CN104195116B - 一种表达鹅细小病毒vp3基因的重组新城疫病毒及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其构建方法，属于重组病毒疫苗领域。该重组新城疫病毒为鹅源分离株，其F蛋白的裂解位点氨基酸是GRQGRL，P3基因位于新城疫病毒P基因和M基因之间非编码区。将转录质粒pCI‑NA‑VP3(SEQ ID NO.1)和转录辅助质粒pcDNA‑N、pcDNA‑P、pcDNA‑L(SEQ ID NO.2～4)共转染新城疫病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞，从转染的宿主细胞的细胞悬液中可拯救重组新城疫病毒。本发明的表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒可作为预防新城疫、鹅细小病毒二联活载体疫苗。

Description

一种表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其构建 方法

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其构建方法。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)是新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。该病在1926年首次爆发于印度尼西亚的巴塔维亚，自上个世纪九十年代第四次大流行以来，包括中国在内的世界多国的主要流行株为classII中基因VII型病毒成员。NDV几乎可感染全部鸟类，并可随侯鸟的迁徙而广泛传播。在所有禽类中，鸡与火鸡最易感，常常可造成整个鸡群90％以上的死亡率。水禽如鸭、鹅等也能感染本病。近年来，研究者从许多地区的水禽体内分离到NDV病毒，对水禽的致病性较高，对15日龄以下的雏鹅致死率高达100％，成年鹅发病率达50％～70％，死亡率为10％～20％。因此，新城疫是危害养禽业的一种主要传染病，OIE将其列为A类疫病。疫苗接种能有效预防该病。在我国NDV疫苗接种几乎是所有新生雏鸡必不可少的免疫程序，每年用于新城疫防制的弱毒疫苗至少在百亿羽份以上，并且随着我国养禽业的发展，疫苗的需求量还会不断增加。

不同NDV毒株的致病性差异很大，影响病毒毒力的主要因素是融合蛋白(F)的前体F0能否被宿主细胞的蛋白酶有效地裂解，大量研究表明F0裂解部位(112-117aa)的氨基酸序列呈现明显的规律性，强毒株的裂解基序为(R/K)RQ(R/K)R↓F，含有多碱性氨基酸，而弱毒株的裂解基序(G/E)(K/R)Q(G/E)R↓L。对于强毒株来说，由于裂解位点含有多碱性氨基酸，F0能被多种组织细胞的蛋白酶识别，从而有效裂解，而弱毒株F0裂解部位中碱性氨基酸被中性氨基酸所代替，不能被大多数细胞内的蛋白酶识别，仅能被上呼吸道中或鸡胚尿囊液中分泌到细胞外的胰酶样蛋白酶识别，因此，膜融合活性低。

新城疫病毒是一种有囊膜的单股、负链RNA病毒，在分类上属于副粘病毒科禽副粘病毒属，一般认为，NDV基因组RNA的长度为15186个核苷酸，但近年来发现部分鹅源毒株和鸡源毒株基因组RNA长度为15192个核苷酸，编码6个结构蛋白，依次为核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大聚合酶蛋白(L)。与其他负链RNA病毒一样，NDV最小感染单位是核糖核蛋白复合体(RNP)，裸露的基因组RNA不具有感染性，只有在与核蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)结合成核糖核蛋白复合体(RNP)后，才能作为模板起始复制和转录，并表达和包装出具有感染性的子代病毒。根据这一原理可建立NDV的反向遗传学操作系统。

鹅细小病毒(goose parvovirus，GPV)也称为小鹅瘟病毒(gosling plaguevirus，GPV)，是一种可引起急性或亚急性败血性传染病，主要侵害一月龄内雏鹅和雏番鸭，以传播快、高发病率、高死亡率、严重下痢以及渗出性肠炎为特征。危害程度与日龄密切相关，10日龄内雏鹅发病率和死亡率可达100％，以后随日龄增大而逐渐减少。目前世界许多集约化养鹅和养殖番鸭的国家都有本病的发生，每年都有不同程度的流行，给养禽业造成巨大损失。1956年，方定一等在扬州首先发现本病，并于1961年用鹅胚分离到本病病原。

