CN108342367A

CN108342367A - 一种重组马立克病毒毒株sca13株及其应用

Info

Publication number: CN108342367A
Application number: CN201810101979.XA
Authority: CN
Inventors: 苏帅
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2018-02-01
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2018-07-31
Anticipated expiration: 2038-02-01
Also published as: CN108342367B

Abstract

本发明公开了一种重组马立克病毒毒株SCA13株，其生物保藏号为：CGMCC NO.15285，SCA13株基因组中整合有ALV LTR，并能稳定存在。本发明还基于其BAC克隆，利用Red E/T重组技术缺失meq、vTR基因，构建了MDV SCA13株meq、vTR基因的缺失株，其生物保藏号为：CGMCC NO.15286，基于SCA13株构建的双基因缺失株完全丧失了对鸡的致死性和致肿瘤性，其免疫抑制性也丧失，具有更好的生物安全性，而且具有更好的水平传播能力，可以解决MD疫苗免疫过程中鸡只漏免导致发病的问题，在临床中对鸡群起到更好的免疫保护。

Description

一种重组马立克病毒毒株SCA13株及其应用

技术领域

本发明涉及动物病毒学领域，具体涉及一种重组马立克病毒毒株SCA13株及其应用。

背景技术

马立克病(Marek′s disease，MD)是由鸡的马立克病病毒(Marek′s diseasevirus，MDV)引起的鸡的一种肿瘤性疾病，以淋巴细胞增生和肿瘤的形成为主要特征，以外周神经、生殖腺、脏器、免疫器官中单核细胞浸润以及由于外周神经肿瘤细胞的集聚而引起的半瘫痪或完全瘫痪为典型特征(Marek，1907)。MDV归属于α-疱疹病毒亚科中的马立克病毒属，其分为3个紧密联系而又有所不同的血清型，血清Ⅰ型病毒有致病性，可引起T细胞淋巴瘤以及其它病变；血清Ⅱ型与Ⅲ型病毒分别分离自鸡与火鸡体内，没有致病性。Isfort等首次发现将感染禽网状内皮增生病病毒(reticuloendotheliosis virus，REV)和MDV的鸡胚成纤维细胞连续传代，不同种属的MDV与REV能够进行基因的自然重组。Davidson等采用“热点组合PCR”(hotspot-combined PCR，or HS-cPCR)的方法从肿瘤病鸡的样品DNA中扩增出了含有REV-LTR片段的MDV的片段，证实在鸡体内同样可以发生MDV和REV间的基因重组。张志等在2001年从中国广西省分离到一株整合有REV的长末端重复序列(Long terminalrepeat,LTR)的MDV重组野毒株。

随着细菌人工染色体(Bacterial ArtificiaI Chromsomes，BAC)技术在构建MDV感染性克隆的广泛应用，人们开始关注MDV基因组结构与功能、病毒与宿主的关系以及MDV预防的新型疫苗。基于BAC克隆，利用Red E/T重组技术构建了MDV的多株基因突变株，进一步揭示了MDV的基因功能。2008年美国禽病学专家将MDV超强毒株Md5中主要的致肿瘤基因meq基因敲除掉，获得的meq基因缺失株-rMd5Δmeq完全丧失致病性，而且能提供比MD疫苗CVI988/Rispens更好的免疫保护。2010年，国内实验室敲除掉MDV超强毒GX0101的meq基因，构建的GX0101Δmeq证实完全丧失致瘤性，比CVI988/Rispens具有更好的免疫保护效果。

敲除meq基因虽然能够使MDV强毒的致瘤性丧失，但meq基因缺失株仍能引起轻微的免疫抑制。MDV编码的vTR基因与鸡的chTR基因具有88％的同源性，研究表明vTR基因虽然与病毒早期的溶细胞感染没有直接关系，但是影响病毒引起T淋巴细胞瘤的产生。敲除MDV的vTR基因，显著降低病毒的致肿瘤率以及肿瘤大小。国内外尚没有同时敲除MDV meq、vTR基因的报道。随着MDV疫苗的使用，MDV的毒力和致病性不断增强，已由弱毒株演变为超强毒株、特超强毒株。Witter等人比较了10株新的疫苗候选株但是免疫效果都不如CVI988/Rispens。近年来，一些免疫CV1988/Rispens的鸡群仍时有肿瘤发生，CV1988/Rispens呈现出对MDV野毒不能提供完全保护的趋势；另外，MD疫苗免疫过程中，鸡只的漏免导致感染MDV野毒引起发病，也是鸡群MD频发的常见原因。因此，研制具有更好免疫效果的MD疫苗成为人们的迫切需求。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种重组马立克病毒毒株SCA13株，并基于其BAC克隆，利用Red E/T重组技术缺失meq、vTR基因，构建了MDV SCA13株meq、vTR基因的缺失株，使其完全丧失对鸡的致死性和致肿瘤性，其免疫抑制性也丧失，具有更好的生物安全性及免疫效力。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种重组马立克病毒毒株SCA13株，已于2018年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：CGMCC NO.15285。

本发明所述的重组马立克病毒毒株SCA13株，在其基因组中整合有禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)LTR，并能稳定存在，所述ALV LTR的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的重组马立克病毒毒株SCA13株属于MDV强毒株，具有致病性和较强的水平传播能力。

