CN108607095B

CN108607095B - 一种鹅细小病毒株及其应用

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Publication number: CN108607095B
Application number: CN201810583772.0A
Authority: CN
Inventors: 王相芹; 王丹娜; 谭鹏; 王学波; 林文超; 李艳丽; 李朝阳
Original assignee: Qingdao Sinder Pharmaceutical Co ltd; Shandong Sinder Technology Co ltd
Current assignee: Qingdao Sinder Pharmaceutical Co ltd; Shandong Sinder Technology Co ltd
Priority date: 2018-06-05
Filing date: 2018-06-05
Publication date: 2020-02-11
Anticipated expiration: 2038-06-05
Also published as: CN108607095A

Abstract

本发明提供一种鹅细小病毒，其保藏编号为CCTCC NO:V201811。本发明所提供的鹅细小病毒可用于制备用于预防番鸭源鹅细小病毒病的疫苗。本发明制备的鹅细小病毒灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本发明中制备的灭活疫苗对番鸭群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

Description

一种鹅细小病毒株及其应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鹅细小病毒株及其应用。

背景技术

鹅细小病毒感染，又称为小鹅瘟，是由鹅细小病毒引起的一种急性传染病，主要侵害1～3周龄的雏鹅和雏番鸭，以发生渗出性肠炎为主要病理变化，发病急，死亡率高，传播快为特点。发病率和死亡率随着日龄的增加而下降，主要侵害7日龄以内的雏鹅和雏番鸭，死亡率可达100％，10日龄以上者死亡率一般不超过60％，20日龄以上的发病率低。根据发病情况分为3种类型，最急性型，急性型和亚急性型。1974年世界禽类学会为纪念Derzsy的先期工作而将此病命名为Derzsy氏病。

近年来，我国养鸭业发展迅速，尤其是散养户较多，一些养鸭设施简陋，消毒意识淡薄及环境卫生不到位等原因，疾病流行情况复杂造成一些新的变异株毒株出现。在我国的一些省、市、自治区均有流行,南方地区的番鸭尤为突出，给番鸭养殖业造成严重的经济损失。

通过对鹅细小病毒感染的流行病学调查，发现该病在我国鸭群中发病率日益上升趋势，尤其是我国中南部地区尤为严重。基于目前，旧的毒株很难保护现在的疾病，需要筛选新变异的病毒株来制备疫苗。必须通过创新技术克服这一问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种鹅细小病毒，并将其毒株制备成灭活疫苗，能够有效预防番鸭源鹅细小病毒感染。从而弥补现有技术的不足。

本发明提供的番鸭源鹅细小病毒，为鹅细小病毒GPV-FJ株，于2018年4月20日保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:V201811。

本发明所提供的鹅细小病毒可用于制备用于预防番鸭源鹅细小病毒病的疫苗；

所述的疫苗为灭活疫苗。

上述的灭活疫苗，番鸭源鹅细小病毒的灭活采用甲醛灭活，疫苗中番鸭源鹅细小病毒的病毒含量≥10^5.0ELD₅₀/0.2ml。

本发明灭活疫苗的制备方法是将GPV-FJ株病毒液中加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16小时，灭活检验后加入Tween-80制备水相，溶解后的水相与白油佐剂1∶2混合乳化，得到番鸭源鹅细小病毒灭活疫苗。

本发明制备的鹅细小病毒灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本发明中制备的灭活疫苗对番鸭群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

附图说明

图1为鹅细小病毒GPV-FJ株的PCR检测结果，其中，M为2000DNAMarker、1为PCR扩增结果、2为阴性对照；

图2为鹅细小病毒GPV-FJ株的进化树图；

图3为鹅细小病毒GPV-FJ株的基因的同源性比较图。

具体实施方式

发明人筛选了番鸭源鹅细小病毒GPV-FJ株，属于新的变异株，从而促成了本发明。下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1GPV-FJ株的分离与鉴定

1.1流行病学调查 2017年5月，福建某番鸭场的8日龄番鸭群出现呼吸症状，即发病初期。番鸭场在1日龄时免疫商品化鸭肝炎二价抗体和鹅细小病毒灭活疫苗，8日龄出现脚软，个别鸭有出现死亡，使用抗菌素，没有好转，并且死亡率逐日增加。死亡鸭解剖发现渗出性肠炎、肠道内形成腊肠样栓子为主要的病理变化。全身脱水心肌充血，肝脏和脾脏肿大等。经实验室诊断为鹅细小病毒的变异株。

