CN109943576A - 一种嵌合犬瘟热病毒主要免疫基因的重组狂犬病病毒及其应用 - Google Patents
一种嵌合犬瘟热病毒主要免疫基因的重组狂犬病病毒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了嵌合犬瘟热病毒主要免疫基因的重组狂犬病病毒BNSP‑CDV‑F和BNSP‑CDV‑H。该重组病毒是以狂犬病病毒SAD‑B19株为骨架，将SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的CDV‑F和CDV‑H基因分别插入重组质粒SAD‑19全长cDNA的N基因和P基因之间，最后通过反向遗传操作技术，拯救出重组狂犬病病毒株BNSP‑CDV‑F和BNSP‑CDV‑H。上述重组病毒BNSP‑CDV‑F和BNSP‑CDV‑H可表达犬瘟热病毒的融合蛋白和血凝素蛋白，将上述重组病毒混合制备的疫苗免疫动物后，能诱导产生较高的抗狂犬病病毒抗体与抗犬瘟热病毒主要免疫基因抗体，还可以降低疫苗成本，具有很好的推广应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物免疫学领域。更具体地，涉及一种嵌合犬瘟热病毒主要免疫基因的重组狂犬病病毒及其应用。
背景技术
狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)感染引起的一种人兽共患传染病，一旦发病，病死率几乎达100％。据WHO统计，全球每年死于狂犬病的人数约6万人，亚洲和非洲是狂犬病的高发区，印度占首位。我国平均每年约有3000人左右死于狂犬病，约99％的患者是被狗、猫咬伤或抓伤引起。要减少或消除人狂犬病的发生，必须控制犬的狂犬病，因此我国犬狂犬病的控制应该是今后防控的重点。随着人民生活水平的提高，宠物的饲养量的增加，对狂犬病的防控提出了更高的要求。欧美发达国家犬狂犬病防控的成功经验表明，狂犬病的控制必须依靠强大的政府支持、各部门的协调与配合、控制犬的数量、实施疫苗大规模免疫，只有在疫苗免疫覆盖率达到70％以上并维持5～7年的情况下才可逐步消灭犬的狂犬病。近年来我国已推出了国产狂犬病灭活疫苗，但因疫苗生产规模限制、生产成本偏高，国产兽用灭活疫苗尚未在国内大量使用。因此，有必要进一步开发出价格低廉、安全、有效的动物用狂犬病疫苗。
犬瘟热是由犬瘟热病毒(CDV)引起的犬科、軸科等肉食性动物的一种急性接触性传染病，严重威胁着养犬业和皮毛动物养殖业的发展。CDV属于副粘病毒科(Paramyxoviridae family)麻疹病毒属(Morbillivirus genus)成员。CDV是单股负链不分节段的RNA病毒，其基因组为15690bp，编码6个结构蛋白，分别为核蛋白(Nucleoprotein,N蛋白)、磷蛋白(Phosphoprotein,P蛋白)、大蛋白(Large protein,L蛋白)、血凝素蛋白(Haemagglutinin,H蛋白)和融合蛋白(Fusion,F蛋白)基质膜蛋白(Matrix protein,M蛋白)。CDV病毒颗粒的可变直径在150-250nm之间，多呈球行。F蛋白是CDV表面重要的囊膜糖蛋白，主要以F1和F2蛋白形式存在，纯化的F蛋白免疫犬后对CDV有攻毒保护作用。H蛋白是CDV感染宿主细胞最主要的蛋白，H蛋白决定了CDV的细胞趋向性和组织嗜性，CDV感染细胞的整个过程都需要H和F蛋白的协调配合才能完成，也是能产生中和抗体的主要基因之一。核蛋白是CDV结构蛋白中保守性最高的蛋白。目前犬瘟热基因工程疫苗的研究基本都是表达F和H蛋白。因此本研究通过狂犬病毒反向遗传操作技术，将上述两种基因分别进行了表达，期望研发出安全、有效的狂犬病和犬瘟热二联基因工程疫苗，对这些疫病的防控具有现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供嵌合犬瘟热病毒主要免疫基因的重组狂犬病病毒疫苗株，该重组狂犬病毒以狂犬病疫苗候选株SAD-B19为骨架，将国内目前流行的CDV毒株的F和H基因分别插入SAD-B19基因组中；通过拯救获得嵌合F和H蛋白的重组狂犬病毒株，免疫后能够诱导产生较高的抗狂犬病病毒抗体与抗犬瘟热病毒主要免疫基因的抗体，以降低疫苗成本。
本发明的目的是提供嵌合F和H基因的重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H，并进一步对重组病毒的鉴定以及作为二联疫苗的效果评估。
本发明的另一目的是提供所述重组狂犬病病毒在作为或制备疫苗方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一株犬瘟热毒株的F和H基因，该基因的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。该基因是通过生物信息学，从当前我国流行的CDV毒株中分析筛选并扩增得到，其表达的F和H蛋白免疫动物后产生的中和抗体能够更加有效的中和当前流行的CDV，更好的保护动物抵抗变异CDV毒株感染。
嵌合CDV F和H基因的重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H，是以狂犬病病毒SAD-B19株为骨架，将SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的F和H基因插入SAD-B19，得到嵌合F和H基因的重组质粒pBNSP-CDV-F和pBNSP-CDV-H，最后拯救筛选获得重组狂犬病病毒株BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H。
具体地：是首先将F和H基因克隆到狂犬病病毒SAD-B19株全长cDNA克隆中，构建了表达犬瘟热病毒主要免疫基因蛋白的重组cDNA克隆pBNSP-CDV-F和pBNSP-CDV-H；最后将cDNA克隆pBNSP-CDV-F和pBNSP-CDV-H和表达狂犬病病毒N、P、G和L蛋白的辅助质粒共转染Vero细胞，拯救获得了嵌合F和H基因的重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H。
该重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H能表达F和H蛋白，制备的疫苗能够诱导产生较高的抗狂犬病病毒抗体与抗犬瘟热病毒主要免疫基因的抗体，可以降低疫苗的成本。
