CN105219735B

CN105219735B - 一种鸭细小病毒毒株及其灭活疫苗和制备方法

Info

Publication number: CN105219735B
Application number: CN201510606498.0A
Authority: CN
Inventors: 刁有祥; 陈浩; 杨晶; 窦砚国; 郑肖强; 牛晓宇; 于相龙
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2015-09-21
Filing date: 2015-09-21
Publication date: 2018-04-03
Anticipated expiration: 2035-09-21
Also published as: CN105219735A

Abstract

本发明涉及动物病毒学领域，提供了一种鸭细小病毒毒株及其灭活疫苗和制备方法，该毒株为鸭细小病毒，具体命名为GT2015株，其生物保藏编号为CCTCCNo：V201527；利用该毒株制备的疫苗有效解决了我国当前该病无法预防的现状，提高肉鸭的出栏合格率，降低肉鸭养殖的料肉比，减少了该病造成了经济损失，制备方法简单，短时间内可制备完毕；安全性高，对环境没有任何不良影响；使用操作方便，使用时取出组织灭活苗注射即可；适于规模化批量生产和应用；免疫效率高，接种后保护率可至100％；保质期可达12个月。

Description

一种鸭细小病毒毒株及其灭活疫苗和制备方法

技术领域

本发明涉及动物病毒学领域，提供了一种鸭细小病毒毒株及其灭活疫苗和制备方法。

背景技术

鸭细小病毒是细小病毒的一种，主要侵害1～3周龄的雏鸭，临床以腹泻、呼吸困难和脚软为主要症状，一年四季均有发生，给鸭饲养带来极大的经济损失，是鸭饲养中主要的疾病之一，发病率和死亡率也较高。

2015年3月以来，我国山东、江苏和安徽等地肉鸭群出现了一种疾病，经验证为鸭细小病毒，该病以鸭喙发育不良，舌头外伸为特征，本病主要发生在14日龄以上的商品鸭，鸭群发病率为10％-20％，最高可达50％，大群感染率最高可达100％，但该病不造成患鸭死亡。患鸭发育迟缓，体温略升高，喙短，弹性降低，舌肿胀，外伸，感染后期患鸭胫骨和翅骨易发生骨折。该病主要导致鸭群料肉比上升，养殖成本升高，鸭出栏合格率降低。对肉鸭养殖业造成巨大的经济损失。

众所周知，疫苗接种是防止疫病爆发和避免造成巨大经济损失的主要措施、关键环节和最后防线。组织灭活苗和疫苗是鸭饲养行业中常用的生物制剂，由于该病为新发疫病，目前国内外尚无预防该病的疫苗。因此，提供一种针对性的疫苗来防治该病成为亟待解决的问题。

发明内容

针对上述情况，本发明的发明人提供了一种鸭细小病毒毒株及其灭活疫苗和制备方法，该毒株为鸭细小病毒，具体命名为GT2015株，其生物保藏编号为CCTCC No：V201527；利用该毒株制备的疫苗有效解决了我国当前该病无法预防的现状，提高肉鸭的出栏合格率，降低肉鸭养殖的料肉比，减少了该病造成了经济损失，制备方法简单，短时间内可制备完毕；安全性高，对环境没有任何不良影响；使用操作方便，使用时取出组织灭活苗注射即可；适于规模化批量生产和应用；免疫效率高，接种后保护率可至100％；保质期可达12个月。

发明人首先对上述病毒进行了分离和鉴定，最终确定上述疾病为鸭细小病毒(Duck Parvovirus DPV)感染引起的一种鸭细小病毒病。进而发明人获得了一株新鸭细小病毒毒株，通过毒种的分离培养、鹅胚中和试验、病毒的PCR检测及病毒的测序检测实验，确定该毒株为一株新的鸭细小病毒，命名为鸭细小病毒GT2015株。本发明鸭细小病毒GT2015株的分离结果显示：本病毒能在鸭胚及其制备的的原代细胞培养物中增殖并形成病变，且随着传代次数的增加，病变越来越明显。但是该病毒不能够在鸡胚、鹅胚上增殖。鸭胚盲传3代可见绒毛尿囊膜水肿、增厚，颈部、胸部、爪、翅尖及喙旁均有出血，头及颈部水肿。收获的鸭胚尿囊液经红细胞凝集试验检测无血凝活性。

发明人对该毒株进行了生物保藏，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，生物保藏编号为CCTCC No：V201527。

在分离获得上述毒株的基础上，发明人进一步获得了该毒株的灭活疫苗，同时提供了该鸭细小病毒灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：

