CN107254450A - 克服鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒疫苗载体候选株及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于应用反向遗传和基因替换技术领域，具体涉及克服鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒疫苗载体候选株及其构建方法。所述的候选株是禽副黏病毒I型AI4‑T4FHN，其保藏号CGMCC No：12987。本发明利用已建立的新城疫病毒基因VII型致弱毒AI4株的反向遗传操作平台，将禽副黏病毒2型的囊膜蛋白F和HN胞外区序列对AI4株基因组的对应部分进行替换，拯救得到重组病毒AI4‑T4FHN。禽副黏病毒2型与新城疫病毒交叉反应能力很弱且对鸡不致病。故该嵌合病毒在鸡胚上具有与母本病毒相似的高繁殖能力，同时能在新城疫高母源抗体水平的鸡体内有效复制，是1株新型疫苗载体。

Description

克服鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒疫苗载体候选 株及构建方法

技术领域

本发明涉及应用反向遗传和基因替换技术，拯救一株克服鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒疫苗载体候选株AI4-T4FHN，用于研制新城疫载体疫苗。

背景技术

反向遗传操作技术(Reverse genetics manipulation technique)是指将RNA病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项研究技术[Neumann G,Whitt M A,KawaokaY.Adecade after the generation of a negative-sense RNA virus from clonedcDNA–what have we learned？Journal of General Virology,2002,83(11):2635-2662.]，也叫全长感染性cDNA克隆技术，又常被称为“病毒拯救”。由于最终“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克隆，因此，可通过中间过程中人为加入的DNA环节，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因敲除(缺失)、基因插入、基因置换和基因互补(即构建嵌合病毒)等改造，解决了对RNA病毒基因组难以操作这一难题，为新型疫苗的研制和开发提供了新的思路[Huang Z,Elankumaran S,Panda A,etal.Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector.Poultry Science,2003,82:899-906.]。

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的主要感染鸡、鸽、鹌鹑、火鸡等家禽和野生禽类的一种急性、败血性、高度接触性传染病。NDV是单股、不分节段的负链RNA病毒，属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属成员。按照标准的致病性指标可以将病毒分为速发型(强毒)、中发型(中等毒力)和缓发型(弱毒)。基因组长度大约15kb，其结构为3’-leader-NP-P-M-F-HN-L-trailer-5’，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基质蛋白(Matrix protein,M)、融合蛋白(Fusion protein,F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN)和大分子蛋白(Large protein,L)。其中F,HN蛋白是NDV的囊膜蛋白,可以刺激机体产生保护性抗体，是NDV的主要保护性抗原。经研究表明，成熟的HN蛋白是四聚体，其中位于膜内的第1-26位氨基酸残基为亲水性膜内区,第27-48位氨基酸残基为疏水性跨膜区，胞外区为HN蛋白的主要功能区,包含蛋白的全部抗体识别位点，受体结合位点以及神经氨酸酶(NA)活性位点[Susan C,,Allen P,etc.Crystalstructure of the multifunctional Paramyxovirus hemagglutinin-neuraminidase[J].Nature structural biology,2000,7(11):1068-1074]。F蛋白有三个强疏水区，第一个疏水区位于1～25氨基酸残 基处，为F蛋白N端信号肽区；第二个疏水区位于117～142氨基酸残基处，为融合诱导区，该区域正好是F1N端，当F0裂解产生F1和F2后，F1N端直接与靶细胞膜接触，参与膜融合；第三个疏水区位于500～522氨基酸残基处，与蛋白的胞质区(523～553aa)相邻，为蛋白跨膜区，具有终止蛋白转移和膜锚定功能。[NiiKura M,Matsuura Y,Hattori M,et al.Characterization of HN glycoprotein of NDV expressed by arecombinant baculovirus[J].Virus Res,1991,20:31-43]，

载体病毒最重要的一个特点是能被用来迅速研制出针对新发高致病性传染病的基因工程疫苗。NDV除具备这一特点外，还具有遗传稳定性好、不存在与细胞基因组整合的可能、高繁殖性能、免疫刺激性强等诸多优点，可作为疫苗载体[Bukreyev A,SkiadopoulosM H,Murphy B R,et al.Nonsegmented negative-strand viruses as vaccine vectors[J].Journal of Virology,2006,80(21):10293-10306.]。在NDV基因组内插入外源基因后的重组病毒，可在动物体内复制并稳定持续地表达外源蛋白，用此重组病毒作为疫苗,可以诱导机体产生针对新发传染病和ND的双重免疫保护力[Veits J,Wiesner D,Fuchs W,etal.Newcastle disease virus expressing H5hemagglutinin gene protects chickensagainst Newcastle disease and avian influenza[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(21):8197-8202.Schroer D,Veits J,Grund C,et al.Vaccination withNewcastle disease virus vectored vaccine protects chickens against highlypathogenic H7avian influenza virus[J].Avian Dis,2009,53(2):190-197.]。

疫苗接种是中国养禽业预防控制ND的重要手段，接种过ND疫苗的母鸡，其母源抗体能通过卵黄囊传递给雏鸡，而使雏鸡产生被动免疫力，故雏鸡体内含有高滴度的ND抗体。有母源抗体的雏鸡用弱毒疫苗免疫后，ND载体疫苗进入雏鸡体内，很快被其中和。只有当母源抗体降到较低水平(小于3log2,一般要15-20日龄后)时，对弱毒活疫苗免疫影响才非常小，方可产生较为可靠的免疫力。[Sarfati M D,Lozano D B,Soto P E,Castro P F,Flores C R et al.(2010)Protective dose of a recombinant Newcastle diseaseLaSota-avian influenza virus H5vaccine against H5N2highly pathogenic avianinfluenza virus and velogenic viscerotropic Newcastle disease virus inbroilers with high maternal antibody levels.[J].Avian Dis.54(1Suppl):239-241.]。这极大限制了NDV载体疫苗在商品鸡群的应用。