具体地，所述重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H中，F和H基因位于N基因和P基因之间，构建策略如附图1所示。
另外，具体地，作为一种优选的可实施方案，本发明所述重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H的构建方法包括如下步骤：
S1：构建重组质粒pBNSP-CDV-F和pBNSP-CDV-H：将SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示F和H基因克隆至狂犬病病毒SAD-B19株全长cDNA中；
S2：利用重组质粒pBNSP-CDV-F和pBNSP-CDV-H进行拯救，获得重组病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H。
具体地，步骤S1构建重组质粒pBNSP-CDV-F和pBNSP-CDV-H的具体方法如下：
S1.1利用引物F和H的上游引物和下游引物，扩增F和H基因，并分别引入BsiWI和NheI酶切位点
S1.2利用核酸限制性内切酶BsiWI和NheI，分别对F、H基因和pBNSP质粒进行酶切处理，两者的酶切产物连接获得重组质粒pBNSP-CDV-F和pBNSP-CDV-H。
其中，优选地，步骤S1.1所述引物F和H的上游引物和下游引物序列分别如表1所示。
优选地，步骤S1.2所述pBNSP质粒是携带SAD-B19毒株全长cDNA的重组质粒。
优选地，步骤S1.1所述扩增的PCR体系为：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL、dNTPs(2.0μM)4.0μL、20pmol的上游引物F和H 1.0μL、20pmol的下游引物F和H 1.0μL、CDV模板DNA1.0μL、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、ddH2O32μL。
优选地，步骤S1.1所述扩增的PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，30个循环；最后72℃延伸10min。
优选地，步骤S1.2所述酶切处理的酶切体系为：F、H/pBNSP 5μL、NebBuffer 2 5μL、BSA 0.5μL、NheI 2μL、BsiWI 2μL、ddH2O 35.5μL。
优选地，步骤S1.2所述连接的反应体系为：F和H基因酶切产物6μL、pBNSP酶切产物2μL、T4DNA连接酶10×Buffer1μL、T4DNA连接酶1μL。
另外，所述重组狂犬病病毒质粒pBNSP-CDV-F和pBNSP-CDV-H在作为或制备狂犬病疫苗方面的应用，也在本发明的保护范围之内。
本发明首先以狂犬病病毒疫苗株SAD-B19为骨架，以我国流行的犬瘟热病毒的F和H蛋白作为二联疫苗的抗原蛋白，通过酶切连接，构建含有F和H基因(见SEQIDNO.1和SEQIDNO.2)的重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H，构建策略如附图1所示。然后对成功拯救的重组狂犬病病毒进行PCR、测序、免疫荧光鉴定正确。本发明还对重组病毒进行生长曲线、致病性、免疫原性和攻毒保护力等生物学特性研究，以评估其作为二联疫苗的效果。结果显示，重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H作为重组二联疫苗致病性较低，不会对成鼠致死，在BSR细胞上的滴度比亲本株BNSP-333稍低，重组二联疫苗具有良好的免疫原性，能诱导机体产生具有保护效力的狂犬病中和抗体和CDV中和抗体。
具体研究方法方面，本发明利用分子生物学手段构建携带F和H基因的具有感染性的全长狂犬病毒cDNA，通过细胞生物技术拯救出携带表达CDV要免疫基因的重组狂犬病毒，利用免疫学相关技术，研究重组二联疫苗的免疫原性。利用分子生物学手段，以狂犬病疫苗候选株SAD-B19为骨架，将国内目前流行的CDV毒株的F和H基因插入SAD-B19；通过拯救获得携带F和H蛋白的重组狂犬病毒株，并在体外培养细胞以及小鼠体内进行了重组狂犬病毒株作为二联基因工程疫苗的效果评估。
本发明对携带F和H的重组狂犬病病毒进行鉴定和用Vero细胞传代及RT-PCR鉴定。经免疫荧光试验证实，重组病毒G蛋白和CDV F和H蛋白在嵌合病毒感染细胞中均成功表达。通过Western-blot鉴定重组病毒的G蛋白和F、H蛋白均得到表达。将BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H在Vero细胞中连续传代15次，通过RT-PCR方法可检测到BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H存在F和H基因，进行序列测定，没有发现任何突变。
本发明对BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H重组病毒在Vero上的体外生长曲线进行了研究。病毒的一步生长曲线表明BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H与亲本株BNSP-333相比较生长特性基本一致。
本发明对BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H重组病毒免疫原性和攻毒保护进行了研究。将BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H灭活抗原混合后与适量的佐剂乳化制成疫苗，同时将混合抗原与PBS分别肌肉注射免疫小鼠，21天后采血分离血清，检测抗狂犬病病毒抗体与抗犬瘟热病毒抗体。结果表明，重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H免疫小鼠后均能诱导产生较高的抗狂犬病病毒抗体与抗犬瘟热病毒主要免疫基因抗体水平，用狂犬病标准攻毒毒株CVS-11进行攻毒保护试验小鼠可获得100％的存活率。
本发明具有以下有益效果：
本发明科学构建了表达犬瘟热病毒主要免疫基因蛋白的重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H。重组狂犬病病毒相比亲本株BNSP-333具有相似的病毒滴度，可以降低犬用疫苗的成本。
本发明同时验证出重组病毒均能在小鼠体内产生狂犬病病毒和犬瘟热病毒达到保护水平的抗体，可以作为狂犬病和犬瘟热的二联疫苗候选株。
