CN108034767A - 鉴别血清i型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒的引物、探针及试剂盒。所述引物和探针包括：第一对引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.3所示；和第二对引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4‑SEQ ID NO.6所示。使用本发明提供的引物和探针进行荧光定量PCR反应，能够快速、精确、科学、客观的对血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒进行鉴别诊断，并且通过对疫苗毒与野毒拷贝数的精确检测，明确鸡群疫苗的免疫状态以及野毒感染的进程。

Description

鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒 的引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及用于鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒的引物、探针及试剂盒。
背景技术
鸡马立克病(Marek`s Disease，MD)是由马立克病毒(Marek`s Disease Virus，MDV)引起的鸡的一种最常见的T淋巴细胞增生性疾病，以外周神经、虹膜、皮肤、肌肉和各内脏器官的淋巴细胞浸润、增生以及肿瘤形成为特征。
MDV分为3种血清型。血清I型为致病型，根据毒力的强弱，MDV毒株又分为弱毒、强毒、超强毒和特超强毒。目前普遍使用的商品化MD疫苗为致弱的I型CVI988/Rispens株。MD疫苗的免疫接种有效的控制了MD的爆发，但是随着疫苗的使用，MDV毒株不断进化，MDV毒力呈现逐渐增强的趋势，部分毒株已经突破了CVI988/Rispens疫苗的免疫保护。血清I型MDV的meq基因是病毒主要的致肿瘤基因，敲除meq基因(包括部分meq基因)后的重组病毒对鸡的免疫保护效果明显优于CVI988/Rispens。进而研制了MDV的meq基因(包括部分meq基因)缺失疫苗，即将应用于鸡群的临床免疫。由于鸡群免疫的MD疫苗CVI988/Rispens与MDV野毒均属于血清I型病毒，基因组结构和基因组成相似，所以疫苗毒与野毒的鉴别诊断较为困难，而MDV的meq基因(包括部分meq基因)缺失疫苗的使用更是增加了这一鉴别诊断的困难程度以及复杂程度。因此，无论疫苗厂还是养殖业对鸡MD疫苗株与野毒株快速、精确鉴别诊断的需求均十分迫切。
利用间接免疫荧光试验虽然能够对MDV野毒进行特异性的鉴别，但是对病毒的分离培养不但需要较高的实验技术，而且与MDV在鸡体内的感染状态密切相关，病毒在鸡体潜伏感染期通常不能够被分离培养，从而影响对鸡群MDV感染的鉴别诊断。利用PCR反应对MDV野毒进行鉴别诊断，虽然具有诊断快速的优势，但是特异性相比间接免疫荧光试验差，容易出现假阳性，并且不能够准确反应鸡群MD疫苗免疫与MDV感染的状态。利用斑点杂交方法能够快速、准确的鉴别I型MDV，但是不能够有效的区别MD疫苗毒与野毒，并且对于结果的判定具有一定的主观性。
专利CN101875978A中公开了一种区分马立克氏病病毒疫苗毒株与强毒株的鉴别方法，通过设计一对独特的引物，能对所有MD血清I型病毒进行有效扩增，不同的病毒扩增出不同大小的片段：CVI988和814疫苗，扩增出730bp左右的条带，而其他野毒MDV扩增出930bp以上的条带，根据条带的大小可以区分疫苗毒株和强毒株。但该方法不能区分血清I型疫苗毒中的血清I型基因缺失疫苗和传代致弱疫苗，以及血清I型基因缺失疫苗和野毒。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒的引物、探针及试剂盒，能够快速、精确、科学、客观的对血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒进行鉴别诊断。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一组引物和探针，所述引物和探针包括：第一对引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示；
和第二对引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示。
本发明的第二方面，提供上述引物和探针在制备鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒的诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明的第三方面，提供一种鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒的试剂盒，所述试剂盒含有上述的引物和探针。
进一步的，所述试剂盒中还包括：阳性标准品和荧光定量PCR反应试剂。
优选的，所述阳性标准品为pMP重组质粒，是由MDV meq基因前450bp与MDV野毒pp38基因的串联序列1324bp克隆入pMD19载体构建而成。
