CN103397002A - 禽传染性支气管炎病毒的致弱方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种禽传染性支气管炎病毒的致弱方法，包括以下步骤，毒株YX10接种SPF鸡胚，每胚接种10^3.5-4EID₅₀/0.2mL，培养一定时间后，将鸡胚置于-20℃半小时后，无菌收集尿囊液，进行下一代次传代；第1代-第10代培养温度为37℃，培养时间为48小时；第11代-第14代培养温度每一代降低1℃，培养时间为48小时；从第15代起培养温度为32℃，培养时间为32-48小时。本发明禽传染性支气管炎病毒的致弱方法可以有效的节省传代时间，减少免疫原性的丢失；有利于及时、有效研制出新型疫苗。

Description

禽传染性支气管炎病毒的致弱方法

技术领域

本发明涉及病毒的致弱方法，尤其涉及一种鸡传染性支气管炎病毒的致弱方法。

背景技术

禽“肾型”传染性支气管炎，是禽传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis)的一种病理表现形式，以呼吸道和肾脏病变相结合的一种急性、高度接触性传染性疾病；其特征为病鸡呼吸道症状、产蛋数量和品质下降、肾病变，幼雌鸡感染可引起输卵管永久性退化。

禽传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)可感染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低；还常常引起霉形体混合感染以及大肠杆菌等继发感染而提高鸡群的死亡率，给养鸡生产带来巨大损失。目前，该病广泛分布于世界各养禽国家和地区，如北美洲、南美洲、西欧、非洲、中国、澳大利亚和新西兰等，是严重危害世界养禽业的重大传染病之一。在我国禽传染性支气管炎的感染率可达80-100％，产蛋率可下降50-70％，死亡率可达10-50％，造成的经济损失每年可超过十亿元。该病是继鸡新城疫、鸡马立克氏病、鸡传染性法氏囊病之后，又一严重危害我国养禽业的烈性传染病。

IBV是冠状病毒科冠状病毒属的代表种，基因组为单股正链RNA。病毒形态为近球形，直径80-120nm，具有囊膜，囊膜表面有棒状纤突，长约20nm。IBV的主要结构蛋白S蛋白、M蛋白和N蛋白的分子摩尔比为1:6:15。I其病毒粒子的结构由内部的基因组与N蛋白结合成螺旋状、外面包括一层由M蛋白构成囊膜，花瓣状或梨状的S蛋白铆定在囊膜并伸展出来形成突起。目前研究最多的是S蛋白。S蛋白(180KD)位于病毒的最外面，构成病毒的纤突。它在宿主细胞内可被裂解为等摩尔的S1(90KD)、S2(84KD)亚单位。目前研究表明，与M、N蛋白相比，S蛋白进化活跃，变异主要发生在S1上。S蛋白是IBV最重要的保护性抗原，决定IBV的血清型及组织嗜性，其作用表现为刺激机体产生中和抗体，在病毒吸附细胞过程中发挥作用，在血清学分类上起决定性作用。其中，S1蛋白在病毒吸附过程中发挥重要作用，其与宿主细胞膜上糖蛋白受体的结合是IBV吸附细胞的前提条件；S1诱发血凝抑制抗体和多数中和抗体；且S1蛋白的氨基端在决定IBV毒株的组织亲和性及其毒力方面具有一定作用。

目前国内外均有关于IBV连续传代致弱的相关报道，但是基本上均采取接胚后于37℃的环境下进行病毒的繁殖，且传代过程中各代次均使用相同的培养时间或者培养时间不明确。现有技术中的致弱方法致弱速度慢，不但浪费了大量的人力、财力、时间，而且容易使病毒丧失免疫原性，从而无法对我国禽业生产起到及时的保护作用。

发明内容

有鉴于此，有必要针对禽传染性支气管炎病毒在常规温度连续传代培养中致弱速度慢的问题，提供一种禽传染性支气管炎病毒的致弱方法。

一种禽传染性支气管炎病毒的致弱方法，包括以下步骤，毒株YX10接种SPF鸡胚，每胚接种10^3.5-4EID₅₀/0.2mL，培养一定时间后，将鸡胚置于-20℃半小时后，无菌收集尿囊液，进行下一代次传代；第1代-第10代培养温度为37℃，培养时间为48小时；第11代-第14代培养温度每一代降低1℃，培养时间为48小时；从第15代起培养温度为32℃，培养时间为32-48小时。

优选地，所述SPF鸡胚在相应培养温度孵育8-12小时后再进行接胚。

优选地，第15代-第60代培养时间为40-48小时，从第61代起培养时间为32-42小时。

更优选地，第15代-第60代培养时间为44小时，从第61代起培养时间为36小时。

更优选地，第15代-第60代培养时间为48小时，从第61代起培养时间为40小时。

更优选地，第15代-第60代培养时间为40小时，从第61代起培养时间为32小时。

随着代次的增加，病毒的最适培养时间减少，第60代之前的最佳培养时间为44小时，第61代之后的最佳培养时间为36小时。这是因为随着病毒传代次数的增加，病毒对鸡胚逐渐适应，从而可以对鸡胚产生越来越明显的病变，导致鸡胚中尿酸盐沉积。为了能够收集到清亮的尿囊液，需要我们及时地对鸡胚接毒后的孵育时间进行调整。

本发明禽传染性支气管炎病毒的致弱方法，先在常温下对病毒进行传代培养，以使病毒适应鸡胚并进行大量繁殖；再在较低温度下对禽肾型传染性支气管炎进行连续传代致弱，可以有效的节省传代时间，减少免疫原性的丢失；经过多次传代后，毒株的基因型依然高度保守；在产生相同的基因缺失的前提下明显缩短毒株的致弱时间，提高弱毒苗的研发效率，从而为禽病防控起到更加及时有效的防控作用。

附图说明

图1感染禽肾型传染性支气管炎病毒毒株YX10的典型症状。图1A所示为典型的肾脏肿大，图1B所示为典型的尿酸盐沉积，图1C所示为轻微的气管出血，图1D所示为气囊炎，图1E所示为典型的肾脏肿大及尿酸盐沉积。

图2D90与Y90在3’-UTR共同缺失的基因序列分析图。

图3D90在S处插入的基因序列分析图。

图4Y90在1b处缺失的基因序列分析图

具体实施方式

为了更好的说明本发明，下面结合具体实施方式和附图作进一步说明。为了是描述更加简洁，本领域技术人员所熟知的方法、步骤、条件等不再一一赘述。

本发明采用的鸡胚为9～11日龄的SPF鸡胚；使用的毒株为禽肾型传染性支气管炎病毒毒株YX10，该毒株为发明人于2010年于浙江湖州分离得到。禽肾型传染性支气管炎病毒毒株YX10已于2012年12月发表于Journal of Virology（Complete Genome Sequence of a Recombinant Nephropathogenic InfectiousBronchitis Virus Strain in China，Yu Xue et al.,J.Virol.2012,86(24):13812）。禽肾型传染性支气管炎病毒毒株YX10在NCBI上的序列号为JX840411。

H120疫苗株为市购疫苗株厂家为青岛宝依特公司，第一次攻读的计量是5羽份即5×10^3.5EID₅₀。

下文中“D”代表在37℃培养，其后数字代表培养代数，如“D5”代表在37℃培养的第5代，“D58”代表在37℃培养的第58代，其他依此类推。“Y”代表在32℃培养，其后数字为从第1代开始算起的培养代数，如“Y58”代表先在37℃培养10代，梯度降温培养4代，再在32℃培养的第44代，其他依此类推。

常规传代（37℃培养）：采用SPF鸡胚对毒株YX10进行连续传代致弱。每个传代代次病毒通过10倍倍比稀释100倍后经尿囊腔接种SPF鸡胚3枚，每胚接种0.2mL，置37℃培养箱中培养48小时后，将鸡胚置于-20℃半小时，随后无菌收集尿囊液再进行下一代次传代。

在常规传代或使用本发明致弱方法的过程中，若鸡胚在24小时内死胚，需弃去24小时内死胚；若鸡胚在24～48小时内死亡，则取出置于4℃保存，并将其随48小时后仍未死亡的鸡胚一起置于-20℃半小时，随后无菌收集尿囊液再进行下一代次传代。

实施例1连续传代致弱

一种禽传染性支气管炎病毒的致弱方法，将毒株YX10按照10倍倍比稀释100倍后，接种已在相应培养温度孵育10小时的SPF鸡胚3枚，每胚接种103.5-4EID50/0.2mL，培养一定时间后，将鸡胚置于-20℃半小时后，无菌收集尿囊液，进行下一代次传代；第1代-第10代培养温度为37℃，培养时间为48小时；第11代-第14代培养温度每一代降低1℃，即第11代培养温度为36℃，第12代培养温度为35℃，第13代培养温度为34℃，第14代培养温度为33℃，培养时间均为48小时；从第15代起培养温度为32℃，第15代-第60代培养时间为48小时；从第61代起培养时间为40小时。

实施例2连续传代致弱

一种禽传染性支气管炎病毒的致弱方法，将毒株YX10按照10倍倍比稀释100倍后，接种已在相应培养温度孵育12小时的SPF鸡胚3枚，每胚接种10^3.5-4EID₅₀/0.2mL，培养一定时间后，将鸡胚置于-20℃半小时后，无菌收集尿囊液，进行下一代次传代；第1代-第10代培养温度为37℃，培养时间为48小时；第11代-第14代培养温度每一代降低1℃，培养时间为48小时；从第15代起培养温度为32℃，第15代-第60代培养时间为40小时；从第61代起培养时间为32小时。

实施例3连续传代致弱

一种禽传染性支气管炎病毒的致弱方法，将毒株YX10按照10倍倍比稀释100倍后，接种已在相应培养温度孵育8小时的SPF鸡胚3枚，每胚接种10^3.5-4EID₅₀/0.2mL，培养一定时间后，将鸡胚置于-20℃半小时后，无菌收集尿囊液，进行下一代次传代；第1代-第10代培养温度为37℃，培养时间为48小时；第11代-第14代培养温度每一代降低1℃，培养时间为48小时；从第15代起培养温度为32℃，第15代-第60代培养时间为44小时；从第61代起培养时间为36小时。

实施例4毒株YX10不同代次致弱评价

132只14天龄SPF雏鸡随机分成12组（H120、阴性对照组各6只，其余各组均为12只），分别饲养于12个负压隔离器中，所有雏鸡均采取自由采食与饮水。随后1～12组雏鸡分别用鸡胚代次毒D5、D25、D58、D75、D90、D102、Y58、Y75、Y90、Y102、H120、阴性尿囊液进行接种，1～10组及阴性对照组接种剂量为1×10^5.5EID₅₀/0.2mL，H120组接种剂量为5×10^3.5EID₅₀。其中Y58、Y75、Y90和Y102鸡胚代次毒使用实施例3的连续传代致弱方法制得；D5、D25、D58、D75、D90和D102使用常规传代方法制得。自接种之日起，每日观察、记录鸡群的发病情况、死亡情况，对死亡鸡只进行剖检，观察IBV靶器官、组织的病理变化。

实验期间，发病鸡只主要表现为精神沉郁、张口呼吸、缩脖、拱背、被毛粗乱、两翅下垂等症状。病死鸡剖检可见两侧肾脏明显肿大，外观呈典型的“花斑肾”，有大量的尿酸盐沉积；气管有轻微出血，有气囊炎（如图1）。此种病状正是目前对我国危害最为严重的肾型传染性支气管炎的典型特征。

实验结果表明：常规传代方面，D5、D25代次毒对SPF雏鸡的发病率均为100%(12/12)，D58代次毒的发病率为75%(9/12)；这三个代次的死亡率分别为25%(3/12)、16.7%(2/12)、8.3%(1/12)，可以看出无论致病率还是死亡率都是逐步降低的。从D75～D102，各代次毒的发病率、死亡率均为0%(0/12)。32℃传代组方面与常温组的变化趋势相类似，发病率和死亡率均随着传代次数的增多而降低，且发现病毒致弱速度更快，Y58代次毒已经不再引起鸡只的死亡且发病率也较低，Y75代次毒已经不引起鸡只发病。阴性对照组接种生理盐水以及H120对照组接种H120后状态良好，无发病或者死亡。实验结果具体如表1。

表1YX10不同代次毒病毒对14天龄SPF鸡的致病力评估

实施例5YX10不同代次对同源毒株的保护性

实施例4中的12组SPF雏鸡接种不同代次病毒后第15天，使用同源强毒株（D5原液>10⁶EID₅₀）进行攻毒，每日观察、记录鸡群的发病情况、死亡情况，对死亡鸡进行剖检，观察IBV靶器官、组织的病理变化。

根据临床观察，使用同源强毒YX10D5进行攻毒后，常温传代组中除了D102代次免疫的组别中出现了发病和死亡鸡只之外，别的组别均未出现发病和死亡情况。而32℃传代组中Y90代免疫的组别中已经出现了一只鸡死亡，Y58、Y75免疫的两组鸡中均表现正常。进一步证明32℃传代致弱速度快于常规传代。对照组中，H120免疫的组别中显示出75%(3/4)的发病率和25%(1/4)的死亡率；而接种生理盐水的阴性对照组中则显示出了100%(4/4)的发病率和50%(2/4)的死亡率。具体结果如表2。

表2YX10不同代次对同源强毒的保护效力

实施例6YX10不同代次基因型一致性评价

传代过程中，发明人对毒株YX10通过RT-PCR的方式对实施例3和常规传代方法中不同传代代次的S1基因进行了测序，进行同源性比对，从而确保传代过程中毒株的基因型始终保证一致。

通过比对2种传代方法不同代次的S1序列，发现毒株D5（YX10原代）S1序列与各个代次的同源性均很高为99.6%～99.8%。且所有代次的S1序列与标准的QXIBV的S1序列同源性均高于96%，表明毒株YX10经过多次传代后，其基因型依然高度保守，具体如表3。

表3不同代次S1基因序列同源性比对

实施例7YX10不同代次全基因序列比对及分析

本实施例中分别选取了D5（YX10原代）、D90、Y90（实施例3）这3个代次的病毒进行了全基因测序，期望找出病毒致病力与其序列之间的相关性。SEQID NO：1所示为D5的全基因序列。

通过对毒株YX10D5、D90、Y90这3个代次的全基因序列的比对，可以看出它们之间氨基酸突变个数非常少，最多也就42个氨基酸突变。但是值得我们关注的是D90、Y90共同地在3’—UTR区域有一段缺失，而这个结果也正好与之前国外的报道相一致，于是我们推测，这段缺失很有可能与毒株的毒力相关。YX10不同代次全基因比对结果如表4，具体变化区间如图2-4。

表4YX10不同代次对同源强毒的保护效力

综上可知，32℃传代与37℃传代相比，在可以产生相同的基因缺失的前提下明显缩短肾型传支病毒YX10的致弱时间，提高弱毒苗的开发效率，从而为禽病防控起到更加及时有效的防控作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种禽传染性支气管炎病毒的致弱方法，其特征在于：包括以下步骤，毒株YX10接种SPF鸡胚，每胚接种10^3.5-4EID₅₀/0.2mL，培养一定时间后，将鸡胚置于-20℃半小时后，无菌收集尿囊液，进行下一代次传代；第1代-第10代培养温度为37℃，培养时间为48小时；第11代-第14代培养温度每一代降低1℃，培养时间为48小时；从第15代起培养温度为32℃，培养时间为32-48小时。

2.根据权利要求1所述的禽传染性支气管炎病毒的致弱方法，其特征在于：所述SPF鸡胚在相应培养温度孵育8-12小时后再进行接胚。

3.根据权利要求1或2所述的禽传染性支气管炎病毒的致弱方法，其特征在于：第15代-第60代培养时间为40-48小时，从第61代起培养时间为32-42小时。

4.根据权利要求3所述的禽传染性支气管炎病毒的致弱方法，其特征在于：第15代-第60代培养时间为44小时，从第61代起培养时间为36小时。

5.根据权利要求3所述的禽传染性支气管炎病毒的致弱方法，其特征在于：第15代-第60代培养时间为48小时，从第61代起培养时间为40小时。

6.根据权利要求3所述的禽传染性支气管炎病毒的致弱方法，其特征在于：第15代-第60代培养时间为40小时，从第61代起培养时间为32小时。

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