CN107432930B - 一种i群4型禽腺病毒dna疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种I群4型禽腺病毒DNA疫苗，其抗原含I群4型禽腺病毒五邻体基因。本发明还公开了一种I群4型禽腺病毒DNA疫苗的制备方法和应用，制备方法为：(1)设计带有EcoR I和Sal I酶切位点的I群4型禽腺病毒五邻体基因引物，以I群4型禽腺病毒DNA为模板，扩增目标基因片段；(2)将五邻体基因片段连接到pMD‑18T载体；(3)将五邻体基因连接到真核表达载体pCI；(4)将pCI‑penton转染进LMH细胞；(5)扩增并提取纯化pCI‑penton。本发明的优点在于：制备简单、使用方便、成本低；能同时激发体液免疫与细胞免疫，对SPF鸡提供有效的全面保护；不存在毒力返强的风险。

Description

一种I群4型禽腺病毒DNA疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及DNA疫苗技术领域，尤其涉及一种I群4型禽腺病毒DNA疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)属于禽腺病毒科禽腺病毒属，根据其抗原性差异分为3个群：I群、II群和III群。1987年在巴基斯坦安卡拉地区的肉鸡场爆发了以心包积液为特征的疾病，给当地的养鸡业带来了巨大的损失，随后在德国、印度、伊朗、墨西哥和日本等地的肉鸡群也相继爆发了以心包积液-包涵体肝炎综合征为特征的疾病，死亡率可达到80％以上，经过研究证实，这些地区的心包积液-包涵体肝炎综合征均是由I群4型禽腺病毒引起。I群禽腺病毒有12个血清型，具有共同的群特异性抗原，该群病毒普遍存在于鸡、鸭和鹅等禽体内，呈现隐性感染，常作为继发病原使家禽患病，本病既可以垂直传播也可以水平传播。能够引起鸡心包积液-包涵体肝炎综合征的主要是I群4型禽腺病毒。2009年之前，禽腺病毒病在我国呈现散发流行，自2009年以后，禽腺病毒病的流行呈现上升趋势，2015年，在我国安徽、河南和山东等省份的鸡群中爆发了心包积液-包涵体肝炎综合征，这种疾病的特点是心包中具有透明状或者黄色液体，心肌纤维中间浸润大量血细胞和淋巴细胞，肝脏肿大，表面出现坏死灶，病理组织学观察肝脏脂肪变性，单核细胞浸润，肝小叶中央部位细胞弥散性肿胀，肝脏实质中常见肝细胞坏死而形成不规则的坏死灶，肝细胞内可见有嗜碱性包涵体存在，有时可见肾脏间质血细胞浸润，肾小管上皮细胞出现坏死，脾脏呈现大量的粒细胞浸润，引起的死亡率甚至可达100％，给养殖业造成巨大的经济损失。

国内尚无商品化疫苗用来防控I群4型禽腺病毒疾病，现由青岛易邦生物工程有限公司、扬州大学等单位研制的I群4型禽腺病毒疫苗均已进入临床试验阶段，但其使用细胞培养法或鸡胚培养法增殖病毒，培养难度大，病毒滴度低，生产成本较高，不利于推广。另外，国外商品化的I群4型禽腺病毒疫苗使用鸡胚生产，同样存在病毒增殖滴度低，生产成本高，不易推广等问题。且不论国内正在研发的I群4型禽腺病毒疫苗，还是国外已上市的I群4型禽腺病毒疫苗，均为灭活疫苗，免疫鸡体后，其抗体产生慢，只能诱导体液免疫，而不能引起细胞免疫，保护效率较低。因此，急需开发一种新型I群4型禽腺病毒疫苗用于防控本病。

DNA疫苗又称核酸疫苗、基因疫苗，是近年来随着基因技术的发展而产生的一种新型疫苗。DNA疫苗是指将编码特异性抗原多肽或蛋白质的基因插入到合适的质粒中，导入动物机体，诱导动物免疫系统对编码抗原基因在体内表达的多肽或蛋白质发生免疫应答以达到预防疾病的作用。DNA疫苗免疫反应主要有两个途径，携带编码抗原基因的重组载体在进入到宿主体内后，被细胞摄入，在真核启动子的作用下在细胞内转录并表达，一部分经过加工被抗原提呈细胞识别，从而激活T淋巴细胞分化成效应细胞，激发机体产生细胞免疫应答；另一方面表达的目的基因被B细胞等一系列的抗原提呈细胞所识别，刺激B细胞转化为浆细胞并产生针对DNA疫苗编码抗原的特异性抗体，激发体液免疫应答。因此，DNA疫苗作为第3代新型疫苗，不仅能够诱导体液免疫应答，而且能够诱导细胞免疫应答，具有免疫效果好、临床应用方便等优点。近年来，DNA疫苗已是国内外研究的热点，有些学者已对禽流感病毒、新城疫病毒、鸡马立克氏病病毒等禽类DNA疫苗进行了相关研究，目前国内哈尔滨兽医研究所研制的禽流感(H5亚型)DNA疫苗即将上市。