鹅细小病毒(GPV)属于细小病毒科细小病毒亚科细小病毒属成员，其基因组为单股、线性DNA，大小约为5kb，GPV基因组中含有2个主要开放阅读框架(ORF)，两个主要的ORF位于同一可读框中，间隔18nt，左侧ORF(LORF)编码非结构蛋白(NS)，右侧ORF(RORF)编码3种结构蛋白(VP)，即VP1、VP2和VP3。其中VP3为主要结构蛋白，是病毒核衣壳的主要成分，约占衣壳总蛋白含量的80％，且暴露于病毒粒子表面，是病毒刺激机体产生保护性中和抗体的主要抗原蛋白。因此，VP3基因在小鹅瘟免疫防制中具有重要意义。

新城疫自1926年爆发以来其病毒虽只有一个血清型，但在进化上分为class I和II两个分支，其中class I包括9个基因型成员大多不致病，class II包括11个基因型，九十年代以来包括中国在内世界多国主要的流行株为基因VII型，而广泛使用的弱毒疫苗株为基因II型，由于基因型与抗原性的不匹配当前弱毒疫苗株不能完全抵抗感染并且强毒攻击后排毒现象严重，尤其在鹅群中愈演愈烈，不断有强毒株的分离的报道，研究表明使用当前流行毒株致弱后免疫家禽不仅能提供很好的保护作用而且显著降低排毒水平，为新型新城疫病毒弱毒疫苗候选株研制指明了方向。

重组NDV作为活病毒载体疫苗具有突出的优点：NDV弱毒疫苗长期以来一直用于家禽防疫，其安全性与有效性已被充分证明；NDV遗传相对稳定，仅有一个血清型，毒株间发生重组及毒力返强可能性极小；NDV复制过程在细胞浆内完成，从RNA到RNA，不存在DNA阶段及与细胞基因组整合的可能；NDV弱毒疫苗可同时诱导全身性体液免疫、局部粘膜免疫及细胞免疫的形成，产生更加全面、确实的免疫保护；可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射多种方式给苗，使用极为方便；NDV具有鸡胚生长高滴度的特性，因而作为疫苗生产成本极为低廉。另外，在养禽业中对NDV的疫苗免疫几乎是必不可少的免疫程序，以NDV作为表达家禽病毒保护性抗原的载体可以做到一针防两病甚至多病，其经济价值十分巨大。

小鹅瘟对养鹅业危害严重，目前常用的预防小鹅瘟感染的疫所分为种鹅用和雏鹅用疫苗两种，种鹅用疫苗可分为鸭胚适应的弱毒苗和鹅胚强毒疫苗，雏鹅用疫苗也分为鸭胚适应的弱毒苗和鹅胚强毒疫苗，强毒疫苗能产生较好的母源抗体，通过卵黄传递给雏鹅，但可能会造成强毒扩散，弱毒疫苗没有致病性，但存在保护力较弱的缺点，不足以控制小鹅瘟的大流行。并且弱毒苗不稳定且易发生毒力返祖现象，可能会选成潜在感染和排毒的风险，油乳剂苗产生免疫力慢且存在使用剂量大、制备工艺比较复杂、成本较高等一系列问题，难以满足集约化的需要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其构建方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒，其新城疫病毒为鹅源分离株。

优选的，所述的重组新城疫病毒F蛋白的裂解位点氨基酸是弱毒株特征序列，具体的是GRQGRL。

优选的，所述的VP3基因位于新城疫病毒P基因和M基因之间非编码区。

优选的，所述的新城疫病毒是NA-1株。

优选的，所述的VP3基因来源于鹅细小病毒GD-01株。

更优选的，所述的表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒的核苷酸序列在SEQID NO.1所示的pCI-NA-VP3质粒的SalI和NotI位点之间。

上述表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建包含插入鹅细小病毒VP3基因的新城疫病毒基因组序列的转录质粒；

