CN103830724B

CN103830724B - 一种番鸭细小病毒灭活疫苗及其应用

Info

Publication number: CN103830724B
Application number: CN201410083495.9A
Authority: CN
Inventors: 李陆梅; 宫晓; 徐保娟; 王红; 宋新宇; 邹敏; 李芳�
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2014-03-07
Filing date: 2014-03-07
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2034-03-07
Also published as: CN103830724A

Abstract

本发明提供一种番鸭细小病毒灭活疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为灭活的番鸭细小病毒，该番鸭细小病毒的保藏编号为CGMCC No.8504。本发明通过筛选出具有毒性小，免疫原性高的用番鸭细小病毒YBMDP株。再接种后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗能提高种番鸭的抗体水平，保证其子代母源抗体水平，预防番鸭细小病毒引起的雏鸭细小病毒感染，此疫苗具有高效、安全性好的优点。

Description

一种番鸭细小病毒灭活疫苗及其应用

技术领域

本发明属于家禽病源微生物筛选技术领域，具体涉及一种番鸭细小病毒灭活疫苗及其应用。

背景技术

番鸭细小病毒病是侵害雏番鸭的一种急性或亚急性传染病，是以喘气、腹泻及胰脏坏死和出血为主要特征的传染病；具有高度传染性，且发病率和死亡率都很高，常造成严重的经济损失。该病主要发生于1～3周龄的雏番鸭，尤其是10日龄左右的雏番鸭，而当达到3周龄以上就基本不发病了。本病最早于20世纪80年代中后期出现于中国福建和法国西部Brittany地区，20世纪90年代初才认识到它是不同于小鹅瘟的独立疾病。如果对死亡的番鸭处理不当，往往造成病毒的蔓延，产生更大的危害。因此，就需要筛选出效价高、免疫原性好的番鸭细小病毒来制备疫苗。而且，由于病毒变异导致使用的疫苗效价降低，也需要筛选出变异的病毒株来制备疗效更高的疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种番鸭细小病毒灭活疫苗及其应用；所提供的疫苗具有高效、安全性好、保护率高的优点，从而弥补现有技术的不足。

本发明的番鸭细小病毒灭活疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为灭活的番鸭细小病毒，该番鸭细小病毒的保藏编号为CGMCCNo.8504。

该保藏编号为CGMCC No.8504的番鸭细小病毒，为YBMDV株，已于2013年11月08日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

其中的番鸭细小病毒是经过甲醛溶液灭活的；

上述的疫苗中番鸭细小病毒的含量为10^5.7ELD₅₀；

上述灭活疫苗的制备方法如下：

1）油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加5份的司本-80，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用；

2）水相制备：将灭活的YBMDV株病毒液加入水中，使每0.2ml水中含YBMDV株病毒含量不低于10^5.7ELD₅₀；取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入病毒液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解；

3）乳化：取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟，乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟完成制备。

本发明通过筛选出具有毒性小，免疫原性高的用番鸭细小病毒YBMDP株。再接种后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗能提高种番鸭的抗体水平，保证其子代母源抗体水平，预防番鸭细小病毒引起的雏鸭细小病毒感染，此疫苗具有高效、安全性好的优点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。本发明所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本发明。

实施例1、YBMDV株的筛选

2011年从浙江省某鸭场爆发了急性的番鸭细小病毒病，取病死鸭的胰脏及肠道，将胰脏及肠道组织用无生理盐水匀浆制成20%悬液，3000r/min离心15min，取上清除菌后经尿囊腔分别接种13日龄番鸭胚，孵化120小时，收集尿囊液及胚体组织，经匀浆后，反复冻融3次，取上清液冻存。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明该毒株病毒含量为10^5.7ELD₅₀/0.2ml,最小免疫剂量为10^2.0ELD₅₀/0.2ml，该病毒仅与番鸭细小病毒发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病毒污染，适合作为制苗用毒株。将筛选的病毒株于2013年11月08日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8504。