1.2病毒分离取患病白番鸭的脑、内脏、肠道等病变的组织50～100g，用研钵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒)，按1∶5(w/v)比例与无菌PBS匀浆，反复冻融3次后6000r/min离心10分钟，取上清液加入青霉素和链霉素各10000IU/ml，4℃过夜，经0.22μm微孔滤器过滤，无菌检验合格后保存备用。

1.3病毒的鉴定

1.3.1血凝特性鉴定无菌采集SPF鸡和鸭血液，制备成0.8％、1％和2％浓度血红细胞，4℃保存备用。按常规方法检测分离毒株是否具有凝集这些红细胞的特性。同时设Ⅲ群鸭1型腺病毒(EDSV-76)为凝集反应阳性对照。结果：分离毒不能凝集SPF鸡和鸭红细胞，即使改变红细胞的浓度，也不能使之凝集。Ⅲ群鸭1型腺病毒(EDSV-76)能够凝集鸡、鸭的红细胞。

1.3.2理化特性检验将收集的病毒液经纯化进行了氯仿处理、乙醚、盐酸(pH＝3.0)、65℃加热30分钟、56℃加热3小时、紫外线照射处理后，接种12日龄的番鸭胚，每枚胚接种0.2ml，各接种10枚。另设生理盐水处理组和病毒液不处理组各接5枚作为对照。接种168小时后观察番鸭胚生长发育情况。结果：对乙醚、氯仿、胰酶有抵抗力，耐酸(pH＝3.0)。65℃加热30分钟、56℃3小时对其毒力无明显变化，而其对紫外线照射敏感。

1.3.3病毒培养特性检验将收集的病毒液经纯化进行了病毒继代培养及病毒含量测定。通过病毒继代发现培养特性比较稳定，死亡番鸭胚可见胚体头部、颈部及绒毛尿囊膜有明显水肿，全身有出血，变化特征明显。收集48～144小时尿囊液离心、过滤作为抗原。该病毒的病毒含量为10^6.2ELD₅₀/0.2ml。

1.3.4病毒纯净性检验将继代后的病毒液经纯化进行了纯净性检验。按现行《中国兽药典》附录的方法进行细菌检验、霉菌检验、支原体检验和外源性病毒检验。结果，无细菌、真菌、支原体及外源性病毒污染。

1.3.5鹅细小病毒GPV-FJ株的PCR检测结果通过NCBI已经公布的鹅细小病毒基因序列，(结构基因VP)全长为2199bp，编码732个氨基酸，设计一对引物涵盖VP基因全长，上游引物P1：5’-CAATAAAGATGACTCAAAGCAGATA-3’，下游引物P2：5’-CACAGAATTTACAGATTTTGAGTT-3’。取番鸭胚病毒尿囊液，利用组织细胞基因组DNA快速提取试剂盒提取病毒DNA，进行PCR检测，1％琼脂糖凝胶电泳约在2216bp处出现了DNA条带(图1)。

PCR反应体系：总体积25ul

在0.5m1PCR管中依次加入

10×Taq聚合酶缓冲液------------5u1

2.5mmo1 4dNTP-------------------4u1

上游引物(20pmol)---------------1u1

下游引物(20pmol)----------------1u1

Taq DNA聚合酶(1-2U)----------0.3ul

DNA--------------------------------4ul

用灭菌去离子水9.7ul补足至总体积25u1，PCR反应在PTC-100基因扩增仪内进行。PCR反应参数：预变性条件为95℃，5分钟，变性条件为94℃，30秒，退火温度和时间为53℃，30秒，延伸温度为72℃延伸2分钟，35个循环，最后72℃延伸10分钟。

1.3.6鹅细小病毒GPV-FJ株的测序结果对该病毒VP基因扩增的片段进行测序、拼接后，通过NCBI已经公布基因序列进行比对分析，GPV-FJ株的VP基因与已公开的GPV的VP基因的序列同源性介于90.1％～99.4％之间。通过基因进化树分析可以看出，GPV-FJ株与安徽株WX1、Yan-2、WX2、ZJ关系较近。与国内疫苗株SYG61v、SYG26-35和GDaGPV较远，属于新的流行株。基因进化树与同源性分析见图2、3。

