CN105368795B - 一种ⅰ群4型禽腺病毒毒株及其应用 - Google Patents

一种ⅰ群4型禽腺病毒毒株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供一种Ⅰ群4型禽腺病毒毒株，其保藏编号为CCTCC No.V 201541。本发明的Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV‑4株具有良好的特异性和免疫原性，感染细胞液与抗减蛋综合征病毒、鸡传染性法氏囊病毒、新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡马立克氏病病毒、禽流感等特异性阳性血清鸡SPF鸡血清均不出现特异性沉淀线，而能与抗Ⅰ群4型禽腺病毒特异性血清出现明显的特异性沉淀线。本发明作为制造效果良好的疫苗毒株，预防鸡心包积水肝炎综合征，用于病毒血清型的鉴定和流行病学的调查。

Description

一种Ⅰ群4型禽腺病毒毒株及其应用
技术领域
本发明属于微生物病毒筛选技术领域，具体涉及一种Ⅰ群4型禽腺病毒毒株及其应用。
技术背景
Ⅰ群禽腺病毒组成了腺病毒科的禽腺病毒属。Ⅱ群(火鸡出血性肠炎和相关病毒)和Ⅲ群(减蛋综合征)腺病毒与疾病的关系明确，相比之下，大多数Ⅰ群的禽腺病毒对禽类的致病作用还未完全确定。但FAdV-1和FAdV-4明显属于例外，其中FAdV-1能引起鹌鹑支气管炎，FAdV-4是心包积水肝炎综合征的主要病因。当鸡的健康受到损害时，如并发感染鸡传染性贫血病毒(CIAV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)等其他病原，其他的腺病毒毒株可使条件性致病原发生快速感染。Ⅰ群禽腺病毒已鉴定了5个禽腺病毒，其名称用字母A～E表示。每个种内的病毒主要根据交叉中和实验结果进一步分为不同的血清型。病毒颗粒直径为70～90nm，无囊膜，呈20面体对称结构。病毒核酸为双股DNA，占整个病毒粒子的11.3％～13.5％，其余部分为蛋白质。病毒六邻体是主要的衣壳蛋白，含有型、群和群特异性抗原决定簇，因而感染后可产生相应的型、群和群的特异性抗体。
Ⅰ群禽腺病毒呈世界性分布，各年龄段家禽均易感。可以通过水平和垂直两种途径传播。虽然感染鸡的12个血清型之间及血清型内部的毒力各有不同，但12个血清型均能诱发包涵体肝炎(IBH)。FAdV-4引起的心包积水肝炎综合征(HHS)的主要临床症状为产蛋下降和引起死亡(死亡率在20％～80％)，主要病理变化是心包腔中有淡黄色清亮的积液，肝脏肿大、苍白，肾脏肿大，心脏和肝脏出现多发性局灶性坏死，肝细胞中见核内包涵体。1987年，巴基斯坦首次发现心包积水肝炎综合征(HHS)，不到一年，HHS就摧毁了巴基斯坦的家禽养殖业。之后在印度、科威特、伊朗、日本和前苏联也发现该病。如今，世界各地都有HHS的踪影，遍及拉丁美洲-中东和亚洲的一些国家。
通过对Ⅰ群禽腺病毒的流行病学调查，该病在我国鸡群中发病率较高，且呈逐年上升趋势。发病的宿主范围越来越广，白羽肉鸡、肉种鸡、蛋鸡、黄羽鸡均可感染发病。特别是2010年以后发病呈现增加趋势，在全国范围内均有流行。临床表现包涵体肝炎(IBH)、心包积水肝炎综合征(HHS)。随着我国养鸡业的迅速发展，Ⅰ群禽腺病毒的发病率给饲养业造成了严重的经济损失。关于该病的防治，国外已有预防Ⅰ群禽腺病毒的商品化疫苗，至今国内尚无疫苗可用，导致Ⅰ群禽腺病毒防控存在漏洞。筛选分离出合适的有效疫苗毒株，以使国内Ⅰ群禽腺病毒的防控更具有针对性和有效性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Ⅰ群4型禽腺病毒毒株，从而弥补现有技术的不足。
本发明提供的一株Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株，于2015年10月15日保藏在位于武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No.V201541。
本发明病毒株用于制备疫苗；优选为灭活疫苗；
本发明的病毒毒株YBAV-4株还用于制备Ⅰ群4型禽腺病毒检测用的琼扩抗原试剂。
本发明的病毒毒株YBAV-4株还用于制备Ⅰ群4型禽腺病毒检测用阳性血清试剂。
本发明的病毒毒株YBAV-4株还用于制备Ⅰ群4型禽腺病毒治疗用抗血清试剂。
本发明的Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株具有良好的特异性和免疫原性，感染细胞液与抗减蛋综合征病毒、鸡传染性法氏囊病毒、新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡马立克氏病病毒、禽流感等特异性阳性血清鸡SPF鸡血清均不出现特异性沉淀线，而能与抗Ⅰ群4型禽腺病毒特异性血清出现明显的特异性沉淀线。本发明作为制造效果良好的疫苗毒株，预防鸡心包积水肝炎综合征，用于病毒血清型的鉴定和流行病学的调查。