对于本发明筛选的毒株的性状进行检测，结果表明，该株病毒属细小病毒，圆形无囊膜，直径在20μｍ左右、对乙醚、胰蛋白酶、酸不敏感，对红细胞无凝集现象。该病毒可引起雏番鸭发生以出血性肠炎为特征的急性败血性传染病。该毒株制备的疫苗免疫成年番鸭后，能保护免疫4个月内种番鸭所产子代免受流行毒株的攻击。该毒株作100倍稀释后，与等量雏番鸭细小病毒病抗血清中和，接种13日龄番鸭胚，结果表明，中和组番鸭胚全部健活，而病毒对照组番鸭胚全部死亡。

对筛选的YBMDV株的结构基因VP进行测序,结果VP全长为2199bp，编码732个氨基酸；NCBI的blast序列分析表明，YBMDV株的结构基因VP与已公开的番鸭细小病毒的VP存在差异位点，同源性为97.7％～98.3％（即存在着9-16个氨基酸的差异）。

为了检测上述氨基酸的差异对YBMDV株抗原性的影响，用YBMDV株来制备抗原来检测其免疫原性。

实施例2制备疫苗

1.制苗用病毒液的制备将生产用毒种YBMDV株，尿囊腔接种12～14日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，36～37℃孵育，每日2次照胚检查。选择接种后48～120小时内死亡，且胚体有广泛出血，毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿膜有轻度水肿的胚，取其尿囊液及胚体放入组织捣碎机中粉碎，取粉碎后的组织按1:2加入生理盐水混合；置2～8℃4～12小时，收取尿囊液、羊水及胚体（去掉头和四肢）。用胚液匀浆、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。

2.灭活将YBMDV株病毒液置于灭活瓶内，计量加入10%甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2%。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。

3.半成品检验

（1）无菌检验取灭活的胚液，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

（2）病毒含量测定将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-54个稀释度，分别尿囊腔接种12～14日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算ELD₅₀。

（3）灭活检验将YBMDV株灭活后的病毒液尿囊腔接种12～14日龄易感番鸭胚10枚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，连续观察168小时。

三、灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备（以下配制中各液体成分按体积比计）。

（1）油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－805份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

（2）水相制备将灭活检验合格的YBMDV株病毒液适当比例混合，使每0.2ml水相中含YBMDV株病毒含量不低于10^4.0ELD₅₀。取灭菌后的吐温-805份，加入配液罐中，同时加混合抗原液95份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

（3）乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

四、疫苗成品检验

（1）性状

外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。

剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

（2）装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

（3）无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

（4）安全检验用21日龄番鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗2.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

（5）效力检验

①血清学方法用21～35日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗，0.5ml/只，另取5只同日龄鸡不免疫作对照，免后21日，采血分离血清，分别测定番鸭细小病毒琼扩抗体。免疫组AGP抗体效价，应不低于1:4，对照组应均为阴性。

②子代母源抗体与攻毒保护的关系90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注射疫苗，2ml/只，另取10只同日龄种番鸭不免疫作对照。于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫一次，收集开产后4月时所产种蛋孵化出雏，于雏番鸭7日龄时，免疫组子代取10只，对照组子代取10只，攻毒YBMDP株，每只肌肉注射0.5ml。免疫组子代保护率应不低于8只，对照组发病率应不低于9只。

③对地方流行毒株的攻毒保护（毒株的筛选）将各地方流行毒株分别制备灭活疫苗，取90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注射疫苗，2ml/只，另取10只同日龄种番鸭不免疫作对照。于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫一次，收集开产1个月内所产种蛋孵化出雏，于雏番鸭7日龄时，免疫组子代取10只，对照组子代取10只，攻毒6株各地方分离株，每只肌肉注射0.5ml。观察攻毒保护情况。

实施例3

一、制苗用抗原的制备

1.制苗用病毒液的制备将生产用毒种YBMDV株，尿囊腔接种12～14日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，36～37℃孵育，每日2次照胚检查。选择接种后48～120小时内死亡，且胚体有广泛出血，毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿囊膜有轻度水肿的番鸭胚，取其尿囊液及番鸭胚体放入组织捣碎机中粉碎，取粉碎后的组织按1:2加入生理盐水混合；置2～8℃4～12小时，收取尿囊液、羊水及胚体（去掉头和四肢）。用胚液匀浆、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。（参见表1）。