1.3.7病毒免疫原性检验将继代后的病毒液经纯化进行了免疫原性试验。该毒株制成灭活疫苗免疫雏番鸭和成年母番鸭，免疫1日龄雏番鸭，2周抗体可达到100％以上的阳性率，免疫期可达5个月；已达到或超过番鸭出栏日龄；免疫成年母番鸭2月龄所产子代均能够产生完全的攻毒保护，说明该毒株是一种理想的抗原。

1.3.8病毒特异性与中和效果检验该毒株和番鸭源流行毒株经继代和纯化制成灭活疫苗，分别免疫兔子，免疫剂量1.0ml/只，每隔2周免疫一次，共免疫3次，三免后2周进行采血,分离血清，经56℃灭活1小时进行特异性试验。

将GPV-FJ株病毒液250倍稀释，分别与该毒株和流行株的阳性血清等体积混合，室温中和1小时后，接种12日龄的番鸭胚，0.2ml/枚，接种后观察168小时。结果发现该病毒的鹅细小病毒血清中和组番鸭胚全部健活，其他流行株的阳性血清中和组组仅60％～70％全部健活，未加血清中和的病毒组番鸭胚全部死亡，说明该病毒与鹅细小病毒血清发生特异性中和反应。本发明筛选的毒株作为抗原制备的阳性血清对本发明筛选的病毒的中和能力明显好于流行毒株制备的阳性血清；而对于该毒株的中和效果相比于流行株的中和效果有明显的差异。

上述的结果表明本发明获得病毒为新的变异株，从而导致已有的疫苗的免疫效果降低。

实施例2疫苗制造及半成品检验

2.1 GPV-FJ株的毒种制备将尿囊液(GPV-FJ株原始毒种第3代)用灭菌PBS作500倍稀释，经尿囊腔接种12日龄的番鸭胚10枚，每胚0.2ml，置36～38℃继续孵育，选择接种后48～144小时内死亡的鸭胚。收集尿囊液离心，取其上清进行传下一代。按此方法连传10代，分别标记为C3～C10代。测定每代次病毒含量。将同代次检验无菌且病毒含量≥10^5.0ELD₅₀/0.2ml病毒液，定量分装，冻干保存。

2.2 GPV-FJ株抗原的制备将毒种用无菌生理盐水稀释500倍，尿囊腔接种12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，37℃孵育，收集48～144小时内鸭胚的尿囊液，经离心，取其上清混合于灭菌的容器中，于2～8℃保存。

2.3病毒含量测定将GPV-FJ株病毒液分别用灭菌PBS作10倍系列稀释，取10^﹣5、10^﹣6、10^﹣7 3个稀释度，分别经尿囊腔接种12日龄的番鸭胚，每胚0.2ml，同时设接种PBS对照5枚，每胚0.2ml。置37℃继续孵育，观察168小时。以鸭胚48小时后死亡并出现尿囊膜增厚，以胚体全身出血性病变、胚体发育缓慢等特征判为感染，计算GPV-FJ株的ELD₅₀。

2.4灭活将GPV-FJ株病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.2％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

2.5半成品检验

2.5.1无菌检验取灭活的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

2.5.2灭活检验将灭活后的GPV-FJ株病毒液经尿囊腔接种12日龄的番鸭胚10枚，每胚0.2ml，置37℃继续孵育，连续观察168小时。

2.6油乳剂灭活疫苗的制备

2.6.1油相制备：

取矿物油94份，硬脂酸铝2份(g)，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司班-80(Span-80)6份(ml)，充分混匀后，121℃高压蒸气灭菌备用。

2.6.2水相制备：

将灭活检验合格的病毒液混合，取其96份(ml)加入4份(ml)灭菌吐温-80(Tween-80)，充分振摇，直到Tween-80彻底溶解。

2.6.3乳化

取油相2份导入乳化罐中，开动电机低速搅拌，同时徐徐加入水相1份后，1000r/min，乳化30分钟，即成油乳剂灭活疫苗。

2.6.4分装定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。

实施例3疫苗成品检验

3.1性状

外观乳白色乳剂。

剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不多于0.5ml。

黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

3.2装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。

3.3无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

3.4安全检验为了保证疫苗的安全性，用1日龄健康易感雏番鸭10只，颈部皮下注射5只，胸部肌肉注射5只，每只均为1.0ml。免后14日，生长发育均正常，精神状态良好，剖检注射部位疫苗吸收良好，全部存活。