附图说明
图1：分离毒株PCR鉴定结果，其中泳道1：DL2000Marker；2：阴性对照；3：阳性对照；4：本发明的分离毒；
图2：分离毒与其他禽腺病毒毒株的Hexon基因同源性性比较；
图3：分离毒株Hexon基因遗传进化树分析；
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。SPF种蛋和雏鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。Ⅰ群禽腺病毒1型CVCC AV208株、2型CVCC AV209株、3型CVCC AV210株、4型CVCC AV211株、5型CVCC AV212株、6型CVCCAV213株、7型CVCC AV214株、8型CVCC AV215株、9型CVCC AV216株、10型CVCC AV217株、11型CVCC AV218株和12型CVCC AV219株标准毒株均购自中国兽医药品监察所；Ⅲ群禽腺病毒EDSV-76京911株，公司质量管理部种毒组领用。12个血清型(Avian Adenovirus Type 1～12Antiserum)标准阳性血清购自Charles River，作为参考阳性血清；标准阳性、阴性血清由本实验室制备。
实施例1：Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株的分离与鉴定
1、流行病学调查自2010年以来，山东、江苏等地区的部分肉种鸡、蛋鸡及麻鸡出现了一种以死亡率高，解剖主要表现为肝脏肿大、心包积水为特点的疾病，经临床调查和实验室检测，初步诊断为Ⅰ群C-4型禽腺病毒引起的心包积水肝炎综合征。2010年，发明人从山东淄博某养殖场有包涵体肝炎和心包积水典型症状的病死鸡肝脏中成功分离到1株病毒。
2、病毒分离取病死鸡的肝脏研碎后，用按1:5的比例加入灭菌生理盐水制成悬液；反复冻融3次后，3000r/min离心30min，取上清；加入青霉素和链霉素各10000IU/ml，4℃过夜，经微孔滤器过滤，无菌检验合格后保存备用。将上述制备的病毒液以0.2ml/胚的剂量，经卵黄囊途径接种6.5日龄SPF鸡胚，弃24h内死胚，取接种48h～168h内死亡鸡胚的尿囊液和胎儿，用上述方法处理后连续传代，观察第3代死胚的肝组织，鸡胚表现为死胚、胚体矮小、发育迟缓、胎儿卷曲、肝脏肿大和质脆，胚胎充血。收集死胚尿囊液和胎儿，－20℃保存。
3、病毒的鉴定
3.1血凝特性鉴定无菌采集SPF鸡和鸭血液5～10ml，反复洗3～5次，末次用生理盐水将血细胞泥稀释成0.8％、1％和2％浓度，4℃保存备用。按常规方法检测分离毒株是否具有凝集这些红细胞的特性。同时设Ⅲ群禽腺病毒EDSV-76为凝集反应阳性对照。结果：分离毒不能凝集SPF鸡和鸭红细胞，即使改变红细胞的浓度，也不能使之凝集。Ⅲ群禽腺病毒EDSV-76能够凝集鸡、鸭的红细胞。
3.2理化特性检验参照《动物病毒学》介绍的方法，病毒液分别以5-溴尿嘧啶-2’-脱氧核苷(BUDR)、氯仿、乙醚、盐酸(pH3)、氢氧化钠(pH10)、温度(60℃、1h)处理后，接种鸡胚(0.2ml/胚)，另设生理盐水处理组作为对照。接种5d后观察鸡胚病变。结果：分离毒分别经BUDR、氢氧化钠(pH10)和60℃、1h处理后，接种鸡胚，鸡胚表现正常，PCR检测阴性。表明BUDR能抑制病毒在鸡胚中的复制，分离毒株的核酸类型为DNA，病毒不耐碱，对热敏感，60℃，1h可被灭活。而经乙醚、氯仿和盐酸(pH3)处理的毒株，不影响病毒在鸡胚中的增殖，出现明显的鸡胚病变，PCR检测结果阳性。表明病毒没有脂质囊膜，对乙醚和氯仿有抵抗力，耐酸。
3.3血清学鉴定
3.3.1群特异性鉴定利用琼脂凝胶扩散试验(AGP)制备琼脂凝胶平板对分离毒株进行群特异性鉴定。琼脂凝固后，用打孔器打孔，打孔图案为中央1孔四周6孔，孔径4mm，孔距为4mm，孔底封闭。待检病毒置于中间孔，周围孔加Ⅰ群禽腺病毒标准株、EDSV-76京911株标准阳性血清及阴性血清。将琼扩板放置于加盖湿盒中37℃作用，24～48h观察是否出现凝集沉淀线。结果：分离毒抗原仅能与Ⅰ群禽腺病毒4型阳性血清出现明显沉淀线，而与Ⅲ群禽腺病毒EDSV-76京911株标准阳性血清及阴性血清之间均未出现沉淀线。
3.3.2型特异性鉴定Ⅰ群禽腺病毒1～12型标准阳性血清首先作1:10稀释，再按2010年版《中国兽药典》附录固定病毒稀释血清法，将Ⅰ群禽腺病毒1～12型标准毒株、分离毒对Ⅰ群禽腺病毒1～12型标准阳性血清进行交叉中和试验，记录中和效价结果。结果：分离毒测4型标准阳性血清的中和效价(1:501)与4型标准毒株测4型标准阳性血清的中和效价(1:537)较接近；分离毒株测其它型标准阳性血清的中和效价均在1:10以下。表明分离株是血清4型。
