CN105920596B - 一种番鸭细小病毒病、小鹅瘟二联疫苗 - Google Patents

一种番鸭细小病毒病、小鹅瘟二联疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种番鸭细小病毒病和小鹅瘟二联灭活疫苗，所用抗原为灭活的番鸭细小病毒和番鸭源小鹅瘟病毒，其中番鸭细小病毒的保藏编号为CGMCC No.8504；番鸭源小鹅瘟病毒的保藏编号为CCTCC NO:V201620。本发明通过筛选出具有病毒含量高，免疫原性好的番鸭细小病毒YBMDP株和番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV‑M株。再接种鸭胚后收取感染的胚体和尿囊液，经匀浆、超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗免疫种番鸭能同时提高种番鸭的两种抗体水平，保证其子代母源抗体水平，预防番鸭细小病毒和番鸭源小鹅瘟病毒引起的雏番鸭细小病毒病和小鹅瘟病毒感染。

Description

一种番鸭细小病毒病、小鹅瘟二联疫苗
技术领域
本发明属于家禽病原微生物筛选技术领域，具体涉及一种番鸭细小病毒病和小鹅瘟二联灭活疫苗的制备及其应用。
背景技术
番鸭细小病毒病是侵害雏番鸭的一种急性或亚急性传染病，是以喘气、腹泻及胰脏坏死和出血为主要特征的传染病；具有高度传染性，且发病率和死亡率都很高，常造成严重的经济损失。该病主要发生于1～3周龄的雏番鸭，尤其是10日龄左右的雏番鸭，而当达到3周龄以上就基本不发病了。本病最早于20世纪80年代中后期出现于中国福建和法国西部Brittany地区，20世纪90年代初才认识到它是不同于小鹅瘟的独立疾病。
鹅细小病毒病又称Derzsy氏病，俗称鹅流感、鹅或小鹅瘟、鹅肝炎、鹅肠炎、传染性心肌炎、复水性肝肾炎等，是一种侵害幼鹅和番鸭的一种高度接触传染性疾病，病名的多样性反映了该病多个病理学特征。根据感染雏鹅、雏鸭的日龄不同，该病可表现为急性、亚急性和慢性型。急性型可引起10日龄以内的雏鹅100％死亡。许多国家也报道了一种抗原性完全不同的番鸭细小病毒感染，死亡率高达80％。该病主要发生于1～3周龄的雏鹅和雏番鸭，尤其是1周龄左右的更易感，4周龄以上的鹅或番鸭感染后，很少表现临床症状。本病最早于20世纪60年代中后期出现于中国和许多欧洲国家，直到1978年才将该病称为鹅细小病毒感染，但是通过病毒中和试验、分子生物学研究证明，从鹅和番鸭分离到的细小病毒有明显的差异。
如果对死亡的番鸭处理不当，往往造成病毒的蔓延，产生更大的危害。因此，就需要筛选出效价高、免疫原性好的番鸭细小病毒、小鹅瘟病毒来制备疫苗。而且，由于病毒变异导致使用的疫苗效价降低，也需要筛选出变异的病毒株来制备疗效更高的疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供种番鸭细小病毒病和小鹅瘟二联灭活疫苗，能够有效预防番鸭细小病毒病和小鹅瘟。
本发明提供的番鸭细小病毒病、小鹅瘟二联灭活疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，所用抗原为灭活的番鸭细小病毒和番鸭源小鹅瘟病毒，
其中番鸭细小病毒，为YBMDP株，已于2013年11月08日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8504。
其中番鸭源小鹅瘟病毒，为番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株，于2016年3月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:V201620。
其中的番鸭细小病毒和番鸭源小鹅瘟病毒均经过甲醛溶液灭活；
作为优选，疫苗用中番鸭细小病毒的含量应不低于105.7ELD50；番鸭源小鹅瘟病毒的含量不低于106.50ELD50。
上述灭活疫苗的制备方法如下：
1)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加5份的司本-80，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用；
2)水相制备：将灭活的YBMDP株和YBGPV-M株病毒液按1:1的比例加入水中，使每0.2ml水中YBMDP株病毒含量不低于105.7ELD50；YBGPV-M株病毒含量不低于106.50ELD50。取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入病毒混液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解；
3)乳化：取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟，乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟完成制备。