(2)构建能够表达新城疫病毒NP蛋白、P蛋白和L蛋白的一个或多个转录辅助质粒；

(3)将转录质粒和辅助质粒共转染新城疫病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)从转染的宿主细胞的细胞悬液中拯救重组新城疫病毒。

步骤(1)中所述的转录质粒优选为pCI-NA-VP3，其核苷酸序列(不含骨架载体)如SEQ ID NO.1所示。

步骤(2)中所述的转录辅助质粒优选为pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L，序列(不含骨架载体)如SEQ ID NO.2～4所示；

步骤(3)中所述的宿主细胞优选为Vero细胞或BHK细胞。

本发明通过建立当前流行的基因VII型新城疫病毒反向遗传操作系统，并在此基础上对其致弱后作为活病毒载体，成功表达了鹅细小病毒保护性抗原蛋白VP3，构建了表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒，其可作为预防新城疫、鹅细小病毒二联活载体疫苗。

附图说明

图1是新城疫病毒NA-1株野生型及重组鹅细小病毒VP3基因组cDNA的构建示意图。其中1A为克隆于pCI载体上的新城疫病毒NA-1株基因组cDNA克隆pCI-NA-1。1B为插入鹅细小病毒VP3基因的重组NDV基因组cDNA克隆pCI-NA-VP3；其中，“粗体字母”标识为PmeI酶切位点，“小写字母”标识为基因转录终止信号序列GE，“下划线的大写字母”标识为基因转录起始信号序列GS，“斜体序列GCCACC”为KozaK序列。

图2是间接免疫荧光检测重组NDV rNA-1和野生型NA-1感染的BHK-21细胞结果图。其中，(A)：rNA-1感染的BHK-21细胞，(B)：NA-1感染的BHK-21细胞，(C))：未感染病毒的BHK-21细胞。

图3是重组病毒RT-PCR检测结果图；泳道1：rNA-VP3(1605bp条带)，泳道2：rNA-1(无条带)，泳道3：DL2000。

图4是间接免疫荧光检测重组病毒rNA-VP3GPV VP3的表达结果图；(A)：rNA-VP3感染的BHK-21细胞，(B)：rNA-1感染的BHK-21细胞，(C)：未感染病毒BHK-21细胞。

图5是母本NDV病毒及重组病毒鸡胚生长特性图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做基因不详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若非特殊说明，实施例中的方法均为本技术领域常规方法。

实施例1 新城疫病毒反向遗传操作系统的构建

1材料和方法

1.1材料

新城疫病毒NA-1株(GenBank：DQ659677.1)；BHK-21细胞(ATCC No.CCL-10)，培养液为含10％胎牛血清的DMEM；质粒pCI(Promega)和pBluescript II KS+(Clontech)；Phusion DNA聚合酶，T4DNA连接酶及其它限制性内切酶均购自NEB公司；感受态细胞购自TaKaRa公司；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；RNA提取用TRIzol、鼠源反转录酶MLV、磷酸钙转染试剂盒，RPMI1640培养液购自Invitrogen；鸡抗NDV全病毒高免血清；荧光素(FITC)标记的羊抗鸡二抗购自Sigma公司；荧光显微镜为BX51FL；Olympus，购自Olympus公司，细胞培养板购自CORNING公司，无特定病原体(SPF)白来航鸡及鸡胚购自北京梅里亚公司等。

