鸡胚传代至第4代、第8代、第12代和第15代，各代突变位点依然存在，遗传稳定性好；其全基因组核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

通过以上数据表明，本发明利用反向遗传操作技术救获的MG7-NP△18+F^mut株在鸡胚中具有高生长滴度和低致病力的生物学特性，且遗传稳定。

本发明所述基因VII型新城疫病毒标记疫苗株MG7-NP△18+F^mut能够用于制备基因VII型新城疫疫苗。

本发明进一步公开了一种预防新城疫的疫苗组合物，包括：免疫有效量的基因VII型新城疫病毒标记疫苗株MG7-NP△18+F^mut和药学上可接受的佐剂。

本发明还公开了一种基因VII型新城疫疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)将基因VII型新城疫病毒标记疫苗株MG7-NP△18+F^mut进行增殖，收获病毒液，灭活；(2)向灭活后的病毒液中加入吐温-80，制备水相；(3)将水相与油相混合，乳化，即得。

其中，步骤(1)所述灭活是采用甲醛溶液灭活病毒液；37℃灭活16h。病毒液中甲醛溶液的终浓度为0.15％。

按照体积比计，步骤(2)吐温-80的加入量为水相体积的4％；步骤(3)水相与油相的比例为1：2；其中，所述油相为常用的油佐剂，包括白油佐剂、弗氏佐剂等。

本发明还公开了所述制备方法制备得到的新城疫疫苗。

免疫保护实验结果表明，MG7-NP△18+F^mut株制备的灭活疫苗对鸡只安全且无副反应；免疫4周龄SPF雏鸡可诱导高水平的保护性抗体，免疫后第21d抗体效价为2^8.5。免疫后分别用NDV F48E9和NDV VII-74强毒进行攻毒，结果免疫鸡只未出现任何发病或死亡，可实现完全保护。免疫攻毒后排毒实验结果表明，MG7-NP△18+F^mut免疫组鸡只的拭子病毒排毒检出率和脏器带毒检出率均低于LaSota免疫组，具有良好的保护效果。

本发明救获的MG7-NP△18+F^mut株作为疫苗株，其基因型与目前中国流行的基因VII型新城疫相一致，可用于防控目前流行的基因VII型新城疫病毒，且能区分野毒感染和疫苗免疫。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明通过将具有高繁殖性能的G7株的NP蛋白443-460位置缺失18个氨基酸及F蛋白裂解位点112-117位置突变为弱毒株LaSota的F蛋白裂解位点GRQGRL，获救一株基因VII型新城疫病毒标记疫苗株MG7-NP△18+F^mut。该标记疫苗株在鸡胚中具有高生长滴度和低致病力的生物学特性，遗传稳定，免疫原性好，能够用于制造防控目前流行的基因VII型新城疫的同型疫苗，为鉴别新城疫疫苗免疫和野毒感染奠定基础。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”指这样的药物组合物，其包括在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超过一种上述组分。

术语“佐剂”意指包括一种或多种物质的组合物，所述物质增强疫苗组合物的抗原性。佐剂可以充当缓慢释放抗原的组织储存，并且还充当非特异性增强免疫应答的淋巴样系统激活。通常，在不存在佐剂的情况下，用单独抗原的初次疫苗接种将无法引发体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、矿物质凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质。

术语“反向遗传操作技术”意指通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，在病毒DNA分子水平上对其进行体外人工操作，如进行基因点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等改造，以此来研究RNA病毒的基因复制与表达调控机理、RNA编辑和自发重组与诱导重组、病毒与宿主间的相互作用关系、抗病毒策略、基因治疗研究，以及构建新型病毒载体来表达外源基因和进行疫苗的研制等。

附图说明

图1为利用高保真聚合酶扩增产生的亚基因组重叠cDNA片段装配全长NDV cDNA的模式图；将cDNA片段在共有的限制性酶切位点进行连接，并且在转录质粒pBR322中装配，在转录质粒pBR322中将RBZ和T7终止子序列预先克隆在其中；