所述荧光定量PCR反应试剂包括：Gene Expression Master Mix buffer和ddH2O。
本发明的第四方面，提供一种鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒的诊断试剂，所述诊断试剂含有上述的引物和探针。
本发明的第五方面，提供上述试剂盒或上述诊断试剂在如下(1)-(5)中任一种中的应用：
(1)鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、血清I型疫苗与野毒株；
(2)检测样品是否感染马立克病毒；
(3)检测样品是否已进行MD疫苗免疫接种；
(4)检测样品进行免疫接种的疫苗类型；
(5)精确检测疫苗毒与野毒拷贝数，明确鸡群疫苗的免疫状态以及野毒感染的进程。
本发明的第六方面，提供一种鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒的方法，包括如下步骤：
采用上述的引物和探针对样品DNA进行荧光定量PCR扩增，根据扩增情况进行判定：
若SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的第一对引物和探针以及SEQ ID NO.4-SEQ IDNO.6所示的第二对引物和探针均能特异性扩增，则为MDV野毒；
若SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的第一对引物和探针不能扩增，而SEQ IDNO.4-SEQ ID NO.6所示的第二对引物和探针能特异性扩增，则为血清I型马立克病毒基因缺失疫苗；
若SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的第一对引物和探针能特异性扩增，而SEQIDNO.4-SEQ ID NO.6所示的第二对引物和探针不能扩增，则为传代致弱疫苗；
若SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的第一对引物和探针以及SEQ ID NO.4-SEQ IDNO.6所示的第二对引物和探针均不能扩增，则为阴性。
优选的，荧光定量PCR扩增的条件为：
50℃ 2分钟；
95℃ 10分钟；
94℃ 15秒，60℃ 1分钟，40个循环。
本发明的有益效果：
(1)使用本发明提供的引物和探针进行荧光定量PCR反应，能够快速、精确、科学、客观的对血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒进行鉴别诊断，并且通过对疫苗毒与野毒拷贝数的精确检测，明确鸡群疫苗的免疫状态以及野毒感染的进程。
(2)本发明不仅可以应用于MDV疫苗、野毒的复制能力研究，具有科研价值；更主要应用于鸡群MDV疫苗免疫效力的监测、MDV野毒感染的检测、MDV疫苗免疫失败的调查、MDV的流行病学分析，进一步推进鸡群MD的免疫防控，具有广阔的市场应用价值。
附图说明
图1：本发明设计引物、探针以及标准品质粒制备的标准曲线；其中，(A)：ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)标准曲线；(B)：FIMDV检测的引物及探针(SEQID NO.4-6)标准曲线。
图2：利用设计引物、探针对血清I型MDV进行荧光定量PCR鉴定；其中，(A)：ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)进行荧光定量PCR，MDV CVI988/Rispens、Md5、GX0101均能有效扩增(对应图中自左向右3条扩增曲线)，对于SC9-1疫苗以及阴性对照不能扩增；(B)：FIMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.4-6)进行荧光定量PCR，MDV SC9-1、Md5、GX0101均能有效扩增(对应图中自左向右3条扩增曲线)，对于CVI988/Rispens疫苗以及阴性对照不能扩增。
图3：利用设计引物、探针对鸡群常见病毒进行荧光定量PCR鉴定；其中，(A)：ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)进行荧光定量PCR。ALV-J、REV、AIV、CAV、ILTV、FPV均不能有效扩增，阳性对照有效扩增(对应图中唯一的扩增曲线)；(B)：FIMDV检测引物及探针(SEQID NO.4-6)进行荧光定量PCR。ALV-J、REV、AIV、CAV、ILTV、FPV均不能有效扩增，阳性对照有效扩增(对应图中唯一的扩增曲线)。
图4：常规PCR对标准品检测的灵敏度；其中，1：101个拷贝数pMP DNA质粒；2：102个拷贝数pMP DNA质粒；3：103个拷贝数pMP DNA质粒；4：104个拷贝数pMP DNA质粒；5：105个拷贝数pMP DNA质粒；M：DNAMarker。
图5：利用设计引物、探针对CVI988/Rispens、SC9-1免疫鸡羽毛囊DNA进行荧光定量PCR检测；其中，(A)：ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)进行荧光定量PCR，能够特异性的检测CVI988/Rispens，并计算出其拷贝数，对于SC9-1不能有效扩增；
