CN103768591A - 鸭出血性卵巢炎、禽流感（h9 亚型）二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸭出血性卵巢炎、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗及其制备方法。该疫苗是针对国内鸭养殖业中高发疫病中，鸭出血性卵巢炎和H9亚型禽流感混合感染的流行形势，提出了一个有效应对策略，并做到一次免疫同时防控两种疾病。该疫苗利用鸭坦布苏病毒和H9亚型禽流感病毒作为疫苗制备用毒株，经过抗原液制备、灭活、浓缩、按照一定比例混合制备而成。本发明涉及到的鸭坦布苏病毒和H9亚型禽流感病毒均为国内流行菌毒株，能够有效预防目前流行疾病。

Description

鸭出血性卵巢炎、禽流感(H9 亚型)二联灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种鸭出血性卵巢炎、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

鸭出血性卵巢炎是2010年我国新发生的一种以蛋鸭和种鸭突发性产蛋下降为主要特点的新型流行性疾病，主要导致卵泡变形、变性，卵泡膜充血、出血，输卵管炎性病变。种鸭发病后种蛋的受精率和孵化率降低。商品肉鸭亦可感染，出现死淘率增加。该病自发生以来给养鸭业造成了严重的经济损失。

在病原学鉴定中，疫病流行之初，曹贞贞、张存等最先报道新分离病毒与黄病毒科黄病毒属恩塔亚病毒群（Ntaya virus group）的巴格扎病毒（Bagaza virus）具有相近的遗传进化关系,但遗传距离介于病毒种的水平（曹贞贞、张存等．鸭出血性卵巢炎的初步研究．中国兽医杂志，2010，46(12):3－6.）。随着病原学研究的深入，李泽君、苏敬良等人的研究表明，新发病毒的E基因和NS5基因与坦布苏病毒相应基因的核苷酸同源性在88%以上，氨基酸同源性高达97%（李泽君．鸭坦布苏病毒病病原的分离鉴定及生物学特性研究.中国家禽，2011，33(17):34-35.苏敬良．引起鸭产蛋下降综合征的BYD病毒感染研究.中国家禽，2011，33(17):32-34.）。我们在某大型鸭场的发病种鸭上分离到一株病毒—WFG36株。病毒全基因编码序列的同源性分析表明，WFG36株病毒与坦布苏病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）的同源性高达90%，属于同一个种的病毒。

禽流感（H9亚型）（Avain Influenza H9subtype）是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征，传染性强，死亡率高，广泛发生于世界各地，给养禽业造成了严重危害。

对于鸭出血性卵巢炎和禽流感（H9亚型）的防控，目前尚无特效药物和疗法，主要通过加强饲养管理和疫苗免疫等措施进行预防和控制。国内外已有上市的禽流感（H9亚型）单一传统疫苗，未有鸭出血性卵巢炎疫苗和相关联苗。由于两种疾病是鸭业养殖中的高发疾病，均需要通过免疫疫苗进行预防，为减少多次抓鸭的注射应激，降低生产成本，我们在单一灭活疫苗的基础上开发出更好预防鸭出血性卵巢炎和禽流感（H9亚型）的二联灭活苗产品。

发明内容

本发明的目的在于利用本发明人自行分离的一株鸭坦布苏病毒和一株H9亚型禽流感病毒作为疫苗生产用毒株，制备一种鸭出血性卵巢炎、H9亚型禽流感二联油乳剂疫苗，一次免疫即可有效预防鸭出血性卵巢炎和H9亚型禽流感两种疾病，同时可以降低养殖风险，减少劳动强度，保证公众健康。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

1.本发明涉及的一种鸭出血性卵巢炎、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗（或鸭出血性卵巢炎、禽流感H9亚型二联灭活疫苗），其特征在于该二联灭活疫苗同时含有灭活的鸭坦布苏病毒WFG36株和灭活的H9亚型禽流感病毒LG1株，其中鸭坦布苏病毒（Duck Tembusuvirus，DTMUV）WFG36株（原命名为：黄病毒（DuckFlavivirus）WFG36株）已于2011年4月12日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCCNo.4718；H9亚型禽流感病毒LG1株为商品化疫苗，鸡新城疫、禽流感H9亚型二联灭活疫苗的生产毒种，产品批准文号：兽药生字（2010）150252152。