1.2NDV基因组全长cDNA克隆及辅助质粒的构建

NDV基因组全长cDNA克隆及辅助质粒的构建所设计的引物如下表：

注：下划线标注限制性酶识别位点；粗体标注Kozak序列。

新城疫病毒接种9～11日龄SPF鸡胚收获病毒尿囊液按常规Trizol方法提取病毒基因组RNA，采用分段克隆的策略将整个基因组分为7个末端部分重叠的片段(F1～F7)进行RT-PCR扩增，在F1段5’端通过PCR引入锤头状核酶结构序列(HamRz)，在F7段3’端通过PCR引入丁肝病毒核酶结构(HdvRz)，同时分别在HamRz序列上游和HdvRz序列下游引入SalI和NotI位点，各cDNA片段克隆至pBluescript EcoRV位点，测序分析证实与基因组RNA对应序列完全一致；利用邻近片段重叠部分的限制性酶切位点通过体外拼接组装成完整的NDV基因组cDNA，并通过PCR方法在cDNA位于P基因和M基因之间的3165-3172nt进行碱基定点突变，引入PmeI限制性酶切位点(GTTTAAAC)作为拯救病毒的分子标记及外源基因插入位点，最后完整的cDNA克隆在转录载体pCI中SalI和NotI位点之间，构成NDV基因组全长克隆pCI-NA-1。pCI-NA-1中CMV启动子和SV40晚期多腺苷酸环化信号之间的DNA片段在宿主细胞RNA聚合酶II作用下得到转录，并且由于HamRz和HdvRz的自身催化功能，可以保证转录产物的3’末端和5’末端与克隆的NDV基因组cDNA精确一致(如图1A)。

按照上述方法，分别将NDV的NP、P和L基因的ORF cDNA克隆至pcDNA3.1载体CMV启动子的下游，并在ATG前加上增强表达的Kozak序列，构成表达NDV NP、P和L蛋白的辅助质粒pcDNA-N、pcDNA-P和pcDNA-L。

1.3病毒的拯救

BHK-21细胞接种于六孔板中，待第二天生长至70～80％单层时，采用磷酸钙转染试剂将构建好的全长转录质粒pCI-NA-1与辅助质粒pcDNA-N、pcDNA-P和pcDNA-L共转染BHK-21细胞，转染量分别为5μg、2.5μg、1.25μg和1.25μg。转染细胞于5％CO₂、37℃培养箱中培养12h后，弃去转染混合物，以含有10％DMSO的PBS液休克细胞2.5min，加入完全DMEM培养液继续于5％CO₂、37℃培养箱中培养。4天后收获细胞上清，接种于9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔，4天后取鸡胚尿囊液，进行血凝(HA)和血凝抑制(HI)检测，收获二者检测均为阳性的鸡胚尿囊液，分别命名为rNA-1，并记为F1代。并按常规方法继续接种9～11日龄SPF鸡胚传代。

1.4拯救新城疫病毒的间接免疫荧光鉴定

将BHK-21细胞接种于24孔板中，第二天待细胞生长至70～80％单层时，以无血清DMEM培养液将救获的重组新城疫病毒rNA-1及母本毒NA-1尿囊液进行10倍系列稀释，取10³倍病毒稀释液接种于24孔板中，接种量为100μL/孔。于5％CO₂、37℃培养箱中培养3d，弃去培养上清，以PBS缓冲液洗涤细胞两次，室温下以3％多聚甲醛固定30min，PBST洗涤三遍。以1％BSA按1:100倍稀释鸡抗NDV高免血清为一抗加入24孔板中室温摇床孵育30min，PBST洗涤三遍后，加入1:300倍稀释FITC标记的山羊抗鸡IgG绿色荧光抗体，室温摇床作用30min，PBST洗涤三遍，荧光显微镜观察检测结果。

1.5拯救病毒的鸡胚生长特性

为比较反向遗传操作拯救病毒与野生型病毒的鸡胚生长特性，拯救病毒rNA-1F3代和野生型NA-1尿囊病毒液按1×10⁴EID₅₀接种SPF鸡胚尿囊腔。在接种后24小时、48小时、72小时及96小时取样，每个时间点随机抽取6枚胚，收集尿囊液，混匀后分别测定其EID₅₀。

2结果

2.1NDV基因组全长cDNA克隆的构建

用TRIzol法提取的NDV基因组RNA，以鼠源反转录酶(MLV)进行反转录合成cDNA第一条链。以合成的cDNA为模板通过引物进行PCR扩增获得了覆盖整个基因组的7个cDNA片段，并用相邻片段重叠部分的限制性酶切位点体外拼接获得了完整的cDNA克隆，在全长cDNA片段5’端前缀HamRz，在全长cDNA片段3’端连有HdvRz，构建成表达野生型NA-1cDNA克隆pCI-NA-1。