(B):FIMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.4-6)进行荧光定量PCR，能够特异性的检测SC9-1，并计算出其拷贝数，对于CVI988/Rispens不能有效扩增。
图6：利用设计引物、探针对Md5感染鸡羽毛囊DNA进行荧光定量PCR检测。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
在本发明具体实施方式中，所述“传代致弱疫苗”为血清I型疫苗，具体为CVI988/Rispens。
正如背景技术所介绍的，鸡MD是危害鸡群最为严重的肿瘤病，虽然有疫苗的免疫，但是依然不能阻止MDV野毒的感染，因此通常情况鸡群多是血清I型MD疫苗(CVI988/Rispens)与MDV野毒共存，这就给MDV野毒的鉴别诊断带来困难。MDV作为疱疹病毒引起潜伏感染是其必须的生物学特性，通常这一感染阶段细胞培养不能分离到病毒，并且病毒基因组拷贝数极低，常规PCR、斑点杂交方法很难精确检测。随着MDV毒力的不断增强，MDV基因缺失疫苗必然与目前普遍使用的CVI988/Rispens疫苗共存，甚至逐步取代CVI988/Rispens。由于MDV基因缺失疫苗是以MD野毒为受体微生物，构建的基因缺失疫苗。目前报道鉴别血清I型MDV疫苗和MD野毒的方法届时均不能有效鉴别血清I型MDV疫苗和MD野毒。基于此，本发明提出了一种鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒的引物、探针及试剂盒。
由于血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒的基因组结构和组成十分相近，对其进行鉴别诊断非常困难。为鉴别血清I型MDV基因缺失疫苗、MDV野毒以及血清I型MDV疫苗，本发明对目前已公开的MDV，尤其克隆纯化的MDV基因组全序列进行了详细的分析比较。本发明在研究中发现，血清I型MDV基因缺失疫苗包括多基因缺失疫苗以及以其构建的载体疫苗，均至少缺失MDV野毒的meq基因的前468bp，因此本申请对比了已知的血清I型MDV疫苗毒和野毒的meq基因前468bp，选择没有出现过SNP(单核苷酸多态性)的基因序列设计引物和探针，因此能够识别所有的血清I型MDV疫苗，但不能识别MDV基因缺失疫苗，由此可以区分血清I型MDV基因缺失疫苗。进一步，针对MDV野毒pp38基因与血清I型MDV疫苗碱基的突变(H19单克隆抗体识别位点)，设计了针对pp38的引物及探针，能够有效的识别MDV野毒，为了增加识别度，人为突变了上述突变位点相邻一个碱基(C-A，SEQ ID NO.4引物3’端倒数第二个碱基)。
本发明所设计的两对引物、探针进行配合使用，二者相辅相成，在设计过程中又进一步充分考虑了双重荧光定量PCR，避免引物、探针之间的相互干扰，最终设计了本申请引物、探针。其中：
第一对引物和探针用于检测血清I型MDV meq基因，其序列如下：
上游引物：ALMDV-F:5’-CCTACAGTCCCGCTGACGAT-3’(SEQ ID NO.1)
下游引物：ALMDV-R:5’-CTGTTGGGGATGTCGTGACTT-3’(SEQ ID NO.2)
探针序列：ALMDV-P:5’-CTCGATCTTTCTCTCGGGTCGACTTCGA-3’(SEQ ID NO.3)。
第二对引物和探针用于检测血清I型MDV野毒pp38基因，其序列如下：
上游引物：FIMDV-F:5’-GAGAGGGAGAGTGGCTGTCAAA-3’(SEQ ID NO.4)
下游引物：FIMDV-R:5’-CTTTCGTCAAGATGTTCATTCCCT-3’(SEQ ID NO.5)
探针序列：FIMDV-P:5’-CTACCGCCTGAGCCCCGGAGGT-3’(SEQ ID NO.6)。
本发明的探针在使用过程中可以标记不同的荧光基团，所述荧光基团为现有技术中常见的荧光基团，标记方法也为常规操作，本发明对此不做具体限定。
本发明利用第一对引物及探针和第二对引物及探针，通过独立荧光定量PCR反应或者双重荧光定量PCR反应，可实现对血清I型MDV疫苗、MDV meq基因缺失疫苗(包括多基因缺失苗以及基因缺失疫苗构建的载体疫苗)和MDV野毒的快速、精确鉴别。
本发明在试验过程中还优化了双重荧光定量PCR条件，在试剂盒的临床应用中最大限度减少操作，既保证灵敏度，又最大限度降低各种污染，确保结果的科学、精确。
本申请在试验过程中，还通过其他的引物设计原则设计了多组不同的引物，并分别进行组合，经反应后分别检测其特异性和扩增效率，以筛选最优的可用于临床检测的引物和探针组合。例如：
针对血清I型MDV meq基因，还设计的引物序列有：
MEQ-F：5’-ACGCAGGGAGCAGACGTACTAT-3’；
MEQ-R：5’-CCATAGGGCAAACTGGCTCAT-3’。
针对血清I型MDV野毒pp38基因，还设计的引物序列有：
上游引物：5’-CTAACCACAGCCTCTCTCC-3’；
下游引物：5’-TGTATCTTTCCTCTGCCTTG-3’。