本发明的疫苗效果研究显示，重组狂犬病毒作为弱毒疫苗和灭活疫苗均能产生具有保护水平的狂犬病病毒和犬瘟热病毒抗体。
附图说明
图1为构建重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F、BNSP-CDV-H和BNSP-CDV-N的基因重组策略。
图2为F、H和N基因扩增电泳图；M：DL2000DNA Maker，1：阴性对照，2～3：F、H和N基因PCR扩增产物。
图3为pBNSP-CDV-F、BNSP-CDV-H和BNSP-CDV-N质粒酶切鉴定电泳图；M:γ-EcoT14Ⅰdigest，1:pBNSP-CDV-F、BNSP-CDV-H和BNSP-CDV-N质粒，2:pBNSP-CDV-F、BNSP-CDV-H和BNSP-CDV-N质粒用BsiWI和NheI双酶切。
图4为携带F、H和N基因的重组病毒BNSP-CDV-F、BNSP-CDV-H和BNSP-CDV-N拯救后免疫荧光鉴定结果；
A：抗N蛋白的荧光抗体染色，B：细胞对照，C：抗CDV多抗的荧光抗体染色，D：细胞对照。
图5为Western blotting检测目的蛋白的结果，1:重组病毒BNSP-CDV-F、BNSP-CDV-H和BNSP-CDV-N感染的细胞，2:细胞对照。
图6为RT-PCR检测重组病毒BNSP-CDV-F、BNSP-CDV-H和BNSP-CDV-N的F、H和N基因的遗传稳定性，M，DL2000DNA Maker；1:第5代病毒,2:第10代病毒；3:第15代病毒；4:阴性对照
图7为嵌合F、H和N基因的重组病毒BNSP-CDV-F、BNSP-CDV-H和BNSP-CDV-N及亲本株BNSP-333在Vero上的生长曲线。
图8为嵌合F、H和N基因的重组病毒BNSP-CDV-F、BNSP-CDV-H和BNSP-CDV-N制备的抗原在Balb/c小鼠体内的狂犬病抗体水平，同时设立与GEL佐剂制备的疫苗与PBS的阴性对照组在免疫后不同时期的抗体水平。
图9为嵌合F、H和N基因的重组病毒BNSP-CDV-F、BNSP-CDV-H和BNSP-CDV-N制备的抗原在Balb/c小鼠体内的犬瘟热病毒主要免疫基因蛋白的抗体水平，同时设立与GEL佐剂制备的疫苗与PBS的阴性对照组在免疫后不同时期的抗体水平。同时嵌合F、H和N基因的重组病毒BNSP-CDV-F、BNSP-CDV-H和BNSP-CDV-N制备的抗原及与GEL佐剂制备的疫苗与PBS的阴性对照在免疫小鼠28天后狂犬病毒攻毒保护率。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1CDV流行毒株筛选
1、对临床采集的疑似CDV的样品进行处理和核酸提取，进行PCR扩增。
(1)引物序列见表1
表1 CDV F、H和N基因扩增引物
(2)利用引物CDV1/CDV2，按表2所示体系进行PCR扩增：
表2 PCR扩增体系
扩增程序：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。将扩增后的PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳。
将扩增产物克隆至pMD19-T Simple载体，连接产物转化至JM109感受态细胞，提取质粒进行PCR鉴定，将阳性质粒送北京金唯智生物科技有限公司进行测序。根据DNAStar中的MegAlign软件对测序结果进行分析，鉴定扩增所得的10个CDV F和H序列的基因型；将F和H基因与Genbank中登录的24株国内外参考CDV分离株F和H基因(表2.1)进行比对，采用Mega软件绘制进化树。
实施例2CDV毒株F和H基因克隆至pBNSP
1、构建重组质粒pBNSP-CDV-F和pBNSP-CDV-H策略见图1所示。
(1)利用引物CDV-F和H的上游引物和下游引物(见表1)扩增实施例1中选择的CDV毒株的F和H基因(序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示)，CDV-F和H上游引物和下游引物预计扩增长度分别为1989bp和1815bp(扩增反应体系如表2所示)。
PCR扩增程序为：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。
(2)反应结束后，取5μLPCR产物于1.0％琼脂糖凝胶进行电泳检测。获得一条特异的DNA电泳带，大小与试验预期相符，见图2所示。
(3)将PCR扩增的F和H基因进行切胶回收、纯化，将纯化的F和H基因和pBNSP质粒(携带SAD-B19毒株全长cDNA的重组质粒)用BsiWI和NheI核酸限制性内切酶进行处理，酶切体系如表3所示：
表3酶切体系
| 组分名称 | 体积 |
| NebBuffer 2 | 5μL |
| Bsiw1 | 2ulμL |
| Nhe1 | 2μL |
| BSA | 0.5μL |
| pBNSP质粒 | 42.5μL |
上述体系混匀后，先37℃孵育2h，然后在55℃孵育2h，用凝胶回收试剂盒进行回收。将回收产物连接，连接体系如表7所示：
表4连接体系
| 组分名称 | 体积 |
| T4ligase buffer(10X) | 2μL |
| T4DNA ligase | 1μL |
| F和H DNA | 5μL |
| pBNSP DNA | 12μL |
上述体系混匀后，在16℃连接过夜。将连接产物转入DH5α感受态细胞，37℃培养箱培养16h后，挑取单克隆接种到羧苄青霉素抗性的LB培养基中振荡培养，37℃振荡培养20h，然后小提质粒用BsiWI/NheI进行酶切鉴定，酶切体系如表3所示，电泳检测酶切结果，pBNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H质粒经双酶切后分别可见15254bp和1989bp以及15254bp和1815bp的目的片段，结果正确见图3。
将酶切正确的质粒送北京金唯智生物科技有限公司进行测序。
将酶切鉴定和测序均正确的克隆参照Qiagen公司质粒大量提取试剂盒的说明书提取质粒，将最终的质粒浓度调整为1μg/μL，4℃保存待用。
实施例4利用重组质粒pBNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H进行重组病毒的拯救及筛选
1、转染和病毒筛选方法参照Matthias Schnell方法进行。
转染：(1)准备Vero-E6细胞：6孔细胞培养板细胞密度为5×105个/孔，培养液中含10％胎牛血清；37℃培养24h，至细胞75％左右时进行转染。
(2)取转染试剂X-tremeGene 9 24μl，加到600μl Optimem培养基的1.5mL离心管中，混匀后置室温5分钟。
(3)取5μl pBNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H，2.5μl pTIT-N，1.25μl pTIT-P，1.25μlpTIT-L，1μl pTIT-G plasmid，1.5μl pCAGGS-T7在另一个1.5mL离心管中混匀。
(4)将混匀的质粒加到转染试剂的管中，混匀后在室温静置15min。
(5)将质粒和转染试剂混合液加到6孔板中细胞中，100μl/孔，然后置34℃5％CO2培养箱中培养96h。
病毒筛选：
转染后第5天，将6孔板中的细胞分别转移到60mm的平皿中扩大培养。
转染后第8天，收获病毒液，并进行免疫荧光试验鉴定重组病毒是否拯救成功。其方法如下：将收获的病毒液加到12孔板中长满单层细胞中，然后置34℃5％CO2培养箱中培养24h，收获上清液，每孔加满80％预冷的丙酮，置4℃30min。弃去丙酮，轻微空干，每孔添加500μL抗狂犬病病毒N蛋白荧光抗体以及抗CDV荧光抗体，37℃孵育1-2h，弃去溶解液，用去离子洗涤细胞3次，荧光显微镜下观察，均可见大量绿色荧光斑点，见图4，获得的病毒命名为BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H。
实施例5重组病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H的传代和鉴定
1、测定拯救的重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H的毒价，按MOI(multiplicity of infection)0.1接种长满单层Vero E6的细胞，置34℃CO2培养箱中培养72h，收获病毒，补加培养液继续置34℃CO2培养箱中培养约72h，然后再收获病毒，这样连续收获病毒3次。分装-80℃保存备用。依次传代至第15次，并检测病毒滴度。
用RT-PCR鉴定重组病毒中F和H基因的遗传稳定性，所用引物和扩增体系如表1和表2，检测结果如图6所示，表明重组病毒可以稳定传代。
用Western blotting鉴定F和H蛋白和G蛋白的表达情况，结果如图5所示，表明重组病毒可以表达目的蛋白。
实施例6重组病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H在Vero细胞上的体外生长曲线研究
1、将Vero细胞在6孔板中按细胞数5×105/孔培养24h，然后将重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H按MOI 10感染细胞，置34℃5％CO2培养，病毒感染后分别在2h、24h、48h、72h和96h取样100μL上清培养液，最后进行免疫荧光试验，测定并绘制病毒生长曲线。
]2、结果显示，重组病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H的滴度比亲病毒的滴度稍低一点，在感染后72h，病毒滴度达到最高水平见，图7。
实施例7重组病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H在Balb/c小鼠体内的致病性研究
1、将毒价达到1×108FFU/mL的重组病毒用2％FBS的PBS作10倍系列稀释，稀释度的梯度为10-1～10-5，每个稀释度的病毒脑内接种6～8周龄BALB/c小鼠6只，每只接种0.03mL，逐日观察，3天内死亡的老鼠不是由于病毒感染引起，为非特异性死亡，不计入最后结果，观察14天。
2、结果所有小鼠在观察期内均健康生长，没有肉眼可见的临床症状出现，表明重组病毒对小鼠无致病性，证实以SAD-B19为骨架的重组狂犬病病毒是弱毒病毒，可以用于口服疫苗对野生动物进行狂犬病的免疫。
实施例8重组病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H灭活疫苗、免疫原性及攻毒保护研究
1、重组狂犬病病毒的灭活和疫苗的制备：
(1)将重组病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H，按0.025％的比例加入β-丙内脂，4℃放置24h，再置于37℃水解2h，完成病毒的灭活。
(2)灭活病毒的安全检验：将灭活后的病毒液、未灭活的狂犬病毒液分别与BSR细胞共同培养在96孔细胞培养板上，34℃，5％CO2培养箱内培养4d后，进行免疫荧光试验检测是否有狂犬病毒生长，如果灭活的病毒样品能够检测到绿色荧光，说明灭活不彻底。结果灭活病毒无荧光斑点，未灭活病毒均有绿色荧光斑点。
(3)采用法国SEPPIC公司的Montanide GEL佐剂，按5％-20％的比例与灭活抗原混合，以200转/分钟乳化低速搅拌10min即可，然后将疫苗分装于灭菌的疫苗瓶内，加盖密封，置于4℃保存备用。
2、疫苗免疫试验：
用BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H灭活抗原和其与Montanide GEL佐剂制备的疫苗分别免疫BALB/C小鼠，每只小鼠接种200μL，每组接种22只，同时设置阴性对照小鼠(注射200μLPBS)。每组小鼠在0天和14天进行免疫，共免疫2次。于首次免疫后7d、14d、21d和28d分别采血3只小鼠，用间接ELISA法测定抗狂犬病毒糖蛋白和抗犬瘟热病毒主要免疫基因蛋白的抗体水平。
结果显示，灭活抗原与Montanide GEL制备的疫苗免疫小鼠后能够产生较高的抗狂犬病毒糖蛋白和抗犬瘟热病毒主要免疫基因蛋白的抗体水平，见图8和图9。
为了验证小鼠获得高水平免疫力后是否具有对狂犬病毒攻击的免疫保护能力，在免疫后第28d对小鼠颅内接种50LD50的CVS-11 30μL，连续观察14d，记录小鼠的发病及死亡情况。
结果如图9所示，免疫灭活抗原与Montanide GEL佐剂制备的疫苗的小鼠在狂犬病毒攻击后全部存活，单独用灭活抗原免疫的小鼠保护率为66.7％，阴性对照小鼠全部发病死亡。
上述结果表明，BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H制成的灭活+佐剂疫苗免疫小鼠后能够抵抗狂犬病毒的攻击，在攻毒试验中符合国际要求的免疫攻毒保护率80％以上的标准。
综上所述，用该方法研制的重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H具有制备狂犬病和犬瘟热病毒病二联疫苗的潜力。
附件：
SEQIDNO.1
5′atgcacaagggaatccccaaaagctccaaaacccaaacacatacccaacaagaccgccccccacaacccagcaccgaacccgaagagaccaggacctcccgagcacgacacagcataacatcagctcagcgatccacgcactatgatcctcgaacatcggacagacccgtctcctacaccatggacaggatcaggtcccgcaagcaaactagccacagattgaagaacatcccagttcacggaaaccacgaggctattatccagcacataccagagagtgtctcaaaaggagcgagatcccagatcgaaaggcggcaacccaatgcaatcaactcaggctctcagtgcacctggttagtcctgtggtgcctcggaatagccagtctctttctgtgttccaaggctcagatacattggaataatttgtcaactattgggatcatcgggactgatagtgtccattacaagatcatgactaggcccagtcaccagtacttggtcataaaactgatgcccaatgtttcacttatagataattgtaccaaagcagaactaggtgagtatgagaaattattgaattcagtcctcgaaccaatcaaccaagccttgactctaatgaccaagaatgtgaagcccctgcagtcattagggtcaggtaggagacaaaggcgttttgcaggagtggtacttgcaggtgcagctttaggagtggctacagctgcacaaatcactgcaggaatagctttacatcaatccaacctcaatgctcaagcaatccaatctcttagaaccagccttgaacagtctaacaaagctatagaagaaattagggaggccacccaagaaaccgtcattgccgttcagggagtccaggactacgtcaacaacgaactcgtccctgccatgcaacatatgtcatgtgaattagttgggcagagattagggttaagactgcttcggtattatactgagttgttgtcaatatttggcccgagtttacgtgaccctatttcagccgagatatcaattcaggcactgagttatgctcttggaggagaaattcataagatacttgagaagttgggatattctggaggtgatatgattgcaatcttggagagtcgggggataaaaacaaaaataactcatgttgatctccctgggaaattcatcatcctaagtatctcatacccaactttatcagaagtcaagggggttatagtccacaggctggaagcagtttcttacaacataggatcacaagagtggtacaccactgtccccaggtatattgcaactaatggttacttaatatctaattttgatgagtcatcttgtgtattcgtctcagagtcagccatttgtagccagaactccctgtatcccatgagcccactcttacaacaatgtattaggggcgacacttcatcttgtgctcggaccttggtatctgggactatgggcaacaaatttattctgtcaaaaggtaatatcgtcgcaaattgtgcttctatactatgtaagtgttatagcacaagcacaattattaatcagagtcctgataagttgctgacatttattgcctccgatacctgcccactggttgaaatagatggtgttactatccaagttggaggcaggcaataccctgatatggtatacgaaggcaaagttgccttaggccctgctatatcacttgagaggttagatgtaggtacaaatttagggaacgcccttaagaaactggatgatgctaaggtactgatagactcctctaaccagatccttgagacggttaggcgctcttcctttaattttggcagtctcctcagcgttcctatattaagttgtacagccctggctttgttgttgctgatttactgttgtaaaagacgctaccaacagacactcaagcagcatactaaggtcgatccggcatttaaacctgatctaaccggaacttcgaaatcctatgtgagatcactctga 3′
SEQIDNO.2
5′ATGCTCCCCTACCAAGACAAGGTGGGTGCCTTCTACAAGGATAATGCAAGAGCCAATTCAACCAAGCTGTCCTTAGTGACAGAAGGACATGGGGGCAGGAGACCACCTTATTTGTTGTTTGTCCTTCTCATCTTATTGGTTGGTATCCTGGCCTTGCTTGCTATCACTGGAGTTCGATTTCACCAAGTATCAACTAGTAATATGGAATTTAGCAGATTGCTGAAAGAGGATATGGAGAAATCAGAGGCCGTACATCACCAAGTCATAGATGTCTTGACACCGCTCTTCAAGATTATTGGAGATGAGATTGGGTTACGGTTGCCACAAAAGCTAAACGAGATCAAACAATTTATCCTTCAAAAGACAAATTTCTTCAATCCGAACAGAGAATTCGACTTCCGCGATCTCCACTGGTGCATTAACCCGCCTAGTACGGGCAAGGGGAATTTTACTAATTACTGTGAGTCAATTGGGATCAGAAAAGCTATTGCATCGGCAGCAAATCCTATCCTTTTATCAGCCCTATCTGGGGGCAGAGGTGACATATTCCCACCACACAGATGCAGTGGAGCTACTACTTCAGTAGGCAAAGTTTTCCCCCTATCAGTCTCATTAtccatgtctttgatctcaaGAACCTCAGAGGTAATCAATATGCTGACCGCTATCTCAGACGGCGTGTATGGCAAAACTTACTTGCTAGTGCCTGATGATATAGAAAGAGAGTTCGACACTCGAGAGATTCGAGTCTTTGAAATAGGGTTCATCAAAAGGTGGCTGAATGACATGCCATTACTCCAAACAACCAACTATATGGTACTCCCGAAGAATTCCAAAGCCAAGGTATGTACTATAGCAGTGGGTGAGTTGACACTGGCTTCCTTGTGTGTAGAAGAGAGCACTGTATTATTATATCATGACAGCAGTGGTTCACAAGATGGTATTCTAGTAGTGACACTGGGGATATTTTGGGCAACACCTATGGATCACATTGAGGAAGTGATACCTGTCGCTCACCCATCAATGAAGAAAATACATATAACAAACCACCGTGGTTTTATAAAAGATTCAATTGCAACCTGGATGGTGCCTGCCCTGGCCTCTGAGAAACAAGAAGAACAAAAAGGTTGTCTGGAGTCAGCTTGTCAAAGAAAAACCTACCCCATGTGCAACCAAGCGTCATGGGAACCCTTCGGAGGAAGACAGTTGCCATCTTATGGGCGGTTGACATTACCTCTAGATGCAAGTGTTGACCTTCAACTTAACATATCGTTCACATACGGTCCGGTTATACTGAATGGAGGTGGTATGGATTATTATGAAAGCCCACTTTTGAActccggatggcttaccattcCCCCCAAAGACGGAACAATCTCTGGATTGATAAACAAAGCAGGTAGAGGAGACCAGTTCACTGTACTCCCCCATGTGTTAACATTTGCGCCCAGGGAATCAAGTGGAAATTGTTATTTACCTATTCAAACATCTCAAATTAGAGATAGAGATGTCCTCATTGAGTCCAATATAGTGGTGTTGCCTACCCAGAGTATTAGATATGTCATAGCAACGTATGACATATCACGAAGTGATCATGCTATTGTCTATTATGTTTACGACCCAATCCGGACGATTTCTTATACGCACCCATTTAGACTAACTACCAAGGGTAGACCTGATTTCCTAAGGATTGAATGTTTTGTGTGGGATGACAATTTGTGGTGTCACCAATTTTACAGATTCGAGGCTGACATCGCCAACTCTACAACCAGTGTTGAGAATTTAGTCCGTATAAGATTCTCATGTAACCGTTAA3′
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种嵌合犬瘟热病毒主要免疫基因的重组狂犬病病毒及其应用
<130> 1
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1989
<212> DNA
<213> canine distemper virus
<400> 1
atgcacaagg gaatccccaa aagctccaaa acccaaacac atacccaaca agaccgcccc 60
ccacaaccca gcaccgaacc cgaagagacc aggacctccc gagcacgaca cagcataaca 120
tcagctcagc gatccacgca ctatgatcct cgaacatcgg acagacccgt ctcctacacc 180
atggacagga tcaggtcccg caagcaaact agccacagat tgaagaacat cccagttcac 240
ggaaaccacg aggctattat ccagcacata ccagagagtg tctcaaaagg agcgagatcc 300
cagatcgaaa ggcggcaacc caatgcaatc aactcaggct ctcagtgcac ctggttagtc 360
ctgtggtgcc tcggaatagc cagtctcttt ctgtgttcca aggctcagat acattggaat 420
aatttgtcaa ctattgggat catcgggact gatagtgtcc attacaagat catgactagg 480
cccagtcacc agtacttggt cataaaactg atgcccaatg tttcacttat agataattgt 540
accaaagcag aactaggtga gtatgagaaa ttattgaatt cagtcctcga accaatcaac 600
caagccttga ctctaatgac caagaatgtg aagcccctgc agtcattagg gtcaggtagg 660
agacaaaggc gttttgcagg agtggtactt gcaggtgcag ctttaggagt ggctacagct 720
gcacaaatca ctgcaggaat agctttacat caatccaacc tcaatgctca agcaatccaa 780
tctcttagaa ccagccttga acagtctaac aaagctatag aagaaattag ggaggccacc 840
caagaaaccg tcattgccgt tcagggagtc caggactacg tcaacaacga actcgtccct 900
gccatgcaac atatgtcatg tgaattagtt gggcagagat tagggttaag actgcttcgg 960
tattatactg agttgttgtc aatatttggc ccgagtttac gtgaccctat ttcagccgag 1020
atatcaattc aggcactgag ttatgctctt ggaggagaaa ttcataagat acttgagaag 1080
ttgggatatt ctggaggtga tatgattgca atcttggaga gtcgggggat aaaaacaaaa 1140
ataactcatg ttgatctccc tgggaaattc atcatcctaa gtatctcata cccaacttta 1200
tcagaagtca agggggttat agtccacagg ctggaagcag tttcttacaa cataggatca 1260
caagagtggt acaccactgt ccccaggtat attgcaacta atggttactt aatatctaat 1320