2.2转录辅助质粒的构建

分别将NDV的NP、P和L基因的ORF cDNA分别克隆至pcDNA载体中构建辅助质粒pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L。pcDNA-N质粒的序列(不含骨架载体)见SEQ ID NO.2(1-6为限制酶HindIII序列，7-12为Kozak序列，1483-1488为限制酶EcoRI序列，其余为NP基因序列)；pcDNA-P质粒的序列(不含骨架载体)见SEQ ID NO.3(1-6为限制酶HindIII序列，7-12为Kozak序列，1201-1206为限制酶EcoRI序列，其余为P基因序列)；pcDNA-L质粒的序列(不含骨架载体)见SEQ ID NO.4(1-6为限制酶NheI序列，7-12为Kozak序列，6528-6535为限制酶NotI序列，其余为L基因序列)。

2.3从cDNA克隆救获感染性rNA-1病毒

为了从克隆的cDNA中拯救感染性rNA-1，以pCI-NA-1与辅助质粒pcDNA-N、pcDNA-P和pcDNA-L共转染BHK-21细胞，转染5天后，将培养上清接种9～11日龄SPF鸡胚，4天后，通过HA、HI检测，结果均为阳性，收取鸡胚尿囊液，命名为rNA-1，记为F1代。表明，通过反向遗传操作技术，利用NDV NA-1株基因组cDNA克隆成功救获具有感染性的野生型NDV NA-1株rNA-1。

2.4间接免疫荧光检测救获的病毒

为进一步鉴定上述救获的病毒，分别以rNA-1和母本毒NA-1适当稀释后感染BHK-21单层细胞，24h后，以3％多聚甲醛固定细胞，分别以1:100倍稀释鸡抗NDV高免血清为一抗、1:300倍稀释山羊抗鸡FITC标记抗体为二抗进行免疫荧光染色。结果显示，救获新城疫病毒rNA-1和母本野生型NA-1感染细胞均显示阳性绿色荧光信号(图2A、2B)，而未感染病毒的BHK-21细胞则显示阴性荧光信号(图2C)。

实施例2 F裂解位点的突变与表达鹅细小病毒(GPV)VP3基因的全长cDNA克隆的构建

1材料和方法

1.1材料

同实施例1。

1.2表达VP3基因全长质粒的构建

在上述NDV基因组全长cDNA克隆pCI-NA-1的基础上，设计突变引物如下表：

注：引物Fmut-R中斜体为F蛋白裂解位点序列，加下划线为突变位点。

采用PCR方法在全长cDNA克隆4883-4900nt进行突变，使编码氨基酸从强毒特征序列RRQKRF突变为弱毒特征序列GRQGRL。从GenBank获得GPV GD-01株VP3开放阅读框序列(GenBank Accession No.DQ665790)，设计引物，上游引物在5’端引入PmeI限制酶识别序列和NDV自身聚合酶蛋白L识别的转录终止序列GE(TTAAGAAAAAA)及转录起始序列GS(ACGGGTAGAA)，并在起始密码子ATG前引入上增强表达的KozaK序列，同时下游引物在VP3ORF3’端同样引入PmeI限制酶识别序列。引物设计如下表：

注：粗体标识为突变/引入限制性内切酶PmeI识别序列；小写字母为基因转录终止信号(GE)序列，加下划线标识为基因转录起始信号(GS)序列；加方框标识为基因间隔区核苷酸，斜体加粗的序列GCCACC标识为KozaK序列。

以GPV基因组为模板，通过上述引物PCR扩增VP3完整ORF，PCR产物克隆至pBluescript EcoRV位点并经测序分析正确后，经限制酶PmeI消化后，回收VP3片段，连接入同样酶切并去磷酸化的cDNA克隆pCI-NA-1中，VP3基因位于NDV基因组P基因与M基因之间，构成表达GPVVP3基因的重组NDV基因组全长cDNA克隆pCI-NA-VP3(如图1B)。