禽副粘病毒2型(Avian Paramyxovirus type-2,APMV-2)属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus),根据抗原性差异将该属分为10个血清型，同属的成员还包括禽副黏病毒1型(Avian Paramyxovirus type-1,APMV-1),该型的成员只有新城疫病毒(NDV)。APMV-2基因结构与NDV十分相似,编码包括囊膜蛋白在内的六个结构蛋白，可在9～10日龄鸡胚尿囊腔中繁殖,但鸡胚没有典型病变。APMV-2单纯感染鸡时未能引起任何临床症 状，对鸡不致病。病毒粒子能够在鸡上呼吸道有效复制，引起鸡的固有和特异性免疫应答。大量动物实验证明，NDV与APMV-2、6、10的交叉保护率最低而其中APMV-2在鸡上的复制效率最高[Warke,A.Stallknecht,D.Williams,S.M.Comparativestudy on the pathogenicity and immunogenicity of wild bird isolates of avianparamyxovirus 2,4,and 6in chickens[J].Avian Pathol,2008,37(04):429-34.]，因此，APMV-2是应用于高水平新城疫母源抗体鸡群的理想疫苗载体候选毒株。其他血清型副黏病毒已经被应用于疫苗的研究：表达NDV F和HN蛋白的重组的禽副粘病毒3型疫苗可以用于保护鸡群免于NDV强毒的感染[Kumar,S.；Nayak,B.；Collins,P.L.；Samal,S.K.Evaluationof the newcastle disease virus f and hn proteins in protective immunity byusing a recombinant avian paramyxovirus type 3vector in chickens[J].J Virol2011,85,6521-6534.]，但是因为其抗原仍能与NDV抗体发生交叉反应，所以依旧受到NDV母源抗体的影响。将HN蛋白和F蛋白替换为禽副粘病毒8型(APMV-8)相应部分的嵌合La sota疫苗可以在NDV免疫鸡群中表达外源蛋白[Steglich,C.；Grund,C.；Ramp,K.；Breithaupt,A.；Hoper,D.；Keil,G.；Veits,J.；Ziller,M.；Granzow,H.；Mettenleiter,T.C.,etal.Chimeric newcastle disease virus protects chickens against avian influenzain the presence of maternally derived ndv immunity[J].PloS one 2013,8,e72530.]，而NDV与APMV-8的交叉反应性最好，在母源抗体水平较高时该疫苗的免疫效果仍有可能被削弱。利用成熟的反向遗传技术，人们就抗ND母源抗体疫苗的研究日益深入，但是能够真正应用于实际中，解决问题的疫苗还待创造。

在NDV吸附和入侵细胞的过程中，F和HN蛋白发挥了关键作用。现有的研究结果表明，F和HN蛋白是NDV的主要毒力决定因子，由于两者还是决定NDV抗原差异和宿主选择差异的主要因素，并且在研究病毒变异和疫苗生产中起指导作用。M蛋白在病毒感染过程中通过与病毒RNP以及表面糖蛋白相互作用，促进病毒的装配和出芽。研究表明，M蛋白装配出芽时通过F、HN蛋白的胞内区和跨膜区募集表面糖蛋白，F蛋白的空间构象又受到HN蛋白茎部的影响，这三个囊膜蛋白之间存在相互作用，共同影响了病毒的复制效率和毒力[Assemblyof sendai virus:M protein interacts with f and hn proteins and with thecytoplasmic tail and transmembrane domain of f protein[J].Virology 2000,276,289-303.]。仅将NDV F和HN蛋白的胞外区换作不同病毒的功能相似区域是否会降低病毒的复制效率和改变抗原性，国内尚未研究。

发明内容

为了克服肉鸡雏鸡中普遍存在的ND母源抗体对NDV活载体疫苗的影响,本发明提供一种新型NDV疫苗载体病毒，该载体病毒的复制不受到ND母源抗体的干扰。

本发明的原理是：利用APMV-2毒株在鸡上高效繁殖和与ND血清低反应的能力，对NDV 的两个抗原基因的胞外区进行替换修饰，拯救出与NDV血清抗体反应能力弱，并且能够在鸡群中有效复制的疫苗载体。2011年胡增磊等对分离的VIId亚型NDV毒株JS5/05的F蛋白裂解位点突变后成功构建了全长克隆载体pNDV/rAI4，经反向遗传操作获得了致弱病毒AI4，其尿囊液的HA效价为10log2[Hu Z,Hu S,Meng C,et al.Generation of a GenotypeVII Newcastle Disease Virus Vaccine Candidate with HighYield in EmbryonatedChicken Eggs.Avian Diseases 2011,55(3):1759-1769]。因此，本发明在上述基础上，以pNDV/rAI4为骨架，将APMV-2的囊膜蛋白F、HN胞外区替换到AI4的对应位置，构建克服雏鸡ND母源抗体影响的嵌合NDV疫苗载体候选株AI4-T4FHN。

本发明提供的一株克服鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒疫苗载体候选株，是禽副黏病毒I型(Avian Paramyxovirus type-1)AI4-T4FHN，其保藏号CGMCCNo.12987。

本发明还公开了所述克服鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒疫苗载体候选株的构建方法：是以禽副黏病毒2型的两个囊膜糖蛋白F基因和HN基因胞外区片段对NDVAI4株基因组的对应部分进行替换，得到重组病毒AI4-T4FHN。