2.本发明所述鸭出血性卵巢炎、禽流感H9亚型二联灭活疫苗的制备方法为：

（1）将鸭坦布苏病毒CGMCCNo.4718株种毒接种易感鸡胚，经37℃孵育收获胚体、胚液和绒毛尿囊膜，研磨混合制备成病毒液，加入甲醛溶液至总量（体积比）的0.1%，37℃灭活24小时；

（2）取H9亚型禽流感病毒LG1株种毒接种9～11日龄健康易感鸡胚孵育后无菌收获鸡胚尿囊液，凝集价低于1∶256（微量法）者应弃去；加入甲醛溶液至总量的0.1%，37℃灭活48小时；

（3）将灭活后的鸭坦布苏病毒液和灭活后的H9亚型禽流感病毒液等量混合，使0.1ml水相中鸭坦布苏病毒含量不低于10^5.0ELD₅₀，H9亚型禽流感病毒含量不低于10^7.0EID₅₀；按常规法制备成油佐剂灭活疫苗。

3.给鸭接种有效剂量的鸭出血性卵巢炎、禽流感H9亚型二联灭活疫苗，能使接种鸭获得特异免疫力，有效预防鸭出血性卵巢炎和H9亚型禽流感病毒感染。

具体实施方式

1.疫苗制备用毒株

（1）病毒来源

疫苗制造及检验用毒种鸭坦布苏病毒WFG36株，由本发明人从山东地区某养殖场的种鸭体内分离得到，并进行鉴定、保管和供应。该病毒株已于2011年4月12日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC No.4718。

疫苗制造及检验用毒种H9亚型禽流感病毒LG1株，由本发明人自行分离、保存，并已经商品化，产品名称：鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗，产品批准文号：兽药生字（2010）150252152。

（2）毒株特性

1）WFG36株的病毒含量

将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-73个稀释度分别经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚5枚，0.1ml/胚，置37℃继续孵育，24小时之内死亡胚弃去不计，24小时之后死亡鸡胚随时取出，置于4℃保存，观察至168小时，根据鸡胚死亡数计算ELD₅₀，每0.1ml病毒含量应≥10^6.0ELD₅₀。

2）LG1株的病毒含量

将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-83个稀释度分别经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.1ml/胚，置37℃继续孵育，48小时之内死亡胚弃去不计，48～120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:128者判为感染，计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量应≥10^7.5EID₅₀。

3）WFG36株对鸡胚的毒力

将毒种用灭菌生理盐水作100倍稀释，卵黄囊接种7日龄易感鸡胚10枚，0.1ml/胚，置37℃继续孵育，鸡胚应于接种后24～168小时死亡8枚以上，死亡胎儿出现全身性出血。

4）LG1株对鸡胚的毒力

将毒种用灭菌生理盐水作10倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚20枚，0.1ml/胚，置37℃继续孵育，在接种后48～96小时内，应至少有15枚鸡胚死亡。

2.生产用种毒的制备

（1）鸭坦布苏病毒WFG36株生产用种毒制备：将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如1:100或1:50），卵黄囊接种6～7日龄易感鸡胚，每胚0.1ml。置37℃继续孵化至120小时，定时照胚，48小时内死亡的鸡胚弃去，及时无菌收获死亡鸡胚尿囊液。将检验无菌的病毒尿囊液，作为生产用毒种。定量分装，注明收获日期、毒种代次等。-70℃以下保存。

（2）禽流感病毒LG1株毒种制备：将毒种用灭菌生理盐水作1000倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后24～96小时死亡鸡胚，分别收获鸡胚液，装于灭菌容器内。将检验无菌且红细胞凝集价不低于1∶256的鸡胚液混合，定量分装，冷冻保存，注明收获日期、毒种代次等。

3.制苗用病毒液的制备

（1）鸭坦布苏病毒液的制备：

种毒接种易感鸡胚  取生产用种毒，按每胚≥10^1.0ELD₅₀的剂量接种易感鸡胚，卵黄囊或尿囊腔途径接种，每胚0.1ml。接种后用蜡烛封好针孔，置37℃继续孵育，不必翻蛋；