3.4PCR检测及基因测序病鸡肝脏无菌研磨，反复冻融3次，利用柱式动物DNA提取试剂盒提取病毒DNA，进行PCR检测。1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。将阳性样品进行Hexon基因测序，并进行遗传进化分析。
PCR反应体系：总体积20ul
模版DNA：1ul
引物Hexon A/Hexon B：0.5ul/0.5ul
2×Premix Taq：10ul
4d水：8ul
PCR反应条件：
经扩增，分离毒株扩增出了相应的目的片段，与预期的目的片段大小相符。结果详见图1：
根据Hexon基因序列比对和遗传进化分析结果可以看出，分离毒与Ⅰ群禽腺病毒属于同一分支，与血清4型同源性最接近，但也存在序列上的差异；与血清6型、7型、8a和8b型同源性更低。详见图2、图3。
3.5动物回归试验将分离毒株接种10只40日龄SPF鸡(编号1～10号)，每只肌肉注射0.1ml，连续观察10日并进行剖检，记录结果。取死亡鸡肝脏用10％福尔马林固定制备组织切片观察组织学病变；并固定并按照负染色方法固定、染色，电镜下观察。结果：分离毒引起试验雏鸡10/10发病，8/10死亡。临床症状主要表现为精神沉郁，食欲不振，闭眼嗜睡、蹲伏、甚至死亡；经剖检可见心包积水，肝脏肿大，边缘有黄白色坏死斑，或表面有不同程度的出血点和出血斑，肝脏褪色呈淡褐色至黄色，质脆；肾脏肿大出血。鸡肝脏组织切片光镜下可观察到肝细胞核内包涵体；电镜下可观察到鸡肝细胞核中有大量腺病毒粒子，有些病毒粒子呈晶格状排列。
结果显示，分离到一株毒力较强的Ⅰ群4型禽腺病毒。
4病毒继代挑选长势良好的鸡肝细胞，弃掉原培养液，加入含有1％毒种(YBAV-4株原始毒种第3代)的维持液，置37℃培养36～48小时，当细胞病变达80％以上时收获，冻融2次，分装于灭菌容器内，取样进行鉴定。注明收获日期、毒种代次等。按此方法连传15代，分别标记为C4～C18代。
实施例2 Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株的毒力测定
1致细胞病变(CPE)作用将病毒含量不低于105.0TCID50/0.1ml的各代次毒种，按0.5％的量接种于长势良好的鸡肝细胞，置37℃培养36～48小时，观察细胞病变情况。结果均出现细胞圆缩等特异性病变。
2病毒含量测定将上述各代毒种，用细胞维持液进行10倍系列稀释，取10－6、10－7、10－83个稀释度，分别接种于长势良好的鸡肝细胞(96孔细胞板)，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml。同时设病毒阳性对照孔和细胞阴性对照孔，37℃、5％CO2培养箱培养和观察168小时，出现CPE者判为感染，计算TCID50。测定结果表明，YBAV-4株第C4～C18代毒种的病毒含量在107.31～108.00TCID50/0.1ml。
3对雏鸡的毒力将C4、C7、C10、C15、C18代毒种，分别用灭菌生理盐水或PBS稀释至105.5TCID50/0.1ml，肌肉注射42～56日龄SPF鸡10只，每只0.2ml。观察并记录发病情况。结果：试验鸡攻毒后3～5日发病，发病后1～2日多数死亡，攻毒后7日内不发病的鸡以后不再发病，攻毒后发病但7日内不死亡的鸡逐渐康复，发病死亡鸡及处于发病期间的鸡于攻毒后7日剖检有典型的心包积水及肝脏或肾脏肿大病变。攻毒后7日内发病率均不少于9/10，死亡率均不少于7/10。详见表1。
表1 YBAV-4株各代次毒种对雏鸡的毒力
毒种代次 SPF鸡日龄 数量(只) 每只鸡攻毒剂量 发病率 死亡率
C4 42 10 2×105.5TCID50 10/10 9/10
C7 56 10 2×105.5TCID50 10/10 8/10
C10 49 10 2×105.5TCID50 10/10 8/10
C15 49 10 2×105.5TCID50 9/10 7/10
C18 56 10 2×105.5TCID50 9/10 7/10
实施例3 Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株的免疫原性评价
将C4、C10、C15、C18代毒种，分别接种鸡肝细胞繁殖，取病毒含量≥107.0TCID50/0.1ml的病毒液，灭活后以1:2(水相:油相)的比例制成灭活疫苗，取21～28日龄SPF鸡20只，10只各颈部皮下或肌肉注射灭活疫苗，每只0.3ml，另10只不免疫作对照。接种后21～28日，所有免疫鸡和对照鸡，肌肉注射Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株病毒液(约含105.5TCID50/0.1ml)，每只0.2ml。观察14日，记录发病情况。结果：免疫组鸡观察14日，攻毒保护率为9/10～10/10；对照组鸡攻毒后7日内发病率为9/10～10/10，死亡率7/10～8/10，7日后均未见新增发病。说明毒种在18代以内免疫原性稳定。详见表2。