本发明的方法具体包括以下步骤：

(1)全长克隆rAI4-T4FHN的构建

1)新城疫病毒AI4株基因组的修饰：在NDV全长转录载体pNDV/rAI4 3250nt处突变碱基引入Pac I酶切位点，构建全长转录载体pNDV/rAI4-Pac I；

2)AI4基因组F和HN胞外区的替换：将合成的序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8分别克隆进质粒pUC17，获得中间质粒pUC-T4F/Pac I和pUC-T4HN/FspA I，用Pac I和AflII酶切这两个质粒，将pUC-T4F/Pac I合成的基因与pUC-T4HN/FspA I合成的基因相连，构建中间质粒pUC-T4FHN；

利用酶切位点Pac I和FspA，将序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的嵌合的APMV-2F和HN基因从pUC-T4FHN导入到全长转录载体pNDV/rAI4-Pac I中，从而获得新的转录载体pNDV/rAI4-T4FHN；

(2)重组病毒AI4-T4FHN株的拯救

将转录载体pNDV/rAI4-T4FHN与pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞，60h后接种9～11日龄SPF鸡胚，37℃孵育，获得重组病毒AI4-T4FHN。

其中步骤1)具体是：

在NDV全长转录载体pNDV/rAI4 3250nt处突变碱基引入Pac I酶切位点，构建全长转录载体pNDV/rAI4-Pac I。根据AI4株的序列设计突变引物Age I F/M R和M F/BstZ17IR，以pNDV/rAI4质粒为模板扩增，使用Overlap PCR将两个片段连接，克隆到pCR2.1载体，构建中间质粒pCR2.1-Pac I。利用全长上的酶切位点Age I和BstZ17I将Pac I酶切位点替换进全长，构建全长转录载体pNDV/rAI4-Pac I。

Age I F：5’-GGGTGAAATGACGCTCAATAAACTCTCA-3’(SEQ ID NO.1)

M R：5’-ATTAATAATGCTGCTGGATTGGTTG-3’(SEQ ID NO.2)

M F：5’-ACCAATCCAGCAGCATTATTAATTAA-3’(SEQ ID NO.3)

BstZ17I R：5’-ACCCTGTCTGAGACGAGGTGTAT-3’(SEQ ID NO.4)。

本发明通过分析APMV-2经典毒株rAPMV-2-Yuc(GenBank:LC187305.1)的基因序列，使用基因合成的方法将表面囊膜蛋白F和HN的胞外区与AI4囊膜蛋白的胞内区基因进行嵌合，利用已建立的NDV AI4株的反向遗传操作平台，将嵌合的F和HN基因替换AI4株的对应部分，构建出重组质粒pNDV/rAI4-T4FHN，该重组质粒与三个辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞后，获得了具有较高繁殖性能嵌合疫苗载体株AI4-T4FHN，适合疫苗的大规模生产，另外，该嵌合病毒能够在新城疫抗体存在的情况下在鸡群中高效复制，作为疫苗载体在控制当前多种疾病的突发和流行显示出广阔的应用前景。

附图说明

图1重组质粒pNDV/rAI4-T4FHN构建模式图。

图2重组病毒AI4-T4FHN的RT-PCR鉴定电泳图。

图3疫苗载体毒株AI4-T4FHN(A)和LaSota弱毒苗(B)免疫商品鸡和SPF鸡的血清转化水平图。

具体实施方式

本发明构建的嵌合新城疫病毒疫苗载体毒株AI4-T4FHN于2016年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；分类命名为：禽副黏病毒I型，其保藏号CGMCC No.12987。

实施例1：

重组质粒pNDV/rAI4-T4FHN构建模式图如图1。

构建步骤一：新城疫病毒AI4株基因组的修饰

生物材料准备：

NDV AI4株的全长表达载体pNDV/rAI4(Hu Z,Hu S,Meng C,et al.Generation ofa Genotype VII Newcastle Disease Virus Vaccine Candidate with HighYield inEmbryonated Chicken Eggs.Avian Diseases 2011,55(3):1759-1769)由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室构建、保存。pCR2.1载体：购自Invitrogen公司；AMV反转录酶、High fidelity DNA polymerase、T4DNA连接酶、Agarose Gel DNA ExtractionKit购自Roche公司；转染试剂SuperFect和质粒抽提试 剂盒(QIAprep Spin MiniPrep Kit)为QIAGEN公司产品；其余常规试剂均为国产分析纯。

设计突变引物Age I F/M R和M F/BstZ17I R，在AI4全长质粒3250nt处突变碱基，添加Pac I酶切位点，引物序列如下：

Age I F：5’-GGGTGAAATGACGCTCAATAAACTCTCA-3’(SEQ ID NO.1)

M R：5’-ATTAATAATGCTGCTGGATTGGTTG-3’(SEQ ID NO.2)

M F：5’-ACCAATCCAGCAGCATTATTAATTAA-3’(SEQ ID NO.3)

BstZ17I R：5’-ACCCTGTCTGAGACGAGGTGTAT-3’(SEQ ID NO.4)

突变碱基以斜体标注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。

PCR反应：以全长表达载体pNDV/AI4为模板配制如下PCR反应体系：

PCR反应循环参数：94℃预变性5min，94℃50s，60℃1min15s，72℃延伸，延伸时间为1min/kb，15个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

Overlap PCR反应体系及条件：

PCR反应循环参数：94℃预变性5min；94℃50s，58℃退火1min，72℃延伸2min，2个循环之后再94℃40s，64℃退火1min，72℃延伸2min，15个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

回收目的片段与pCR2.1载体相连，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，阳性质粒命名为pCR2.1-Pac I。利用酶切位点Age I/BstZ17I将酶切位点Pac I导入全长表达载体pNDV/AI4，获得新的表达载体pNDV/AI4-Pac I。