I群4型禽腺病毒呈球形，无囊膜，基因组为线性双股DNA，病毒粒子直径为70～90nm，呈20面体对称结构。I群4型禽腺病毒衣壳由三种主要的结构蛋白组成，它们是五邻体(penton)蛋白、六邻体蛋白和纤维蛋白，而penton蛋白是I群4型禽腺病毒的主要结构蛋白，已有研究发现penton蛋白在病毒侵染和进入细胞过程中起重要作用，并且能够在血清中检测到针对penton蛋白的中和抗体，说明其可以作为抗原用于预防此病，目前以penton蛋白作为亚单位疫苗的研究已有报道，并且证明其具是良好免疫原性。但是还未见到I群4型禽腺病毒五邻体基因DNA疫苗的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种制备简单、使用方便、成本较低、更有针对性，且不存在毒力返强的可有效抵抗I群4型禽腺病毒强毒株攻毒的I群4型禽腺病毒DNA疫苗及其制备方法和应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种I群4型禽腺病毒DNA疫苗，所述I群4型禽腺病毒DNA疫苗含有I群4型禽腺病毒五邻体基因。

作为本发明的优选方式之一，所述I群4型禽腺病毒五邻体基因的序列如SEQ IDNo.1所示。

一种制备上述I群4型禽腺病毒DNA疫苗的方法，包括如下步骤：

(1)使用PCR的方法扩增出目的片段，设计一对带有EcoR I和Sal I酶切位点的I群4型禽腺病毒五邻体基因的特异性引物，以I群4型禽腺病毒DNA为模板，扩增出五邻体基因片段；

(2)将五邻体基因片段连接到pMD-18T载体，通过测序对序列进行验证；

(3)采用酶切连接的方法，将五邻体基因连接到真核表达载体pCI上；

(4)将pCI-penton转染进LMH细胞，通过Western-blot鉴定是否表达penton蛋白；

(5)扩增并进一步提取纯化重组真核表达质粒pCI-penton，用作I群4型禽腺病毒DNA疫苗。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中根据I群4型禽腺病毒的五邻体基因序列，使用Oligo7软件设计相应的一对特异性引物。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中一对带有EcoR I和Sal I酶切位点的I群4型禽腺病毒五邻体基因的特异性引物分别为：

引物1：5'-CGGAATTCATGTGGGGGTTGCAGCCG-3'；

引物2：5'-GTCGACGTCGCGGAACTCAGAACGGT-3'。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中进行五邻体基因片段PCR扩增的反应体系为：一对引物各1μl，模板DNA2μl，LA Taq 1μl，10×PCR Buffer10μl，dNTP Mix 4μl，ddH₂O 31μl；反应条件为：94℃5min，94℃变性50s，58℃退火45s，72℃延伸1min 30s，35个循环，72℃延伸10min。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中测序于北京六合华大基因科技有限公司进行。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中酶切采用EcoR I和Sal I双酶切。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中使用质粒提取试剂盒对重组真核表达质粒DNA疫苗进行提取纯化。

一种使用上述I群4型禽腺病毒DNA疫苗的应用，用于预防鸡心包积液-包涵体肝炎综合征。

本发明相比现有技术的优点在于：

(1)制备简单、使用方便、成本较低；

(2)目前市场上还没有出现I群4型禽腺病毒五邻体基因的DNA疫苗；作为一种新型疫苗，I群4型禽腺病毒DNA疫苗能同时激发体液免疫与细胞免疫，对SPF鸡提供有效的全面保护；