孵育和观察  易感鸡胚接种后每日照胚1次，弃去24小时内的死亡胚，以后每隔6小时照胚一次，随时取出死亡胚，置于2～8℃保存。168小时孵育完成后，取出全部鸡胚，置于2～8℃冷却；

收获病毒液  将冷却的鸡胚取出，无菌收获胚体、胚液和绒毛尿囊膜，研磨混合。研磨液过滤后取样作无菌检验，应无菌生长。收获的滤液灭活前置-15℃以下保存，应不超过1个月。

灭活  将检验合格的鸭坦布苏病毒液导入灭活罐内，加入甲醛溶液至总量的1‰，随即充分混合升温，当温度升至37℃时开始计时。37℃灭活24小时后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

（2）H9亚型禽流感病毒液的制备

接种  取生产用种毒，用灭菌生理盐水作1000倍稀释，尿囊腔内接种9～11日龄健康易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

孵育和观察  鸡胚接种后，每日照胚1次，将24小时前死亡的鸡胚弃去。以后每4～8小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却。

收获  将冷却4～24小时的鸡胚取出，无菌收获鸡胚尿囊液，死胚和活胚分别收获（先收活胚后收死胚），每若干个鸡胚的胚液混合为一组。吸取胚液放于同一灭菌容器内，每组抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1∶256（微量法）者应弃去。胚液取样作无菌检验，应无菌生长。收获的胚液灭活前置-15℃以下保存，应不超过3个月。

灭活  将检验合格的H9亚型禽流感病毒液导入灭活罐内，加入甲醛溶液至总量的1‰，随即充分混合升温，当温度升至37℃时开始计时。37℃灭活48小时后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

4.灭活疫苗的制备

油相制备  取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本-806份，至温度达到125℃时维持30分钟，冷却后备用。

水相制备  将检验合格的鸭坦布苏病毒液、H9亚型禽流感病毒液等量混合，使0.1ml水相中鸭坦布苏病毒含量不低于10^5.0ELD₅₀，H9亚型禽流感病毒含量不低于10^7.0EID₅₀。取灭菌后的吐温-80 4份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，充分振摇，使吐温-80完全溶解。

乳化  取油相2份置乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以3000r/min搅拌60分钟，在终止乳化前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，应不出现分层。

5.成品检验

1）性状

外观  乳白色乳剂。

剂型  油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性  吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。

粘度  用1ml吸管（下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm）吸取25℃左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间，应在8秒以内。

2）无菌检验  按现行《中国兽药典》进行，应无菌生长。

3）安全检验  用7～14日龄健康易感鸭10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，应不出现由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应。

4）效力检验

（1）鸭出血性卵巢炎部分效力检验

取7～14日龄健康易感鸭20只，其中10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另外10只作为非免疫对照。21日后，每只鸭各肌肉注射WFG36株病毒液1ml。攻毒后5日，剖检，取脾脏进行病毒分离。对照鸭应至少8只为病毒分离阳性，免疫鸭应至少7只为病毒分离阴性。

（2）H9亚型禽流感部分效力检验

血清学方法  用7～10日龄SPF鸡15只，其中10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另5只不免疫作对照。21日后，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。免疫鸡HI抗体效价的几何平均值应不低于1∶90.5（微量法），未免疫对照鸡应为阴性。

免疫攻毒法  用7～10日龄SPF鸡20只，其中10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另10只不免疫作为对照。21日后，用10倍稀释的LG1株毒种进行静脉注射，每只鸡0.2ml，攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，进行病毒分离。免疫鸡应至少9只为病毒分离阴性；对照鸡应至少9只为病毒分离阳性。

本发明涉及的微生物菌种

本发明涉及到的鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）WFG36株（原命名为：黄病毒（Duck Flavivirus）WFG36株），由本发明人从山东地区某养殖场的种鸭体内分离得到，并进行鉴定、保管和供应。该病毒株已于2011年4月12日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC No.4718。

本发明涉及到的H9亚型禽流感病毒LG1株，由本发明人自行分离、保存，并已经商品化，产品名称：鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗，产品批准文号：兽药生字（2010）150252152。