图2为MG7-NP△18株全长cDNA的突变位置的测序结果；其中，rNP是野生型NP蛋白基因序列；NP△18是缺失18个氨基酸后的NP蛋白基因序列；

图3为MG7-NP^mut3株全长cDNA的突变位置的测序结果；其中，rNP是野生型NP蛋白基因序列；NP^mut3是突变3个氨基酸后的NP蛋白基因序列；

图4为MG7-NP△18+F^mut、MG7-NP△18+F^mut-1、MG7-NP△18+F^mut-2和MG7-NP△18+F^mut-3株全长cDNA的突变位置的测序结果；其中，rNP是野生型NP蛋白基因序列；NP△18是缺失18个氨基酸后的NP蛋白基因序列；rF是野生型F蛋白基因序列；F^mut、F^mut1、F^mut2和F^mut3分别是 MG7-NP△18+F^mut、MG7-NP△18+F^mut-1、MG7-NP△18+F^mut-2和MG7-NP△18+F^mut-3株突变后的F蛋白基因序列；

图5为MG7-NP△18+F^mut标记疫苗株第4代、第8代、第12代和第15代NP蛋白和F蛋白基因突变位点的测序结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、细胞和病毒 

BHK-21细胞(仓鼠肾细胞)购于ATCC；DMEM培养基，含10％胎牛血清(Gibco)；NDV/Chicken/Guangdong/2008/G7病毒株(简称G7株)分离于广东省某养鸡场的鸡只泄殖腔拭子，中国农业科学院兰州兽医研究所动物病毒分子生态学创新团队进行纯化并保存；攻毒用强毒株NDVVII-74分离于广东省某养鸡场的鸡只泄殖腔拭子，中国农业科学院兰州兽医研究所动物病毒分子生态学创新团队进行纯化并保存；NDV F48E9株购买于中国兽医药品监察所，中国农业科学院兰州兽医研究所动物病毒分子生态学创新团队保存；SPF鸡胚及SPF雏鸡均购买于北京梅里亚维通生物技术有限公司；pBR322真核表达载体购于Promega公司；pBluescript SKⅡ(+/-)质粒购于Stratagen公司；痘病毒为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高研究员馈赠。

实施例1 MG7-NP△18和MG7-NP^mut3株的拯救

1、实验方法 

1.1 G7株基因组全长cDNA构建

利用Trizol法提取G7株鸡胚接种尿囊液中的基因组RNA，详细步骤如下：

①取鸡胚尿囊液250μL，加入750μL Trizol(Invitrogen，USA)，震荡混匀，室温放置5分钟；

②每管加入氯仿200μL，盖紧离心管，剧烈摇荡离心管15秒；室温放置10min，12000rpm离心15min；

③取上层水相放置于新的离心管内，加700μL异丙醇，4℃放置10分钟，12000rpm离心10分钟；

④弃去上清液，加入1mL 75％乙醇，混匀，4℃下8500g离心5分钟；

⑤小心弃去上清液，室温干燥5-10分钟，最后将RNA溶于DEPC水 中。将RNA反转录成cDNA后，利用PCR方法扩增各基因片段，切胶回收目的片段，备用。

设计3对引物用于扩增G7株基因组，引物序列如下：

F1:5'ATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGACCAAACAGAGAATCTGTGAGGTACGATAA3'；

R1:5'TCACACTGCAGGACTTCCGATTTTGGGTGTCATCT3'；

F2:5'TGCAGAGATCACTCACACTCACATCAATAC3'；

R2:5'CCTCCACAAGTTCTATGGTATCAGGGTTGGATACA3'；

F3:5'ACGAACACTGTGATTAAGATTGCACTGACTAG3'；

R3:5'AGCCGGCGCCAGCGAGGAGGCTGGGACCATGCCGGCCACCAAACAGAGATTTGGTGAATGACATC3'；

整个基因组分为末端部分重叠的3个片段(F1-F3)进行PCR扩增，将cDNA片段克隆至pBR322真核表达载体上，构建完成的质粒命名为prG7；核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框(ORF)cDNA分别克隆在pBluescript SKⅡ(+/-)质粒T7启动子下游，分别构成转录辅助质粒pBSK-NP、pBSK-P和pBSK-L。