(3)不存在毒力返强的风险，免疫鸡群能够有效抵抗I群4型禽腺病毒强毒株攻毒。

附图说明

图1是实施例2中的I群4型禽腺病毒五邻体基因PCR扩增产物电泳图；

图2是实施例2中的pCI-penton阳性质粒双酶切后的电泳鉴定图；

图3是实施例2中的使用底物曝光后的I群4型禽腺病毒五邻体蛋白的表达鉴定图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例的一种I群4型禽腺病毒DNA疫苗，含有I群4型禽腺病毒五邻体基因，该I群4型禽腺病毒五邻体基因的序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2

本实施例的一种I群4型禽腺病毒DNA疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)I群4型禽腺病毒的增殖

I群4型禽腺病毒强毒株分离自发病肉鸡；将病毒接种于长成单层的LMH细胞，在37℃，吸附1h，补加5％血清浓度的DMEM维持液，继续培养至60-64h，当细胞出现圆缩、脱落等病变时，收毒，-70℃保存备用；

(2)引物设计与合成

①根据I群4型禽腺病毒基因组序列(Gene ID:10399473)，选取五邻体基因(penton)序列，使用Oligo7软件设计penton基因的一对特异性引物：

引物1：5'-CGGAATTCATGTGGGGGTTGCAGCCG-3'，

引物2：5'-GTCGACGTCGCGGAACTCAGAACGGT-3'

②在引物1、2上分别加入限制性核酸内切酶EcoR I和Sal I酶切位点，扩增片段长1578bp，含有penton基因的全部序列，该引物由北京六合华大基因科技有限公司合成；

(3)提取I群4型禽腺病毒基因组DNA和扩增五邻体基因

①使用DNA提取试剂盒(购自OMEGA公司)提取I群4型禽腺病毒强毒株，分离自发病肉鸡)基因组DNA，并进行五邻体基因的PCR扩增；反应体系为：引物1、2各1μl，模板DNA 2μl，LA Taq(购自TaKaRa公司)1μl，10×PCR Buffer 10μl，dNTP Mix 4μl，ddH₂O 31μl；反应条件为：94℃5min，94℃变性50s，58℃退火45s，72℃延伸1min 30s，35个循环；72℃延伸10min；

②将PCR产物进行凝胶电泳，结果如图1(图中，泳道M为Marker DL-5000，泳道1为I群4型禽腺病毒五邻体基因PCR产物)；使用胶回收试剂盒(购自TaKaRa公司)进行胶回收，将回收的目的片段直接克隆到pMD-18T载体(购自TaKaRa公司)上，构建pMD-18T-penton，送交北京六合华大基因科技有限公司进行序列测定；结果测得的penton基因的序列如SEQ IDNo.1所示；

(4)重组pCI-penton真核表达载体的构建

将测序结果正确的pMD-18T-penton和pCI(购自TaKaRa公司)分别用EcoR I和SalI进行双酶切，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒(购自TaKaRa公司)分别回收目的片段penton和pCI，然后16℃连接过夜，将连接产物转化到感受态细胞E.coliDH5α转中，挑取单克隆菌落，接种至5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培振荡培养12h，使用小量质粒提取试剂盒(购自TaKaRa公司)提取质粒，使用分光光度计测定质粒浓度，然后对质粒进行双酶切鉴定，鉴定结果如图2(图中，泳道M为Marker DL-5000，泳道1为pCI-penton的双酶切鉴定)；将其命名为pCI-penton，阳性质粒送交北京六合华大基因科技有限公司进行序列测定，结果penton序列与SEQ ID No.1序列一致。

(5)应用Western-blot鉴定表达的penton蛋白

将测序正确的pCI-penton真核表达质粒转染LMH细胞，在转染前2h，将LMH细胞更换成无血清的DMEM培养基，1mL/孔。取A和B两个灭菌后的1.5mL Eppendof管，每管各加入250μl Opti-mem，将2μg pCI-penton加入到A管中，将4μg Lipofectamine2000加入到B管中，充分混匀，室温下孵育5min，再另取灭菌后的C管，将A管和B管混合到C管中，室温孵育15min。将C管加入到LMH细胞6孔板中，37℃、5％CO₂培养4-6h，更换成有血清培养基。转染后48-60h后，取D和E两支1.5mL Eppendof管，吸取细胞上清于D管中，使用细胞刮将细胞收集于E管中，室温3000rpm/min离心10min，弃去上清。分别按体积比1:1向D和E管中加入2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混合均匀后100℃煮沸10min；将蛋白样品直接加到SDS-PAGE胶的样孔内，进行电泳，电泳结束后进行电转，将蛋白转移至PVDF膜上，电转结束后，用5％脱脂奶粉封闭1h，一抗使用鸡I群4型禽腺病毒阳性血清，1000倍稀释，室温下孵育1h后使用PBST洗涤3次，每次洗涤5min，二抗使用辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY，5000倍稀释，室温下孵育1h后使用PBST洗涤3次，每次洗涤5min，使用底物进行曝光；使用底物曝光后的I群4型禽腺病毒五邻体(penton)蛋白条带如图3(图中，泳道M为蛋白分子质量标准，泳道1为I群4型禽腺病毒五邻体蛋白)，条带在60KDa左右；