本发明的积极意义

本发明涉及一种鸭出血性卵巢炎、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗及其制备方法。该疫苗是针对国内鸭养殖业中高发疫病中，鸭出血性卵巢炎和H9亚型禽流感混合感染的流行形势，提出了一个有效应对策略，并做到一次免疫同时防控两种疾病。该疫苗利用鸭坦布苏病毒和H9亚型禽流感病毒作为疫苗制备用毒株，经过抗原液制备、灭活、浓缩、按照一定比例混合制备而成。本发明涉及到的鸭坦布苏病毒和H9亚型禽流感病毒均为国内流行菌毒株，能够有效预防目前流行疾病。

实施例

以下实施例进一步说明本发明，但不对本发明要求的保护范围构成限制。

实施例1

——疫苗制备（以1208002批疫苗为例）

1.疫苗制备用毒株

（1）病毒来源

疫苗制造及检验用毒种鸭坦布苏病毒WFG36株，由本发明人从山东地区某养殖场的种鸭体内分离得到，并进行鉴定、保管和供应。该病毒株已于2011年4月12日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC No.4718。

疫苗制造及检验用毒种H9亚型禽流感病毒LG1株，由本发明人自行分离、保存，并已经商品化，产品名称：鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗，产品批准文号：兽药生字（2010）150252152。

（2）毒株特性

1）WFG36株的病毒含量

将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-73个稀释度分别经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚5枚，0.1ml/胚，置37℃继续孵育，24小时之内死亡胚弃去不计，24小时之后死亡鸡胚随时取出，置于4℃保存，观察至168小时，根据鸡胚死亡数计算ELD₅₀，每0.1ml病毒含量≥10^6.0ELD₅₀。

2）LG1株的病毒含量

将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-83个稀释度分别经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.1ml/胚，置37℃继续孵育，48小时之内死亡胚弃去不计，48～120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:128者判为感染，计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量≥10^7.5EID₅₀。

3）WFG36株对鸡胚的毒力

将毒种用灭菌生理盐水作100倍稀释，卵黄囊接种7日龄易感鸡胚10枚，0.1ml/胚，置37℃继续孵育，鸡胚应于接种后24～168小时死亡8枚以上，死亡胎儿出现全身性出血。

4）LG1株对鸡胚的毒力

将毒种用灭菌生理盐水作10倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚20枚，0.1ml/胚，置37℃继续孵育，在接种后48～96小时内，应至少有15枚鸡胚死亡。

2.生产用种毒的制备

（1）鸭坦布苏病毒WFG36株生产用种毒制备：将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如1:100或1:50），卵黄囊接种6～7日龄易感鸡胚，每胚0.1ml。置37℃继续孵化至120小时，定时照胚，48小时内死亡的鸡胚弃去，及时无菌收获死亡鸡胚尿囊液。将检验无菌的病毒尿囊液，作为生产用毒种。定量分装，注明收获日期、毒种代次等。-70℃以下保存。

（2）禽流感病毒LG1株毒种制备：将毒种用灭菌生理盐水作1000倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后24～96小时死亡鸡胚，分别收获鸡胚液，装于灭菌容器内。将检验无菌且红细胞凝集价不低于1∶256的鸡胚液混合，定量分装，冷冻保存，注明收获日期、毒种代次等。

3.制苗用病毒液的制备

（1）鸭坦布苏病毒液的制备：

种毒接种易感鸡胚  取生产用种毒，按每胚≥10^1.0ELD₅₀的剂量接种易感鸡胚，卵黄囊或尿囊腔途径接种，每胚0.1ml。接种后用蜡烛封好针孔，置37℃继续孵育，不必翻蛋；

孵育和观察  易感鸡胚接种后每日照胚1次，弃去24小时内的死亡胚，以后每隔6小时照胚一次，随时取出死亡胚，置于2～8℃保存。168小时孵育完成后，取出全部鸡胚，置于2～8℃冷却；

收获病毒液  将冷却的鸡胚取出，无菌收获胚体、胚液和绒毛尿囊膜，研磨混合。研磨液过滤后取样作无菌检验，应无菌生长。收获的滤液灭活前置-15℃以下保存，应不超过1个月。