步骤二：以rAPMV-2-Yuc株的F和HN胞外区替换AI4基因组相应部分

生物材料准备：

pCR2.1载体：购自Invitrogen公司；AMV反转录酶、High fidelity DNApolymerase、T4DNA连接酶、Agarose Gel DNA ExtractionKit购自Roche公司；质粒抽提试剂盒(QIAprep Spin MiniPrep Kit)为QIAGEN公司产品；其余常规试剂均为国产分析纯。

1、表达嵌合囊膜蛋白基因的质粒pUC-T4F/Pac I和pUC-T4HN/FspA I的合成

根据GenBank中发表的1株APMV-2毒株rAPMV-2-Yuc(GenBank:LC187305.1)的全长序列，利用胞外区在线预测网站(http://minnou.cchmc.org)预测rAPMV-2-Yuc的F和HN基因的胞外区,。用SnapGene基因编辑软件将rAPMV-2-Yuc F基因胞外区(1-1440nt)和AI4F基因胞内区(1513-1662nt)基因序列拼接到一起，人为创建一个嵌合基因F，具体序列见SEQID NO.5(其中1-1440bp为rAPMV-2-Yuc F基因胞外区；1441-1590bp为AI4F蛋白的胞内区)。用同样的方法将rAPMV-2-Yuc HN基因胞外区(145-1743nt)和AI4HN基因胞内区(1-165nt)基因序列拼接，创建嵌合HN基因，具体序列见SEQ ID NO.6(其中1-165bp为AI4HN基因胞内区；166-1764bp为rAPMV-2-Yuc HN基因胞外区)。

设计并合成SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。

SEQ ID NO.7中，PacI酶切位点为1-6bp和2967-2972bp；7-1304bp和2895-2966bp为酶切位点到F基因之间的AI4序列；1305-2894bp为SEQ ID NO.5。

SEQ ID NO.8中，1-6bp、3300-3305bp为酶切位点PacI，16-21bp为酶切位点AflII；22-149bp和1914-3300bp为酶切位点到HN基因之间的AI4序列；150-1913bp为SEQ ID NO.6。

将合成的序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8分别克隆进商品质粒pUC17，获得中间质粒pUC-T4F/Pac I和pUC-T4HN/FspA I，其中pUC-T4F/Pac I中合成的序列SEQ ID NO.7由AI4基因组中Pac I酶切位点到F基因之前的序列以及嵌合F基因组成；pUC-T4HN/FspA I中合成的序列由SEQ ID NO.8含有以及AI4基因组中HN基因之后到FspA I酶切位点的序列和嵌合HN基因pUC-T4HN/FspA I合成的基因在5‘端添加了酶切位点Pac I，AflII为F和HN基因之间的酶切位点。用Pac I和AflII酶切这两个质粒，将pUC-T4F/Pac I合成的基因与pUC-T4HN/FspA I合成的基因相连，构建中间质粒pUC-T4FHN。

2、囊膜糖蛋白基因的替换：

pUC-T4HN/FspA I合成的基因在5‘端添加了酶切位点Pac I，AflII为F和HN基因之间的酶切位点。用Pac I和AflII酶切这两个质粒，将pUC-T4F/Pac I合成的基因与pUC-THN/FspA I合成的基因相连，构建中间质粒pUC-T4FHN。利用酶切位点Pac I和FspA，将嵌合的APMV-2F(SEQ ID NO.5)和HN(SEQ ID NO.6)基因从pUC-T4FHN导入到全长转录载体pNDV/rAI4-Pac I中，获得新的转录载体pNDV/rAI4-T4FHN。

3、重组质粒pNDV/rAI4-T4FHN的酶切鉴定：

由于分离株T4基因组中HN基因序列中不含有Hind III酶切位点，而pNDV/AI4上HN基因序列上却含此位点，但NDV AI4株全长cDNA 14056nt和转录载体的292nt处也存在此酶切位点，因此，HN基因被成功替换的阳性质粒，经Hind III酶切后会出现10.8kb、6.0kb和1.4kb大小的3条目的片段。

步骤三：重组病毒AI4-T4FHN株的拯救

生物材料准备:

可稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高研究员惠赠。

真核表达质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L(胡顺林，张艳梅，孙庆，刘玉良等.鹅源新城疫病毒拯救体系的建立[J].微生物学通报.2007，34(3))：由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室构建、保存。其中，表达NP和P基因的真核表达质粒pCI-NP、pCI-P还公开于(刘玉良.(2005).从cDNA克隆产生感染性ZJ1株鹅源新城疫)；表达L基因的真核表达质粒pCI-L还公开于(胡顺林.(2007).鹅源新城疫病毒反向遗传技术平台的建立及其应用)。

SPF种蛋购自北京梅里亚公司，在扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室孵化。

1、重组病毒的拯救

转染时所用质粒(pNDV/rAI4-T4FHN、pCI-NP、pCI-P和pCI-L)均采用QIAprepSpinMiniPrepKit抽提。将pCI-NP、pCI-P和pCI-L 3个辅助质粒与重组NDV基因组全长cDNA克隆pNDV/rAI4-T4FH共转染BSR-T7/5细胞，18-24h后加入终浓度为10％SPF胚尿囊液，60h后将转染样品冻融1次后，收获并接种9～11日龄SPF鸡胚，收集鸡胚尿囊液，按OIE标准测定血凝效价，所测HA效价为10log₂，血凝特性能被针对APMV-2的多克隆抗体抑制。

2、RT-PCR验证获救病毒AI4-T4FHN

红细胞凝集试验(hemagglutination,HA)和红细胞凝集抑制实验(hemagglutination inhibition,HI)检测均为阳性的尿囊液，在SPF鸡胚上传4代后，收集尿囊液抽提病毒的总RNA，用6nt随机引物反转录成cDNA后用于RT-PCR反应。

