CN105412921B - 一种ⅰ群4型禽腺病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗，其抗原为灭活后的YBAV‑4株病毒。本发明制备的Ⅰ群4型禽腺病毒灭活疫苗，利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本发明中制备的禽腺病毒灭活疫苗对禽能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

Description

一种Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗

技术领域

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗。

技术背景

Ⅰ群禽腺病毒组成了腺病毒科的禽腺病毒属。Ⅱ群(火鸡出血性肠炎和相关病毒)和Ⅲ群(减蛋综合征)腺病毒与疾病的关系明确，相比之下，大多数Ⅰ群的禽腺病毒对禽类的致病作用还未完全确定。但FAdV-1和FAdV-4明显属于例外，其中FAdV-1能引起鹌鹑支气管炎，FAdV-4是心包积水肝炎综合征的主要病因。当鸡的健康受到损害时，如并发感染鸡传染性贫血病毒(CIAV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)等其他病原，其他的腺病毒毒株可使条件性致病原发生快速感染。Ⅰ群禽腺病毒已鉴定了5个禽腺病毒，其名称用字母A～E表示。每个种内的病毒主要根据交叉中和实验结果进一步分为不同的血清型。病毒颗粒直径为70～90nm，无囊膜，呈20面体对称结构。病毒核酸为双股DNA，占整个病毒粒子的11.3％～13.5％，其余部分为蛋白质。病毒六邻体是主要的衣壳蛋白，含有型、群和群特异性抗原决定簇，因而感染后可产生相应的型、群和群的特异性抗体。

Ⅰ群禽腺病毒呈世界性分布，各年龄段家禽均易感。可以通过水平和垂直两种途径传播。虽然感染鸡的12个血清型之间及血清型内部的毒力各有不同，但12个血清型均能诱发包涵体肝炎(IBH)。FAdV-4引起的心包积水肝炎综合征(HHS)的主要临床症状为产蛋下降和引起死亡(死亡率在20％～80％)，主要病理变化是心包腔中有淡黄色清亮的积液，肝脏肿大、苍白，肾脏肿大，心脏和肝脏出现多发性局灶性坏死，肝细胞中见核内包涵体。1987年，巴基斯坦首次发现心包积水肝炎综合征(HHS)，不到一年，HHS就摧毁了巴基斯坦的家禽养殖业。之后在印度、科威特、伊朗、日本和前苏联也发现该病。如今，世界各地都有HHS的踪影，遍及拉丁美洲-中东和亚洲的一些国家。

通过对Ⅰ群禽腺病毒的流行病学调查，该病在我国鸡群中发病率较高，且呈逐年上升趋势。发病的宿主范围越来越广，白羽肉鸡、肉种鸡、蛋鸡、黄羽鸡均可感染发病。特别是2010年以后发病呈现增加趋势，在全国范围内均有流行。临床表现包涵体肝炎(IBH)、心包积水肝炎综合征(HHS)。随着我国养鸡业的迅速发展，Ⅰ群禽腺病毒的发病率给饲养业造成了严重的经济损失。关于该病的防治，国外已有预防Ⅰ群禽腺病毒的商品化疫苗，至今国内尚无疫苗可用，导致Ⅰ群禽腺病毒防控存在漏洞。研制安全有效的Ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗，为提高国内Ⅰ群禽腺病毒疫苗的防控能力和防止Ⅰ群禽腺病毒蔓延奠定基础。

发明内容

本发明提供了一种Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗，用于预防鸡心包积水肝炎综合征，从而弥补现有技术的不足。

本发明中制备禽腺病毒灭活疫苗，其抗原为灭活后的YBAV-4株病毒。

所使用的Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株，该病毒株于2015年10月15日保藏于武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.V201541。

上述的灭活疫苗，其中病毒的灭活采用甲醛灭活；

所述疫苗的制备方法包括在YBAV-4株病毒液中加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h，灭活的病毒液与油佐剂1∶2混合乳化，得到禽腺病毒灭活疫苗。

本发明制备的Ⅰ群4型禽腺病毒灭活疫苗，利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本发明中制备的禽腺病毒灭活疫苗对禽能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

具体实施方式

实施例1

YBAV-4株的分离与鉴定

1、流行病学调查 自2010年以来，山东、江苏等地区的部分肉种鸡、蛋鸡及麻鸡出现了一种以死亡率高，解剖主要表现为肝脏肿大、心包积水为特点的疾病，经临床调查和实验室检测，初步诊断为Ⅰ群C-4型禽腺病毒引起的心包积水肝炎综合征。2010年，发明人从山东淄博某养殖场有包涵体肝炎和心包积水典型症状的病死鸡肝脏中成功分离到1株病毒。