1.2 G7株NP蛋白缺失18个氨基酸和突变3个氨基酸及其全长cDNA的连接

设计3对引物用于G7NP蛋白氨基酸缺失和突变，引物序列如下：

F4:5'AAGGAAAAAAGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGACCAAACAGAGAATCTGTGAGGTACGATAA3'；

R4:5'TCACACTGCAGGACTTCCGATTTTGGGTGTCATCT3'；

F5:5'GCCGCAAGGGCAACCAGATGCTGGGGATGCGCCAAATCCTGTACAGAGCACCACCCATC3'；

R5:5'GATGGGTGGTGCTCTGTACAGGATTTGGCGCATCCCCAGCATCTGGTTGCCCTTGCGGC3'；

F6:5'GGGGAGACCCAATTCTTGGCATTTGCAGCGGCAGTGGCGAACGGC3'；

R6:5'ATGCCGTTCGCCACTGCCGCTGCAAATGCCAAGAATTGGGTC3'；

其中，F4+R5、F4+R6、F5+R4和F6+R4引物利用PCR方法分别扩出目的条带，分别命名为A1、A2、A3和A4。在此基础上，利用F4+R4引物分别经重叠PCR方法，分别以A1+A3和A2+A4为模板，分别获得NP蛋白缺失18个氨基酸的相应基因片段和NP蛋白突变3个氨基酸的相应基因片段，扩增目的片段长度均为7122bp。

利用重叠PCR方法，分别将G7株NP蛋白443-460aa进行缺失和449-452aa进行突变(表1)，将扩增后的目的片段和prG7全长载体经NotⅠ和AfeⅠ限制性内切酶分别双酶切，进行核酸电泳，胶回收目的片段分别与载体prG7进行连接，所获得的突变质粒分别命名为pMG7-NP△18 和pMG7-NP^mut3。

表1 NP蛋白缺失和突变位置

1.3 MG7-NP△18和MG7-NP^mut3株的拯救

转染时用0.1MOI痘病毒15μL感染BHK-21细胞，随后转染拯救病毒。将质粒pMG7-NP△18和pMG7-NP^mut3分别与pBSK-NP、pBSK-P和pBSK-L三个真核表达质粒共转染BHK-21细胞，在37℃的CO₂培养箱中培养72h。72h后将细胞轻轻刮下，并与细胞上清充分混合过滤后接种9日龄SPF鸡胚，每份样品接种3枚，0.2mL/枚，接种后的SPF胚继续培养5d，取鸡胚尿囊液50μL按常规进行NDV的血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验，分别获得MG7-NP△18和MG7-NP^mut3株。

1.4 MG7-NP△18和MG7-NP^mut3株病毒毒力指标检测

为检测利用反向遗传技术救获的MG7-NP△18和MG7-NP^mut3株病毒毒力，按照OIE标准(OIE编著[农业部畜牧兽医局译].哺乳动物、禽类和蜜蜂A类和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册.北京：中国农业科技出版社，1996:140-146)测定G7及其突变株的鸡胚半数致死量(MDT)和脑内致病指数(ICPI)。

2、实验结果 

2.1 G7株基因组全长cDNA构建

为建立G7株反向遗传操作系统，本发明首先构建相应基因组的全长cDNA克隆，作为基因组负链RNA转录模板。为此构建了覆盖G7株整个基因组的3个cDNA克隆片段，利用各片段间重叠部分的酶切位点，在转录载体质粒pBR322连接组装获得了15192nt的完整cDNA克隆。在全长cDNA片段的5’末端前添加T7RNA聚合酶启动子，在全长cDNA片段末端加入具有自我催化功能的丁肝病毒核酶序列和T7转录终止信号，构建完成的质粒命名为prG7(图1)。与其它研究者一样，本发明同时在T7RNA聚合酶启动子与全长基因组cDNA的5’末端之间引入两个多余的G，这可能有助于副粘病毒反向遗传操作的病毒拯救。

2.2 MG7-NP△18和MG7-NP^mut3株的拯救

本发明利用反向遗传操作技术分别拯救获1株MG7-NP△18株和1株MG7-NP^mut3株。MG7-NP△18及MG7-NP^mut3株全长cDNA的突变位置的测序结果分别见图2和图3。