1.3病毒的拯救

BHK-21细胞接种于六孔板中，待第二天生长至70～80％单层时，采用磷酸钙转染试剂将构建好的全长转录质粒pCI-NA-VP3与辅助质粒pcDNA-N、pcDNA-P和pcDNA-L共转染BHK-21细胞，转染量分别为5μg、2.5μg、1.25μg和1.25μg。转染细胞于5％CO₂、37℃培养箱中培养12h后，弃去转染混合物，以含有10％DMSO的PBS液休克细胞2.5min，加入完全DMEM培养液继续于5％CO₂、37℃培养箱中培养。NDV的融合蛋白F0必需裂解为F1和F2才能感染周围细胞，对于转染质粒pCI-NA-VP3拯救突变致弱毒而言，裂解其F0蛋白的蛋白酶不能由BHK-21细胞分泌，因此，需在培养液中加入相应的蛋白酶TCPK，2μg/孔，3天后，收获培养上清接种9～11日龄SPF鸡胚，4天后检测HA和HI，收取均为阳性的尿囊液，命名为rNA-VP3，并记为F1代。

1.4重组病毒的RT-PCR鉴定

为确定拯救成功的重组病毒中是否携带有外源基因片段，取F1代毒的鸡胚尿囊液，按RNA提取试剂盒说明书提取病毒的RNA，以VP3特异性引物进行RT-PCR。同时设接种rNA-1的鸡胚尿囊液为阴性对照。

1.5拯救新城疫病毒的间接免疫荧光鉴定

将BHK-21细胞接种于24孔板中，第二天待细胞生长至70～80％单层时，以无血清DMEM培养液将救获的重组新城疫病毒rNA-VP3及母本毒rNA-1尿囊液进行10倍系列稀释，取10³倍病毒稀释液接种于24孔板中，接种量为100μL/孔。于5％CO₂、37℃培养箱中培养24h，弃去培养上清，以PBS缓冲液洗涤细胞两次，室温下以3％多聚甲醛固定30min，PBST洗涤三遍。以1％BSA按1:100倍稀释鼠抗VP3蛋白高免血清为一抗加入24孔板中室温摇床孵育30min，PBST洗涤三遍后，加入1:300倍稀释FITC标记的山羊抗鼠IgG绿色荧光抗体，室温摇床作用30min，PBST洗涤三遍，荧光显微镜观察检测结果。

2结果

2.1表达GPV VP3基因的NDV全长cDNA克隆的构建

在pCI-NA-1的全长cDNA克隆基础上，通过PCR方法对基因组4883-4900nt相应位置进行基因定点突变，使其F蛋白裂解位点氨基酸从强毒典型序列变为具有弱毒特征序列，经测序分析结果表明突变位置与核苷酸正确，与预期一致。通过PCR扩增GPV VP3基因并引入PmeI酶切位点与NDV GE、GS及增强表达的KozaK序列构成完整的NDV基因表达盒，并通过限制性内切酶PmeI消化后克隆至全长cDNA转录质粒中，位于基因组P和M之间，方向为正向，得到pCI-NA-VP3，其序列(不含骨架载体)见SEQ ID NO.1(1-6为限制酶SalI序列，7-64为核酶HamRz序列，3229-4877为插入VP3表达盒，16898-16985为核酶HdvRz序列，16986-16993为NotI序列，剩余序列为新城疫病毒NA-1基因组序列)。

2.2病毒的拯救

通过共转染全长质粒pCI-NA-VP3与辅助质粒pcDNA-N、pcDNA-P和pcDNA-L于BHK-21细胞，进行病毒拯救，由于突变F蛋白裂解位点为弱毒，在转染48h后需额外添加TPCK，2μg/孔，于转染5天后，将培养上清接种9～11日龄SPF鸡胚，4天后，通过HA、HI检测，结果均为阳性，收取鸡胚尿囊液，命名为rNA-VP3，记为F1代。表明，通过反向遗传操作技术，利用基因组cDNA克隆成功救获具有感染性的表达GPV VP3蛋白的NDV rNA-VP3。