结果发现，以采用本发明的引物与探针组合(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6)对血清I型MDV疫苗、MDV meq基因缺失疫苗(包括多基因缺失苗)和MDV野毒进行检测的特异性和灵敏度最优。而其他的引物和探针组合则不能对血清I型MDV疫苗、MDV meq基因缺失疫苗(包括多基因缺失苗)和MDV野毒进行有效的区分，容易出现假阳性或假阴性。
MDV不同于其它病毒，长期潜伏感染是其重要特点也是对鸡群最大危害，即使免疫疫苗依然能够感染MDV。以MDV DNA作为阳性标准品不仅制备困难、成本高、稳定性差，而且具有生物安全隐患。本发明提供了具有良好性能的阳性标准品pMP重组质粒。由MDV meq基因前450bp与MDV野毒pp38基因的串联序列1324bp克隆入pMD19载体，构建了pMP重组质粒。利用本发明提供的阳性标准品以及引物、探针，能够对MDV疫苗、MDV野毒进行精确定量，及时掌握鸡群的免疫保护状态以及MDV的感染进程，最大限度保障鸡群的健康养殖。
因此，本发明综合了斑点杂交的精确以及PCR的灵敏优势，完全避免了斑点杂交时间长、依靠主观判断以及PCR假阳性等诸多缺点，设计了引物、探针，系国内外首次有效鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒，并通过对MDV疫苗、MDV野毒精确定量，科学应用于临床MD的防控以及鸡群的健康养殖。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：荧光定量PCR引物和探针的设计
通过对目前已经公开的MDV尤其克隆纯化的MDV基因组全序列进行了详细的比较和分析(本发明的参考序列在NCBI的登录号分别为：CVI988/Rispens-DQ530348，GX0101-JX844666，584A-EU627065，RB1B-EF523390，Md5-AF243438，GA-AF147806，Md11-AY510475，LMS-JQ314003)，特别是目前所有的MD血清I型基因缺失疫苗基因组序列设计出能够鉴别诊断血清I型基因缺失疫苗、血清I型疫苗CVI988/Rispens与MD野毒的引物与探针。
设计的鉴别鸡马立克病血清I型基因缺失疫苗与野毒的引物与探针序列如下：
上游引物：ALMDV-F:5’-CCTACAGTCCCGCTGACGAT-3’(SEQ ID NO.1)
下游引物：ALMDV-R:5’-CTGTTGGGGATGTCGTGACTT-3’(SEQ ID NO.2)
探针序列：ALMDV-P:5’-CTCGATCTTTCTCTCGGGTCGACTTCGA-3’(SEQ ID NO.3)
上游引物：FIMDV-F:5’-GAGAGGGAGAGTGGCTGTCAAA-3’(SEQ ID NO.4)
下游引物：FIMDV-R:5’-CTTTCGTCAAGATGTTCATTCCCT-3’(SEQ ID NO.5)
探针序列：FIMDV-P:5’-CTACCGCCTGAGCCCCGGAGGT-3’(SEQ ID NO.6)
实施例2：荧光定量PCR鉴别方法的建立
1.血清I型MDV的培养
血清I型疫苗CVI988/Rispens购自北京翎羽生物科技有限公司，血清I型基因缺失疫苗SC9-1(记载在专利CN102628053B中)、血清I型MDV Md5、GX0101均由本实验室保存。将液氮中冻存的血清I型MDV迅速在37℃水浴锅中融化，在超净台内加入高压灭菌的1.5ml的离心管中，4℃、2000转/分钟离心3分钟，去尽细胞冻存液，1ml细胞维持液轻轻重悬后适量加入细胞瓶中，放置在37℃，5％的二氧化碳(CO2)培养箱中培养3-5天，待出现MDV典型的蚀斑后，按照消化细胞的方法收集细胞。
2.MDV DNA的提取
约107细胞加入500μl细胞裂解液(蛋白酶K 0.2mg/mL；NaCl100mM；Tris-Cl 10mM；EDTA1mM)，于54℃恒温水浴锅中消化4h，等消化澄清后，加入等体积的苯酚(sigma)抽提2次，氯仿抽提1次。加入1/10体积的3mol/L醋酸钠和2倍体积无水乙醇后，置于-20℃冷却2h，1300转/分钟离心20分钟，沉淀细胞DNA，再用70％乙醇漂洗DNA沉淀后,1300转/分钟离心15分钟，去尽上清。空气中室温自然干燥后，溶解于30～50ul TE Buffer(10mmol Tris-Cl，1mmol EDTA，pH 8.0)中。
3.荧光定量PCR反应
采用20μl的反应体系：冰浴条件下在荧光定量PCR反应管中分别加入各成分：上、下游引物各0.5μM，探针0.2μM，2×Gene Expression Master Mix buffer 10μl，2μl MDV DNA，灭菌双蒸水补齐至20μl。
利用ABI 7500sequence detection system(Applied Biosystems)进行荧光定量PCR反应，
反应程序为50℃ 2分钟；95℃ 10分钟；94℃ 15秒和60℃ 1分钟(40个循环)。
4.阳性标准品的构建及标准曲线的建立
以MDV DNA作为阳性标准品不仅制备困难、成本高、稳定性差，而且具有生物安全隐患。本发明提供了具有良好性能的阳性标准品pMP重组质粒。由商业测序公司合成MDVmeq基因前450bp与MDV野毒pp38基因的串联序列1324bp克隆入pMD19载体，构建了pMP重组质粒。将阳性标准品10倍梯度稀释，荧光定量RT-PCR进行目的基因的扩增，建立以模板DNA拷贝数log值为横坐标，Ct值为纵坐标的标准曲线。ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)标准曲线为：Y＝-3.42x+41.39(y＝Ct，x＝log copy)。FIMDV检测的引物及探针(SEQ IDNO.4-6)标准曲线为：Y＝-3.49x+38.56(y＝Ct，x＝log copy)。如图1所示。