本发明通过筛选出具有病毒含量高，免疫原性好的用番鸭细小病毒YBMDP株和番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株。再接种鸭胚后收取感染的胚体和尿囊液，经匀浆、超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗免疫种番鸭能同时提高种番鸭的两种抗体水平，保证其子代母源抗体水平，预防番鸭细小病毒和番鸭源小鹅瘟病毒引起的雏番鸭细小病毒病和小鹅瘟病毒感染；免疫1日龄雏番鸭，两种抗体均是10天就可产生，能有效预防雏番鸭细小病毒和番鸭源小鹅瘟病毒引起的雏番鸭细小病毒病和小鹅瘟病毒感染。此疫苗具有高效、安全性好，且有打一针防两病的优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。本发明所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本发明。
实施例1 番鸭细小病毒制苗毒株(YBMDP)筛选
1.YBMDP株的筛选 2011年从浙江省某鸭场爆发了急性的番鸭细小病毒病，取病死鸭的胰脏及肠道，将胰脏及肠道组织用无生理盐水匀浆制成20％悬液，3000r/min离心15min，取上清除菌后经尿囊腔分别接种13日龄番鸭胚，孵化120小时，收集尿囊液及胚体组织，经匀浆后，反复冻融3次，取上清液冻存。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明该毒株病毒含量为105.7ELD50/0.2ml,最小免疫剂量为102.0ELD50/0.2ml，该病毒仅与番鸭细小病毒发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病毒污染，适合作为制苗用毒株。将筛选的病毒株于2013年11月08日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8504。
对于本发明筛选的毒株的性状进行检测，结果表明，该株病毒属细小病毒，圆形无囊膜，直径在20nm左右、对乙醚、胰蛋白酶、酸不敏感，对红细胞无凝集现象。该病毒可引起雏番鸭发生以出血性肠炎为特征的急性败血性传染病。该毒株制备的疫苗免疫成年番鸭后，能保护免疫4个月内种番鸭所产子代免受流行毒株的攻击。该毒株作100倍稀释后，与等量雏番鸭细小病毒病抗血清中和，接种12日龄番鸭胚，结果中和组番鸭胚全部健活，而病毒对照组番鸭胚全部死亡。
对筛选的YBMDP株的结构基因VP进行测序,结果VP基因全长为2199bp，编码约732个氨基酸。将该基因与NCBI GenBank中收录的7个国内外MDPV毒株的VP基因进行进化树及核苷酸序列同源性分析，结果表明，YBMDP株的结构基因VP与已公开的MDPV的VP基因的序列同源性介于89.3％～99％；同时由于MDPV与GPV毒株的VP基因序列相似性相对较高，还进行了与国内外29个GPV的VP基因进行了进化树及基因序列同源性分析，结果发现，MDPV和GPV存在较大差异，处于两个明显不同的进化分支，YBMDP株与29个GPV毒株的VP基因序列同源性介于79.9％～89.4％之间。
2.YBGPV-M株的筛选
2013年从福建省某鸭场的雏番鸭群中出现了以腹泻、部分鸭肠粘膜脱落形成栓塞为主要特征的疫病，发病率50％～80％，病死率45％～70％，临床上使用抗菌素、番鸭细小病毒病疫苗及番鸭细小高免卵黄抗体均不能控制病情，我们无菌采集濒死鸭的肝脏、脾脏及胰腺，将肝脏、脾脏及胰腺用无菌生理盐水匀浆制成20％悬液，3000r/min离心15min，取上清除菌后经尿囊腔分别接种11日龄番鸭胚，孵化168小时，收集24小时后死亡胚的尿囊液及胚体组织，经匀浆后，反复冻融3次，取上清液冻存。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明该毒株病毒含量为106.50ELD50/0.2ml,最小免疫剂量为102.0ELD50/0.2ml，该病毒仅与小鹅瘟病毒发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病毒污染，适合作为制苗用毒株。将筛选的病毒株于2016年3月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:V201620。
对于本发明筛选的毒株的性状进行检测，结果表明，该株病毒属细小病毒，圆形无囊膜，直径在20～22nm左右、对理化因素的灭活作用有很强的抵抗力65℃加热处理30min病毒滴度不受影响，37℃作用1小时仍稳定，对乙醚、胰蛋白酶、酸不敏感，对红细胞无凝集现象。该病毒可引起雏番鸭发生以腹泻、部分鸭肠粘膜脱落形成栓塞为特征疫病。该毒株制备的疫苗免疫1日龄雏番鸭，10天就可产生抗体，免疫期可达6个月以上；免疫成年番鸭后，能保护免疫6个月内种番鸭所产子代免受流行毒株的攻击。该毒株作100倍稀释后，与等量番鸭源小鹅瘟毒病抗血清中和，接种11日龄番鸭胚，结果表明，中和组番鸭胚全部健活，而病毒对照组番鸭胚全部死亡。
对筛选的YBGPV-M株的结构基因VP进行测序,结果VP基因全长为2199bp，编码约732个氨基酸。将该基因与NCBI GenBank中收录的28个国内外GPV毒株的VP基因进行进化树及核苷酸序列同源性分析，结果表明，YBGPV-M株的VP基因与已公开的GPV的VP基因的序列同源性介于85.9％～90.3％之间；同时由于MDPV与GPV毒株的VP基因序列相似性相对较高，还进行了YBGPV-M株与国内外8个MDPV(含YBMDP株)的VP基因进行了进化树及基因序列同源性分析，结果发现，GPV与MDPV存在较大差异，处于两个明显不同的进化分支，YBGPV-M株与8个MDPV毒株的VP基因序列同源性介于80.4％～89.6％之间。