上述的重组马立克病毒毒株SCA13株在构建MD基因缺失疫苗和/或构建疱疹病毒与反转录病毒的重组模型中的应用也是本发明的保护范围。

本发明的第二方面，提供一种重组马立克病毒meq和vTR双基因缺失株，已于2018年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：CGMCC NO.15286。

本发明所述的重组马立克病毒meq和vTR双基因缺失株，是在重组马立克病毒毒株SCA13株的基因组中同时缺失了MDV致病性相关vTR基因和meq基因，其vTR基因序列如SEQID No.2所示，meq基因序列如SEQ ID No.3所示。

本发明所述的重组马立克病毒meq和vTR双基因缺失株为血清I型，命名为MDVSDL161株，其对鸡无致肿瘤性，不引起接种鸡的死亡以及免疫抑制；而且具有更好的水平传播能力，可以解决MD疫苗免疫过程中鸡只漏免导致发病的问题，在临床中对鸡群起到更好的免疫保护。

本发明的第三方面，提供上述重组马立克病毒meq和vTR双基因缺失株在制备防治鸡马立克病疫苗和/或药物中的用途。

本发明的第四方面，提供上述重组马立克病毒meq和vTR双基因缺失株在作为载体构建病毒活载体疫苗中的用途。

本发明的第五方面，上述重组马立克病毒meq和vTR双基因缺失株在禽类宿主中诱导抗鸡马立克病保护性免疫的用途。

本发明的第六方面，提供一种疫苗组合物，由有效量的上述重组马立克病毒meq和vTR双基因缺失株及药学上接受的载体或佐剂制成。

本发明的第七面，提供一种鉴别重组马立克病毒meq和vTR双基因缺失株疫苗、MD商品疫苗CVI988/Rispens和814的方法，包括如下步骤：

设计两组引物对样品DNA进行PCR扩增，根据扩增情况进行判定；

所述第一组引物的序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；

所述第二组引物的序列如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所述。

若采用第一组引物能够扩增出215bp条带，采用第二组引物能够扩增出200bp条带，则样品为重组马立克病毒meq和vTR双基因缺失株疫苗；

如采用第一组引物不能扩增出条带，采用第二组引物能够扩增出1397bp条带，则样品为MD商品疫苗CVI988/Rispens和814。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次提供了一种重组MDV SCA13株，在其基因组中整合了ALV LTR片段，表明ALV LTR能够与MDV发生重组并且稳定存在，为今后重组病毒生物学研究提供了资源，也为今后研究人的疱疹病毒与反转录病毒的重组提供了模型；而且，本发明的重组MDVSCA13株具有致病性(属于MDV强毒株，致病性弱于MDV超强毒)和非常强的横向传播能力(即水平传播能力)，为具有更好免疫保护力的MDV疫苗的研制提供了亲本病毒资源。

(2)基于本发明的重组MDV SCA13株，本发明缺失了重组MDV SCA13株的meq基因和vTR基因(各两个拷贝)，构建得到了MDV基因缺失株SDL161，其对鸡没有致病性、致肿瘤性以及免疫抑制，并且低剂量(1000PFU/只)的免疫效力依然显著优于CVI988/Rispens株疫苗。

(3)相比其它MDV基因缺失疫苗，以重组MDV SCA13株构建的MDV基因缺失株SDL161具有更好的水平传播能力。近年来鸡群MD不断频发，MD疫苗免疫过程中鸡只的漏免导致感染野毒引起发病是鸡群MD频发的常见原因。SDL161株MDV具有更好的水平传播能力，1日龄免疫鸡群后，通过育雏期高密度的饲养，漏免鸡只可以通过接触感染SDL161株MDV，相当于“补充免疫”，因而可以在临床中对鸡群起到更好的免疫保护。

(4)SDL161株是MD基因缺失疫苗株，在鸡群传播中不存在毒力返强的可能，而CVI988/Rispens株疫苗属于传代致弱毒力的传统疫苗，存在毒力返强的可能。因此SDL161株具有更好的生物安全性以及免疫效力。

(5)SDL161的亲本病毒是SCA13株MDV，来源于中国，相比CVI988/Rispens疫苗毒株(来源于荷兰)对中国鸡群具有更好的免疫原性，其基因组中的ALV LTR序列可以作为分子标记有效的与MDV野毒区分。因此SDL161株作为MD疫苗不但能够对鸡群MD起到良好的免疫保护作用，而且能够尽早的监测MDV野毒的感染，有利于鸡群MD的防控。

附图说明

图1：SCA13株MDV基因组中ALV LTR插入位点及序列。

图2：MDV SCA13株对SPF鸡体重的影响。

图3：SCA13株对SPF鸡AIV H9(1)、NDV(2)灭活苗抗体水平的影响。

图4：MDV SDL161的PCR鉴定结果；图中，(1)MDV SDL161vTR、meq基因PCR检测结果，A：SCA13DNA为模板，LTR-F/R检测引物扩增结果；B：SCA13DNA为模板，MDV-F/R检测引物扩增结果；C：SCA13DNA为模板，vTR-F/R检测引物扩增结果；M：2000bp DNA Marker；D：SDL161DNA为模板，LTR-F/R检测引物扩增结果；E：SDL161DNA为模板，MDV-F/R检测引物扩增结果；F：SDL161DNA为模板，vTR-F/R检测引物扩增结果；G、H：空白对照；(2)MDV SDL161BAC序列缺失的PCR检测结果。A：SDL161DNA为模板，Us2-F/Us7-R检测引物扩增结果；B：SCA13DNA为模板，Us2-F/Us7-R检测引物扩增结果；M：15000bp DNA Marker；C：空白对照。