(1)病毒增殖程序将GT2015株按照0.2mL/胚接种9日龄健康鸭胚，120h后收获病毒尿囊液，-20℃下保存；

(2)病毒的灭活病毒尿囊液过滤处理，加入甲醛溶液至终浓度(体积分数吗？)为0.1％，然后再37℃灭活16h，期间振摇3-4次，保存于4℃；

(3)灭活疫苗的的制备

a.油相的制备白油94份、司盘-80 6份，混合后加热，加入硬脂酸铝2份混合均匀，即得油相；

b.水相的制备吐温-80 4份、灭活浓缩后的病毒抗原液96份，混合均匀，即得水相；

c.混合与乳化 6份油相放入胶体磨中，开动机器慢速搅拌,同时缓慢加入3份水相，加完后以8000-10000r/min乳化3分钟,然后加入1份水相,继续搅拌30秒,在终止搅拌前加入w/v 1％硫柳汞水溶液,使其终浓度w/v为万分之一即得。

获得灭活疫苗之后即可通过各种手段检验疫苗的效果，结果表明制备的鸭细小病毒灭活疫苗具有稳定的物理性状和安全性，种鸭免疫后可以使子代雏鸭获得抵抗鸭细小病毒感染，特别是针对GT2015株的抗感染能力。

综上所述，本发明首次提出了利用鸭细小病毒GT2015株制备鸭细小病毒灭活疫苗，该疫苗的研制有效解决了我国当前该病无法预防的现状，提高肉鸭的出栏合格率，降低肉鸭养殖的料肉比，减少了该病造成了经济损失。用GT2015株制备灭活疫苗，方法简单，短时间内可制备完毕；安全性高，对环境没有任何不良影响；使用操作方便，使用时取出组织灭活苗注射即可；适于规模化批量生产和应用；免疫效率高，接种后保护率可至100％；保质期长(可达12个月)；灭活苗的病毒株可以通过本发明的制备方法长期保存，循环利用。目前该病在我国南方地区的番鸭、半番鸭群和北方地区的肉鸭群中均有流行，该疫苗的制备为我国有效防控该病提供了技术保障。

发明人对本发明所公开的鸭细小病毒GT2015进行了生物保藏，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，具体保藏信息如下：

保藏信息

保藏时间：2015年8月28日

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心 CCTCC

保藏编号：CCTCC NO：V 201527

保藏单位地址：中国武汉大学

分类命名:鸭细小病毒GT2015

附图说明

图1为鸭细小病毒GT2015株的PCR检测结果，其中M为DL2000 DNA marker，1：组织样本PCR扩增结果；2、3、4、5分别为第2-5代病毒液PCR扩增结果；

图2为不同水禽细小病毒的VP3基因序列比较分析图。

具体实施方式

实施例1

病毒的分离和鉴定

2015年4月，对采集自山东高唐地区的患鸭，临床表现为发育迟缓，上下喙萎缩等，取肝脏经研磨、冻融、过滤除菌后，接种于9日龄鸭胚，进行病毒分离，并对分离株进行PCR、EID50毒价测定、动物回归试验等鉴定。结果显示，成功扩增得到目的片段；病毒毒力为10^6.7EID50/0.2mL；动物感染试验的接种鸭出现明显的临床症状和病理变化，与临床发病鸭一致。由此确定分离株为鸭细小病毒，命名为GT2015株，发明人对其进行生物保藏，保藏编号(CCTCC No：V201528)。具体过程如下：

1.病料的处理取短喙长舌症状患鸭的肝脏，按常规方法匀浆、反复冻融3次，4℃，12000r/min离心10min，取上清液，-20℃冻存备用。

2.病毒鸭胚分离传代将上清过滤后，按照0.2mL/胚尿囊膜接种9日龄健康鸭胚，120h后收获尿囊液，盲传三代。可见鸭胚尿囊膜浑浊、增厚，分离的毒株命名为GT2015株，将该毒株继续传代，至第五代时病毒增殖状况良好，提取2-5代病毒尿囊液DNA，进行PCR检测，检测结果均为阳性(如图1所示)。

3.GT2015株的鉴定分别采用禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、坦布苏病毒、禽腺病毒、I型和III型鸭肝炎病毒、水禽细小病毒等特异性引物进行PCR扩增，结果显示，只有水禽细小病毒得到特异性扩增目的条带，约为921bp。克隆连接至pMD18-T载体中，经测序分析显示，该分离株属于水禽细小病毒，其与鹅细小病毒欧洲分离株亲缘关系较近，与国内分离株位于不同分支上(图2)。

4.病毒的体外增殖将GT2015株在健康鸭胚上连续传10代，分别测定第4、6、8、10代病毒的EID50，结果表明，该病毒在鸭胚中稳定增殖，不能致死鸭胚，EID50/0.2mL稳定在10^6.5-10^6.7之间。