3.5效力检验

3.5.1血清学方法选用1日龄雏番鸭30只，颈部皮下免疫10只，胸部肌肉免疫10只，共20只，每只0.2ml，另10只不免疫作对照。免疫后21～28日，每只鸭分别采血，分离血清，用琼脂免疫扩散试验检测免疫组和对照组的番鸭血清。效检标准：GPV-FJ株免疫组应至少10只阳性，对照组应全部阴性。

血清结果：GPV-FJ株通过颈部皮下和胸部肌肉免疫在14日以上琼扩抗体均≥8/10阳性，对照组鸭全部为阴性，试验均符合效检标准。免疫期可达5个月以上；已达到或超过番鸭出栏日龄。详见表1。

表1：1日龄雏番鸭免疫疫苗后不同时间抗体水平

3.5.2番鸭源流行株疫苗免疫与GPV-FJ株攻毒保护效果选用1日龄雏番鸭50只，流行株制备疫苗方法同GPV-FJ株。制苗用GPV-FJ株和流行毒株的病毒液均≥10^5.0ELD₅₀/0.2ml，每种苗颈部皮下免疫10只，共40只，每只0.2ml，另10只不免疫作对照。免疫后14日，进行攻毒试验。所有免疫组和对照组雏番鸭肌肉注射GPV-FJ株病毒液(约含10^5.0ELD₅₀/0.2ml)，每只0.2ml。攻毒后，连续观察14日，每日观察鸭的临床表现，记录发病和死亡情况。

流行株疫苗免疫与GPV-FJ株攻毒保护结果：GPV-FJ株免疫后14日保护数100％保护，而流行株的免疫后14日保护数均低于80％；对照组用制苗毒株攻毒14日内全部发病，死亡率达90％以上。说明本发明制备的疫苗免疫效果最好。具体数据详见下表2。

表2：1日龄雏番鸭流行株疫苗免疫与GPV-FJ株攻毒保护结果

3.5.3子代母源抗体与攻毒保护的关系取成年健康母番鸭30只，每只颈部皮下免疫0.5ml，30只不免疫作为对照。

免后2月龄所产的蛋，经孵化出雏番鸭，取免疫组20只雏番鸭，取对照组20只雏番鸭，于饲养进行攻毒试验。免疫组和对照组雏番鸭肌肉注射GPV-FJ株病毒液(约含10^5.0ELD₅₀/0.2ml)和流行株病毒液，每只0.2ml。攻毒后，每日观察鸭的临床表现，记录发病和死亡情况，连续观察14日。效检标准：GPV-FJ株免疫鸭应至少8只正常，对照组应至少8只发病。

子代母源抗体与攻毒保护的结果：灭活疫苗免疫成年母番鸭2月龄所产子代在7日龄时测定的琼扩抗体均100％阳性。对照组全部为阴性。子代7日龄雏番鸭攻制备疫苗用的毒株和流行毒株，其中流行株选择具有代表性的3株。连续观察14日，免疫组保护数均达到90％；对照组用制苗毒株攻毒14日内全部发病，死亡率达90％以上。对照组用流行毒株攻毒14日内保护数均低于10％。交叉保护率高。说明本发明制备的疫苗能有效的预防目前各地流行的鹅细小病毒感染，且具有良好的免疫效果。具体数据详见下表3、4。

表3：子代7日龄雏番鸭的母源抗体及攻毒保护试验

表4：子代7日龄雏番鸭的母源抗体与流行株的交叉保护试验

综上所述，本发明筛选的GPV-FJ株制备疫苗是一种免疫效果比较理想的灭活疫苗，能够有效的预防鹅细小病毒的发生。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，其他的任何未背离本发明精神和原则之内，所做的改变、修饰、替代、组合等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种鹅细小病毒，其特征在于，所述的鹅细小病毒的保藏编号为CCTCC NO:V201811。

2.权利要求1所述的鹅细小病毒在制备用于预防番鸭源鹅细小病毒病的灭活疫苗中的应用。

3.一种灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗是使用灭活的权利要求1所述的鹅细小病毒作为抗原制备的。

4.如权利要求3所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的鹅细小病毒的灭活采用甲醛灭活。

5.如权利要求3所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗中鹅细小病毒的病毒含量≥10^5.0ELD₅₀/0.2ml。