5.特异性试验
以血清I型MDV CVI988/Rispens、SC9-1、Md5、GX0101DNA为模板，ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)进行荧光定量PCR，对于MDV CVI988/Rispens、Md5、GX0101均能有效扩增，对于SC9-1疫苗不能扩增；FIMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.4-6)进行荧光定量PCR，对于MDV SC9-1、Md5、GX0101均能有效扩增，对于CVI988/Rispens疫苗不能扩增。如图2所示。
以鸡群常见的RNA病毒ALV-J、REV、AIV的cDNA以及DNA病毒CAV、ILTV、FPV为模板，ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)、FIMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.4-6)进行荧光定量PCR，均不能有效扩增。如图3所示。
结果显示：ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)、FIMDV检测引物及探针(SEQID NO.4-6)能够特异性的鉴别诊断血清I型基因缺失疫苗、血清I型疫苗与MD野毒。
6.灵敏性试验
设计一对引物(F：5’-TGCAACAATGCGTTCTTAT-3’(SEQ ID NO.7)；R：5’-TTTCTCCAGATTCCACCTC-3’(SEQ ID NO.8))，目的基因212bp，以上述不同稀释倍数稀释的标准品质粒为模板，进行常规PCR反应，比较两种检测方法的灵敏度。荧光定量PCR结果显示，ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)、FIMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.4-6)能够检测10个拷贝数的pMP DNA(见标准曲线)，普通PCR最低只能检测到103个拷贝数的pMP DNA(图4)。
结果表明ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)、FIMDV检测引物及探针(SEQ IDNO.4-6)进行荧光定量PCR的灵敏度是普通PCR的至少100倍，因此具有较高的灵敏度。
实施例3：试剂盒的组成、实验参数的优化及特异性、灵敏性和重复性考察
1.试剂盒的组成：
本实施例的试剂盒用于鉴别诊断血清I型基因缺失疫苗、血清I型疫苗CVI988/Rispens与MD野毒，试剂盒中含有ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)、FIMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.4-6)，阳性标准品质粒以及荧光定量PCR反应试剂。
其中，阳性标准品质粒为pMP重组质粒。由商业测序公司合成MDV meq基因前450bp与MDV野毒pp38基因的串联序列1324bp克隆入pMD19载体，构建而成。
荧光定量PCR反应试剂包括：Gene Expression Master Mix buffer和ddH2O。
2.实验参数的优化：
对试剂盒中的ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)、FIMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.4-6)的双重荧光定量PCR反应条件进行了优化探索，结果显示，ALMDV检测引物、FIMDV检测引物为0.2μM，探针为0.1μM，退火温度为60℃，试剂盒敏感性、检测效果最好。
3.试剂盒的特异性、灵敏性和重复性考察
(1)特异性试验
用试剂盒的ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)和FIMDV检测引物及探针(SEQID NO.4-6)进行独立荧光定量PCR，检测血清I型基因缺失疫苗、血清I型疫苗CVI988/Rispens与MD野毒。结果发现，ALMDV检测引物及探针以血清I型疫苗CVI988/Rispens、MD野毒DNA为模板能进行特异性扩增，血清I型基因缺失疫苗DNA为模板不能扩增；FIMDV检测引物及探针以血清I型基因缺失疫苗、MD野毒DNA为模板能进行特异性扩增，血清I型疫苗CVI988/RispensDNA为模板不能扩增。
用试剂盒的ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)、FIMDV检测引物及探针(SEQID NO.4-6)依据优化条件进行双重荧光定量PCR，检测血清I型基因缺失疫苗、血清I型疫苗CVI988/Rispens与MD野毒。结果见表1。
