CN117778471A - 克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体及应用，涉及兽用生物制品技术领域。本发明利用已建立的新城疫病毒LaSota株反向遗传操作平台，将融合蛋白(F)和血凝素‑神经氨酸酶蛋白(HN)的中和表位突变后，所得重组载体转染BSR‑T7/5细胞系，得重组病毒载体。本发明所提供的重组新城疫病毒载体LS/EM株在鸡胚上具有较高的繁殖滴度，具有低致病性的分子特征，且不被新城疫阳性血清中和，因此能在新城疫高母源抗体水平的鸡体内有效复制，可作候选疫苗载体，有效解决了新城疫母源抗体影响疫苗保护效果的问题。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及到一种克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体及应用。
背景技术
新城疫(Newcastledisease，ND)是由新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)引起的一种高度接触性传染病，可造成禽呼吸系统、消化系统和神经系统损伤。NDV是单股负链RNA病毒，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、副粘病毒亚科(Paramyxovirinaae)、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)禽副粘病毒I型(Avian Paramyxovirus type I,APMV-1)。NDV基因组约15kb，依次编码六种结构蛋白：核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基质蛋白(Matrix protein,M)、融合蛋白(Fusion protein,F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(Heamagglutinin-Neuraminidase protein,HN)、大分子蛋白(Largeprotein,L)。其中，F和HN蛋白是NDV的主要保护性抗原，可刺激机体产生中和抗体。HN可识别细胞表面含唾液酸的受体，同时促进F蛋白的融合活性，从而使病毒能够穿透细胞表面。许多研究表明，F蛋白的跨膜区和胞质区位于500～553位氨基酸处，具有终止蛋白转移和膜锚定功能；HN蛋白的跨膜区和胞质区位于1～48位氨基酸处，胞外区为主要功能区。然而，只有同型的HN和F才能诱导融合，这表明HN和F之间存在特定的相互作用，这种相互作用涉及F和HN蛋白的胞外功能区。
随着反向遗传系统的广泛应用，新型载体疫苗的研发得到快速的发展，大量研究证明NDV具有作为人类和动物疫苗载体的潜力。NDV作为疫苗载体，具有以下优点：NDV只有一个血清型，遗传相对稳定；NDV基因组仅编码6种结构蛋白，免疫后有助于机体产生针对外源蛋白的特异性免疫应答；NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，其疫苗生产成本低；重组NDV经连续传代后，仍可稳定表达外源蛋白；NDV载体疫苗经粘膜途径免疫，可以诱导机体产生对全身和粘膜免疫的有效免疫应答；NDV载体疫苗免疫方式较方便，极大节省免疫成本；NDV弱毒载体(如LaSota株)在人和动物上的安全性已得到广泛证实。
然而，在当前的养殖条件下，接种市售NDV疫苗的种鸡存在高滴度的NDV抗体，这种抗体能通过卵黄囊传递至雏鸡，因而低日龄的雏鸡具有高滴度的NDV母源抗体。高滴度的母源抗体，中和了大量的ND疫苗抗原，降低了疫苗的保护效果，因此母源抗体的影响成为NDV载体疫苗的主要瓶颈。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体及应用，该具有低致病性的分子特征，且不被新城疫阳性血清中和，因此可在新城疫高母源抗体水平的鸡体内有效复制，有效解决了新城疫母源抗体影响疫苗保护效果问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体，该重组新城疫病毒载体包括中和表位突变的融合蛋白和血凝素-神经氨酸酶蛋白。
进一步，上述融合蛋白的三个抗原表位的氨基酸序列分别如SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2和SEQ ID N0.3所示。
进一步，编码上述融合蛋白的三个抗原表位的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示。
进一步，上述血凝素-神经氨酸酶蛋白的四个抗原表位的氨基酸序列分别如SEQID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示。
进一步，编码上述血凝素-神经氨酸酶蛋白的四个抗原表位的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.11、SEQ ID N0.12、SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示。
上述克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体的制备方法，包括以下步骤：
S1、将中和表位突变的融合蛋白和血凝素-神经氨酸酶蛋白的基因片段导入转录载体中，得重组载体pLS/EM；
S2、将步骤S1所得重组载体pLS/EM和辅助质粒共转染宿主细胞得重组新城疫病毒载体。
进一步，步骤S1中，通过Red/ET重组工程技术结合ccdB反向筛选两步法导入转录载体。
进一步，上述转录载体为pLaSota。
进一步，上述转录载体包括融合蛋白F和血凝素-神经氨酸酶蛋白HN中和表位突变的新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因组cDNA序列。
进一步，步骤S2中，上述辅助质粒为pCI-neo-NP、pCI-neo-P和pCI-neo-L。
进一步，上述辅助质粒包括编码新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白NP的cDNA序列、磷酸蛋白P的cDNA序列和大聚合酶蛋白L的cDNA序列。