表2 YBAV-4株各代次毒种免疫原性测定
实施例4 Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株的特异性评价
将C4、C10、C15、C18代毒种，分别用细胞维持液稀释至200TCID50/0.1ml，与等量抗Ⅰ群4型禽腺病毒特异性血清混合，在室温中和1小时后，接种长势良好的鸡肝细胞(24孔细胞板)4孔，每孔0.2ml，补充维持液至2.0ml；同时设未中和的病毒液4孔作阳性对照，正常细胞2孔作阴性对照，置37℃、5％CO2培养箱培养和观察168小时，记录细胞病变孔数。详见表3。
表3 YBAV-4株各代次毒种的特异性测定
实施例5 Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株灭活疫苗安全性试验
用21～28日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下分点注射疫苗1.0ml(颈后部两侧皮下各注射0.5ml)，观察14日，观察是否出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
试验结果：所有接种鸡均未有异常的临床反应和病理变化。灭活后加油佐剂的Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株对接种鸡是安全的，不会造成任何的局部或全身反应。
实施例6 Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株灭活疫苗免疫保护性试验
1取21～28日龄SPF鸡20只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另10只作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，用琼扩试验检测Ⅰ群4型禽腺病毒抗体，记录抗体结果。
2取21～28日龄SPF鸡20只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另10只作对照。接种后21～28日，所有免疫鸡和对照鸡，肌肉注射Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株病毒液(约含105.5TCID50/0.1ml)，每只0.2ml。观察并详细记录免疫鸡和对照鸡的发病情况。
试验结果：琼扩试验检测Ⅰ群4型禽腺病毒抗体，免疫组至少8只阳性，对照组全部阴性。对照鸡攻毒后7日内发病至少8只，免疫鸡攻毒后观察14日，保护至少8只。显示该毒株具有良好的免疫保护效果。
实施例7 Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株稳定抗原的制备及稳定性试验
将Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株接种鸡肝细胞培养，收获细胞培养物，经甲醛溶液灭活后，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成。该抗原在使用和储备时不存在散毒的危险，减少了因为使用活病毒抗原而对环境和人体的危害，该产品具有很好的稳定性，在2～8℃条件下，保存12个月以上该产品效价不变，可用于Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗体的检测。
而且，用YBAV-4株制备的毒病灭活疫苗对于YBAV-4株的攻毒的免疫效果明显好于市售的Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗，推测是由于YBAV-4株基因发生变异导致的。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种Ⅰ群4型禽腺病毒，其特征在于，所述的病毒的保藏编号为：CCTCC No.V 201541。
2.权利要求1所述的病毒在制备疫苗中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗。
4.权利要求1所述的病毒在制备Ⅰ群4型禽腺病毒检测用的琼扩抗原试剂中的应用。
5.权利要求1所述的病毒在制备Ⅰ群4型禽腺病毒检测用阳性血清试剂中的应用。
6.权利要求1所述的病毒在制备Ⅰ群4型禽腺病毒治疗用抗血清试剂中的应用。
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