2、病毒分离 取病死鸡的肝脏研碎后，用按1:5的比例加入灭菌生理盐水制成悬液；反复冻融3次后，3000r/min离心30min，取上清；加入青霉素和链霉素各10000IU/ml，4℃过夜，经微孔滤器过滤，无菌检验合格后保存备用。将上述制备的病毒液以0.2ml/胚的剂量，经卵黄囊途径接种6.5日龄SPF鸡胚，弃24h内死胚，取接种48h～168h内死亡鸡胚的尿囊液和胎儿，用上述方法处理后连续传代，观察第3代死胚的肝组织，鸡胚表现为死胚、胚体矮小、发育迟缓、胎儿卷曲、肝脏肿大和质脆，胚胎充血。收集死胚尿囊液和胎儿，－20℃保存。

3、病毒的鉴定

3.1血凝特性鉴定 无菌采集SPF鸡和鸭血液5～10ml，反复洗3～5次，末次用生理盐水将血细胞泥稀释成0.8％、1％和2％浓度，4℃保存备用。按常规方法检测分离毒株是否具有凝集这些红细胞的特性。同时设Ⅲ群禽腺病毒EDSV-76为凝集反应阳性对照。结果：分离毒不能凝集SPF鸡和鸭红细胞，即使改变红细胞的浓度，也不能使之凝集。Ⅲ群禽腺病毒EDSV-76能够凝集鸡、鸭的红细胞。

3.2理化特性检验 参照《动物病毒学》介绍的方法，病毒液分别以5-溴尿嘧啶-2’-脱氧核苷(BUDR)、氯仿、乙醚、盐酸(pH3)、氢氧化钠(pH10)、温度(60℃、1h)处理后，接种鸡胚(0.2ml/胚)，另设生理盐水处理组作为对照。接种5d后观察鸡胚病变。结果：分离毒分别经BUDR、氢氧化钠(pH10)和60℃、1h处理后，接种鸡胚，鸡胚表现正常，PCR检测阴性。表明BUDR能抑制病毒在鸡胚中的复制，分离毒株的核酸类型为DNA，病毒不耐碱，对热敏感，60℃，1h可被灭活。而经乙醚、氯仿和盐酸(pH3)处理的毒株，不影响病毒在鸡胚中的增殖，出现明显的鸡胚病变，PCR检测结果阳性。表明病毒没有脂质囊膜，对乙醚和氯仿有抵抗力，耐酸。

3.3血清学鉴定

3.3.1群特异性鉴定 利用琼脂凝胶扩散试验(AGP)制备琼脂凝胶平板对分离毒株进行群特异性鉴定。琼脂凝固后，用打孔器打孔，打孔图案为中央1孔四周6孔，孔径4mm，孔距为4mm，孔底封闭。待检病毒置于中间孔，周围孔加Ⅰ群禽腺病毒标准株、EDSV-76京911株标准阳性血清及阴性血清。将琼扩板放置于加盖湿盒中37℃作用，24～48h观察是否出现凝集沉淀线。结果：分离毒抗原仅能与Ⅰ群禽腺病毒4型阳性血清出现明显沉淀线，而与Ⅲ群禽腺病毒EDSV-76京911株标准阳性血清及阴性血清之间均未出现沉淀线。

3.3.2型特异性鉴定 Ⅰ群禽腺病毒1～12型标准阳性血清首先作1:10稀释，再按2010年版《中国兽药典》附录固定病毒稀释血清法，将Ⅰ群禽腺病毒1～12型标准毒株、分离毒对Ⅰ群禽腺病毒1～12型标准阳性血清进行交叉中和试验，记录中和效价结果。结果：分离毒测4型标准阳性血清的中和效价(1:501)与4型标准毒株测4型标准阳性血清的中和效价(1:537)较接近；分离毒株测其它型标准阳性血清的中和效价均在1:10以下。表明分离株是血清4型。

3.4PCR检测及基因测序 病鸡肝脏无菌研磨，反复冻融3次，利用柱式动物DNA提取试剂盒提取病毒DNA，进行PCR检测。1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。将阳性样品进行Hexon基因测序，并进行遗传进化分析。

PCR反应体系：总体积20ul

模版DNA：1ul

引物Hexon A/Hexon B：0.5ul/0.5ul

2×Premix Taq：10ul

4d水：8ul

PCR反应条件：

72℃55秒

72℃10分钟

4℃保存

经扩增，分离毒株扩增出了相应的目的片段，与预期的目的片段大小相符。

根据Hexon基因序列比对和遗传进化分析结果可以看出，分离毒与Ⅰ群禽腺病毒属于同一分支，与血清4型同源性最接近，但也存在序列上的差异；与血清6型、7型、8a和8b型同源性更低。

该病毒株于2015年10月15日保藏于武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.V201541。