表1毒液的制备

毒株名称	制苗材料	接种胚数（枚）	胚日龄	收获毒液（ml）
					YBMDP株	番鸭胚	100	13	1200

2.灭活将病毒液倒入灭活瓶内，计量加入10%甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2%。加甲醛溶液后倒入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。

3.疫苗半成品检验

（1）无菌检验取灭活的胚液，按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。

（2）病毒含量测定将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-54个稀释度，分别尿囊腔接种12～14日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算ELD₅₀为10^5.7ELD₅₀/0.2ml。

（3）灭活检验将病毒液尿囊腔接种12～14日龄易感番鸭胚10枚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，连续观察168小时，鸭胚均无死亡。

二、灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备（以下配制中各液体成分按体积比计，参见表2）。

（2）水相制备将灭活检验合格的病毒液混合，检测每0.2ml水相中含YBMDP株病毒含量不低于10^5.7ELD₅₀。取灭菌后的吐温-805份，加入配液罐中，同时加混合抗原液95份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

（3）乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。

（4）分装定量分装，加盖密封。

表2疫苗乳化和分装

三、疫苗成品检验

（1）性状

外观乳白色乳剂。

剂型油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水，呈油滴状不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。

黏度按现行版《中国兽药典》附录进行，为58.6cp。

（2）装量检查按现行版《中国兽药典》附录进行,符合标准。

（3）无菌检验按现行版《中国兽药典》附录进行,无菌生长。

（4）安全检验用21日龄番鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗2.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，试验番鸭全部健活,且均未出现任何因疫苗引起的局部和全身反应。

（5）效力检验

①用28日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗0.5ml，另取5只同日龄鸡不免疫作对照，免后21日，采血分离血清，测定番鸭细小病毒AGP抗体效价。免疫组10只鸡抗体效价均不低于为1:4，对照组5只鸡均为阴性。（参见表3）。

表3疫苗效力检验结果

②子代母源抗体与攻毒保护的关系90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注射疫苗，2ml/只，另取10只同日龄番鸭不免疫作对照。于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫一次，收集开产后4月时所产种蛋孵化出雏，于雏番鸭7日龄时，免疫组子代取10只，对照组子代取10只，攻毒YBMDP株，每只肌肉注射0.5ml。免疫组子代保护9只，对照组全部发病。

③对地方流行毒株的攻毒保护（毒株的选育）90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注射疫苗，2ml/只，另取10只同日龄种番鸭不免疫作对照。于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫一次，收集开产1个月内所产种蛋孵化出雏，于雏番鸭7日龄时，免疫组子代取10只，对照组子代取10只，攻毒6株各地方分离株，每只肌肉注射0.5ml。结果表明，用YBMDP株制备的番鸭细小病毒病灭活疫苗相比较其它毒株制备的灭活疫苗，能抵御各地方分离毒的攻击（参见表4）。而且，用YBMDP株制备的番鸭细小病毒病灭活疫苗对于YBMDP株的攻毒实验表明，YBMDP株制备的疫苗的免疫效果最好，推测是由于YBMDP株基因发生变异导致的；多次攻毒实验的结果也表明用YBMDP株制备的番鸭细小病毒病灭活疫苗对YBMDP株的免疫效果最佳。

表4：对地方流行毒株的攻毒保护

上述结果表明，本发明制备的疫苗能有效的预防目前各地流行的番鸭细小病毒病的感染，且对于出发的抗原病毒具有更佳的免疫效果。

Claims

1.一种灭活疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其特征在于，所述的抗原为灭活的番鸭细小病毒，该番鸭细小病毒的保藏编号为CGMCC No.8504；其含量为10^5.7ELD₅₀。

2.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于所述的番鸭细小病毒是经过甲醛溶液灭活的。