3.YBMDP与YBGPV-M株同源性比较
从基于MDPV、GPV毒株VP基因进化树以及基因序列同源性比较结果来看，制苗的两个毒株YBMDP、YBGPV-M处于进化树的两个明显的进化分支，两者结构基因VP的同源性仅有80.9％。
实施例2 制备疫苗
1.制苗用病毒液的制备
1.1YBMDP株病毒液的制备 将生产用毒种YBMDP株用无菌生理盐水稀释100倍，尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，37℃孵育，每日2次照胚检查。选择接种后48～168小时内死亡的鸭胚，置2～8℃4～12小时，无菌条件下打开气室，挑取胚体有广泛出血，毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿囊膜有轻度水肿的胚，取其胚体(去掉头和四肢)放入组织捣碎机中粉碎，收取尿囊液、羊水，用胚液匀浆，取粉碎后的组织按1:1加入生理盐水混合，冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。
1.2YBGPV-M株病毒液的制备 将生产用毒种YBGPV-M株用无菌生理盐水稀释100倍，尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，37℃孵育，每日2次照胚检查。选择接种后48～168小时内死亡的鸭胚，置2～8℃4～12小时，无菌条件下打开气室，挑取胚体有广泛出血，毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿囊膜有轻度水肿的胚，取其胚体(去掉头和四肢)放入组织捣碎机中粉碎，收取尿囊液、羊水，用胚液匀浆，取粉碎后的组织按1:1加入生理盐水混合，冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。
2.灭活 将YBMDP株和YBGPV-M株病毒液分别置于灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2％。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。
3.半成品检验
(1)无菌检验 取灭活的两种胚液，分别按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
(2)病毒含量测定 将YBMDP株和YBGPV-M株病毒液分别用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6 4个稀释度，分别尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，分别计算YBMDP株和YBGPV-M株的ELD50。
(3)灭活检验 分别将YBMDP株和YBGPV-M株灭活后的病毒液尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚10枚，每胚0.2ml，置37℃继续孵育，连续观察168小时。
4.灭活疫苗的制备
经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。
(1)油相制备 取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。
(2)水相制备 将灭活检验合格的YBMDP株和YBGPV-M株病毒液按1:1比例混合，再按所测定的YBMDP株和YBGPV-M株病毒液的效价计入一定量的无菌生理盐水，使每0.2ml水相中YBMDP株病毒含量不低于104.0ELD50；YBGPV-M株病毒含量不低于104.50ELD50。取灭菌后的吐温-80 5份，加入配液罐中，同时加混合抗原液95份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。
(3)乳化 取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。
5.疫苗成品检验
(1)性状
外观 疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。
剂型 为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。
稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。
黏度 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
(2)装量检查 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
(3)无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
(4)安全检验 用1日龄健康易感雏番鸭10只，每只腿部肌肉注射疫苗2.0ml(左右各1.0ml)，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察20日，记录试验鸭采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