表1：特异性试验考察结果
以鸡群常见的RNA病毒ALV-J、REV、AIV的CDNA以及DNA病毒CAV、ILTV、FPV为模板，ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)、FIMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.4-6)进行荧光定量PCR，均不能有效扩增。
以上试验结果表明，本发明试剂盒的特异性为100％，具有较强的特异性。
(2)重复性试验
应用该试剂盒，进行该试剂盒的重复性试验。取不同批次的血清I型MDV CVI988/Rispens、SC9-1、Md5、GX0101DNA为模板，利用试剂盒进行重复性检测，发现ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)、FIMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.4-6)能够特异性的鉴别诊断不同批次的血清I型基因缺失疫苗、血清I型疫苗CVI988/Rispens与MD野毒。试验结果证实该试剂盒重复性较强。
(3)灵敏性试验
将pMP DNA稀释成不同浓度，采用该试剂盒进行检测，同时以普通PCR检测作为对比。结果发现，双重荧光定量PCR结果显示，ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)以及FIMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.4-6)能够检测10个拷贝数的pMP DNA，普通PCR最低只能检测到103个拷贝数的pMP DNA。表明该试剂盒进行双重荧光定量PCR的灵敏度是普通PCR的至少100倍，具有较高的灵敏度。
实施例4：本发明试剂盒的临床应用实验
MDV感染的动物实验：将120只1日龄SPF鸡随机分为6个组(每组20只)分别饲养在正压过滤空气的隔离罩内。1日龄时，第1、2组鸡以2000PFU/只的剂量免疫MD基因缺失疫苗SC9-1；第3、4组鸡以2000PFU/只的剂量免疫血清I型MD疫苗CVI988/Rispens。6日龄时，第2、4、5组以1000PFU/只的剂量注射MDV野毒Md5。第6组作为空白对照组。饲养90天，每日观察各组鸡的变化，剖检死亡鸡，计算各组鸡的死亡率、肿瘤率以及免疫保护率。
结果发现，SC9-1疫苗对SPF鸡的免疫保护效果为95％，CVI988/Rispens疫苗对SPF鸡的免疫保护效果为70％，Md5攻毒组鸡的死亡率为100％，肿瘤率为25％，肿瘤分布在肝脏、脾脏以及心脏等内脏器官。以上结果表明MDV严重危害养鸡业，导致未经免疫的鸡群较高的死亡率以及肿瘤率；SC9-1疫苗免疫保护效果明显优于CVI988/Rispens。
表2各组鸡的死亡率、肿瘤率以及MD疫苗的免疫保护效果。
疫苗免疫 MDV攻毒 死亡率 肿瘤率 免疫保护指数
SC9-1 - 0％ 0％ -
SC9-1 Md5 5％ 0％ 95％
CVI988/Rispens - 0％ 0％ -
CVI988/Rispens Md5 30％ 10％ 70％
- Md5 100％ 25％ -
- - 0％ 0％ -
利用本发明的试剂盒(实施例3)检测各组鸡羽毛囊DNA中MDV的复制增殖情况。无论ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)、FIMDV检测引物及探针(SEQ IDNO.4-6)进行独立荧光定量PCR还是双重荧光定量PCR，结果均显示对于阴性对照鸡的羽毛囊DNA不能有效扩增。ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)对于CVI988/Rispens、Md5能够特异性的扩增，FIMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.4-6)对于SC9-1、Md5能够特异性的扩增。MD疫苗的免疫能够显著降低MDV野毒的复制，但是不能阻止MDV的感染。临床试验应用结果显示，该试剂盒特异性的鉴别诊断血清I型基因缺失疫苗SC9-1、血清I型疫苗CVI988/Rispens与MDV野毒Md5。该试剂盒ALMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.1-3)在CVI988/Rispens免疫鸡6天的羽毛囊DNA能够检测到CVI988/Rispens，在Md5攻毒鸡7天的羽毛囊DNA能够检测到Md5。FIMDV检测引物及探针(SEQ ID NO.4-6)在SC9-1免疫鸡6天的羽毛囊DNA能够检测到SC9-1，在Md5攻毒鸡7天的羽毛囊DNA能够检测到Md5。依据疫苗以及病毒的拷贝数可以科学分析MD疫苗的免疫状态以及MDV野毒感染的进程(图5和图6)。
以上实施例表明，本发明设计的引物、探针建立的血清I型基因缺失疫苗与野毒的鉴别诊断方法能够特异性的鉴别诊断血清I型基因缺失疫苗、血清I型疫苗与MDV野毒；最低能够检测10个拷贝数的MDV DNA，灵敏度高；不同批次MDV检测结果表明重复稳定性好，可以应用于MD疫苗、野毒的复制能力研究，具有科研价值；更可以应用于鸡群MD疫苗免疫效力的监测、MDV野毒感染的检测、MD疫苗免疫失败的调查、MDV的流行病学分析，进一步推进鸡群MD的免疫防控，具有广阔的市场应用价值。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒的引物、探针及试剂盒