(6)I群4型禽腺病毒五邻体基因DNA疫苗的制备

使用大量质粒提取试剂盒(购自OMEGA公司)对重组真核表达质粒DNA疫苗pCI-penton进行提取纯化，具体实验步骤按照试剂盒说明书进行，使用分光光度计测定提取的pCI-penton浓度，-20℃保存备用。

实施例3

本实施例的一种I群4型禽腺病毒DNA疫苗的安全性和免疫效果检测，包括如下步骤：

(1)疫苗安全性检测

使用3周龄SPF鸡20只，第1组10只鸡，采用腿部肌肉注射上述实施例中制备的pCI-penton疫苗，200μg(两测腿各注射100μg)，第2组10只鸡作为对照组，采用腿部肌肉注射质粒pCI 200μg，连续观察2周，观察免疫鸡是否由于注射疫苗引起的任何局部性和全身性不良反应。

结果显示：2组鸡免后精神、饮食均正常，注射部位均未见红肿等异常反应。

(2)疫苗免疫效果检测

将20只2周龄SPF鸡随机分为2组，每组10只；第1组10只鸡，每只鸡腿部肌肉注射150μg上述实施例中制备的pCI-penton疫苗，首免后21日采用同样的接种剂量和免疫途径进行加强免疫；第2组10只鸡不免疫作为对照；二免后14日，对第1组和第2组鸡进行肌肉注射本实验室分离的I群4型禽腺病毒强毒株病毒液，每只0.1mL，10^6.0TCID₅₀/0.1mL；观察并记录免疫鸡和对照鸡的发病情况；

结果显示：2组鸡攻毒后观察14日，攻毒对照组全部发病，病鸡精神沉郁、羽毛蓬乱、食欲减退，并出现8/10死亡，剖检死亡鸡及发病存活鸡，发现心包积液，肝脏肿大、出血或坏死，均为典型的心包积液-包涵体肝炎综合征症状；免疫组鸡精神、饮食均正常，未出现发病症状；可见，pCI-penton疫苗有良好的保护效果。

基于以上结果，上述实施例的I群4型禽腺病毒DNA疫苗可有效用于预防鸡心包积液-包涵体肝炎综合征。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽东方帝维生物制品股份有限公司