(5)效力检验
①免疫攻毒法 取1日龄雏番鸭40只，随机分成两组，每组20只，其中一组每只颈部皮下注射疫苗，0.2ml/只，另一组20只同日龄雏番鸭不免疫作对照，隔离饲养。于免疫后15日免疫组和对照组均各随机分成两组，每组10只。其中免疫组和对照组各10只攻击雏番鸭细小病毒YBMDP,每只颈部皮下注射0.2ml/只(105.7ELD50/0.2ml)；剩下的免疫组和对照组各10只攻击雏鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株，每只颈部皮下注射0.2ml/只(106.50ELD50/0.2ml)，连续观察15日，免疫组鸭均应至少8只保护，对照组鸭均应至少9只发病。
②子代母源抗体与攻毒保护的关系90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注射疫苗，2ml/只，另取10只同日龄种番鸭不免疫作对照。于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫一次，收集开产后4月时所产种蛋孵化出雏，于雏番鸭7日龄时，免疫组子代取20只，随机分成两组，每组10只，一组攻击雏番鸭细小病毒YBMDP,每只颈部皮下注射0.2ml/只(105.7ELD50/0.2ml)；另一组攻击雏鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株，每只颈部皮下注射0.2ml/只(106.50ELD50/0.2ml)；对照组子代取20只，随机分成两组，每组10只，一组攻击雏番鸭细小病毒YBMDP,每只颈部皮下注射0.2ml/只(105.7ELD50/0.2ml)；另一组攻击雏鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株，每只颈部皮下注射0.2ml/只(106.50ELD50/0.2ml)；连续观察15日，免疫组子代鸭均应至少8只保护，对照组子代鸭均应至少9只发病。
实施例3
一、制苗用抗原的制备
1.制苗用病毒液的制备
1.1将生产用毒种YBMDP株用无菌生理盐水稀释100倍，尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，37℃孵育，每日2次照胚检查。选择接种后48～168小时内死亡的鸭胚，置2～8℃4～12小时，无菌条件下打开气室，挑取胚体有广泛出血，毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿囊膜有轻度水肿的胚，取其胚体(去掉头和四肢)放入组织捣碎机中粉碎，收取尿囊液、羊水，用胚液匀浆，取粉碎后的组织按1:1加入生理盐水混合，冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。(参见表1)。
1.2将生产用毒种YBGPV-M株用无菌生理盐水稀释100倍，尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，37℃孵育，每日2次照胚检查。选择接种后48～168小时内死亡的鸭胚，置2～8℃4～12小时，无菌条件下打开气室，挑取胚体有广泛出血，毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿囊膜有轻度水肿的胚，取其胚体(去掉头和四肢)放入组织捣碎机中粉碎，收取尿囊液、羊水，用胚液匀浆，取粉碎后的组织按1:1加入生理盐水混合，冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。(参见表1)。
表1：毒液的制备表
毒株名称 制苗材料 接种胚数(枚) 胚日龄 收获毒液(ml)
YBMDP株 番鸭胚 50 12 750
YBGPV-M株 番鸭胚 50 12 800
2.灭活 将病毒液倒入灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2％。加甲醛溶液后倒入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。
3.疫苗半成品检验
(1)无菌检验 取灭活的胚液，按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。
(2)病毒含量测定 将两种病毒液分别用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-4、10-5 4个稀释度，分别尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算ELD50。结果，YBMDP株为105.7ELD50/0.2ml；YBGPV-M株为106.5ELD50/0.2ml。
(3)灭活检验 将病毒液尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚10枚，每胚0.2ml，置37℃继续孵育，连续观察168小时，鸭胚均无死亡。
二、灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计，参见表2)。