MG7-NP△18株和MG7-NP^mut3株的病毒毒力指数测定结果见表2。

试验数据表明，本发明拯救的MG7-NP△18株、MG7-NP^mut3株与G7相比，病毒毒力没有明显减弱。

表2病毒毒力指数测定结果

*病毒经适当比例稀释后，接种9日龄SPF鸡胚(100μL/只)，能够使所有鸡胚致死的病毒最大稀释倍数即为病毒的最小致死量(MLD)，MDT是最小致死量(MLD)引起鸡胚死亡的平均时间，利用此方法测定MDT；

**病毒种毒经10倍稀释后脑内接种1日龄SPF雏鸡(50μL/只)，测定ICPI。

实施例2 MG7-NP△18+F^mut标记疫苗株的拯救

1、实验方法 

1.1 MG7-NP△18株F蛋白裂解位点的突变及其全长cDNA构建

由于本发明实施例1拯救的MG7-NP△18和MG7-NP^mut3株病毒毒力没有明显减弱，因此，本发明在实施例1构建的质粒pMG7-NP△18的基础上，对F蛋白裂解位点进行突变，将F蛋白裂解位点RRQKRF分别突变为GRQGRL、GRQKRF、RRQGRF和RRQKRL，获得突变质粒pMG7-NP△18+F^mut、pMG7-NP△18+F^mut-1、pMG7-NP△18+F^mut-2和pMG7-NP△18+F^mut-3。

用于突变F蛋白裂解位点的引物如下：

F7:5’CTCCGACCAAAACCCTCCCACACTCCCTG3’；

R7:5’AGAGTAGAGAAGAATACCCTCCCTGTTGCAG3’；

F8:5’TCTGTGTCCACGTCTGGAGGAGGGAGACAGGGGCGCCTTATAGGTGCTGTTATTGGCAG3’；

R8:5’CTGCCAATAACAGCACCTATAAGGCGCCCCTGTCTCCCTCCTCCAGACGTGGACACAGA3’；

F9:5’TCTGTGTCCACGTCTGGAGGAGGGAGGCAAAAACGCTTTATAGGTGCTGTTATTGGCAG3’；

R9:5’CTGCCAATAACAGCACCTATAAAGCGTTTTTGCCTCCCTCCTCCAGACGTGGACACAGA3’；

F10:5’TCTGTGTCCACGTCTGGAGGAAGGAGGCAAGGGCGCTTTATAGGTGCTGTTATTGGCAG3’；

R10:5’CTGCCAATAACAGCACCTATAAAGCGCCCTTGCCTCCTTCCTCCAGACGTGGACACAGA3’；

F11:5’TCTGTGTCCACGTCTGGAGGAAGGAGGCAAAAACGCCTCATAGGTGCTGTTATTGGCAG3’；

R11:5’CTGCCAATAACAGCACCTATGAGGCGTTTTTGCCTCCTTCCTCCAGACGTGGACACAGA3’；

其中，F7+R8、F7+R9、F7+R10和F7+R11对引物利用PCR方法分别扩出目的条带，命名为B1、B2、B3和B4；F8+R7、F9+R7、F10+R7和F11+R7 对引物利用PCR方法分别扩出目的条带，命名为B5、B6、B7和B8。胶回收后分别以B1+B5、B2+B6、B3+B7和B4+B8为模板，以F7+R7这1对引物利用重叠PCR方法进行扩增，获得含有F基因突变的片段长为5426bp，分别命名为F^mut、F^mut-1、F^mut-2和F^mut-3。

将扩增后的各目的片段和载体pMG7-NP△18经SalⅠ和AfeⅠ限制性内切酶分别双酶切，进行核酸电泳，胶回收各目的片段，分别和载体pMG7-NP△18进行连接，所获得的突变质粒命名为pMG7-NP△18+F^mut、pMG7-NP△18+F^mut-1、pMG7-NP△18+F^mut-2和pMG7-NP△18+F^mut-3。

1.2标记疫苗株的拯救

转染时用0.1MOI痘病毒15μL感染BHK-21细胞，随后转染拯救病毒。将质粒pMG7-NP△18+F^mut、pMG7-NP△18+F^mut-1、pMG7-NP△18+F^mut-2和pMG7-NP△18+F^mut-3分别与pBSK-NP、pBSK-P和pBSK-L三个真核表达质粒共转染BHK-21细胞，在37℃的CO₂培养箱中培养72h。72h后将细胞轻轻刮下，并与细胞上清充分混合过滤后接种9日龄SPF鸡胚，每份样品接种3枚，0.2mL/枚，接种后的SPF胚继续培养5d，取鸡胚尿囊液50μL按常规进行NDV的血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验，最终拯救获得4株标记疫苗株，分别为MG7-NP△18+F^mut、MG7-NP△18+F^mut-1、MG7-NP△18+F^mut-2和MG7-NP△18+F^mut-3。

1.3标记疫苗株在鸡胚的生长特性及致病特性

为检测利用反向遗传技术救获的MG7-NP△18+F^mut、MG7-NP△18+F^mut-1、MG7-NP△18+F^mut-2和MG7-NP△18+F^mut-3标记疫苗株在鸡胚上的生长特性及其对鸡胚的致病性，将MG7-NP△18+F^mut、MG7-NP△18+F^mut-1、MG7-NP△18+F^mut-2和MG7-NP△18+F^mut-3标记疫苗株尿囊液及G7分别按10⁶EID₅₀剂量接种9日龄SPF鸡胚尿囊腔，观察鸡胚96小时内死亡情况。96小时后将鸡胚冻死，收集尿囊液，测定尿囊液HA、EID₅₀；按照OIE标准测定G7及其突变株的鸡胚半数致死量(MDT)、脑内致病指数(ICPI)和静脉接种指数(IVPI)。

1.4 MG7-NP△18+F^mut标记疫苗株遗传稳定性分析

将获得的MG7-NP△18+F^mut标记疫苗株使用9日龄SPF鸡胚传代至第15(F15)代，分别提取第4代、第8代、第12代和第15代病毒的RNA，反转录成cDNA后扩增相应目的片段，并切胶回收目的片段，送样测序。

2、实验结果 

2.1标记疫苗株的拯救

本发明利用反向遗传技术救获标记疫苗株4株，分别为MG7-NP△18+F^mut、MG7-NP△18+F^mut-1、MG7-NP△18+F^mut-2和MG7-NP△18+F^mut-3。上述4株标记疫苗株全长cDNA的突变位置的测序结果见图4。

2.2标记疫苗株在鸡胚的生长特性及致病特性

MG7-NP△18+F^mut株接种鸡胚96小时内无死胚；G7株接种鸡胚后鸡胚在60h内死亡；MG7-NP△18+F^mut-1、MG7-NP△18+F^mut-2及MG7-NP△18+F^mut-3株接种鸡胚后，鸡胚均在60h内死亡。

G7株及其突变株的HA效价和每毫升尿囊液EID₅₀测定结果见表3。G7及其突变株的鸡胚半数致死量(MDT)、脑内致病指数(ICPI)和静脉接种指数(IVPI)测定结果见表4。

表3 HA效价和EID₅₀测定结果

表4病毒毒力指数测定结果

*病毒经适当比例稀释后，接种9日龄SPF鸡胚(100μL/只)，能够使所有鸡胚致死的病毒最大稀释倍数即为病毒的最小致死量(MLD)，MDT是最小致死量(MLD)引起鸡胚死亡的平均时间，利用此方法测定MDT；

**病毒种毒经10倍稀释后脑内接种1日龄SPF雏鸡(50μL/只)，测定ICPI；

***翅下静脉注射(100uL/只)，测定IVPI。

通过以上数据表明，本发明利用反向遗传操作技术救获的MG7-NP△18+F^mut株在鸡胚中具有高生长滴度和低致病力的生物学特性,可用于疫苗生产；而MG7-NP△18+F^mut-1、MG7-NP△18+F^mut-2和MG7-NP△18+F^mut-3病毒毒力高，不适合作为疫苗应用。

2.2 MG7-NP△18+F^mut标记疫苗株遗传稳定性

提取MG7-NP△18+F^mut株病毒RNA，反转录成cDNA后，利用PCR方法扩增相应片段，对突变位置进行测序。结果表明，MG7-NP△18+F^mut株用9日龄SPF鸡胚传代至第4代、第8代、第12代和第15代，各代突变株突变位点依然存在，遗传稳定性好(图5)。MG7-NP△18+F^mut株全基因组序列为SEQ ID No.1所示。

本发明将获得的基因VII型新城疫病毒标记疫苗株MG7-NP△18+F^mut提交中国典型培养物保藏中心进行保藏，其微生物保藏编号为：CCTCCNO：V201505。

实施例3 MG7-NP△18+F^mut标记疫苗株对SPF鸡免疫效果实验

1、实验方法 

为测定本发明实施例2救获的MG7-NP△18+F^mut标记疫苗株(微生物保藏编号为：CCTCC NO：V201505；对4周龄SPF鸡的免疫保护性，利用9日龄SPF鸡胚扩增病毒，收集尿囊液，测得该标记疫苗株的EID₅₀为5.62×10⁹/mL，制备成疫苗时将病毒稀释至3.16×10⁹/mL。

病毒稀释后灭活，具体操作为：先将分析纯甲醛(无结晶)溶液用灭菌生理盐水作1：10稀释，再将稀释后的甲醛溶液加入到病毒液中，边加边摇，使甲醛溶液的终浓度为0.15％(如向99mL病毒液中加入1:10稀释的甲醛溶液1mL即可)。充分混匀后移入另一个无菌瓶中，密封后于37℃水浴灭活16h，间隔4-6h振摇一次。病毒液置2～8℃保存。取灭活后的MG7-NP△18+F^mut株病毒液，具体方法为：水相制备：将灭活后检验合格的抗原置于灭菌烧杯中，加入水相体积4％的吐温-80，充分振摇，使吐温-80完全溶解为止，即为水相(30ml)。乳化制苗：取油相2份(60ml)置于灭菌烧杯中，使用IKA T18B型乳化机进行乳化，调至3档(13500rpm)1min内加完水相，然后调至4档(17500rpm)乳化5min，将制备好的疫苗2-8℃保存。LaSota组的疫苗制备及病毒含量与MG7-NP△18+F^mut标记疫苗株相同。

将SPF鸡分别免疫MG7-NP△18+F^mut(300μL，皮下注射)、LaSota(300μL，皮下注射)、MG7-NP△18+F^mut(20μL，肌注)和LaSota(20μL，肌注)各20只，另设非免疫对照组20只，免疫组和非免疫组分别饲养于空气负压过滤隔离器中。免疫后21d翅静脉采血分离血清按常规检测NDV特异HI抗体。

另外，在免疫后21d将免疫组和对照组分别进行分组，每组10只，分别用强毒NDV F48E9和NDV VII-74(本发明人实验室保存用种毒)以1×10⁶EID₅₀剂量经肌肉注射途径进行攻毒，观察两周，统计发病与死亡情况。

2、实验结果 

灭活疫苗MG7-NP△18+F^mut和LaSota分别免疫SPF鸡，免疫后观察21d，免疫组所有雏鸡无任何异常，饲料消耗及生长发育与非免疫对照组无明显差异。

免疫后21d检测血清NDV特异HI抗体水平，MG7-NP△18+F^mut免疫组抗体效价高于LaSota组(表5)。

表5 MG7-NP△18+F^mut标记疫苗株和LaSota株的免疫原性结果

*接种剂量：分别为300μL/只和20μL/只；

**免疫3周后翅下静脉采血，测定HI滴度，计算平均值。

8组免疫组攻毒后未出现任何发病或死亡，完全保护(10/10)，同日龄非免疫对照组则全部发病死亡(0/10)(表6)。

表6 MG7-NP△18+F^mut标记疫苗株和LaSota株的攻毒保护性试验结果

*4周龄SPF雏鸡，分别经颈部皮下和肌肉注射途径接种MG7-NP△18+F^mut疫苗；

**翅下静脉采血，测定HI滴度，计算平均值；

***免疫后三周，分别用NDV F48E9和NDV VII-74强毒通过肌肉注射途径进行攻毒(1×10⁶EID₅₀/只)。

以上结果表明，MG7-NP△18+F^mut标记疫苗一次免疫雏鸡即可诱导高水平的保护性抗体，具有良好的保护效果。

实施例4 MG7-NP△18+F^mut标记疫苗株和LaSota株免疫攻毒后排毒实验

1、实验方法 

为测定本发明实施例2利用反向遗传操作系统救获的MG7-NP△18+F^mut标记疫苗株(微生物保藏编号为：CCTCC NO：V201505)免疫攻毒后的排毒情况，将SPF鸡分别免疫MG7-NP△18+F^mut(300μL，皮下注射)、LaSota(300μL，皮下注射)、MG7-NP△18+F^mut(20μL，肌注)和LaSota(20μL，肌注)。病毒量保持一致，均为3.16×10⁸EID₅₀/100μL(疫苗制备方法同实施例3)。免疫组和非免疫组分别饲养于空气负压隔离器中。在免疫后21d用强毒NDV F48E9和NDVVII-74(本发明人实验室保存用种毒)以1×10⁶EID₅₀剂量经肌肉注射途径 进行攻毒，攻毒后的第2d、4d、6d、8d和10d分别采集喉拭子和泄殖腔拭子，并在攻毒后第3d和6d每组杀3只鸡，采集脏器。将拭子和脏器使用SPF鸡胚进行滴定，检测病毒的排毒情况和脏器带毒情况。

2、实验结果 

分别用NDV F48E9毒株和NDV VII-74攻毒后检测排毒情况，结果表明，LaSota免疫组鸡只的拭子病毒排毒检出率高于MG7-NP△18+F^mut组(表7和表8)；LaSota免疫组鸡只的脏器带毒检出率高于MG7-NP△18+F^mut组(表9和表10)。

表7 MG7-NP△18+F^mut株和LaSota株免疫后攻毒(F48E9株)检测排毒结果

表8 MG7-NP△18+F^mut株和LaSota株免疫后攻毒(NDV VII-74)检测排毒结果

表9 MG7-NP△18+F^mut株免疫后攻毒(F48E9株)检测脏器带毒结果

表10 MG7-NP△18+F^mut株免疫后攻毒(NDV VII-74)检测脏器带毒结果

Claims (10)

1.一株基因VII型新城疫病毒标记疫苗株MG7-NP△18+F^mut，其特征在于，其微生物保藏编号为：CCTCC NO：V201505。

2.按照权利要求1所述的基因VII型新城疫病毒标记疫苗株MG7-NP△18+F^mut，其特征在于：其全基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

3.一种权利要求1或2所述基因VII型新城疫病毒标记疫苗株MG7-NP△18+F^mut的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建基因VII型新城疫病毒G7株基因组全长cDNA质粒prG7；

(2)在prG7基础上将NP蛋白第443-460位18个氨基酸进行缺失突变，且将F蛋白裂解位点第112-117位的氨基酸序列突变为GRQGRL，构建突变质粒pMG7-NP△18+F^mut；

(3)将突变质粒pMG7-NP△18+F^mut与辅助质粒pBSK-NP、pBSK-P和pBSK-L共转染痘病毒感染后的BHK-21细胞，培养72h；然后将细胞刮下，与细胞上清混合过滤后，接种9-11日龄SPF鸡胚，收获病毒液，即得。

4.权利要求1所述的基因VII型新城疫病毒标记疫苗株MG7-NP△18+F^mut在制备新城疫疫苗中的应用。

5.一种预防新城疫的疫苗组合物，其特征在于，包括：免疫有效量的权利要求1所述基因VII型新城疫病毒标记疫苗株MG7-NP△18+F^mut和药学上可接受的佐剂。

6.一种基因VII型新城疫疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述基因VII型新城疫病毒标记疫苗株MG7-NP△18+F^mut进行增殖，收获病毒液，灭活；

(2)向灭活后的病毒液中加入吐温-80，制备水相；

(3)将水相与油相混合，乳化，即得。

7.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述灭活是采用甲醛溶液灭活病毒液；37℃灭活16h。

8.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于：病毒液中甲醛溶液的终浓度为0.15％。

9.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：按照体积比计，步骤(2)吐温-80的加入量为水相体积的4％；步骤(3)水相与油相的比例为1：2。

10.由权利要求6至9任何一项所述制备方法制备得到的新城疫疫苗。