灭活  将检验合格的鸭坦布苏病毒液导入灭活罐内，加入甲醛溶液至总量的1‰，随即充分混合升温，当温度升至37℃时开始计时。37℃灭活24小时后取出，放2～8℃保存，备用。

（2）H9亚型禽流感病毒液的制备

接种  取生产用种毒，用灭菌生理盐水作1000倍稀释，尿囊腔内接种9～11日龄健康易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不翻胚。

孵育和观察  鸡胚接种后，每日照胚1次，将24小时前死亡的鸡胚弃去。以后每4～8小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却。

收获  将冷却4～24小时的鸡胚取出，无菌收获鸡胚尿囊液，死胚和活胚分别收获（先收活胚后收死胚），每若干个鸡胚的胚液混合为一组。吸取胚液放于同一灭菌容器内，每组抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1∶256（微量法）者应弃去。胚液取样作无菌检验，为无菌生长。收获的胚液灭活前置-15℃以下保存备用。

灭活  将检验合格的H9亚型禽流感病毒液导入灭活罐内，加入甲醛溶液至总量的1‰，随即充分混合升温，当温度升至37℃时开始计时。37℃灭活48小时后取出，放2～8℃保存备用。

4.灭活疫苗的制备

油相制备  取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本-806份，至温度达到125℃时维持30分钟，冷却后备用。

水相制备  将检验合格的鸭坦布苏病毒液、H9亚型禽流感病毒液等量混合，使0.1ml水相中鸭坦布苏病毒含量不低于10^5.0ELD₅₀，H9亚型禽流感病毒含量不低于10^7.0EID₅₀。取灭菌后的吐温-80 4份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，充分振摇，使吐温-80完全溶解。

乳化  取油相2份置乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以3000r/min搅拌60分钟，在终止乳化前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，未出现分层。

实施例2

疫苗成品检验（以1208002批疫苗为例）

1）性状

外观  乳白色乳剂。

剂型  油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性  吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相≤0.5ml。

粘度  用1ml吸管（下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm）吸取25℃左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间，在8秒以内。

2）无菌检验  按现行《中国兽药典》进行，无菌生长。

3）安全检验  用7～14日龄健康易感鸭10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，未出现由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应。

4）效力检验

（1）鸭出血性卵巢炎部分效力检验

取7～14日龄健康易感鸭20只，其中10只各肌肉注射疫苗0.3ml，另外10只作为非免疫对照。21日后，每只鸭各肌肉注射WFG36株病毒液1ml。攻毒后5日，剖检，取脾脏进行病毒分离。对照鸭9/10只病毒分离阳性，免疫鸭7/10只病毒分离阴性。

（2）H9亚型禽流感部分效力检验

血清学方法：用7～10日龄SPF鸡15只，其中10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另5只不免疫作对照。21日后，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。免疫鸡HI抗体效价的几何平均值为1∶126（微量法），未免疫对照鸡均为阴性。

免疫攻毒法：用7～10日龄SPF鸡20只，其中10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另10只不免疫作为对照。21日后，用10倍稀释的LG1株毒种进行静脉注射，每只鸡0.2ml，攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，进行病毒分离。免疫鸡9/10只病毒分离阴性；对照鸡10/10只病毒分离阳性。

实施例3

——鸭出血性卵巢炎、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗安全试验

1.材料

试验用疫苗  3批鸭出血性卵巢炎、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗，批号为1208001、1208002、1208003。500羽份/瓶。

疫苗保存条件及有效期  2～8℃保存，有效期为12个月。

2.方法

（1）SPF雏鸭安全性试验

1）一次单剂量接种安全试验

取40只7日龄SPF鸭，每批疫苗胸部肌肉注射10只，0.3ml/只（含1羽份）。另10只等量注射生理盐水做为对照组。观察14日，每日记录雏鸭的精神状态、饮食及粪便性状，接种部位有无肿块、溃疡等不良反应。第14日时全部剖杀，观察各脏器有无病理变化。