用引物2-F和2-R扩增嵌合基因，长度约为3200bp(见图2)，回收目的片段进行测序鉴 定，扩增片段的测序结果显示rAPMV-2-Yuc株的囊膜蛋白插入成功。

2-F：5’-CATTCAGGACACAGCATGATACCCGTGTTAATTGCCAGC-3’(SEQ ID NO.9)

2-R：5’-TCAATTGGGGAGTTCCTTCCG-3’(SEQ ID NO.10)。

实施例2：重组病毒的生物学特性鉴定

1、MDT与ICPI的测定

鸡胚平均致死时间(mean death time,MDT)测定：用灭菌生理盐水将重组病毒rAI4-gB分别作10倍(10^-6、10^-7……10^-10)梯度稀释，每个稀释度接种5枚9～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，同时设置5枚接种生理盐水的鸡胚作为对照。37℃孵育，弃去24h内死亡的鸡胚，之后每隔12h观察一次直至120h，按OIE标准方法计算病毒的MDT。结果：病毒5个稀释度的接种鸡胚在120h内没有死亡，该毒株的MDT值大于120h。

雏鸡脑内接种致病指数(intracerebral pathogenicity index,ICPI)测定：取HA滴度大于4log2的新鲜病毒尿囊液经无菌检验后以不含抗生素灭菌的生理盐水重做10倍稀释，经脑内接种10只1日龄的SPF鸡，每只脑内接种0.05mL，同时设置10只注射生理盐水的SPF鸡作为对照。按OIE标准方法对鸡进行打分，计算病毒的ICPI。尿囊液经脑内接种1日龄SPF鸡后均未发病或死亡，ICPI为0，表明获救病毒的毒力完全符合弱毒的标准。

2、细胞感染试验

载体疫苗株AI4-T4FHN作10^-3稀释后，接种鸡胚成纤维细胞48h后，细胞没有出现病变，说明拯救后病毒对细胞没有毒性。

实施例3：疫苗载体株的免疫效力试验

将1日龄商品鸡和SPF鸡随机分组，10只/组，进行隔离饲养，经滴鼻点眼分别接种疫苗载体毒株AI4-T4FHN和LaSota弱毒苗，10⁶EID₅₀/只，同时设PBS接种组作为对照。每只试验鸡免疫后2周采集静脉血，检测针对免疫毒株的血清转化水平。结果如图3，AI4-T4FHN和LaSota免疫鸡群未表现出任何临床症状，说明AI4-T4FHN疫苗载体毒株对鸡不致病，可以安全使用。LaSota弱毒苗免疫1日龄商品鸡受母源抗体影响较大，不能有效地刺激抗体产生，仅能维持血清效价；AI4-T4FHN疫苗载体毒株在SPF和商品鸡中都能够良好地复制，并且有效地刺激产生抗体产生。

经试验表明：AI4-T4FHN能够在含有高水平ND母源抗体的商品鸡群中复制并且有效地刺激免疫系统，显示了广阔的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 克服鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒疫苗载体候选株及构建方法

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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atgaatcaag cactcgtgat tttgttggta tctttccagc tcggcgttgc cttagataac 60

tcagtgttgg ctccaatagg agtagctagc gcacaggagt ggcaactggc ggcatataca 120

acgaccctca cagggaccat cgcagtgaga tttatcccgg tcctgcctgg gaacctatca 180

acatgtgcac aggagacgct gcaggaatat aatagaactg tgactaatat cttaggcccg 240

ttgagagaga acttggatgc tctcctatct gacttcgata aacctgcatc gaggttcgtg 300

ggcgccatca ttgggtcggt ggccttgggg gtagcaacag ctgcacaaat cacagccgcc 360

gtggctctca atcaagcaca agagaatgcc cggaatatat ggcgtctcaa ggaatcgata 420

aagaaaacca atgcggctgt gttggaattg aaggatggac ttgcaacgac tgctatagct 480

ttggacaaag tgcaaaagtt tatcaatgat gatattatac cacagattaa ggacattgac 540

tgccaggtag ttgcaaataa attaggcgtc tacctctcct tatacttaac agagcttaca 600

actgtatttg gttctcagat cactaatcct gcattatcaa cgctctctta ccaggcgctg 660

tacagcttat gtggagggga tatgggaaag ctaactgagc tgatcggtgt caatgcaaag 720

gatgtgggat ccctctacga ggctaacctc ataaccggcc aaatcgttgg atatgaccct 780

gaactacaga taatcctcat acaagtatct tacccaagtg tgtctgaagt gacaggagtc 840

cgggctactg agttagtcac tgtcagtgtc actacaccaa aaggagaagg gcaggcaatt 900

gttccgagat atgtggcaca gagtagagtg ctgacagagg agttggatgt ctcgacttgt 960

aggtttagca aaacaactct ttattgtagg tcgattctca cacggcccct accaactttg 1020

atcgccagct gcctgtcagg gaagtacgac gattgtcagt acacaacaga gataggagcg 1080

ctatcttcga gattcatcac agtcaatggt ggagtccttg caaactgcag agcaattgtg 1140

tgtaagtgtg tctcaccccc gcatataata ccacaaaacg acattggctc cgtaacagtt 1200

attgactcaa gtatatgcaa ggaagttgtc ttagagagtg tgcagcttag gttagaagga 1260

aagctgtcat cccaatactt ctccaacgtg acaattgacc tttcccaaat cacaacgtca 1320

gggtcgctgg atataagcag tgaaattggt agcattaaca acacagttaa tcgggtcgac 1380

gagttaatca aggaatccaa cgagtggctg aacgctgtga acccccgcct tgtgaacaat 1440

attgttctaa ctgtcatttc cctaattttc ggtgcactta gtctggtttt agcgtgttac 1500

ctgatgtaca aacagaaggt acaacagaag accttgctat ggcttgggaa taataccctc 1560

gatcagatga gagccaccac aagagcatga 1590

<210> 6

<211> 1764

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggaccgcg cggttaacag agtcgtgctg gagaatgagg aaagagaagc aaagaacaca 60