进一步，上述编码新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白NP的cDNA序列、磷酸蛋白P的cDNA序列和大聚合酶蛋白L的cDNA序列都位于T7启动子之后。
进一步，通过脂质体转染法转染宿主细胞。
进一步，上述宿主细胞为BSR-T7/5细胞。
进一步，上述BSR-T7/5细胞能稳定表达T7 RNA聚合酶。
进一步，45～50h后收获细胞上清接种9～11日龄SPF鸡胚，在36～38℃下孵育45～50h。
上述克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体在制备重组鸡传染性支气管炎病毒、重组鸡传染性喉气管炎病毒、重组传染性法氏囊病毒、重组传染性贫血病毒、重组禽流感病毒或重组禽腺病毒疫苗中的应用。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本发明以新城疫LaSota弱毒疫苗株为骨架，通过突变F和HN基因的中和表位，获得重组新城疫病毒株LS/EM，该病毒株具有低致病性的分子特征，且不被新城疫阳性血清中和，因此LS/EM可在新城疫高母源抗体水平的鸡体内有效复制，可作为克服新城疫母源抗体影响的候选疫苗载体。具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为重组质粒pLS/EM构建模式图；
图2为中间载体pLS-FHN/ccdB酶切鉴定电泳图；
图3为重组载体pLS/EM酶切鉴定电泳图；
图4为重组病毒RT-PCR鉴定电泳图；
图5为重组病毒生长曲线图；
图6为重组病毒LS/EM免疫组血清抗体水平检测图；
图7为LaSota株免疫组血清抗体水平检测图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行进一步的说明，但并不构成对本发明的限定。
实施例1F和HN蛋白中和表位突变的重组新城疫病毒的构建
(1)重组质粒pLS/EM的构建
重组质粒pLS/EM是通过Red/ET重组工程技术结合ccdB反向筛选两步法策略，将中和表位突变的F和HN基因导入转录载体pLaSota中，从而获得新的转录载体pLS/EM，如图1所示，具体步骤如下。
设计引物FHN-ccdB-F/FHN-ccdB-R，如表1所示，以pBR322-ccdB-amp为模板扩增筛选基因，扩增的FHN-ccdB基因片段两端带有一段LaSota基因组F基因上游和HN基因下游的同源臂。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带约1400bp，与预期的1423bp大小相符。对PCR产物进行回收纯化，测定核酸浓度，取少量送测序公司进行序列测序。
表1筛选基因ccdB基因扩增引物设计
将纯化后的筛选基因片段FHN-ccdB与pLaSota载体通过电转化表达Redα/β的工程菌中，进行同源重组，在LB平皿上培养16h后挑取单菌落，进行菌液PCR鉴定。阳性菌液扩摇后抽提质粒，并进行XhoI和NheI双酶切鉴定，结果如图2所示。
由图2可知，重组质粒的酶切条带大小与预设图谱完全一致，初步表明中间质粒pLS-FHN/ccdB构建正确。
将酶切正确重组质粒送测序公司测序，结果表明所有序列与预期完全一致，中间质粒pLS-FHN/ccdB构建成功。
将合成的SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4基因片段与F和HN基因间的非编码区融合，通过Red/ET同源重组技术，与中间质粒pLS-FHN/ccdB进行重组，PCR鉴定为阳性菌液扩摇后抽提质粒，并进行XhoI和NheI双酶切鉴定，结果如图3所示。
由图3可知，重组质粒的酶切条带大小与预设图谱完全一致，初步表明重组质粒pLS/EM构建正确。将酶切正确重组质粒送测序公司测序，结果表明所有序列与预期完全一致，重组质粒pLS/EM构建成功。
(2)重组病毒拯救
采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒pLS/EM以及三个辅助质粒pCI-neo-NP、pCI-neo-P和pCI-neo-L共转染BSR-T7/51细胞，转染48h后收获细胞，反复冻融后，取细胞上清接种9-11日龄SPF鸡胚，37℃孵育48h后，收获鸡胚尿囊液，盲传三代后进行重组病毒鉴定。
(3)重组病毒鉴定
通过血凝试验对收获的鸡胚尿囊液进行检测，结果显示重组病毒血凝效价为1:128，初步表明重组病毒LS/EM拯救成功。
取200μL病毒液按Axyprep体液病毒DNA/RNA小量抽提试剂盒说明书操作提取病毒RNA。以上述RNA为模板，引物MDA-JD-F/MDA-JD-R的引物序列和扩增长度如表2所示，按一步法RT-PCR试剂盒PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2说明书配制体系，反应体系如表3所示，扩增程序：50℃，30min；94℃，2min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，2min，共32个循环；72℃，5min。RT-PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测并送测序公司进行序列测序，结果如图4所示。
由图4可知，目的条带与预期大小相符，且测序结果显示与预期序列100％一致，表明重组病毒LS/EM拯救成功。
表2重组病毒LS/EM鉴定引物设计
表3一步法RT-PCR反应体系体系
| 反应组分 | 25μL反应体系 |
| Primescript 1 Step Enzyme Mix | 0.2μL |
| 2×1 Step Buffer | 12.5μL |
| 上游引物，10μM | 1μL |
| 下游引物，10μM | 1μL |
| RNA | 2μL |
| Rnase Free dH2O | 补足至25μL |
实施例2重组病毒的生物学特性
(1)MDT和ICPI的测定