2.3重组病毒RT-PCR鉴定

通过提取拯救病毒rNA-VP3和rNA-1基因组RNA，反转录后以VP3特异引物进行PCR检测，结果显示，重组病毒rNA-VP3基因组能扩增出1605bp大小条带，而rNA-1则不能，表明重组病毒rNA-VP3基因组中携带有GPVVP3基因，外源基因重组成功(图3)。

2.4VP3蛋白间接免疫荧光检测

进一步在蛋白水平鉴定所救获的重组病毒rNA-VP3外源基因VP3的表达，分别以rNA-VP3与野生型rNA-1适当稀释后感染BHK-21单层细胞，24h后，以3％多聚甲醛固定细胞，以鼠抗VP3蛋白高免血清为一抗，FITC标记山羊抗鼠荧光抗体为二抗，进行免疫荧光染色，荧光显微镜检测结果显示感染重组病毒rNA-VP3的细胞具有绿色荧光染色(图4A)，而野生型rNA-1感染细胞和未感染病毒的BHK-21细胞均无荧光信号(图4B，4C)表明外源基因VP3得到了表达。

实施例3 鸡胚生长特性比较

1材料和方法

1.1材料

SPF鸡胚购自北京梅里亚，96孔板血凝板，新鲜鸡血，磷酸盐缓冲液(PBS)，孵化器等。

1.2方法

为确定拯救重组病毒rNA-1、rNA-VP3与母本野生型NA-1鸡胚生长特性，将重组病毒rNA-1和rNA-VP3F3代尿囊液与野生型rNA-1尿囊病毒液以PBS稀释后按1×10⁴EID₅₀接种SPF鸡胚尿囊腔。在接种后24小时、48小时、72小时及96小时取样，每个时间点随机抽取6枚胚，收集尿囊液，混匀后分别测定其EID₅₀。

2结果

为鉴定拯救突变株与野生型母本株在鸡胚生长特性，将突变株rNA-VP3与野生型母本株rNA-1，按1×10⁴EID₅₀接种SPF鸡胚尿囊腔。在接种后每隔24小时随机抽取6枚胚，收集尿囊液，混匀后分别测定其EID₅₀，结果显示重组病毒rNA-VP3在24h、48h、72h、96h测得EID₅₀分别为10^7.9/mL、10^8.5/mL、10^9.0/mL、和10^9.2/mL；而拯救野生型NDV rNA-1相应时间点的EID₅₀分别为10⁸/mL、10^9.0/mL、10^9.6/mL和10^9.0/mL，野生型母本毒NA-1相应时间点的EID₅₀分别为10⁸/mL、10^9.0/mL、10^9.8/mL、10^9.2/mL，绘制生长动力学曲线。表明拯救重组NDV rNA-1和rNA-VP3与野生型母本株NA-1生长滴度在相近时间达到峰值，鸡胚生长特性无明显差异(图5)。

实施例4 重组病毒致病性检测

1材料和方法

1.1材料

SPF鸡胚及孵化SPF鸡，生理盐水，新鲜鸡血，孵化器等。

1.2方法

为确定拯救重组NDV rNA-1、rNA-VP3与母本野生型NA-1在致病性上的差异，按照OIE标准测定NDV重组病毒rNA-1、rNA-VP3和野生型母本毒rNA-1的最小致死量致死鸡胚平均死亡时间(mean death time of chicken embryos，MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(intracerebral pathogenicity index in day-old chicks，ICPI)、6W雏鸡静脉接种致病指数(intravenous pathogenicity index in6-week-old chickens，IVPI)，具体地，在测定MDT中，取新鲜病毒尿囊液，用灭菌的生理盐水连续10倍系列稀释成10^-6～10^-9，每个稀释度经尿囊腔接种5枚9～10日龄的SPF鸡胚，每枚接种0.1mL，37℃培养。余下的病毒液4℃保存，8小时后，每稀释度接种另外5枚SPF鸡胚，每枚接种0.1mL，37℃培养。每日照蛋两次，连续观察7天，每天观察三次，记录各鸡胚的死亡时间。最后按O.I.E标准计算MDT值；在ICPI测定中，将新鲜病毒尿囊液用灭菌的生理盐水10倍稀释，脑内接种出壳24～40小时的SPF雏鸡，共10只，每只接种0.05mL，每天观察一次，并给鸡打分，正常鸡为0，发病鸡为1，死鸡记为2。共观察8天，按O.I.E标准计算ICPI值；在IVPI测定中，选取10只6周龄SPF鸡，每只鸡静脉注射0.2mL10倍稀释的病毒尿囊液，接种后10天内观察发病和死亡情况，按O.I.E标准计算IVPI值。