tttgatgagt catcttgtgt attcgtctca gagtcagcca tttgtagcca gaactccctg 1380
tatcccatga gcccactctt acaacaatgt attaggggcg acacttcatc ttgtgctcgg 1440
accttggtat ctgggactat gggcaacaaa tttattctgt caaaaggtaa tatcgtcgca 1500
aattgtgctt ctatactatg taagtgttat agcacaagca caattattaa tcagagtcct 1560
gataagttgc tgacatttat tgcctccgat acctgcccac tggttgaaat agatggtgtt 1620
actatccaag ttggaggcag gcaataccct gatatggtat acgaaggcaa agttgcctta 1680
ggccctgcta tatcacttga gaggttagat gtaggtacaa atttagggaa cgcccttaag 1740
aaactggatg atgctaaggt actgatagac tcctctaacc agatccttga gacggttagg 1800
cgctcttcct ttaattttgg cagtctcctc agcgttccta tattaagttg tacagccctg 1860
gctttgttgt tgctgattta ctgttgtaaa agacgctacc aacagacact caagcagcat 1920
actaaggtcg atccggcatt taaacctgat ctaaccggaa cttcgaaatc ctatgtgaga 1980
tcactctga 1989
<210> 2
<211> 1815
<212> DNA
<213> canine distemper virus
<400> 2
atgctcccct accaagacaa ggtgggtgcc ttctacaagg ataatgcaag agccaattca 60
accaagctgt ccttagtgac agaaggacat gggggcagga gaccacctta tttgttgttt 120
gtccttctca tcttattggt tggtatcctg gccttgcttg ctatcactgg agttcgattt 180
caccaagtat caactagtaa tatggaattt agcagattgc tgaaagagga tatggagaaa 240
tcagaggccg tacatcacca agtcatagat gtcttgacac cgctcttcaa gattattgga 300
gatgagattg ggttacggtt gccacaaaag ctaaacgaga tcaaacaatt tatccttcaa 360
aagacaaatt tcttcaatcc gaacagagaa ttcgacttcc gcgatctcca ctggtgcatt 420
aacccgccta gtacgggcaa ggggaatttt actaattact gtgagtcaat tgggatcaga 480
aaagctattg catcggcagc aaatcctatc cttttatcag ccctatctgg gggcagaggt 540
gacatattcc caccacacag atgcagtgga gctactactt cagtaggcaa agttttcccc 600
ctatcagtct cattatccat gtctttgatc tcaagaacct cagaggtaat caatatgctg 660
accgctatct cagacggcgt gtatggcaaa acttacttgc tagtgcctga tgatatagaa 720
agagagttcg acactcgaga gattcgagtc tttgaaatag ggttcatcaa aaggtggctg 780
aatgacatgc cattactcca aacaaccaac tatatggtac tcccgaagaa ttccaaagcc 840
aaggtatgta ctatagcagt gggtgagttg acactggctt ccttgtgtgt agaagagagc 900
actgtattat tatatcatga cagcagtggt tcacaagatg gtattctagt agtgacactg 960
gggatatttt gggcaacacc tatggatcac attgaggaag tgatacctgt cgctcaccca 1020
tcaatgaaga aaatacatat aacaaaccac cgtggtttta taaaagattc aattgcaacc 1080
tggatggtgc ctgccctggc ctctgagaaa caagaagaac aaaaaggttg tctggagtca 1140
gcttgtcaaa gaaaaaccta ccccatgtgc aaccaagcgt catgggaacc cttcggagga 1200
agacagttgc catcttatgg gcggttgaca ttacctctag atgcaagtgt tgaccttcaa 1260
cttaacatat cgttcacata cggtccggtt atactgaatg gaggtggtat ggattattat 1320
gaaagcccac ttttgaactc cggatggctt accattcccc ccaaagacgg aacaatctct 1380
ggattgataa acaaagcagg tagaggagac cagttcactg tactccccca tgtgttaaca 1440
tttgcgccca gggaatcaag tggaaattgt tatttaccta ttcaaacatc tcaaattaga 1500
gatagagatg tcctcattga gtccaatata gtggtgttgc ctacccagag tattagatat 1560
gtcatagcaa cgtatgacat atcacgaagt gatcatgcta ttgtctatta tgtttacgac 1620
ccaatccgga cgatttctta tacgcaccca tttagactaa ctaccaaggg tagacctgat 1680
ttcctaagga ttgaatgttt tgtgtgggat gacaatttgt ggtgtcacca attttacaga 1740
ttcgaggctg acatcgccaa ctctacaacc agtgttgaga atttagtccg tataagattc 1800
tcatgtaacc gttaa 1815
Claims (8)
1.一株犬瘟热病毒的F和H基因，其特征在于，其序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。
2.一种嵌合犬瘟热病毒主要免疫基因的重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H，其特征在于，以狂犬病病毒SAD-B19株为骨架，将SEQIDNO.1所示的犬瘟热病毒F基因和SEQIDNO.2所示的犬瘟热病毒H免疫基因分别插入SAD-B19全长cDNA中，最后通过反向遗传操作技术拯救分别获得重组狂犬病病毒株BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H。
3.根据权利要求2所述的重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H，其特征在于，以狂犬病病毒SAD-B19株为骨架，将SEQIDNO.1所示的F基因和SEQIDNO.2所示的H基因分别克隆至狂犬病病毒SAD-B19株全长cDNA中，分别构建了重组质粒pBNSP-CDV-F和pBNSP-CDV-H，之后通过反向遗传操作技术拯救分别获得重组狂犬病病毒株BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H。
4.根据权利要求2所述的重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H，其特征在于，以狂犬病病毒SAD-B19株为骨架，将SEQIDNO.1所示的F基因和SEQIDNO.2所示的H基因分别克隆在狂犬病病毒SAD-B19全长cDNA中的N基因和P基因之间，分别获得重组质粒pBNSP-CDV-F和pBNSP-CDV-H，利用重组质粒pBNSP-CDV-F和pBNSP-CDV-H进行重组病毒拯救，分别获得重组病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H。
5.根据权利要求3或4任一项所述的重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H，其特征在于，构建重组质粒pBNSP-CDV-F和pBNSP-CDV-H的具体方法如下：利用CDV-F和H的上游引物和下游引物分别扩增F和H基因，引入核酸限制性内切酶BsiWI和NheI分别对F基因、H基因和pBNSP质粒进行酶切处理，F基因和pBNSP质粒的酶切产物连接转化获得重组质粒pBNSP-CDV-F，H基因和pBNSP质粒的酶切产物连接转化获得重组质粒pBNSP-CDV-H。
6.根据权利要求5所述的重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H，其特征在于，CDV-F和H的上游引物和下游引物的序列如表1所示。
7.根据权利要求5所述的重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H，所述pBNSP质粒是携带SAD-B19毒株全长cDNA的重组质粒。
8.权利要求2～7任一所述重组狂犬病病毒BNSP-CDV-F和BNSP-CDV-H作为重组二联疫苗在免疫狂犬病病毒和/或犬瘟热病毒病方面的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910309372.5A CN109943576A (zh) | 2019-04-17 | 2019-04-17 | 一种嵌合犬瘟热病毒主要免疫基因的重组狂犬病病毒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910309372.5A CN109943576A (zh) | 2019-04-17 | 2019-04-17 | 一种嵌合犬瘟热病毒主要免疫基因的重组狂犬病病毒及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN109943576A true CN109943576A (zh) | 2019-06-28 |
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ID=67014369
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| CN201910309372.5A Pending CN109943576A (zh) | 2019-04-17 | 2019-04-17 | 一种嵌合犬瘟热病毒主要免疫基因的重组狂犬病病毒及其应用 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110951699A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-04-03 | 长春西诺生物科技有限公司 | 表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用 |
| CN112852759A (zh) * | 2021-02-19 | 2021-05-28 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种嵌合犬细小病毒vp2基因的重组狂犬病病毒及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107320720A (zh) * | 2016-04-29 | 2017-11-07 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种疫苗组合物、试剂盒及应用 |
-
2019
- 2019-04-17 CN CN201910309372.5A patent/CN109943576A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
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