<130> 2018
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
cctacagtcc cgctgacgat 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ctgttgggga tgtcgtgact t 21
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ctcgatcttt ctctcgggtc gacttcga 28
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gagagggaga gtggctgtca aa 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ctttcgtcaa gatgttcatt ccct 24
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ctaccgcctg agccccggag gt 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
tgcaacaatg cgttcttat 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
tttctccaga ttccacctc 19

Claims (10)

1.一组引物和探针，所述引物和探针包括：第一对引物和探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.3所示；
和第二对引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示。
2.权利要求1所述的引物和探针在制备鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒的诊断试剂或试剂盒中的应用。
3.一种鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：阳性标准品和荧光定量PCR反应试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品为pMP重组质粒，是由MDV meq基因前450bp与MDV野毒pp38基因的串联序列1324bp克隆入pMD19载体构建而成。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应试剂包括： Gene Expression Master Mix buffer和ddH2O。
7.一种鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒的诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂含有权利要求1所述的引物和探针。
8.权利要求3-6任一项所述的试剂盒或权利要求7所述的诊断试剂在如下(1)-(5)中任一种中的应用：
(1)鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、血清I型疫苗与野毒株；
(2)检测样品是否感染马立克病毒；
(3)检测样品是否已进行MD疫苗免疫接种；
(4)检测样品进行免疫接种的疫苗类型；
(5)精确检测疫苗毒与野毒拷贝数，明确鸡群疫苗的免疫状态以及野毒感染的进程。
9.一种鉴别血清I型马立克病毒基因缺失疫苗、传代致弱疫苗与野毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用权利要求1所述的引物和探针对样品DNA进行荧光定量PCR扩增，根据扩增情况进行判定：
若SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的第一对引物和探针以及SEQ ID NO.4-SEQ IDNO.6所示的第二对引物和探针均能特异性扩增，则为MDV野毒；
若SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的第一对引物和探针不能扩增，而SEQ ID NO.4-SEQID NO.6所示的第二对引物和探针能特异性扩增，则为血清I型马立克病毒基因缺失疫苗；
若SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的第一对引物和探针能特异性扩增，而SEQ IDNO.4-SEQ ID NO.6所示的第二对引物和探针不能扩增，则为传代致弱疫苗。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：荧光定量PCR扩增的条件为：50℃2分钟；95℃10分钟；94℃15秒，60℃1分钟，40个循环。
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