(1)油相制备 取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。
(2)水相制备 将灭活检验合格的病毒液混合，检测每0.2ml水相中含YBMDP株病毒含量不低于105.7ELD50。取灭菌后的吐温-80 5份，加入配液罐中，同时加混合抗原液95份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。
(3)乳化 取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。
(4)分装 定量分装，加盖密封。
表2：疫苗乳化和分装
Figure BDA0001021654490000091
三、疫苗成品检验
(1)性状
外观 乳白色乳剂。
剂型 油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水，呈油滴状不扩散。
稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。
黏度 按现行版《中国兽药典》附录进行，为58.6cp。
(2)装量检查 按现行版《中国兽药典》附录进行,符合标准。
(3)无菌检验 按现行版《中国兽药典》附录进行,无菌生长。
(4)安全检验 用1日龄健康易感雏番鸭10只，每只腿部肌肉注射疫苗2.0ml(左右各1.0ml)，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察20日，记录试验鸭采食、饮水及临床情况。试验番鸭全部健活,且均未出现任何因疫苗引起的局部和全身反应。
(5)效力检验
①取1日龄雏番鸭40只，随机分成两组，每组20只，其中一组每只颈部皮下注射疫苗，0.2ml/只，另一组20只同日龄雏番鸭不免疫作对照，隔离饲养。于免疫后15日免疫组和对照组均各随机分成两组，每组10只。其中免疫组和对照组各10只攻击雏番鸭细小病毒YBMDP株,每只颈部皮下注射0.2ml/只(105.7ELD50/0.2ml)；剩下的免疫组和对照组各10只攻击雏鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株，每只颈部皮下注射0.2ml/只(106.50ELD50/0.2ml)，连续观察15日，免疫组鸭用YBMDP株攻击的10只仅1只发病，保护率为90％，用YBGPV-M株攻击的10只均未见发病，保护率为100％；对照组鸭用YBMDP株攻击的10只有9只发病，保护率为10％，用YBGPV-M株攻击的10只均发病，保护率为0(参见表3)。
表3：二联苗疫苗效力检验结果
Figure BDA0001021654490000101
Figure BDA0001021654490000111
②子代母源抗体与攻毒保护的关系90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注射疫苗，2ml/只，另取10只同日龄番鸭不免疫作对照。于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫一次，收集开产后4月时所产种蛋孵化出雏，于雏番鸭7日龄时，免疫组子代取10只，对照组子代取10只，攻毒YBMDP株，每只肌肉注射0.2ml(105.7ELD50/0.2ml)，另取免疫组子代取10只，对照组子代取10只，攻击雏鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株，每只颈部皮下注射0.2ml/只(106.50ELD50/0.2ml)，连续观察15日，免疫组子代鸭用YBMDP株攻击的10只仅1只发病，保护率为90％，用YBGPV-M株攻击的10只也仅1只发病，保护率为90％，；对照组子代鸭用YBMDP株攻击的10只有9只发病，保护率为10％，用YBGPV-M株攻击的10只均发病，保护率为0(见表4)。而且用YBGPV-M株的攻毒实验表明，本发明的疫苗的免疫效果明显好于已有的疫苗，推测是由于YBGPV-M株基因发生变异导致的。
表4：子代母源抗体与攻毒保护结果
Figure BDA0001021654490000112
Figure BDA0001021654490000121

Claims (4)

1.一种二联灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗包含有抗原和疫苗佐剂，其中所用抗原为灭活的番鸭细小病毒和番鸭源小鹅瘟病毒；
所述的番鸭细小病毒的保藏编号为CGMCC No.8504；
所述的番鸭源小鹅瘟病毒的保藏编号为CCTCC NO:V201620。
2.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的番鸭细小病毒和番鸭源小鹅瘟病毒经过甲醛溶液灭活。
3.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗中番鸭细小病毒的含量应不低于105.7ELD50。
4.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗中番鸭源小鹅瘟病毒的含量不低于106.50ELD50。
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