实施例2

1.疫苗制备和检验

(3)灭活疫苗的的制备

2.疫苗物理性状的检查

1.1外观：白色乳剂。

1.2型剂：油包水型，将疫苗数滴滴于冷水表面,不扩散,呈规则圆形。

1.3稳定性：疫苗置37℃下24h不应有破乳、分层现象，将疫苗装入小离心管中,经3000r/min离心,不出现分层。

1.4粘度：用出口内径为1.2mm吸管吸取疫苗1mL在25℃左右室温下,令其垂直流出,在8s内应流出0.4mL以上判为合格。

2.灭活疫苗的无菌检验

按照《中国兽药典》2010版进行无菌检验，应无菌落生长。

3.鸭细小病毒灭活疫苗的安全性试验

3.1一次单剂量注射的安全试验

使用三批次的鸭细小病毒灭活疫苗，一次注射1日龄雏鸭0.1mL/羽，雏鸭注射局部和全身无不良反应(表1)。

表1一次单剂量注射的安全性试验结果

批次	免疫羽数	剂量(mL)	观察时间(d)	无反应	轻微反应	严重反应
							1	10	0.1	20	20/20	0	0
2	10	0.1	20	20/20	0	0
							3	10	0.1	20	20/20	0	0

3.2一次大剂量注射的安全试验

以3批鸭细小病毒灭活疫苗一次大剂量注射开产种鸭，0.5mL/羽，种鸭注射局部或全身无任何不良反应，结果见表2。

表2一次大剂量注射的安全试验结果

批次

免疫羽数

剂量(mL)

观察时间(d)

无反应

轻微反应

严重反应

1	10	0.5	20	20/20	0	0
							2	10	0.5	20	20/20	0	0
3	10	0.5	20	20/20	0	0

3.2重复大剂量注射的安全试验

以3批鸭细小病毒灭活疫苗两大剂量注射开产种鸭，间隔4周，每次0.5mL/羽，种鸭注射局部或全身无任何不良反应，结果见表3。

表3重复大剂量注射的安全试验结果

以上试验结果证实该灭活疫苗具有良好的安全性。

4.灭活疫苗免疫效力检验

4.1对雏鸭不同剂量的鸭细小病毒灭活疫苗免疫试验

取制备的鸭细小病毒灭活疫苗，按0.05mL/只、0.1mL/只和0.15mL/只，接种1日龄健康雏鸭，于接种后6日后攻击10⁶EID50鸭细小病毒GT2015株，称量雏鸭的体重，观察喙和胫骨发育情况。结果见表4。

表4雏鸭不同剂量保护性试验结果

免疫剂量分组

雏鸭日龄(d)

数量(羽)

观察时间

20日龄体重

喙部短

胫骨短粗

0.05mL

1

20

1012.4±47.3

0/20

0.1mL

1

20

1083.2±53.4

0/20

0.15mL

1

20

1074.2±67.9

0/20

对照

1

10

20

892.3±49.5

2/20

16/20

可见三个免疫剂量对雏鸭均具有保护性，与对照组相比，均能够抵抗GT2015株的感染，最佳免疫剂量为0.1mL。

4.2种鸭血清抗体水平与子代雏鸭的被动免疫保护力

取制备的灭活疫苗免疫20羽开产种鸭，按照0.5mL/羽颈部皮下接种，采集第1、2、3、4、5、6、7周种鸭血清，并于免疫后第3、4、5、6、7周收集种蛋。将采集的血清采用建立的基于鸭细小病毒VP3蛋白的间接ELISA方法进行抗体效价检测。五个周龄种蛋孵化1日龄雏鸭，用10⁶EID50鸭细小病毒GT2015株攻击，观察临床症状20天，并于20日称重，同时设定对照组雏鸭。判断种鸭免疫的抗体水平和子代雏鸭的被动免疫之间的关系。

表5种鹅免疫后血清中抗体变化

免疫后周龄	3	4	5	6	7
						OD450	0.74±0.13	0.93±0.11	1.02±0.16	1.06±0.12	1.08±0.21

表6种鸭免疫后抗体水平与子代雏鸭被动免疫结果

上述试验结果显示，种鸭抗体水平在0.74时，子代雏鸭就可以获得有效的被动免疫保护。

Claims

1.一种鸭细小病毒毒株，命名为鸭细小病毒GT2015株，其保藏编号为：CCTCC No：V201527。

2.一种鸭细小病毒灭活疫苗，其特征在于，所采用的毒株为鸭细小病毒GT2015株，其保藏编号为：CCTCC No：V201527。

3.一种鸭细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）病毒增殖程序将GT2015株按照0.2mL/胚接种9日龄健康鸭胚，120h后收获病毒尿囊液，-20℃下保存；

（2）病毒的灭活病毒尿囊液过滤处理，加入甲醛溶液至终浓度v/v为0.1%，然后再37℃灭活16h，期间振摇3-4次，保存于4℃；

（3）灭活疫苗的制备

a. 油相的制备白油 94 份、司盘-80 6份，混合后加热，加入硬脂酸铝2份混合均匀，即得油相；

b. 水相的制备吐温-80 4 份、灭活浓缩后的病毒抗原液96份，混合均匀，即得水相；

c. 混合与乳化 6份油相放入胶体磨中，开动机器慢速搅拌,同时缓慢加入3份水相，加完后以8000-10000r/min乳化3分钟,然后加入1份水相,继续搅拌30秒, 在终止搅拌前加入w/v 1%硫柳汞水溶液,使其终浓度w/v为万分之一即得；

所述GT2015株为保藏编号CCTCC No：V201527的鸭细小病毒。