2结果

致病性检测

为确定拯救重组NDV rNA-VP3、rNA-1与母本野生型NA-1致病性的差异，按照OIE评价NDV毒力大小标准测定MDT、ICPI、IVPI，结果显示重组病毒rNA-VP3的MDT>120h、ICPI为0.35、IVPI为0；拯救rNA-1相应的MDT<60h、ICPI为2、IVPI为3；而母本野生型NDV NA-1MDT<60h，ICPI为2，IVPI为3，表明拯救重组病毒rNA-1与母本毒具有相似的致病性，都属于强毒，而突变F蛋白裂解位点表达GPVVP3的重组病毒其致病性大大降低，实现了对病毒的致弱后表达外源保护性基因，为开发预防鹅细小病毒、新城疫病毒感染二联弱毒苗奠定了基础。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒，其特征在于：所述的重组新城疫病毒为鹅源基因VII型新城疫病毒基因修饰株；

所述的表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建包含插入鹅细小病毒VP3基因的新城疫病毒基因组序列的转录质粒，转录质粒包含鹅源基因VII型新城疫病毒NA-1株全基因组cDNA序列并在5’端和3’端分别引入锤头状核酶结构序列(HamRz)和丁肝病毒核酶结构序列(HdvRz)，然后将cDNA克隆至转录载体pCI的CMV启动子的下游，进行遗传修饰后插入鹅细小病毒VP3基因；

所述的新城疫病毒是NA-1株，且F蛋白的裂解位点修饰为弱毒株特征序列GRQGRL；

VP3基因位于新城疫病毒P基因和M基因之间非编码区；

所述的VP3基因来源于鹅细小病毒GD-01株；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，所述转录辅助质粒包含所述新城疫病毒的核蛋白N、磷蛋白P和大聚合酶蛋白L编码基因，并且核蛋白N、磷蛋白P和大聚合酶蛋白L编码基因的ORF cDNA克隆至pcDNA3.1载体的CMV启动子的下游；

(3)将所述转录质粒和所述辅助质粒共转染所述新城疫病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)从转染的宿主细胞的细胞悬液中拯救重组新城疫病毒。

2.根据权利要求1所述的表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒，其特征在于：所述的重组新城疫病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒，其特征在于：所述步骤(3)的详细过程如下：BHK-21细胞接种于六孔板中，待第二天生长至70％-80％单层时，采用磷酸钙转染试剂将构建好的转录质粒与辅助质粒共转染BHK-21细胞；转染细胞于5％CO2、37℃培养箱中培养12h后，弃去转染混合物，以含有10％DMSO的PBS液休克细胞2.5min，加入完全DMEM培养液继续于5％CO2、37℃培养箱中培养；4天后收获细胞上清，接种于9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔，4天后取鸡胚尿囊液，进行血凝HA和血凝抑制HI检测。

4.根据权利要求1所述的表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒，其特征在于：步骤(1)中所述的转录质粒为pCI-NA-VP3，用量为5μg，序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤(2)中所述的转录辅助质粒为pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L，用量分别为2.5μg、1.25μg和1.25μg；序列如SEQ ID NO.2～4所示；

步骤(3)中所述的宿主细胞是Vero细胞或BHK细胞。

5.权利要求1-4任一项所述的表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒在制备新城疫病毒、鹅细小病毒二联苗中的应用。

6.一种新城疫病毒、鹅细小病毒二联苗，其特征在于：包含权利要求1-4任一项所述的表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒。