CN102220287B - 鸡传染性支气管炎冷适应致弱疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鸡传染性支气管炎冷适应致弱疫苗株及其应用。本发明将传染性支气管炎病毒野生强毒株进行连续低温冷适应传代致弱培养，获得一株具有良好免疫保护效力的冷适应弱毒疫苗株，其微生物保藏号是：CGMCC No.4711。免疫效力评价实验表明，本发明冷适应致弱疫苗株具有良好的免疫保护性，主动免疫保护率为80％以上，被动免疫在9天内可以获得90％以上的保护，对鸡传染性支气管炎具有良好的保护效力，可有效保护鸡抵抗传染性支气管炎病毒强毒的攻击。安全性试验表明，本发明冷适应弱毒活疫苗对雏鸡和产蛋种鸡安全，无副反应，安全性好。本发明冷适应致弱疫苗株可应用于制备成防治鸡传染性支气管炎病毒的单苗或联苗等。

Description

鸡传染性支气管炎冷适应致弱疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及弱毒活疫苗株，尤其涉及鸡传染性支气管炎冷适应弱毒活疫苗株及其应用，属于鸡传染性支气管炎的防治领域。

背景技术

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的一种急性、高度接触传染性、病毒性呼吸道疾病，其特征是：病鸡咳嗽、打喷嚏、气管啰音；肾脏肿大、苍白，输尿管扩张、有大量尿酸盐沉积，外观呈现典型的“花斑肾”。

鸡传染性支气管炎于1930年在美国北达科塔州首次发现，1931年由Schalk和Hawn首次报道。早期的研究表明，鸡传染性支气管炎病毒主要侵害雏鸡的呼吸道(呼吸型IB)，也危害育成鸡和产蛋鸡群，使之抵抗力降低、产蛋量及蛋的品质下降。1962年Winterfield和Hitchner在美国报道了致肾脏病变型IB的出现。1956年Jungherr报到了1951年分离的康涅狄格株(Connecticut，以下简称Conn)和1941年分离的马萨诸塞株(Massachusetts，以下简称Mass)可引起类似的疾病，但不能交叉保护或交叉中和，从而证明IBV不只一个血清型。

中国在1953年就有呼吸型IB发生的报道，1972年邝荣禄在广东首次确诊IB在中国的存在。目前，IBV在中国大部分地区流行，而且在中国免疫鸡群和非免疫鸡群中有新基因型的肾致病性IBV在流行。

IBV对所有日龄的鸡均可感染，但感染主要侵害1～4周龄的幼鸡和雏鸡，并可引起死亡，随鸡年龄的增长抵抗力逐渐加强。IBV自然感染常在48小时内出现症状，人工接种后从第24小时到第7天始终可从气管、肾、法氏囊中分离出病毒。雏鸡感染后症状严重，死亡率取决于病毒的毒力及鸡群的抵抗力，一般死亡率为20％～30％。本病主要通过呼吸道排毒，传播速度快，距离远，往往整栋鸡舍同时发病。此外，IBV还可通过泄殖腔传播。IBV能够在呼吸道、肠道、肾脏和输卵管等组织器官中复制。上呼吸道是IBV复制的主要部位，通常不论分离株来自何种组织，都可感染鸡的呼吸道并在气管中产生特征性病变。随后出现病毒血症，病毒从上呼吸道广泛分布到其它组织。传统的呼吸型IB，感染病鸡的临床症状以咳嗽、喷嚏和气管发生罗音等呼吸道表现为主。致肾病变型IBV，病鸡临床剖检主要表现为肾苍白肿大，严重者出现典型的“花斑肾”，有大量的尿酸盐沉积，最后常因肾衰竭而死亡。目前，致肾病变型IBV已成为危害养鸡业的重要病原。

免疫接种是防治该病的最有效手段。目前，市场上已经有一些弱毒疫苗在临床上应用，但由于IBV血清型众多，且流行毒株与疫苗株相比在基因水平上存在较大变异，致使现有的疫苗株不能够有效防制IB流行毒株的攻击，IB的防制效果不理想。因此，研究开发新的具有较好保护力的IB弱毒疫苗显得尤为重要。

发明内容

本发明主要所要解决的技术问题是克服现有疫苗株不能够有效防制鸡传染性支气管炎病毒流行毒株的攻击，防制效果不理想等缺陷，提供一株新的鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗株，该弱毒疫苗株能够有效抵抗传染性支气管炎病毒的攻击，可提供良好的免疫保护效力。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

本发明将传染性支气管炎病毒野生强毒株进行连续低温冷适应传代致弱培养，最终筛选获得一株具有良好免疫保护效力的鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗株(LDL70-C株)，其微生物保藏号是：CGMCC No.4711；分类命名：传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitis Virus)；保藏时间是2011年3月28日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

本发明鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗株(LDL70-C株)的形态学观察：LDL70-C株病毒尿囊液经离心、磷钨酸负染后在电镱下可见到直径经为80-120nm的冠状毒，毒病毒粒子呈多形性，多数为圆形，有囊膜，表面有呈松散、均匀排列的冠状突起。

本发明冷适应弱毒疫苗株免疫效力评价实验表明，本发明LDL70-C株(P70代毒)具有良好的免疫保护性，主动免疫保护率为80％以上，被动免疫在9天内可以获得90％以上的保护，说明本发明毒株对鸡传染性支气管炎具有良好的保护效力。可有效保护鸡抵抗传染性支气管炎病毒强毒的攻击。安全性试验结果表明，本发明鸡传染性支气管炎冷适应弱毒活疫苗(LDL70-C株)对雏鸡和产蛋种鸡安全，无副反应，安全性好。

由于冷适应弱毒疫苗株LDL70-C株是由野生型毒株LDL091022在鸡胚持续逐级降温培育驯化而获得的子代毒株，参照本发明说明书中实施例1中的方法，本领域普通技术人员将能应用常规方法从LDL70-C株培育和分离子代亚克隆毒株，另外，公开的毒株进一步传代或利用不同条件培养获得毒株均完全在病毒学领域技术人员的普通技能之内，因此，以上LDL70-C株及其子代毒均在本发明范围之内。

本发明冷适应弱毒疫苗株LDL70-C克隆毒株S1基因序列如SEQ ID NO：1所示；其亲本野生毒株LDL091022株的S1基因序列如SEQ ID NO：2所示；与商品化IB疫苗株H120、H52和W93疫苗株S1基因序列和氨基酸序列多重比对如图1和图2所示。以类似本发明公开的方式，从冷适应弱毒疫苗株LDL70-C及亲本毒分离或培育的类似克隆毒株也应在本发明的保护范围之内。另外，S基因是传染性支气管炎病毒的主要保护性基因，能够刺激机体产生中和抗体，S基因也是在病毒演化过程中最容易发生变异的基因，且其高变区主要位于S1基因内，因此本发明主要展示本发明弱毒株的亲本野毒株S1基因序列。本发明冷适应弱毒疫苗株与亲本野毒株进化关系紧密，本领域技术人员可通过培育或分离的子代亚克隆毒株S1基因与亲本毒LDL091022株S1基因的对比，可发现本发明涉及弱毒疫苗毒株的基因序列特征。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种预防或治疗鸡传染性支气管炎的疫苗，该由本发明冷适应弱毒疫苗株LDL70-C株和冻干保护剂组成。

本发明所述的预防或治疗鸡传染性支气管炎疫苗可参考以下方法制备得到：(1)将本发明弱毒疫苗株培养增殖得到生产用毒种；将生产用毒种接种于鸡胚尿囊腔内，培养，收获病毒尿囊液，灭菌；(2)经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒尿囊液与冻干保护剂混合培苗，即得。

其中，步骤(2)中将病毒液与冻干保护剂按照9∶1的体积比进行配苗；所述的冻干保护剂优选主要由蔗糖和明胶组成(8％明胶、40％蔗糖保护剂)。

本发明鸡传染性支气管炎疫苗的使用方法：

(1)接种途径：滴鼻。

(2)接种剂量：1羽份。

本发明鸡传染性支气管炎疫苗免疫后14天产生免疫力，一次免疫持续期为4个月。本发明弱毒株除了作为单苗使用外，还可用于制备联苗等。

附图说明

图1本发明弱毒株(LDL70-C)克隆及其亲本野毒株S1基因与IBV H120、H52、W93株和LDT3-A株S1基因核苷酸序列比对。

图2本发明弱毒株(LDL70-C)克隆及其亲本野毒株S1蛋白与IBV H120、H52和W93株S1蛋白的氨基酸序列比对。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验例1 本发明鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗株LDL70-C株的培育及鉴定

1 材料与方法

1.1 病毒株LDL091022的冷适应传代致弱

使用9-10日龄SPF鸡胚对IBV强毒株LDL091022株进行连续低温冷适应传代培养，每个代次通过尿囊腔接种3枚鸡胚，每胚接种100μL，培养条件为：从35℃开始每10代降低1℃，每代次孵育72h，72h后，将鸡胚取出，观察鸡胚病变情况，无菌收集鸡胚尿囊液，进行下一次传代，传代至孵育温度到30℃，后期传代均为30℃培养，连续传至70代。

1.2 病毒滴度测定

取LDL091022P2、P10、P20、P30、P40、P50、P60和P70代次毒的鸡胚尿囊液，分别依次作10倍系列稀释；选择4个稀释倍数(10⁴～10⁷或10⁵～10⁸)的病毒悬液分别接种5枚9～10日龄的SPF鸡胚，每枚鸡胚接种100μL，将鸡胚置37℃温箱内孵育1周，每天照胚，记录1周内鸡胚的感染数和生存数，按Reed-Muench法计算EID₅₀。

1.3 无菌检验和支原体检验

分别将LDL091022株在鸡胚传代过程中的P2、P10、P30、P40、P50、P60和P70代次毒按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验和支原体检验。

1.4 外源病毒检验

分别将LDL091022株在鸡胚传代过程中的P2、P10、P30、P40、P50、P60和P70代次毒进行外源病毒检测。

1.4.1 用鸡胚进行外源病毒检测(病毒的特异性检验)

取病毒样品LDL091022株P2、P10、P30、P40、P50、P60和P70代次毒，稀释成每剂量1×10^2.0EID₅₀/0.1ml，与抗传染性支气管炎病毒特异性抗血清混合，进行中和，取9～10日龄SPF鸡胚10枚，每枚鸡胚尿囊腔接种病毒样品悬液0.2ml，另取9～10日龄SPF鸡胚10枚，每枚鸡胚尿绒毛尿囊膜接种病毒样品悬液0.2ml，同时设正常对照组，孵化7日，每日照胚，接种后24小时内的死亡鸡胚为非特异性死亡，弃去不计，每组存活至少8枚鸡胚，对所有接种24小时后存活的鸡胚进行检查，观察有无异常。对绒毛尿囊膜进行观察，检查有无异常，并对尿囊液进行血凝抗原检测。

1.4.2 用细胞培养物进行外源病毒检测

取病毒样品1×10^2.0EID₅₀/0.1ml，与抗传染性支气管炎病毒特异性抗血清混合，进行中和，取2个方瓶(100ml容量)的鸡胚成纤维细胞(CEF)，接种中和后的病毒液0.2ml，在37℃下吸附1小时，观察5日，检查是否出现由接种物引起的CPE；用鸡红细胞进行血吸附试验，弃去培养液，并洗涤单层细胞，加入5％红细胞悬液，在4℃吸附60分钟，用缓冲液洗涤2次细胞后，在显微镜下观察，是否出现CPE和血吸附现象。

1.4.3 COFAL试验(禽白血病病毒检验)

取病毒样品，制备成每剂量5×10^5.5EID₅₀/0.2ml，取2个方瓶(100ml容量)的鸡胚成纤维细胞(CEF)，各接种病毒样品0.2ml，吸附30分钟，弃去培养液，加入细胞生长液，次日换成维持液。同时设立正常细胞和培养液作为对照。培养5～7日，按常规方法收获细胞，其中1/2作标记置-70℃检验用(P1)，其余细胞分在两个瓶中，培养7日后，按同样方法收获细胞，留样(P2)，如此继续传第3代，收获细胞(P3)，所有对照同样处理。将P1、P2、P3和所有对照冻融3次。同时设立阳性对照按照“中华人民共和国兽用生物制品质量标准”对每份样品进行COFAL试验。

1.5 LDL091022的致弱评价

180只1日龄的SPF鸡随机分为9组(每组20只)，分别将9组鸡饲养于9个负压隔离器中，雏鸡自由采食及饮水。在10日龄时，1～8组雏鸡分别用鸡胚代次毒P2(10^4.7EID₅₀)、P10(10^4.8EID₅₀)、P20(10^5.2EID₅₀)、P30(10⁵EID₅₀)、P40(10^4.8EID₅₀)、P50(10^4.8EID₅₀)、P60(10^4.9EID₅₀₎和P70(10⁵EID₅₀)进行接种，每只滴鼻100μL；第9组雏鸡作为对照组，每只滴鼻100μL正常尿囊液。自接种之日起，每日观察、记录接种鸡群的发病情况、死亡情况，对死亡鸡进行剖检，观察IBV靶器官、组织的病理变化并于接种后14日，使用同源强毒LDL091022 P3(10^5.68EID₅₀)进行攻击，每只滴鼻点眼100μL；攻毒后，每日观察、记录鸡群的发病情况、死亡情况，对死亡鸡进行剖检，观察IBV靶器官、组织的病理变化。

2 实验结果

2.1 LDL091022的传代致弱

随着对LDL091022病毒传代次数的增加，其对鸡胚的适应性越来越强，鸡胚死亡率逐渐升高，死亡时间逐渐缩短，鸡胚病变也更加明显。接种病毒的鸡胚呈现明显发育障碍(侏儒胚)，蜷曲成球形，胚体出血，羊膜水肿增厚，紧贴胚体等典型的传染性支气管炎病毒感染的变化。每个代次的鸡胚尿囊液均不能凝集鸡外周血红细胞，说明鸡胚尿囊液中不含能使鸡外周血红细胞凝集的禽的其它病毒，如正粘病毒、副粘病毒或腺病毒等。将LDL091022P2、P10、P20、P30、P40、P50、P60和P70代次毒的鸡胚尿囊液经离心、磷钨酸负染后在电镜下均可见到直径约为80-120nm典型的冠状病毒，病毒粒子呈多形性，多数为圆形，有囊膜，表面有呈松散、均匀排列的冠状突起，而且未观察到有其它病毒。含有LDL091022 P2、P10、P30、P40、P50、P60和P70代次毒的鸡胚尿囊液通过RT-PCR扩增得到的产物，经0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，结果发现与预期扩增核酸片断大小相符的特异性条带，而在阴性对照中未见此条带。

2.2 病毒滴度测定结果

LDL091022毒株可高度适应鸡胚，P2代的EID₅₀高达10^6.68/0.1ml，传代后病毒滴度逐渐升高，P25～P80代≥10⁷EID₅₀/0.1ml，P100～P120趋于稳定，滴度约为10⁷EID₅₀/0.1ml。

表1 LDL091022鸡胚冷适应传代毒滴度测定结果

2.3 无菌检验和支原体检验

鸡胚传代过程中的P2、P10、P30、P40、P50、P60和P70代次毒经检验无细菌、霉菌和支原体污染。

2.4 外源病毒检验

鸡胚传代过程中的P3、P10、P25、P50、P80、P100、P110和P120代次毒经检验无外源病毒的污染。

2.5 LDL091022不同代次毒的致弱评价

LDL091022毒株在鸡胚上连续传代后对SPF雏鸡的致病力在F50-F60之间减弱(见表2)。P2、P10、P20、P30代毒对SPF雏鸡发病率均为100％，死亡率均在3/20至16/20。P40、P50代毒对SPF雏鸡发病率减少为15-50％之间，但仍然维持死亡率1/20。发病鸡表现为精神沉郁、缩脖、拱背、被毛粗乱、两翅下垂、张口呼吸等症状。病死鸡剖检可见气管出血，两侧肾脏肿大，纹理清晰，外观呈现典型的“花斑肾”，有尿酸盐沉积，部分鸡只盲肠扁桃体肿大、出血。所有对照组鸡接种阴性尿囊液后状态良好，无发病或死亡。而P60和P70代毒对SPF雏鸡发病率和死亡率则均为0％。剖检未见气管出血，肾脏肿大等特异性病理变化，与接种阴性尿囊液后的SPF鸡一致。

本发明选取P70(LDL70-C株)作为疫苗研制的候选毒株。将P70(LDL70-C株)毒株提交保藏，微生物保藏号是：其微生物保藏号是：CGMCC No.4711；分类命名：传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)；保藏时间是2011年3月28日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

表2 LDL091022不同代次毒对SPF雏鸡的致病力

实验例2 本发明冷适应弱毒疫苗株LDL70-C株的免疫效力及保护效果实验

1、实验方法

1.1 LDL70-C的免疫效力初步评价

1.1.1 10日龄SPF鸡免疫效力试验

40只1日龄SPF鸡随机分为2组(每组20只)，分别饲养于负压隔离器中，雏鸡自由采食及饮水。10日龄时，其中一组雏鸡使用LDL70-C(P70，10⁴EID₅₀)进行接种，每只滴鼻100μL；另一组雏鸡则作为对照组，每只滴鼻100μL正常尿囊液。自接种之日起，每日观察、记录接种鸡群的发病情况、死亡情况，并于免疫后14天，对每组采集血清进行特异性抗体检测，具体方法参照传染性支气管炎病毒抗体检测试剂盒说明书进行；同时将2组雏鸡用同源强毒LDL091022 P2(10⁶EID₅₀/0.1ml)进行滴鼻攻击，每只100μL；攻毒后，每日观察、记录鸡群的发病情况、死亡情况。

1.1.2 3日龄SPF鸡免疫效力试验

方法同1.1.1，SPF鸡日龄为3日龄。

1.2.LDL70-C对雏鸡气管和肾脏的保护试验

试验1.1.1中攻毒后第5天，将2组鸡各处死5只，观察脏器病变情况，采集肾脏及气管，进行病毒分离及RT-PCR检测。

2、实验结果

2.1 LDL70-C免疫效力的初步评价

2个不同日龄的免疫组，在免疫后14天，采集鸡只血清样品，应用间接ELISA试剂盒检测发现，接种过LDL70-C的鸡只血清样品全部转为IBV抗体阳性，而对照组鸡血清样品均为阴性。使用同源强毒LDL091022 P2(10⁶EID₅₀)对免疫组及对照组鸡攻击后观察5天，发现免疫组鸡状态良好，无发病症状；而对照组发病明显，表现为精神沉郁、拱背、被毛粗乱、两翅下垂、张口呼吸等症状，且在攻毒后约30％(6-7/20)鸡死亡。

表3 LDL70-C的免疫效力评价

2.2 LDL70-C对雏鸡气管和肾脏的保护效果

攻毒后第5天剖检鸡发现免疫组雏鸡脏器无眼观病理变化，对照组雏鸡可见气管出血，两侧肾脏肿大，纹理清晰，外观呈现“花斑肾”变化，个别雏鸡有尿酸盐沉积及盲肠扁桃体出血。通过RT-PCR方法，免疫各组都有1只免疫鸡的肾脏和气管中检测出IBV病毒核酸片断，而对照组鸡肾脏及气管检测结果均为阴性。

表4 对雏鸡气管和肾脏的保护效果

实验例3 鸡传染性支气管炎弱毒疫苗的制备

取本发明弱毒疫苗株(LDL70-C株)，培养条件恢复至37℃，增殖生产用毒种，用灭菌生理盐水稀释生产用毒种10万倍，接种于9～10日龄SPF鸡胚尿囊腔内，每胚接种0.1ml，接种后密封针孔，置37℃孵育。鸡胚接种24小时照胚，弃去死胚，将于37℃条件下孵育30～72小时的鸡胚气室向上，置于4℃冷却4～24小时。收获病毒尿囊液，将若干个鸡胚尿囊液混合为一组，置灭菌瓶中，在2～8℃保存，同时做无菌检验，同时测得病毒含量应≥10^6.0EID₅₀/0.1ml。

经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒尿囊液混合后再与蔗糖明胶保护剂按9∶1(病毒液∶保护剂)配苗，冻干保护剂以40℃～50℃为宜(8％明胶、40％蔗糖保护剂，经115℃高压灭菌40分钟，放4℃保存，72小时内用完)。在添加过程中应不断摇动病毒液，充分混合均匀后，即为疫苗原液。将疫苗原液无菌定量分装，迅速冷冻真空干燥，加盖密封。

实验例4 本发明冷适应弱毒疫苗株(LDL70-C株)免疫效力实验

1 实验材料

试验用疫苗：按照试验例3的方法分5个批次制备了5批次疫苗，批号分别为：2009001、2009002、2009003、2009004、2009005。1000羽份/瓶。疫苗保存条件及有效期：-20℃保存，有效期为12个月。

用法与用量按瓶签标注羽份用生理盐水稀释，用滴管吸取疫苗，每只鸡滴鼻一滴(约0.03～0.05ml)。

2 实验方法

2.1 主动免疫试验

将1～5组3日龄SPF雏鸡分别接种5批次疫苗，每只滴鼻接种1个使用剂量(约0.03～0.05ml)。第6组3日龄SPF鸡每只滴鼻一滴灭菌生理盐水。免疫后14日，6组鸡滴鼻方法攻击10^6.0EID₅₀的LDL091022株强毒，观察14日，记录发病和死亡情况。

2.2 被动免疫试验

将1～5组16～22周龄AA种鸡分别接种5批次疫苗，每只滴鼻接种1个使用剂量(约0.03～0.05ml)。第6组种鸡每只滴鼻一滴灭菌生理盐水。免疫14日后，每组随机取鸡胚100枚进行孵化，每组取孵化的小鸡60只分别于7天、9天和14天测定母源抗体并滴鼻方法攻击10^6.0EID₅₀的LDL091022株强毒，观察14日，记录发病和死亡情况。

3 实验结果

3.1 主动免疫试验

各批疫苗免疫组免疫14日后，以强毒攻击，其中生理盐水对照组全部发病，均出现精神萎靡，羽毛松乱等传染性支气管炎临床症状，在观察期内有7/20死亡，解剖发现均有肾脏肿大，“花斑肾”特异病变。而疫苗免疫组中以2009001批次疫苗免疫的鸡有1只鸡出现一过性精神不振症状，1～2天内恢复正常，观察至14天解剖所有鸡，免疫组鸡均未发现特异性病理变化。由此来看，免疫保护率均可达到80％(19/20)以上，大部分疫苗批次保护率达到100％(20/20)，详细结果见表5。

表5 鸡传染性支气管炎活疫苗主动免疫效力试验数据

表6 鸡传染性支气管炎活疫苗(LDL70-C株)的被动免疫试验结果

3.2 被动免疫试验

LDL70-C疫苗免疫健康AA种鸡所产鸡蛋孵化的雏鸡均能够在9天内获得保护作用，攻毒保护率在90％以上。抗体检测结果显示，虽然检测结果仍然保持阳性，但是母源抗体在持续下降过程中对强毒攻击的保护率在逐渐降低。这可能一方面与传染性支气管炎主要以上呼吸道局部免疫为主，另一方面在免疫类型方面以细胞免疫为主，以体液免疫为辅有关。

抗体检测结果与攻毒保护结果见表2。

实验结果表明，主动免疫保护率为80％以上，被动免疫在9天内可以获得90％以上的保护，说明本发明毒株对鸡传染性支气管炎具有良好的保护效力。

实验例5 本发明冷适应弱毒疫苗株安全性实验

1 实验材料

试验用疫苗：按照试验例3的方法分5个批次制备了5个批次疫苗，5个批次的批号分别为：2009001、2009002、2009003、2009004、2009005，1000羽份/瓶。疫苗保存条件及有效期：-20℃保存，有效期为12个月。

用法与用量按瓶签标注羽份用生理盐水进行适当稀释，用滴管吸取疫苗，每只鸡滴鼻途径接种。

2 实验方法

2.1 SPF鸡安全试验

2.1.1 单剂量接种试验

单剂量接种安全试验用100只3日龄雏鸡，每批疫苗使用20只，另设对照组鸡20只，试验组滴鼻接种疫苗1羽份，对照组滴鼻等量的生理盐水，观察14日；剖检，观察是否出现鸡传染性支气管炎特异病变如：部分发病鸡气管、鼻窦内有浆液性或卡他性分泌物，有些鸡盲肠扁桃体有明显的出血点，多数鸡肾脏出现肿胀，质地很脆，出现典型的“花斑肾”变化。

2.1.2 单剂量重复接种试验

单剂量重复接种安全试验用100只3日龄雏鸡，每批疫苗使用20只，另设对照组鸡20只，试验组滴鼻接种疫苗1羽份，每只鸡于14天后重复滴鼻接种相同剂量的疫苗。对照组滴鼻等量的生理盐水，观察14日；剖检，观察是否出现鸡传染性支气管炎特异病变。

2.1.3 大剂量接种组试验

大剂量接种试验共用100只3日龄SPF雏鸡，每批疫苗使用20只，另设对照组鸡20只，将疫苗稀释至10羽份/0.1ml的剂量，试验组滴鼻接种稀释好的疫苗0.1ml，对照组注射等量的生理盐水，观察14日。剖检，观察是否出现鸡传染性支气管炎特异病变如。

2.2 AA种鸡的安全试验

2.2.1 单剂量接种试验

单剂量接种安全试验用60只AA种鸡，每批疫苗使用10只，对照组鸡10只，试验组滴鼻接种疫苗1羽份，对照组滴鼻等量的生理盐水，观察30日，期间测定其产蛋数及孵化率等指标。

2.1.2 单剂量重复接种试验

单剂量重复接种安全试验用60只AA种鸡，每批疫苗使用10只，对照组鸡10只，试验组滴鼻接种疫苗1羽份，每只鸡于14天后重复滴鼻接种相同剂量的疫苗。对照组滴鼻等量的生理盐水，观察30日，期间测定其产蛋数及孵化率等指标。

2.1.3 大剂量接种组试验

大剂量接种试验共用60只AA种鸡，每批疫苗使用10只，另设对照组鸡10只，将疫苗稀释至10羽份/0.1ml的剂量，试验组滴鼻接种稀释好的疫苗0.1ml，对照组注射等量的生理盐水，观察30日，期间测定其产蛋数及孵化率等指标。

3 实验结果

3.1 SPF雏鸡安全试验

从SPF雏鸡单剂量接种试验、单剂量重复接种试验、大剂量试验结果来看，鸡传染性支气管炎活疫苗对3日龄的SPF雏鸡安全可靠，生理活动正常，剖检无传染性支气管炎特异病变；证明了该疫苗对疫苗推荐最小日龄鸡安全可靠，鸡的采食、饮水、日常活动不受影响。试验组和对照组试验数据无明显差异。试验数据详见表7、表8和表9。