tggcgcctag tattccggat cgcagtctta cttttaatgg taatgactct agctatctcc 120

gcggctgccc tggcacacag catgggggcc agtacgccgc acgacctgga taacatggct 180

tcgaacacat ggacaacaac tgaggctgac cgtgtgatat ctagcatcac gactccgctc 240

aaagtccctg tcaaccagat taatgacatg tttcggattg tagcgcttga cctacctctg 300

cagatgacat cattacagaa agaaataaca tcccaagtcg ggttcttggc tgaaagtatc 360

aacaatgttt tatccaagaa tggatctgca ggcctggttc ttgttaatga ccctgaatat 420

gcagggggga tcgctgtcag cttgtaccaa ggagatgcat ctgcaggcct aaatttccag 480

cccatttctt taatagaaca tccaagtttt gtccctggtc ctactactgc taagggctgt 540

ataaggatcc cgaccttcca tatgggccct tcacattggt gttactcaca taacatcatt 600

gcatcaggtt gccaggatgc gagccactcc agtatgtata tctctctggg ggtgctgaaa 660

gcatcgcaga ccgggtcgcc tatcttcttg acaacggcca gccatctcgt ggatgacaac 720

atcaaccgga agtcatgcag catcgtagcc tcaaaatacg gttgtgatat cctatgcagt 780

attgtgattg aaacagagaa tgaggattat aggtctgatc cggctactag catgattata 840

ggtaggctgt tcttcaacgg gtcatacaca gagagcaaga ttaacacagg gtccatcttc 900

agtctattct ctgctaacta ccctgcggtg gggtcgggta ttgtagtcgg ggatgaagcc 960

gcattcccaa tatatggtgg ggtcaagcag aacacatggt tgttcaacca gctcaaggat 1020

tttggttact tcacccataa tgatgtgtac aagtgcaatc ggactgatat acagcaaact 1080

atcctggatg catacaggcc acctaaaatc tcaggaaggt tatgggtaca aggcatccta 1140

ttgtgcccag tttcactgag acctgatcct ggctgtcgct taaaggtgtt caataccagc 1200

aatgtgatga tgggggcaga agcgaggttg atccaagtag gctcaaccgt gtatctatac 1260

caacgctcat cctcatggtg ggtggtagga ctgacttaca aattagatgt gtcagaaata 1320

acttcacaga caggtaacac actcaaccat gtagacccca ttgcccatac aaagttccca 1380

agaccatctt tcaggcgaga tgcgtgtgcg aggccaaaca tatgccctgc tgtctgtgtc 1440

tccggagttt atcaggacat ttggccgatc agtacagcca ccaataacag caacattgtg 1500

tgggttggac agtacttaga agcattctat tccaggaaag acccaagaat agggatagca 1560

acccagtatg agtggaaagt caccaaccag ctgttcaatt cgaatactga gggagggtac 1620

tcaaccacaa catgcttccg gaacaccaaa cgggacaagg catattgtgt agtgatatca 1680

gagtacgctg atggggtgtt cggatcatac aggatcgttc ctcagcttat agagattaga 1740

acaaccaccg gtaaatctga gtga 1764

<210> 7

<211> 2972

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttaattaaga aaaaatacgg gtagaatcaa agtgcctcga ttgcaccaaa atggactcat 60