实施例2

YBAV-4株毒种的制备

挑选长势良好的鸡肝细胞，弃掉原培养液，加入含有1％毒种(YBAV-4株原始毒种第3代)的维持液，置37℃培养36～48小时，当细胞病变达80％以上时收获，冻融2次，分装于灭菌容器内，取样进行鉴定。注明收获日期、毒种代次等。按此方法连传15代，分别标记为C4～C18代。每代均测定病毒含量。将检验无菌且病毒含量≥10^7.0TCID₅₀病毒液混合，定量分装，冻干保存。注明收获日期、毒种代次等。

实施例3

YBAV-4株制苗用病毒液的制备

1制苗材料选择 Ⅰ群4型禽腺病毒液的制备，选择鸡肝细胞。

2细胞制备 从液氮罐中取出冻存管置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10ml培养液的离心管中，1000r/min离心5分钟。用含20％新生牛血清的培养液悬浮细胞，置37℃、5％CO₂培养箱培养，当长成良好单层时用胰酶-EDTA消化细胞，用细胞营养液传代培养。

3细胞单层培养 将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中，37℃培养。

4接毒 挑选长势良好的鸡肝细胞，弃掉原培养液，加入含有1％毒种的维持液，置37℃继续培养。

5观察与收获 接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况。当细胞病变达80％以上时收获，冻融2次，取样进行半成品检验。－15℃保存。

实施例4

YBAV-4株病毒液的灭活及半成品检验与疫苗的制备

1病毒灭活 将病毒液过滤后导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.2％。经37℃搅拌灭活16小时(以罐内液体温度达到37℃开始计时)。灭活后的病毒液置2～8℃保存。

2半成品检验

2.1病毒含量测定 将毒种用细胞维持液进行10倍系列稀释，取10^－6、10^－7、10^－83个稀释度，分别接种于长势良好的鸡肝细胞(96孔细胞板)，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml。同时设病毒阳性对照孔和细胞阴性对照孔，37℃培、5％CO₂培养箱培养和观察168小时，出现CPE者判为感染，计算TCID₅₀。

2.2无菌检验 取灭活后的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验。

2.3灭活检验 将灭活后的病毒液作10倍稀释，接种长势良好的鸡肝细胞(24孔细胞板)4孔，每孔0.2ml，补充维持液至2.0ml；同时设未接种的鸡肝细胞作空白对照，37℃、5％CO₂培养箱培养，观察168小时。将培养物收获反复冻融后盲传一代，继续培养120小时。观察是否出现CPE。

3灭活疫苗制备 将各种物质配比后，混匀，高压灭菌后冷却备用。取油相2份导入乳化罐中，开动电机低速搅拌，同时徐徐加入水相1份后，3600r/min，乳化30分钟。取疫苗10ml加入离心管中，3000r/min离心15分钟，观察管底有无水相析出，如有水相析出，计量析出水相的体积。

4分装 定量分装，加盖密封，2～8℃保存。

实施例5疫苗安全效果检测

用21日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下分点注射疫苗1.0ml(颈后部两侧皮下各注射0.5ml)，观察14日，观察是否由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。结果显示，疫苗免疫的所有试验鸡精神、采食及饮水均未见异常，注射部位均无红肿反应。

实施例6

疫苗免疫效果检测

1血清学方法 取21日龄SPF鸡20只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另10只作对照。接种后7日至5个月，每只鸡分别采血，分离血清，用琼扩试验检测免疫鸡和对照鸡的Ⅰ群4型禽腺病毒抗体，记录抗体结果。

2免疫攻毒法 取21日龄SPF鸡20只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另10只作对照。免疫后21～28日，所有免疫鸡和对照鸡，肌肉注射Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株病毒液(约含10^5.5TCID₅₀/0.1ml)，每只0.2ml。观察并详细记录免疫鸡和对照鸡的发病情况。

结果显示：3批疫苗免疫组21日及以后琼扩抗体均≥8/10阳性，对照组鸡全部为阴性；攻毒保护结果，3批疫苗免疫鸡攻毒后观察14日，保护数均不少于9只；对照鸡攻毒7日内全部发病，死亡8只，死亡鸡(死亡后剖检)及发病鸡(攻毒后7日剖检)剖检病理变化：均出现典型的心包积水、肝脏肿大病变。详见下表1、2。

表1：疫苗免疫后抗体效价检测结果

表2：3批疫苗效力检验结果

而且，用YBAV-4株制备的毒病灭活疫苗对于YBAV-4株的攻毒的免疫效果明显好于市售的Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗，推测是由于YBAV-4株基因发生变异导致的。

Claims (2)

1.一种禽腺病毒灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗的抗原为灭活后的YBAV-4株病毒；所述的YBAV-4株病毒的保藏编号为CCTCC No.V201541。

2.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的病毒的灭活采用甲醛灭活。