2）单剂量重复接种安全试验

取40只7日龄SPF鸭，每批疫苗胸部肌肉注射10只，0.3ml/只（含1羽份）。另10只等量注射生理盐水做为对照组。间隔2周后重复接种1次。观察14日，每日记录雏鸭的精神状态、饮食及粪便性状，接种部位有无肿块、溃疡等不良反应。第14日时全部剖杀，观察各脏器有无病理变化。

3）超剂量接种安全试验

取40只7日龄SPF鸭，每批疫苗胸部肌肉注射10只，1.5ml/只（含5羽份）。另10只等量注射生理盐水做为对照组。观察14日，每日记录雏鸭的精神状态、饮食及粪便性状，接种部位有无肿块、溃疡等不良反应。第14日时全部剖杀，观察各脏器有无病理变化。

（2）产蛋鸭安全性试验

1）单剂量接种安全试验

取40只产蛋鸭，每批疫苗胸部肌肉注射10只，0.5ml/只（含1羽份）。另10只等量注射生理盐水做为对照组。观察14日，每日记录产蛋鸭的精神状态、饮食、粪便性状及产蛋数。第14日时，观察接种部位有无肿块、溃疡等不良反应。

2）单剂量重复接种安全试验

取40只产蛋鸭，每批疫苗胸部肌肉注射10只，0.5ml/只（含1羽份）。另10只等量注射生理盐水做为对照组。间隔2周后重复接种1次。观察14日，每日记录产蛋鸭的精神状态、饮食、粪便性状及产蛋数。第14日时，观察接种部位有无肿块、溃疡等不良反应。

3）超剂量接种安全试验

取40只产蛋鸭，每批疫苗胸部肌肉注射10只，2.0ml/只（含4羽份）。另10只等量注射生理盐水做为对照组。观察14日，每日记录产蛋鸭的精神状态、饮食、粪便性状及产蛋数。第14日时，观察接种部位有无肿块、溃疡等不良反应。

3.结果

（1）SPF雏鸭安全性试验  3批鸭出血性卵巢炎、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗对SPF雏鸭的单剂量接种、单剂量重复接种和超剂量接种后安全试验结果表明，在观察期间接种鸭精神、饮食、粪便等均正常，接种部位无肿块、溃疡等不良反应。剖检无特征性病理变化。具体结果见表1、表2和表3。

表1  疫苗对雏鸭的单剂量接种试验结果

表2  疫苗对雏鸭单剂量重复接种试验结果

表3  疫苗对雏鸭超剂量接种试验结果

（2）对产蛋鸭安全性试验  3批鸭出血性卵巢炎、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗对产蛋鸭的单剂量接种、单剂量重复接种和超剂量接种后安全试验结果表明，在观察期间接种鸭精神、饮食、粪便、产蛋等均正常，接种部位无肿块、溃疡等不良反应。具体结果见表4、表5、表6。

表4  疫苗对产蛋鸭单剂量接种试验结果

表5  疫苗对产蛋鸭单剂量重复接种试验结果

表6  疫苗对产蛋鸭超剂量接种试验结果

鸭出血性卵巢炎、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗对雏鸭和产蛋鸭是安全的。

实施例4

——鸭出血性卵巢炎、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗效力试验

1.材料

试验用疫苗  3批鸭出血性卵巢炎、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗，批号为1208001、1208002、1208003。500羽份/瓶。

疫苗保存条件及有效期  2～8℃保存，有效期为12个月。

2.方法

（1）SPF雏鸭效力试验

取80只14日龄健康易感雏鸭，每批疫苗胸部肌肉注射20只，0.3ml/只（含1羽份）。另20只等量注射生理盐水做为对照组。免疫后21日，每组各取10只雏鸭分别肌肉注射10^5.0ELD₅₀鸭坦布苏病毒WFG36株强毒，攻毒后5日，剖检，取脾脏进行病毒分离。

每组另10只各静脉注射10倍稀释的H9亚型禽流感病毒LG1株强毒。攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，进行病毒分离。免疫鸡应至少9只为病毒分离阴性；对照鸡应至少9只为病毒分离阳性。

（2）产蛋鸭效力试验

取40只健康易感产蛋鸭，每批疫苗胸部肌肉注射10只，0.5ml/只（含1羽份）。另10只等量注射生理盐水做为对照组。免疫后21日，每组各取5只产蛋鸭分别肌肉注射5×10^4.0ELD₅₀鸭坦布苏病毒WFG36株强毒，攻毒后5日，剖检，取卵泡膜进行病毒分离。