ccaggacaat cgggctgtac tttgattctg ccctcccttc cagcagccta ttagcatttc 120

cgattatctt acaagacaca ggagacggga agaaacaaat caccccacaa tacaggatcc 180

agcgtcttga ttcgtggaca gacagtaagg aagactcggt atttatcacc acctacgggt 240

tcatctttca agttgggaat gaagaagcca ccgtcggtgt gatcaatgac aatcccaggc 300

acgagctact ctcttccgca atgctctgct tagggagtgt cccgaacaac ggagatcttg 360

ttgagctggc gagagcctgc ctcaccatgg tggtaacctg caagaagagt gcaactaaca 420

ctgagagaat agtcttctca gtagtgcagg cacctcgggt gctgcaaaat tgtatggttg 480

tgtcgaatag gtactcatca gtgaatgcag tgaagcatgt gaaggcgccc gaaatgatcc 540

ctgggagcgg agccctagag tatgaagtga tatttgtctc tttgactgtg gtgccgagaa 600

gggatgtcta caggatccca actgcagtat tgaaagtgtc tggctcaagc ctgtacaatc 660

ttgcgctcaa tgtcactatt gatgtggacg tggatccgaa gagcccgcta gtcaaatccc 720

tttctaagtc tgatagcgga tactatgcga atctttttct gcatatcggg cttatgtcca 780

ctgtagataa gagaggaaag aaagtgacat ttgacaagat agaggaaaag ataaggagac 840

tcaatctatc tgttgggctc agtgatgtgc tcggaccctc tgtgcttgtg aaggcgagag 900

gtgcacggac taagctactt gctcctttct tctctagcag tgggacagcc tgctatccta 960

tagcaaatgc ctctccccag gttgccaaga tactctggag ccagaccgcg cacctgcgga 1020

gcgtgaaagt catcattcaa gccggcactc agcgtgctgt cgcagtgacc gctgatcatg 1080

aggtaacctc cactaagata gagaggaggc acgccattgc taaatacaat cctttcagga 1140

aataagttgc atccctaaga ctgcagttca cctgctttcc tgaatcacca tgacaccaga 1200

taatgatcca tctcgactgc ttatagttag ttcacctgtc tagcaaatta gaaaaaacac 1260

gggtagaaga gtctggatcc cgaccggcac attcaggaca cagcatgaat caagcactcg 1320

tgattttgtt ggtatctttc cagctcggcg ttgccttaga taactcagtg ttggctccaa 1380

taggagtagc tagcgcacag gagtggcaac tggcggcata tacaacgacc ctcacaggga 1440

ccatcgcagt gagatttatc ccggtcctgc ctgggaacct atcaacatgt gcacaggaga 1500

cgctgcagga atataataga actgtgacta atatcttagg cccgttgaga gagaacttgg 1560

atgctctcct atctgacttc gataaacctg catcgaggtt cgtgggcgcc atcattgggt 1620

cggtggcctt gggggtagca acagctgcac aaatcacagc cgccgtggct ctcaatcaag 1680

cacaagagaa tgcccggaat atatggcgtc tcaaggaatc gataaagaaa accaatgcgg 1740

ctgtgttgga attgaaggat ggacttgcaa cgactgctat agctttggac aaagtgcaaa 1800

agtttatcaa tgatgatatt ataccacaga ttaaggacat tgactgccag gtagttgcaa 1860

ataaattagg cgtctacctc tccttatact taacagagct tacaactgta tttggttctc 1920

agatcactaa tcctgcatta tcaacgctct cttaccaggc gctgtacagc ttatgtggag 1980

gggatatggg aaagctaact gagctgatcg gtgtcaatgc aaaggatgtg ggatccctct 2040

acgaggctaa cctcataacc ggccaaatcg ttggatatga ccctgaacta cagataatcc 2100

tcatacaagt atcttaccca agtgtgtctg aagtgacagg agtccgggct actgagttag 2160

tcactgtcag tgtcactaca ccaaaaggag aagggcaggc aattgttccg agatatgtgg 2220

cacagagtag agtgctgaca gaggagttgg atgtctcgac ttgtaggttt agcaaaacaa 2280

ctctttattg taggtcgatt ctcacacggc ccctaccaac tttgatcgcc agctgcctgt 2340

cagggaagta cgacgattgt cagtacacaa cagagatagg agcgctatct tcgagattca 2400

tcacagtcaa tggtggagtc cttgcaaact gcagagcaat tgtgtgtaag tgtgtctcac 2460

ccccgcatat aataccacaa aacgacattg gctccgtaac agttattgac tcaagtatat 2520

gcaaggaagt tgtcttagag agtgtgcagc ttaggttaga aggaaagctg tcatcccaat 2580

acttctccaa cgtgacaatt gacctttccc aaatcacaac gtcagggtcg ctggatataa 2640

gcagtgaaat tggtagcatt aacaacacag ttaatcgggt cgacgagtta atcaaggaat 2700

ccaacgagtg gctgaacgct gtgaaccccc gccttgtgaa caatattgtt ctaactgtca 2760

tttccctaat tttcggtgca cttagtctgg ttttagcgtg ttacctgatg tacaaacaga 2820

aggtacaaca gaagaccttg ctatggcttg ggaataatac cctcgatcag atgagagcca 2880

ccacaagagc atgaatgcag ataagaggtg gacagatacc caacagcagc ctgtgtgtca 2940

attccgataa cctgtcaagt agaagactta ag 2972

<210> 8

<211> 3305

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttaattagta gaagacttaa gaaaaaatta ctgggaacaa gcaaccaaag agcaatgcac 60