图5：MDV SDL161间接免疫荧光鉴定结果；图中，A：单抗H19作为一抗鉴定SCA13感染CEF细胞形成的蚀斑；B：单抗H19作为一抗鉴定SDL161感染CEF细胞形成的蚀斑；C：空白CEF细胞作为对照；D：meq蛋白多抗作为一抗鉴定SCA13感染CEF细胞形成的蚀斑；E：meq蛋白多抗作为一抗鉴定SDL161感染CEF细胞形成的蚀斑；F：空白CEF细胞作为对照。

图6：重组MDV SDL161与MD疫苗CVI988/Rispens、814株的PCR鉴别；A：SDL161基因组特有分子标记ALV LTR的PCR扩增，其中，1：SDL161株DNA为模板；M：2000DNA Marker；2：CVI988/Rispens DNA为模板；3：814株DNA为模板；4：阴性对照。B：meq基因的PCR扩增，其中，1：SDL161株DNA为模板；M：2000DNA Marker；2：CVI988/Rispens DNA为模板；3：814株DNA为模板；4：阴性对照。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所介绍的，目前鸡群MD频发主要是由两方面的原因造成的，一是MDV的毒力和致病性的逐渐增强，现有疫苗的免疫保护能力已有些力不从心；二是MD疫苗免疫过程中，存在鸡只漏免的情况。近年来，科学家利用各种方法构建了各种MDV候选毒株试图改进疫苗的效果，但都不成功，用常规方法改进疫苗似乎已走到了尽头。

由于广泛接种MDV疫苗，包括单价、双价和多价疫苗，并且采用大剂量接种，造成了鸡群的高度免疫状态，在免疫压力下MDV可能发生变异以适应新的微生态环境。病毒的变异一般分为三种，一是由病毒在复制过程中其基因组核酸序列突变造成的变异；二是像流感病毒一样病毒基因组由多个节段组成，不同病毒间基因组节段的交换造成的病毒变异。以上变异普遍被学术界关注。此外，还有第三种变异方式，即不同科属病毒间的基因重组。现有研究表明，MDV和反转录病毒间的自然重组的频率非常低，目前仅见MDV和REV间自然重组毒株分离的报道。

本发明首次分离得到了一种重组MDV SCA13株，在SCA13株的基因组中整合有ALVLTR片段，ALV LTR能够与MDV发生重组并且稳定存在。致病性试验表明，重组MDV SCA13株具有致病性，属于MDV强毒，但是致病性弱于MDV超强毒Md5。利用MDV特异性核酸探针进行斑点杂交对空白对照鸡接触感染MDV的检测表明，空白对照鸡与SCA13株攻毒鸡接触感染21d，10/15的比例空白对照鸡羽毛囊中检出MDV SCA13株，而与MDV Md5攻毒鸡接种感染的空白对照鸡，在35d时2/15比例检出MDV Md5。说明重组MDV SCA13株具有非常强的横向传播能力。

基于该重组MDV SCA13株，本发明利用Red E/T同源重组技术敲除掉SCA13株的meq、vTR基因，构建了完全丧失致病性的MDV基因缺失株，该重组毒株为血清Ⅰ型，被命名MDVSDL161株，构建的MDV基因缺失株SDL161对鸡没有致病性、致肿瘤性以及免疫抑制，并且低剂量(1000PFU/只)的免疫效力依然显著优于CVI988/Rispens株疫苗。

重组MDV SCA13株基因组中含有ALV LTR序列，ALV LTR的重组能够显著提高MDV的横向传播能力，因此，相比其它MDV基因缺失疫苗，以重组病毒SCA13株构建的SDL161株MDV具有更好的水平传播能力。近年来鸡群MD不断频发，MD疫苗免疫过程中鸡只的漏免导致感染野毒引起发病是鸡群MD频发的常见原因。SDL161株MDV具有更好的水平传播能力，1日龄免疫鸡群后，通过育雏期高密度的饲养，漏免鸡只可以通过接触感染SDL161株MDV，相当于“补充免疫”，因而可以在临床中对鸡群起到更好的免疫保护。重组病毒SDL161是MD基因缺失疫苗株，因此在鸡群传播中不存在毒力返强的可能，而CVI988/Rispens株疫苗属于传代致弱毒力的传统疫苗，存在毒力返强的可能。因此SDL株MDV具有更好的生物安全性以及免疫效力。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：重组MDV的分离鉴定

选择9-10日龄发育良好的SPF鸡胚，在超净台内先用碘酒棉对气室部位的蛋壳进行消毒，常规方法制备鸡胚成纤维细胞(CEF)，按照500万/细胞瓶的浓度接种于细胞培养的方瓶中(35cm²)，置于37℃，5％的二氧化碳(CO₂)培养箱中培养，待细胞长成单层后换用维持液(1％的新生牛血清，500IU/mL的青链霉素，2IU/mL的两性霉素)备用。

针对鸡群MD临床症状明显发病鸡无菌采集抗凝剂的血1ml。将血液与等体积的PBS缓冲液充分混匀，缓缓的沿管壁加入2ml淋巴细胞分离液的液面上，400g离心15min。收集淋巴细胞层加入1ml PBS重悬，充分混匀后，1000g离心5min，收集淋巴细胞接种CEF细胞，维持5-7d，出现MDV典型的细胞病变，利用间接免疫荧光试验以及PCR方法进行鉴定。结果显示，病变细胞同时感染MDV以及J亚型ALV。通过对MDV的连续传代纯化，分离到一株整合ALV LTR序列的重组MDV，命名为重组MDV SCA13株，其能够引起CEF细胞典型的MD病变，经间接免疫荧光试验鉴定为血清I型野毒；重组MDV SCA13株基因组中ALV LTR插入位点及序列见图1。

实施例2：重组MDV SCA13株的致病性试验

将65只1日龄SPF鸡随机分成四组，分别饲养在正压隔离罩内。第1组20只SPF鸡，其中15只SPF鸡在1日龄时以2000PFU/只的剂量腹腔注射SCA13株MDV，7日龄免疫NDV和AIV-H9灭活苗。另外5只鸡不做任何处理，做好标记，用作检测SCA13株的横向传播能力及在接触感染过程中SCA13株基因组中ALV LTR片段的稳定性。第2组15只SPF鸡，7日龄免疫NDV和AIV-H9灭活苗，作为空白对照组。免疫后4w、5w采集两组鸡的血液分离血清，通过血凝血抑试验检测两组鸡AIV-H9、NDV抗体效价，观察SCA13病毒对鸡体的免疫抑制作用。攻毒后7、14、21、28d称量两组鸡的体重，检测重组病毒对鸡生长性能的影响。第3组15只SPF鸡，在1日龄时以1羽份/只的剂量颈部皮下免疫CVI988/Rispens，第4组15只SPF鸡。6日龄，第3、4组所有SPF鸡均以2000PFU/只的剂量腹腔注射SCA13株MDV。观察各组临床症状并记录死亡数；90d后剩余鸡全部捕杀并剖检，记录病变及肿瘤情况。

结果显示，第1组MDV SCA13株接种鸡的体重、NDV和AIV-H9灭活苗诱导的抗体水平相比空白对照组鸡显著降低，表明MDV SCA13株能引起接种鸡显著得免疫抑制(图2、3)。试验期间，空白对照组鸡生长良好，没有出现死亡。第1组MDV SCA13株接种鸡死亡8只，死亡率53.3％，3只鸡出现可眼观肿瘤，肿瘤率20％。第3组CVI988/Rispens免疫SCA13攻毒组死亡1只鸡，死亡率6.7％，CVI988/Rispens提供93.3％的免疫保护。第4组SCA13攻毒组鸡死亡4只鸡，死亡率26.7％(表1)。重组MDV SCA13株在CEF细胞上传20代，其基因组中插入的ALV LTR片段能够稳定存在。攻毒后6-8周采集攻毒组鸡的羽毛囊提取DNA，均能扩整出ALV LTR片段，并且从接触3周感染SCA13株病毒的鸡的羽毛囊DNA中，也能扩出ALV LTR片段。

表1：SCA13株的致病性以及CVI988/Rispens的免疫保护结果

1日龄接种	6日龄接种	死亡率	肿瘤率	免疫保护指数
					SCA13	-	53.3％	20％	-
-	-	0％	0％	-
					CVI988/Rispens	SCA13	6.7％	0％	93.3％
-	SCA13	26.7％	13.3％	-

以上结果证实SCA13株属于MDV强毒，具有较强的横向传播能力，无论在鸡体内还是体外的复制其基因组中的ALV LTR片段均能稳定存在的。

本发明将分离的重组MDV毒株SCA13株于2018年01月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CG MCCNo.15285。

实施例3：重组MDV SDL161株的构建及鉴定

1、MDV SCA13株BAC克隆的构建

取1μg SCA13株感染的CEF DNA与2.5μg pDS-pHAI-US2质粒DNA共同转染原代CEF。6d后，将转染出的病变细胞用0.05％的胰酶消化，接种到在培养基中已加有250μg/mL霉酚酸，50μg/mL黄嘌呤及100μg/mL次黄嘌呤的含有8×10⁶个CEF的T75细胞瓶中，37℃﹑5％CO₂培养5d后，将感染的CEF消化下来再次接种于新鲜的CEF，如此反复进行4次，待出现60％的细胞病变时，将细胞消化，提取细胞基因组DNA。将1μg病毒感染CEF基因组DNA与50μL DH10B感受态细胞于预冷的0.1cm电转化杯中，在2000V，100Ω，25uF的条件下进行电转化。电击后迅速加入1mL预热至37℃的SOC液体培养基(含0.2mmol/L葡萄糖，0.1mmol/L Mg₂SO₄，0.1mmol/L MgCL₂)，置于37℃，摇震培养2h后，取200μL涂布于含25μg/mL的氯霉素的LB选择性琼脂平板上。次日，挑取单菌落于含25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中培养16h，按常规提取质粒的方法少量提取BAC DNA，进行PCR鉴定，阳性质粒命名为SCA13BAC。

2、标记基因rpsl-neo取代SCA13-BAC中的meq基因

由商业公司人工合成一对引物MDV-rpsl-neo-F/R(序列见表2，序列号为SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7)。引物中大写字母分别表示位于SCA13基因组中meq基因的上游和下游的MDV基因组的50bp序列，小写字母为标记基因rpsL-neo的5′端和3′端序列。以Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒(德国GeneBridges公司)的rpsL-neo templateDNA为模板做PCR，由此扩增出长1419bp的PCR产物，含有完整的能表达的标记基因rpsl-neo及其二侧的用于同源重组的MDV的同源臂序列。

按照Counter-Selection BAC Modification Kit的方法，将含有四环素抗性基因的pRed/ET质粒电转化进含有SCA13BAC质粒的DH10B大肠杆菌。经氯霉素(Cmr，30μg/mL)和四环素(Tet，5μg/mL)双抗性的LB平板筛选。挑取单个菌落，接种到含有同样二种抗菌素的10mL LB培养液中，30℃振荡培养，待OD₆₀₀达到0.3左右时，加入10％L-阿拉伯糖400μL，37℃振荡培养60min。将上述含有同源臂的标记基因rpsL-neo PCR产物电转化进含有pRed/ET质粒和SCA13BAC质粒的DH10B大肠杆菌中，37℃诱导重组，经四环素(Tet，5μg/mL)和卡那霉素(Kan，15μg/mL)2种抗性的LB平板，由此筛选出对卡那霉素有抗性的标记基因rpsL-neo替代SCA13BAC基因组中meq基因的细菌克隆SCA13-rpsL-neo。

3、筛选不具有链霉素抗性的SCA13-rpsL-neo细菌克隆

大肠杆菌DH10B携带突变型的rpsl基因，能够编码抵抗链霉素的蛋白，具有链霉素抗性。相对野生型的rpsl基因，突变型rpsl基因为隐性基因，因此当将表达显性的野生型rpsl基因的质粒转化进DH10B后，就不再具有链霉素抗性。含卡那霉素的LB板培养和筛选到的重组菌SCA13-rpsL-neo虽然能够保证rpsl-neo基因的存在，但是由于经PCR扩增的标记基因rpsL-neo会有碱基突变，使得野生型rpsl基因不再发挥对链霉素敏感的功能，对进行下一步重组菌筛选造成干扰。为此，我们必须要筛选到不具有链霉素抗性的SCA13-rpsL-neo细菌克隆。分别制备含有氯霉素(Cmr，30μg/mL)、卡那霉素(Kan，15μg/mL)和链霉素(Str，50μg/mL)抗性的平板(A板)以及含有氯霉素(Cmr，30μg/mL)、卡那霉素(Kan，15μg/mL)抗性的平板(B板)，利用记号笔在A、B板后面进行划格标记序号。将SCA13-rpsL-neo同一单菌落分别在A、B板相同位置接种，30℃温箱中培养24h左右，选择A板不生长的SCA13-rpsL-neo细菌克隆进行下一步重组。

4、SCA13meq基因两侧基因组融合片段取代SCA13-rpsL-neo基因组中的rpsl-neo基因

根据SCA13基因组中meq基因两侧序列，由商业公司直接合成缺失meq基因的基因片段约600bp(SEQ ID No.4)。将筛选的不具有链霉素抗性的SCA13-rpsL-neo菌落接种到含有氯霉素(Cmr，30μg/mL)、四环素(Tet，5μg/mL)和卡那霉素(Kan，15μg/mL)3种抗性的10mLLB培养液中，30℃振荡培养，待OD₆₀₀达到0.3左右时，加入10％L-阿拉伯糖400μL，37℃振荡培养60min。将上述缺失meq基因的600bp基因片段电转化进含有pRed/ET质粒和SCA13-rpsL-neo质粒的DH10B大肠杆菌中，37℃诱导重组，再接种于含氯霉素(Cmr，30μg/mL)、四环素(Tet，5μg/mL)和链霉素(Str，50μg/mL)三种抗菌素的LB平板，选择阳性菌落。当600bp目的基因取代标记基因rpsL-neo后，由于失去了野生型rpsl基因，相应的DH10B宿主菌又恢复链霉素抗性。由此得到了新的重组SCA13Δ1meq及其相应的转化菌。按照上述相同的方法再次敲除另外一个meq基因，构建meq基因缺失株SCA13Δmeq。利MDV-F/R引物对(序列见表2，序列编号为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9)SCA13Δmeq进行meq基因缺失的PCR鉴定。

5、缺失MDV SCA13Δmeq株的vTR基因

利用上述相同步骤继续敲除SCA13Δmeq的vTR基因，构建meq与vTR双基因缺失株SCA13ΔmeqΔvTR，在构建过程中使用了两组引物vTR-rpsl-F/R和vTR-F/R(序列见表2，序列编号分别为SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11以及SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13)。由商业公司直接合成缺失vTR基因的基因片段约600bp(SEQ ID No.5)，相比MDV SCA13株基因组，片段仅缺失vTR基因。

6、构建缺失meq、vTR基因的SDL161株MDV

参考Zhao等方法敲除SCA13ΔmeqΔvTR的BAC序列(Zhao Y,Petherbridge L,Smith LP,Baigent S,Nair V.2008.Self-excision of the BAC sequences from therecombinant Mar ek's disease virus genome increases replication andpathogenicity.Virology journal 5:19)。方法简述如下：将SCA13ΔmeqΔvTR质粒和含有同源臂的SV40-cre表达盒片段转化进EL250，Red E/T同源重组后，经含有卡纳霉素(50μg/ml)和氯霉素(30μg/ml)的LB平板32℃培养24-36小时，筛选具有两种抗性的单克隆菌落，最终通过US2基因(Us2-F:5'-GGAATACATTCGAGCGCAA-3′，SEQ ID NO.14)和US7(Us7-R:5'-CTATAGACCAGATGCCTCGAA-3′，SEQ ID NO.15)基因的引物鉴定阳性的单克隆菌落。阳性菌落能够扩增出3.5kb的PCR产物，而没有重组的SCA13ΔmeqΔvTR株MDV由于缺失US2基因，所以不能扩增出任何片段。阳性菌株经大量培养，提取质粒，按照转染试剂LipfectamineTM2000的说明转染CEF细胞，待出现MDV特异的蚀斑后，将MDV在原代CEF细胞上进行连续5次传代，经过96孔板对MDV的单个蚀斑进行纯化，经PCR验证BAC序列已经完全被敲除掉的病毒，命名为SDL161。

本发明将构建的缺失meq、vTR基因的SDL161株于2018年01月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.15286。

表2：重组MDV SDL161株的构建及鉴定所采用的引物

实施例4：重组MDV SDL161的PCR方法以及间接免疫荧光试验鉴定

提取MDV SDL161、SCA13感染CEF细胞的DNA作为模板，进行PCR反应鉴定。结果显示：以MDV SCA13感染CEF细胞的DNA作为模板，LTR-F/R检测引物扩增出215bp特异性条带，与预期大小一致，经过测序验证为目的基因(图4中(1)-A)；引物MDV-F/R、vTR-F/R分别扩增出660bp、686bp的条带，测序验证为特异性目的基因(图4中(1)-B、C)。以MDV SDL161感染CEF细胞的DNA为模板，LTR-F/R检测引物扩增出215bp特异性条带，与预期大小一致，经过测序验证为目的基因(图4中(1)-D)；meq基因和vTR基因特异性的检测引物MDV-F/R以及vTR-F/R均没有扩增出目的条带(图4中(1)-E、F)。空白对照均没有扩增出条带(图4中(1)-G、H)。利用Us2-F/Us7-R引物进行PCR反应，以MDV SDL161感染CEF细胞的DNA作为模板能够扩增出3500bp的目的条带(图4中(2)-A)；MDV SCA13感染CEF细胞的DNA作为模板以及空白对照均没有扩增出目的条带(图4中(2)-B、C)。以上结果表明SDL161缺失meq、vTR基因，并且不再含有BAC序列。间接免疫荧光试验显示，针对MDV pp38蛋白的单克隆抗体H19能够与SCA13以及SDL161反应，发出特异性的亮绿色荧光(图5A、B)；针对MDV meq蛋白的多克隆抗体能够与SCA13反应，发出特异性的亮绿色荧光(图5D)，与SDL161不反应(图5E)。空白对照均没有特异性荧光(图5C、F)。结果表明SDL161的pp38蛋白能够表达，meq蛋白不表达，进一步证实SDL161株缺失meq基因。

实施例5：重组MDV SDL161株对SPF鸡的致病性

将MDV SDL161株以3000PFU/只剂量腹腔接种15只1日龄SPF鸡，感染13周后，鸡群没有出现鸡只死亡，剖检所有鸡只没有出现可眼观的肿瘤；接种SDL161鸡的体重及NDV、AIVH9灭活苗免疫产生的抗体水平与空白对照鸡差异不显著，表明MDV SDL161株对SPF鸡没有致病性以及致肿瘤性，不会引起鸡的免疫抑制。

实施例6：重组MDV SDL161株对SPF鸡和海兰褐鸡的免疫效力

将1日龄SPF鸡60只，随机分为4组，每组15只，分别饲养于4个正压过滤空气消毒的隔离罩内。1日龄时，第1组鸡以2000PFU/只的剂量腹腔接种SDL161株，第2组鸡以2000PFU/只的剂量腹腔免疫CVI988/Rispens疫苗株。第3组作为攻毒对照组，第4组作为空白对照组。接种5天后，第1、2、3组分别以1000PFU/只的剂量接种vv MDV Md5(购自美国菌种保藏中心(American type culture collection，ATCC，VR-987)。攻毒后每天观察各组鸡的临床症状并记录鸡的死亡数。饲养90天后，所有存活鸡均被处死并剖检观察其病变。选取疑似MDV病变的组织、脏器，并且每组随机选取3只分别取其心脏、肾脏、肝脏做石蜡切片，HE染色，进行病理组织学观察。疫苗免疫保护效力由保护指数(protective index,PI)来评价，免疫组PI计算方法为攻毒对照组的鸡产生MD病变百分数(MD病变百分数由病变鸡除以每组总鸡数乘以100)减去免疫组鸡产生MD病变百分数再除以攻毒对照组鸡产生MD病变百分数乘以100。按照相同的试验方法评价重组MDV SDL161株对海兰褐鸡的免疫效力。

结果显示Md5攻毒对照组鸡群个体明显偏小，生长发育状况差，羽毛蓬乱、精神沉郁，并且鸡只出现明显的瘫痪症状。攻毒后90天，SDL161株接种后感染Md5组没有鸡只死亡，剖检，没有发现可眼观的白色肿瘤结节；CVI988/Rispens免疫后感染Md5组有5只死亡，其中2只鸡肝脏、肾脏出现明显的白色肿瘤结节，其余3只死鸡均没有可眼观的肿瘤结节；Md5攻毒对照组15只鸡死亡。空白对照组鸡没有出现鸡只死亡。SDL161对SPF鸡能够提供100％的免疫保护，商品化疫苗CVI988/Rispens提供60％的保护(表3)。SDL161对海兰褐蛋鸡提供100％的免疫保护，商品化疫苗CVI988/Rispens提供80％的保护(表4)。

表3：SDL161株MDV与CVI988/Rispens对SPF鸡保护指数的比较

1日龄接种MDV	6日龄接种MDV	MD死亡率	MD病变率	PI
					SDL161	Md5	0/15＝0％	0/15＝0％	100^a
CVI988/Rispens	Md5	5/15＝33.3％	6/15＝40％	60^b
					-	Md5	15/15＝100％	15/15＝100％	-
-	-	0/15＝0％	0/15＝0％	-

表4：SDL161株MDV对海兰褐蛋鸡的免疫保护效果

以上结果证实SDL161比CVI988/Rispens具有更好的免疫效力。

实施例7：重组MDV SDL161株疫苗的制备

SDL161株疫苗接种鸡胚成纤维细胞，按每转瓶(生长面积680cm²)接种4×10⁸个细胞分装细胞培养转瓶，转瓶旋转速度为9～11r/h，37℃培养18～20h，每转瓶接种10⁵～10⁶PFU疫苗毒，继续培养36-48h，病变细胞占细胞单层面积的70％后收获，加入保护液液氮冷冻保存。

实施例8：重组MDV SDL161株疫苗与商品化MD疫苗的鉴别诊断

针对MDV SDL161株疫苗基因组中ALV LTR这一分子标记以及缺失的meq、vTR基因特点，设计引物meq-JC-F/R(meq-JC-F：5’-ATCTTCCCGAAACTATGA-3’，SEQ ID NO.16；meq-JC-R：5’-GTTGGTGCTGGAATGTTA-3’，SEQ ID NO.17)，结合引物LTR-F/R(LTR-F：5’-TGGTGGAAGTAAGGTGGT-3’，SEQ ID NO.18；LTR-R：5’-GCGTAGTCGTCAGGGAAT-3’，SEQ IDNO.19)，进行PCR反应能够有效的鉴别MDV SDL161株疫苗与MD商品疫苗CVI988/Rispens、814株。

引物LTR-F/R进行PCR，MDV SDL161株DNA为模板能够扩增出215bp条带，而CVI988/Rispens、814株DNA作为模板不能扩增出条带。引物meq-JC-F/R进行PCR，MDV SDL161株DNA为模板能够扩增出200bp条带，而CVI988/Rispens、814株DNA作为模板扩增出1397bp条带(图6)。因此，以上两对引物的联合使用能够对SDL161株与CVI988/Rispens、814株有效的鉴别。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种重组马立克病毒毒株SCA13株及其应用

<130> 2018

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 325

<212> DNA

<213> 禽白血病病毒(ALV LTR)

<400> 1

tgtagtgtta tgcagtactc ttgtgtaacg atgaaacagc aatatgcctt ataaggaaga 60

aaaaggcact gtacacgttg attggtggaa gtaaggtggt atgatcatgg tatgatcgta 120

ccttattagg aaggcaacag acgggtctta tatggattgg acgagctcct tagttccgca 180

ttacagagat attgtattta agtgcctagc ctgacacaat aaacgccatt ttacctccca 240

ccacattggt gtgcacctgg gttgatggcc ggaccgtcga ttccctgacg actacgcgca 300

cctgaatgaa gcggaaggct tcatt 325

<210> 2

<211> 277

<212> DNA

<213> vTR

<400> 2

cacgtggcgg gtggaaggct ccgctgtgtc taaccctaat cggaggtatt gatggtactg 60

tcgccgcgct ccctccgccc gctgtttact cgctgacttt cagcgggcta ggggagccgc 120

cccagggggc gccgcggcgg ggagggggtg gggcggacgc gggagaaagg accgaaaggg 180

gctccacggc aaacaaaaaa aaacgtcagc gaggggtcct ctcgccccca tccgccctgg 240

ggtcctcgcc cgcaggccgc ggtcggccgg cacccgc 277

<210> 3

<211> 1020

<212> DNA

<213> meq

<400> 3

atgtctcagg agccagagcc gggcgctatg ccctacagtc ccgctgacga tccgtccccc 60

ctcgatcttt ctctcgggtc gacttcgaga cggaaaaaaa ggaaaagtca cgacatcccc 120

aacagcccct ccaaacaccc cttccctgac ggcctatctg aggaggagaa acagaagctg 180

gaaaggagga gaaaaaggaa tcgtgacgcc gctcggagaa gacgcaggaa gcagacggac 240

tatgtagaca aactccatga agcatgtgaa gagctgcaga gggccaatga acacctacgt 300

aaggaaattc gagatctaag gactgagtgc acgtccctgc gtgtacagtt ggcttgtcat 360

gagccagttt gccctatggc ggtaccccta acggtgaccc ttggactgct taccaccccg 420

cacgatcccg ttcctgaacc tcccatttgc actcctccac ctccctcacc ggatgaacct 480

aacgctccac attgctccgg ttcccaacct cctatctgta ccccccctcc tcccgatacg 540

gaggaacttt gcgcccagct ctgctcgacc ccaccacctc ccatctctac tccccatatt 600

atctacgctc cggggccttc ccccctccaa cctcctatct gtacccccgc tcctcccgat 660

gcggaggagc tttgcgccca gctctgctcg accccaccac ctcccatctg tactccccat 720

tccctcttct gccctcccca gcctccatct ccggagggca tcttccctgc attgtgtcct 780

gttaccgagc cgtgtacccc tccatcgccg gggacggttt acgctcagct ttgtcctgtt 840

ggccaggttc ccctttttac cccatctccc ccacatccgg ctccggagcc ggagaggctt 900

tatgctcgtc ttaccgagga tcccgaacag gattccttgt attcgggcca gatttatact 960

cagtttccct cggatactca gtctacggtc tggtggtttc caggtgacgg gagaccctga 1020

<210> 4

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工合成取代meq的序列()

<400> 4

ccgagagatg ttgccccaga agttttccac atagctaagt ttatctcata cttcggaact 60

cctggagcca acaaatcccc tgaccatgta actcaaaata gttcttccga gtctaagcta 120

cacggtaagg aaaatttgtt accccagagg atttttttat gtcagtaaat cgataaataa 180

tgcctttaac cctttccttt atgttgatct tcccgaaact atgaaaacta ttatatataa 240

ctaggggaga agaaacatgg ggcatagacg atgtgctgct gagagtcaca atgcggatca 300

ctctttacac ctgtaccgtg cccgccttct ccctggtata cacctgcaag agacgcctgc 360

ctaggaatca gtgtgcggaa tttattctta acattccagc accaacctcc ccgaaccaaa 420

ataataatta aaaaagcaac acccacagac ccgaaagtat tgaagaatta cacgttcgcg 480

aacggtcaca attcacctgt cattttataa aggagcaata gtttatttaa gaggtaggta 540

taaatcgatc atttcccccc cccccgtctc cgtatcactc ccgaaccatt agatatcagt 600

<210> 5

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工合成取代vTR的序列()

<400> 5

atacaggaca tgttttaacg aggttctgcg ctaaatccag ggcgggaaag ctcagcccgc 60

atctcgcagc ccccggatcc gatcccgcag accccggccc acaggaaggg gcggggcacg 120

tgcatggggc gtggcgggag atgaatgacc gcggagttcc aaactcccgc accggcccct 180

ctctgctcgc tctcctcccc gccgccaata gctacgcggc agcgtacagc ccggccaata 240

ggcgcgcggt gggcgtaggc ggaggaagct acaagagccc cacgcggggt tcccccggca 300

cattgccgcc gcgaagagtt cgcctctgtc agcctcggcg gcgcccggga gatgcggcgc 360

gcggccccgc gcccccagca gagcaacacg ggagcggcgc ccccggggca acccccgcgc 420

ccccctgcgc cgtggggcgc gcggacggcg tcgctcccac acgcgcggcc ccgcgcgcac 480

gaccgttgga gccgttgagc cgcgcgcggg gctctgtgag tagaccgaac gggccccccg 540

cggaggtggg cgctcgagcc cggtccctgc gcaggtggtg cccgctgggc gccgctcggg 600

<210> 6

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

agaaacatgg ggcatagacg atgtgctgct gagagtcaca atgcggatca ggcctggtga 60

tgatggcggg atcg 74

<210> 7

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

cttgcaggtg tataccaggg agaaggcggg cacggtacag gtgtaaagag tcagaagaac 60

tcgtcaagaa ggcg 74

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

caatgtggag cgttaggt 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

tcttcaatac tttcgggtct 20

<210> 10

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gggcgtaggc ggaggaagct acaagagccc cacgcggggt tcccccggca ggcctggtga 60

tgatggcggg atcg 74

<210> 11

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

tcccgggcgc cgccgaggct gacagaggcg aactcttcgc ggcggcaatg tcagaagaac 60

tcgtcaagaa ggcg 74

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

accctaatcg gaggtattga tg 22

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

tgtgcccacg cttattgc 18

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

ggaatacatt cgagcgcaa 19

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

ctatagacca gatgcctcga a 21

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

atcttcccga aactatga 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

gttggtgctg gaatgtta 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

tggtggaagt aaggtggt 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

gcgtagtcgt cagggaat 18

Claims

1.一种重组马立克病毒毒株SCA13株，其生物保藏号为：CGMCC NO.15285。

2.根据权利要求1所述的重组马立克病毒毒株SCA13株，其特征在于，其基因组中整合有ALV LTR；所述ALV LTR的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1或2所述的重组马立克病毒毒株SCA13株在构建MD基因缺失疫苗和/或构建疱疹病毒与反转录病毒的重组模型中的应用。

4.一种重组马立克病毒meq和vTR双基因缺失株，其生物保藏号为：CGMCC NO.15286。

5.根据权利要求4所述的组马立克病毒meq和vTR双基因缺失株，其特征在于，其在权利要求1或2所述的重组马立克病毒毒株SCA13株的基因组中同时缺失了MDV致病性相关vTR基因和meq基因，所述vTR基因序列如SEQ ID No.2所示，meq基因序列如SEQ ID No.3所示。

6.权利要求4或5所述的重组马立克病毒meq和vTR双基因缺失株在制备防治鸡马立克氏病疫苗和/或药物中的用途。

7.权利要求4或5所述的重组马立克病毒meq和vTR双基因缺失株在作为载体构建病毒活载体疫苗中的用途。

8.权利要求4或5所述的重组马立克病毒meq和vTR双基因缺失株在禽类宿主中诱导抗鸡马立克病保护性免疫的用途。

9.一种疫苗组合物，其特征在于，由有效量的权利要求4或5所述的重组马立克病毒meq和vTR双基因缺失株及药学上接受的载体或佐剂制成。

10.一种鉴别重组马立克病毒meq和vTR双基因缺失株疫苗、MD商品疫苗CVI988/Rispens和814的方法，其特征在于，包括如下步骤：

所述第一组引物的序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；

所述第二组引物的序列如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所述。