表7 鸡传染性支气管炎活疫苗雏鸡单剂量接种安全试验

表8 鸡传染性支气管炎活疫苗雏鸡单剂量重复接种安全试验

表9 鸡传染性支气管炎活疫苗雏鸡大剂量安全试验

3.2 AA种鸡安全试验 从AA种鸡单剂量接种试验、单剂量重复接种试验、大剂量试验结果来看，鸡传染性支气管炎活疫苗对种鸡安全可靠，生理活动正常，鸡的采食、饮水、日常活动不受影响。试验组和对照组试验产蛋数及孵化率无明显差异。试验数据详见表10、表11和表12。

表10 鸡传染性支气管炎活疫苗种鸡单剂量接种安全试验

表11 鸡传染性支气管炎活疫苗种鸡单剂量重复接种安全试验

表12 鸡传染性支气管炎活疫苗种鸡大剂量安全试验

4 实验结论

4.1 本发明鸡传染性支气管炎冷适应弱毒活疫苗(LDL70-C株)对雏鸡是安全的。

4.2 本发明鸡传染性支气管炎冷适应弱毒活疫苗(LDL70-C株)对产蛋种鸡是安全的。

实验例5 本发明冷适应弱毒疫苗株免疫持续期实验

1 材料和方法

1.1 疫苗 按照实验例3所述的方法制备的鸡传染性支气管炎活疫苗：批号为2009001。

1.2 试验用鸡 3日龄SPF雏鸡。

1.3 攻击用强毒 LDL091022株强毒(10^6.0EID₅₀/0.1ml)由哈尔滨兽医研究所分离、鉴定、保存和供应。

1.4 ELISA抗体检测试剂盒 购自美国IDEXX公司。

1.5 实验动物分组 3日龄SPF雏鸡180只，随机分为18组，其中免疫组9组，对照组9组。

1.6 免疫 用疫苗免疫3日龄其中9组SPF雏鸡90只，作为免疫组。免疫组免疫疫苗的剂量为一个羽份，对照组鸡滴鼻0.1ml生理盐水。

1.7 免疫后抗体动态监测 免疫组和对照组鸡在免疫后5、7、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150日采血，用ELISA抗体检测试剂盒检测抗体滴度，统计结果。

1.8 不同时期免疫保护监测 9组免疫鸡分别于免疫后第5、7、10、20、30、60、90、120、150天进行攻毒试验，在不同时间分别与一组对照鸡10只滴鼻方法攻击10^6.0EID₅₀的LDL091022株强毒，分别观察14日，记录发病情况，统计结果，结合抗体检测结果得出疫苗免疫提供的免疫保护持续期。

2 实验结果

2.1 抗体持续期 2009001批次疫苗以1羽份的剂量免疫雏鸡后10日，即可用ELISA方法检出部分免疫鸡血清抗体，抗体阳性率达到5/10，疫苗免疫后14天抗体阳性率达到8/10，疫苗免疫后20～120天抗体阳性率维持在8/10以上，免疫后150天抗体阳性率则下降至8/10(见表13)。

2.2 攻毒保护率 免疫后第5、7、10、20、30、60、90、120、150天通过攻毒发现，免疫组在免疫后10天攻毒保护率达到6/10，免疫后14天攻毒保护率达到8/10以上，免疫后20～120天攻毒保护率均可达到8/10以上，免疫后150天攻毒保护率仍达到9/10(见表14)。

表13 免疫持续期雏鸡攻毒保护结果(2006001批次)

表14 2006001批次疫苗诱导的抗体滴度

3 实验结论 本发明疫苗免疫持续期为4个月。

Claims (4)

1.鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗LDL70-C株，其特征在于：其微生物保藏号是CGMCC No.4711。

2.权利要求1所述的鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗LDL70-C株在制备预防或治疗鸡传染性支气管炎药物中的用途。

3.一种防治鸡传染性支气管炎的疫苗组合物，由权利要求1所述的鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗LDL70-C株和药学上可接受的冻干保护剂组成。

4.按照权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于：所述的冻干保护剂主要由蔗糖和明胶组成。

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