每组另5只各静脉注射10倍稀释的H9亚型禽流感病毒LG1株强毒。攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，进行病毒分离。

3.结果

（1）雏鸭效力试验

1）免疫鸭对鸭坦布苏病毒强毒的攻毒保护  3批疫苗接种健康易感雏鸭后21日，用鸭坦布苏病毒WFG36株强毒感染，脾脏组织的病毒再分离结果显示，对照组10/10病毒分离阳性，疫苗免疫组7/10以上病毒分离阴性。详细结果见表7。

表7  3批疫苗对健康易感雏鸭免疫的鸭坦布苏病毒攻毒保护效果

2）免疫鸭对H9亚型禽流感病毒强毒的攻毒保护  3批疫苗接种健康易感雏鸭后21日，用H9亚型禽流感病毒LG1株强毒感染，泄殖腔拭子的病毒再分离结果显示，对照组9/10病毒分离阳性，疫苗免疫组8/10以上病毒分离阴性。详细结果见表8。

表8  3批疫苗对健康易感雏鸭免疫的H9亚型禽流感病毒攻毒保护效果

（2）产蛋鸭效力试验

1）免疫鸭对鸭坦布苏病毒强毒的攻毒保护  3批疫苗接种产蛋鸭后21日，用鸭坦布苏病毒WFG36株强毒感染，卵泡膜组织的病毒再分离结果显示，对照组5/5病毒分离阳性，疫苗免疫组4/5以上病毒分离阴性。详细结果见表9。

表9  3批疫苗对产蛋鸭免疫的鸭坦布苏病毒攻毒保护效果

2）免疫鸭对H9亚型禽流感病毒强毒的攻毒保护  3批疫苗接种产蛋鸭后21日，用H9亚型禽流感病毒LG1株强毒感染，泄殖腔拭子的病毒再分离结果显示，对照组5/5病毒分离阳性，3批疫苗免疫组均5/5病毒分离阴性。详细结果见表10。

表10  3批疫苗对产蛋鸭免疫的H9亚型禽流感病毒攻毒保护效果

Claims (3)

1.一种鸭出血性卵巢炎、禽流感H9亚型二联灭活疫苗，其特征在于该二联灭活疫苗含有并同时含有灭活的鸭坦布苏病毒WFG36株和灭活的H9亚型禽流感病毒LG1株，其中鸭坦布苏病毒WFG36株已于2011年4月12日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCCNo.4718；H9亚型禽流感病毒LG1株为商品化疫苗鸡新城疫、禽流感H9亚型二联灭活疫苗的生产毒种，产品批准文号：兽药生字（2010）150252152。

2.如权利要求1所述一种鸭出血性卵巢炎、禽流感H9亚型二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于:

（1）将鸭坦布苏病毒CGMCC No.4718株种毒接种易感鸡胚，经37℃孵育收获收获胚体、胚液和绒毛尿囊膜，研磨混合制备成病毒液，加入甲醛溶液至总量的0.1%（V/V），37℃灭活24小时；

（2）取H9亚型禽流感病毒LG1株种毒接种9～11日龄健康易感鸡胚孵育后无菌收获鸡胚尿囊液，凝集价微量法低于1∶256者应弃去；加入甲醛溶液至总量的0.1%，37℃灭活48小时；

（3）将灭活后的鸭坦布苏病毒液和灭活后的H9亚型禽流感病毒液等量混合，使0.1ml水相中鸭坦布苏病毒含量不低于10^5.0ELD₅₀、H9亚型禽流感病毒含量不低于10^7.0EID₅₀；按常规法制备成油佐剂灭活疫苗。

3.如权利要求1所述鸭出血性卵巢炎、禽流感H9亚型二联灭活疫苗的应用，其特征在于：给鸭接种有效剂量的鸭出血性卵巢炎、禽流感H9亚型二联灭活疫苗，能使接种鸭获得对鸭出血性卵巢炎和H9亚型禽流感病毒国内流行毒株产生有效预防的免疫力。