gggtagaacg gtcagaggag ccacccttca atcgaaaatt aggcttcaca acattcgttc 120

taccacatca ccaacaacaa gagtcaatca tggaccgcgc ggttaacaga gtcgtgctgg 180

agaatgagga aagagaagca aagaacacat ggcgcctagt attccggatc gcagtcttac 240

ttttaatggt aatgactcta gctatctccg cggctgccct ggcacacagc atgggggcca 300

gtacgccgca cgacctggat aacatggctt cgaacacatg gacaacaact gaggctgacc 360

gtgtgatatc tagcatcacg actccgctca aagtccctgt caaccagatt aatgacatgt 420

ttcggattgt agcgcttgac ctacctctgc agatgacatc attacagaaa gaaataacat 480

cccaagtcgg gttcttggct gaaagtatca acaatgtttt atccaagaat ggatctgcag 540

gcctggttct tgttaatgac cctgaatatg caggggggat cgctgtcagc ttgtaccaag 600

gagatgcatc tgcaggccta aatttccagc ccatttcttt aatagaacat ccaagttttg 660

tccctggtcc tactactgct aagggctgta taaggatccc gaccttccat atgggccctt 720

cacattggtg ttactcacat aacatcattg catcaggttg ccaggatgcg agccactcca 780

gtatgtatat ctctctgggg gtgctgaaag catcgcagac cgggtcgcct atcttcttga 840

caacggccag ccatctcgtg gatgacaaca tcaaccggaa gtcatgcagc atcgtagcct 900

caaaatacgg ttgtgatatc ctatgcagta ttgtgattga aacagagaat gaggattata 960

ggtctgatcc ggctactagc atgattatag gtaggctgtt cttcaacggg tcatacacag 1020

agagcaagat taacacaggg tccatcttca gtctattctc tgctaactac cctgcggtgg 1080

ggtcgggtat tgtagtcggg gatgaagccg cattcccaat atatggtggg gtcaagcaga 1140

acacatggtt gttcaaccag ctcaaggatt ttggttactt cacccataat gatgtgtaca 1200

agtgcaatcg gactgatata cagcaaacta tcctggatgc atacaggcca cctaaaatct 1260

caggaaggtt atgggtacaa ggcatcctat tgtgcccagt ttcactgaga cctgatcctg 1320

gctgtcgctt aaaggtgttc aataccagca atgtgatgat gggggcagaa gcgaggttga 1380

tccaagtagg ctcaaccgtg tatctatacc aacgctcatc ctcatggtgg gtggtaggac 1440

tgacttacaa attagatgtg tcagaaataa cttcacagac aggtaacaca ctcaaccatg 1500

tagaccccat tgcccataca aagttcccaa gaccatcttt caggcgagat gcgtgtgcga 1560

ggccaaacat atgccctgct gtctgtgtct ccggagttta tcaggacatt tggccgatca 1620

gtacagccac caataacagc aacattgtgt gggttggaca gtacttagaa gcattctatt 1680

ccaggaaaga cccaagaata gggatagcaa cccagtatga gtggaaagtc accaaccagc 1740

tgttcaattc gaatactgag ggagggtact caaccacaac atgcttccgg aacaccaaac 1800

gggacaaggc atattgtgta gtgatatcag agtacgctga tggggtgttc ggatcataca 1860

ggatcgttcc tcagcttata gagattagaa caaccaccgg taaatctgag tgagaagcta 1920

gacgtggccg attgagccaa tcataggatg gttaggaaga cgacaccgcg ccaatcatct 1980

cccataatgc ttagagtcaa gctgaatatt aacataagcc aggatcccgt gttgtcgggc 2040

aaccacaatc tgacaatgct gatatgatta ttctgagtct cgcccactgt cactttatta 2100

agaaaaaaca caagaagcat tgacatataa gggaaaacaa ccaacaaggg agaacacggg 2160

taggacatgg cgggctccgg tcccgaaagg gcagagcacc agatcatcct accagagtca 2220

catctatcct ctccattggt caagcacaaa ttgctatact actggaaatt gaccgggcta 2280

ccgcttcctg atgaatgcga ctttgatcat ctcattatca gcaggcaatg gaagagaata 2340

ctggagtcgg ccactcctga cacagagaga atgataaaac tcgggcgggc agtgcaccag 2400

actctcaacc acaattccaa gataaccgga gtgctccatc ccaggtgttt aggagaactg 2460

gctagtattg aggtccctga ttcaactaac aaattccgga agattaaaaa gaagatccag 2520

attcacaaca caaggtatgg agacctgttc acaaagctgt gcacgcaagt tgagaagaaa 2580

ttgctaggat catctcggtc taataatgtc ccacgatcag aggaattcag cagcatccgt 2640

acagatccgg cattctggtt tcactcaaaa tggtccagag ccaagttcgc gtggctccat 2700

ataaaacaag tccaaaggca tctgattgta gcagcaagga caaggtctgc agtcaacaag 2760

ttagtaacat taagtcataa gataggccac gtctttgtta ctcctgagct tgtcattgtg 2820

acacatacag atgagaacaa gttcacatgc ctcacccagg aacttgtatt gatgtatgcg 2880

gatatgatgg aaggcaggga catggtcaat ataatatctt ctacagcagc acatctcagg 2940

aacctatccg agaaaattga tgatatcctg cggttagtag atgctctggc aaaggactta 3000

ggtaatcaag tctatgatgt tgtagcatta atggagggat tcgcatacag tgccgttcag 3060

ctgcttgaac catcaggtac atttgcagga gatttcttcg catttaacct acaggagctc 3120

aaaaacacgt taatcgaact tctcccaaat aatatagcgg aagcagtaac tcacgctatt 3180

gccactgtat tctccggctt agaacagaat caagcagctg agatgttgtg cttgctgcgt 3240

ttgtggggtc atccattgct tgagtctcgt agtgcagcaa gagcagtcag gagccagatg 3300

tgcgc 3305

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cattcaggac acagcatgat acccgtgtta attgccagc 39

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcaattgggg agttccttcc g 21

Claims (3)

1.克服鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒疫苗载体候选株，是禽副黏病毒I型(Avian Paramyxovirus type-1)AI4-T4FHN，其保藏号CGMCC No：12987。

2.权利要求1所述克服鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒疫苗载体候选株的构建方法，其特征在于：以禽副黏病毒2型的两个囊膜糖蛋白F基因和HN基因胞外区片段对NDVAI4株基因组的对应部分进行替换，得到重组病毒AI4-T4FHN。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)全长克隆rAI4-T4FHN的构建

1)新城疫病毒AI4株基因组的修饰：在NDV全长转录载体pNDV/rAI4 3250nt处突变碱基引入Pac I酶切位点，构建全长转录载体pNDV/rAI4-Pac I；

2)AI4基因组F和HN胞外区的替换：将合成的序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8分别克隆进质粒pUC17，获得中间质粒pUC-T4F/Pac I和pUC-T4HN/FspA I，用Pac I和AflII酶切这两个质粒，将pUC-T4F/Pac I合成的基因与pUC-T4HN/FspA I合成的基因相连，构建中间质粒pUC-T4FHN。

利用酶切位点Pac I和FspA，将序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的嵌合的APMV-2F和HN基因从pUC-T4FHN导入到全长转录载体pNDV/rAI4-Pac I中，从而获得新的转录载体pNDV/rAI4-T4FHN；

(2)重组病毒AI4-T4FHN株的拯救

将转录载体pNDV/rAI4-T4FHN与pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞，60h后接种9～11日龄SPF鸡胚，37℃孵育，获得重组病毒AI4-T4FHN。