<120> 一种I群4型禽腺病毒DNA疫苗及其制备方法和应用

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1578

<212> DNA

<213> 天然序列

<400> 1

atgtgggggt tgcagccgcc gacgtcgatt ccgccgcctc ctccgccgac cgagttaacg 60

ccctcgacct atccggcgat ggtgaacggc tatccgcctc cggccgcgtc cgcgcagagc 120

tgttcctcta gcggcggtca gagcgagctg tatatgcccc ttcagcgggt gatggcccct 180

acggggggac ggaacagcat taagtatcgc gattacacgc cgtgtcgtaa caccaccaag 240

ctgttttacg tagacaacaa ggctagcgat atcgatacgt ataataaaga cgccaaccat 300

agcaatttcc gcaccacggt gatccataac caggatctgg acgcggacac ggccgccacc 360

gagtccatcc agttggacaa ccgctcctgc tggggcggtg acctaaagac agccgtgcgt 420

accaactgcc cgaacgtgag cagttttttc cagagtaaca gcgtgcgcgt gcgcatgatg 480

tggaagcgcg acccgccgac tagcacggct cctccgagcg cggtaggcag cggctattcg 540

gtgcccggcg cgcagtacaa gtggtacgac ctgacggtcc ccgagggtaa ctacgcgctg 600

tgcgaactga tagacctgct caacgagggc atcgtgcagc tctacctgag cgagggtcgc 660

cagaacaacg tgcaaaaatc ggacatcggg gtcaagttcg acacacgcaa cttcggcttg 720

ctccgcgacc ccgtgacggg actggtaact ccgggcacgt acgtgtacaa gggttaccac 780

cccgacatcg tgctgctgcc cggatgcgcg atcgacttta cgtacagccg cctgagcctg 840

ctcctgggca tagggaagcg cgagccctac tcgaaggggt tcgttattac ctacgaggat 900

ctgcagggag gggatatccc ggctctgctg gacctcgact ccgtcgacgt gaacgacgct 960

gacggtgaag tgatcgagct cgacaacgct gctccccttt tacatgacag cgcgggcgtg 1020

tcgtataacg tcatttacga ccaggtgacg ggaaaacccg tgacagcgta tcgctcgtgg 1080

atgttggctt acaacgtgcc taactcgcag gccaatcaga cgaccttgct gacggtgccc 1140

gatatggcgg gcgggatcgg ggcgatgtac acgtccctgc ccgatacctt tatcgcgcct 1200

accgggttca aggaagataa cacgaccaac ctttgcccgg tcgtcggcat gaacctgttc 1260

cccacctaca ataaaattta ttaccaggcg gcgtccacgt acgtgcaacg cctggaaaat 1320

tcctgccagt cggccacagc cgccttcaac cgctttcccg aaaacgagat tctgaagcaa 1380

gcgcccccca tgaatgtttc gtccgtgtgc gataaccaac ccgccgtcgt tcagcagggt 1440

gtgttgcctg tgaagagctc gctccccgga ctgcagcgcg tgctgatcac agacgaccag 1500

cgtcgtccga taccctacgt gtataagtct atcgcgacgg ttcagccgac cgttctgagt 1560

tccgcgacct tgcagtag 1578

Claims (4)

1.一种I群4型禽腺病毒DNA疫苗，其特征在于，所述I群4型禽腺病毒DNA疫苗含有I群4型禽腺病毒五邻体基因；

其通过以下方法制备，包括以下步骤：

（1）使用PCR的方法扩增出目的片段，设计一对带有EcoR I和Sal I酶切位点的I群4型禽腺病毒五邻体基因的特异性引物，以I群4型禽腺病毒DNA 为模板，扩增出五邻体基因片段；

（2）将五邻体基因片段连接到pMD-18T载体，通过测序对序列进行验证；

（3）采用酶切连接的方法，将五邻体基因连接到真核表达载体pCI上；

（4）将pCI-penton转染进LMH细胞，通过Western-blot鉴定是否表达penton蛋白；

（5）将（4）中能够正确表达penton蛋白的pCI-penton质粒进行大量扩增并进一步提取纯化重组真核表达质粒pCI-penton，用作I群4型禽腺病毒DNA疫苗；

所述步骤（1）中一对带有EcoR I和Sal I酶切位点的I群4型禽腺病毒五邻体基因的特异性引物分别为：

引物1：5'-CGGAATTCATGTGGGGGTTGCAGCCG-3'；

引物2：5'-GTCGACGTCGCGGAACTCAGAACGGT-3'；

所述步骤（3）中酶切采用EcoR I和Sal I双酶切；

所述I群4型禽腺病毒五邻体基因的序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的I群4型禽腺病毒DNA疫苗，其特征在于，所述步骤（1）中进行五邻体基因片段PCR扩增的反应体系为：一对引物各1 μl，模板DNA 2 μl，LA Taq 1 μl，10×PCR Buffer 10 μl，dNTP Mix 4 μl，ddH₂O 31 μl；反应条件为：94℃ 5 min，94℃变性50s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min 30 s，35个循环，72℃延伸10 min。

3.一种制备如权利要求1-2任一项所述的I群4型禽腺病毒DNA疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）使用PCR的方法扩增出目的片段，设计一对带有EcoR I和Sal I酶切位点的I群4型禽腺病毒五邻体基因的特异性引物，以I群4型禽腺病毒DNA 为模板，扩增出五邻体基因片段；

（2）将五邻体基因片段连接到pMD-18T载体，通过测序对序列进行验证；

（3）采用酶切连接的方法，将五邻体基因连接到真核表达载体pCI上；

（4）将pCI-penton转染进LMH细胞，通过Western-blot鉴定是否表达penton蛋白；

（5）将（4）中能够正确表达penton蛋白的pCI-penton质粒进行大量扩增并进一步提取纯化重组真核表达质粒pCI-penton，用作I群4型禽腺病毒DNA疫苗。

4.根据权利要求3所述的I群4型禽腺病毒DNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中使用质粒提取试剂盒对重组真核表达质粒DNA疫苗进行提取纯化。

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