鸡胚平均致死时间(MDT)测定：将P8代重组病毒用生理盐水作10倍梯度稀释，10-4-10-9稀释度，定量接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚胚，0.1mL/胚，于37℃孵育。弃去24h内死亡的鸡胚，接种后连续观察7天，每隔12h观察一次，并记录鸡胚死亡情况和死亡时间，按OIE标准方法计算重组病毒的MDT。结果显示，重组病毒的MDT为107.4小时。
雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定：取1日龄SPF鸡10只，各脑内注射10-1稀释的LS/EM株病毒液0.05mL，同时设置10只注射生理盐水的SPF鸡作为对照，接种后每日在相应接种的时间观察，记录雏鸡情况(分正常、发病、死亡3种情况)，观察8日，计算ICPI值。结果显示，重组病毒LS/EM脑内接种1日龄SPF鸡后未出现发病或死亡，ICPI值为0，符合低致病力毒株标准。
(2)生长曲线测定
为确定重组病毒在鸡胚上的生长曲线，将重组病毒LS/EM和母本病毒LaSota进行鸡胚生长动力测定比较。将P8代重组病毒LS/EM和母本病毒用生理盐水稀释，按100EID50的接种量经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚，0.1mL/胚。分别于接种后12h、24h、36h、48h、60h和72h六个时间点收获鸡胚尿囊液，进行EID50测定，结果如图5所示。
由图5可知，重组病毒LS/EM鸡胚生长动力学与母本病毒LaSota株相似，仍然保有在鸡胚上高滴度生长的增殖特性。
实施例3重组病毒LS/EM与新城疫阳性血清的中和试验
将重组病毒LS/EM株和母本病毒LaSota株分别用灭菌生理盐水稀释至106.0EID50/0.1mL，分别与等量抗鸡新城疫特异性血清混合，置室温作用60分钟，分别通过尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2mL，同时设置不中和的病毒对照组，置37℃下孵育96小时。收获各组鸡胚尿囊液进行红细胞凝集试验，结果如表4所示，重组病毒LS/EM的新城疫阳性血清中和组的胚液均为阳性，LaSota株的新城疫阳性血清中和组的胚液均为阴性，表明重组病毒LS/EM不被新城疫阳性血清所中和。
表4重组病毒LS/EM与新城疫阳性血清的中和试验
实施例4重组病毒在SPF鸡和商品鸡上的免疫试验
将30只1日龄商品鸡随机分成3组，分别经滴鼻点眼途径接种LS/EM株、LaSota株和PBS，免疫剂量为106.0EID50/只。按照上述试验条件，同时设置重组病毒在SPF鸡上免疫试验。免疫后3周，每组鸡只静脉采血，分离血清检测针对免疫毒株的血清抗体水平。结果显示，重组病毒LS/EM株免疫后，鸡群未出现任何临床症状，表明LS/EM株安全性良好。血清抗体水平如图6-7所示。
由图6-7可知，重组病毒LS/EM株在SPF鸡和商品鸡上均可有效诱导抗体产生，表明LS/EM株可在SPF鸡和商品鸡体内有效复制。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
Claims (10)
1.克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体，其特征在于，包括中和表位突变的融合蛋白和血凝素-神经氨酸酶蛋白。
2.如权利要求1所述的克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体，其特征在于，所述融合蛋白的三个抗原表位的氨基酸序列分别如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.3所示。
3.如权利要求2所述的克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体，其特征在于，编码所述抗原表位的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示。
4.如权利要求1所述的克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体，其特征在于，所述血凝素-神经氨酸酶蛋白的四个抗原表位的氨基酸序列分别如SEQ ID N0.7、SEQ IDN0.8、SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示。
5.如权利要求4所述的克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体，其特征在于，编码所述抗原表位的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.11、SEQ ID N0.12、SEQ ID N0.13和SEQID N0.14所示。
6.权利要求1-5任一项所述的克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将中和表位突变的融合蛋白和血凝素-神经氨酸酶蛋白的基因片段导入转录载体中，得重组质粒pLS/EM；
S2、将步骤S1所得重组质粒pLS/EM和辅助质粒共转染宿主细胞，得重组新城疫病毒载体。
7.如权利要求6所述的克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，通过Red/ET重组工程技术结合ccdB反向筛选两步法导入转录载体；所述转录载体为pLaSota。
8.如权利要求6所述的克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述辅助质粒为pCI-neo-NP、pCI-neo-P和pCI-neo-L。
9.如权利要求6所述的克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体的制备方法，其特征在于，步骤S2中，通过脂质体转染法转染宿主细胞；所述宿主细胞为BSR-T7/5细胞。
10.权利要求1-5任一项所述的克服新城疫母源抗体影响的重组新城疫病毒载体在制备重组鸡传染性支气管炎病毒、重组鸡传染性喉气管炎病毒、重组传染性法氏囊病毒、重组传染性贫血病毒、重组禽流感病毒或重组禽腺病毒疫苗中的应用。
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