CN102634489B - 一种重组火鸡疱疹病毒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒（rHVT-VP2），其实际上是将含鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的表达盒与火鸡疱疹病毒（HVT）结合在一起，获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒rHVT-VP2，该病毒同时也是一种马立克氏病和鸡传染性法氏囊病的二联重组疫苗，通过将由启动子控制下的VP2基因插入到HVT基因组中，rHVT-VP2不仅可以对鸡MD起到良好的免疫保护作用，而且在具有高IBDV母源抗体水平的商品化鸡群中可以诱导抗IBDV的持久保护性免疫。
Description
技术领域
本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒(rHVT-VP2)，其基因组中包含有启动子控制下的鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2基因。
背景技术
鸡马立克氏病(Marek’s disease，MD)和鸡传染性法氏囊病(Infectiousbursal disease，IBD)是两种影响家禽生产最常见的免疫抑制性疾病。其中IBD是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起，主要危害3周龄～12周龄青年鸡的急性、高度接触性传染病。IBDV主要造成鸡的主要免疫器官-法氏囊的损伤，从而导致鸡体严重的免疫抑制，致使感染鸡只对其它疾病的易感性增加以及对疫苗免疫应答能力的下降，给养禽业造成巨大的损失(Mundt E，Beyer J，Müller H.Identification of a novel viral pro-tein ininfectious bursal disease virus-infected cells.JGenVirol，1995，176：437-443.)。
目前商品化的传染性法氏囊病活毒疫苗分为弱毒、中毒和强毒三类。弱毒活疫苗对SPF鸡安全，但对有母源抗体鸡群的免疫保护力很差。中等毒力和强毒疫苗的免疫保护力虽然要高很多，但由于具有一定的致病力而损伤法氏囊。同时，由于母源抗体的干扰以及IBDV的特点，在实际应用中传统疫苗可形成不可避免的免疫空白期。因此，近些年来，对能够突破以上壁垒的新型IBD疫苗的要求越发强烈。
MD是由马立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)引起的鸡淋巴组织增生性疾病，以外周神经、虹膜、皮肤、肌肉和内脏器官的淋巴样细胞浸润，增生和肿瘤形成为特征。MDV疫苗株可作为活病毒载体来表达外源基因，对其分子生物学的研究表明，MDV基因组较大，并已经确定了多处病毒复制非必需区，其本身是优良的病毒表达载体。相较于其它病毒载体，MDV作为载体具有独特的优势(Sakaguchi M.，Nakamura H，Maedn H，et al.Protection of chickens withor without maternal antibodies against both Marek′s and Newcastlediseases by one time vaccination with recombinant vaccine of Marek′sdisease virus type 1.1998，Vaccine 16：472-9)，MDV为严格的细胞结合型，可以突破母源抗体的干扰，适合早期免疫，通过鸡胚免疫，操作更方便。并且，一次免疫可诱发终生的细胞和体液免疫应答，节约成本。基于以上特点，以MDV为载体进行的活疫苗研究倍受青睐，而火鸡疱疹病毒(HVT)为其中的一种α疱疹病毒，因其与MDV抗原相关性，同时又由于HVT与MDV有明显区别对鸡无致病性，被广泛用作预防马立克氏病(MD)的活疫苗。
因此如何能够以火鸡疱疹病毒(HVT)为载体进行鸡传染性法氏囊病(IBD)的活疫苗研究成为一项亟待攻克的难题。
发明内容
本发明的发明人提供了一种重组火鸡疱疹病毒(rHVT-VP2)，其实际上是将含IBDV的VP2基因与火鸡疱疹病毒HVT结合在一起，获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒rHVT-VP2，该病毒同时也是一种马立克氏病和鸡传染性法氏囊病的二联疫苗，通过将由启动子控制下的IBDV VP2基因(IBDV-VP2基因表达盒)插入到HVT基因组中，rHVT-VP2不仅可以对鸡MD起到良好的免疫保护作用，而且在具有高IBDV母源抗体水平商品化鸡群中可以诱导抗IBDV的持久保护性免疫。
发明人对该重组后的病毒毒株进行了生物保藏，其保藏编号为：CGMCCNo.5890。该重组病毒的DNA序列模式图如附图1所示，具体如下：
在本发明中，发明人将含有传染性法氏囊病毒VP2基因的表达盒插入HVT基因组中，插入的区域为HVT基因组中病毒生长非必需的区域。HVT基因组中的数个复制非必需区已经有报道，本发明IBDV-VP2基因的表达盒插入HVT基因组中的位置位于HVT FC126基因组(ACCESSION NO.NC_002641)的UL55基因和LORF4基因之间，更具体的位置为HVT FC126基因组(ACCESSION NO.NC_002641)的112071bp-112088bp位置之间，即在HVT FC126基因组(ACCESSION NO.NC_002641)中的序列A(CTAAATGTTCATAGAGGTCTTTGGGCTATATGTTATTAAATAAAATAATT)和序列B(GTTTAATGTTAGTTTATTCAATGCATTGGTTGCAAATATTCATTACTTCT)之间。
为了达到上述的目的，发明人首先获得了含鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因的表达盒，具体如下：
IBDV-VP2表达盒包括启动子序列(Murine cytomegalovirus enhancer DNAsequence)、鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因及SV40终止序列。启动子序列(Murine cytomegalovirus enhancer DNA sequence)(ACCESSION NO.L06570)依据参考文献设计(K Dorsch-Hasler，A long and complex enhancer activatestranscription of the gene coding for the highly abundant immediate earlymRNA in murine cytomegalovirus，PNAS：1985 vol.82 no.248325-8329；M Messerle，Structure and expression of murine cytomegalovirusimmediate-early gene 2，J.Virol.March 1991 vol.65 no.31638-1643)；IBDV VP2序列参考Cu-1wt株设计(ACCESSION NO.AF362747)。该表达盒的基因序列如Seq ID No：1所示，序列的示意图如附图2所示，图中下划线部分为启动子调控序列，斜体部分为IBDV-VP2基因，加粗部分为SV40终止序列；该表达盒最终按上述特征按现有方法合成，也可交由专业公司合成。
将上述制备的表达盒克隆入PUC19载体中，该质粒命名为PUC19-VP2，其构建过程如附图3所示；
然后，在上述质粒PUC19-VP2的基础上，发明人构建了含有HVT基因组非必需区的重组质粒PUC19-UL-VP2作为同源重组质粒，如附图4所示，具体构建方法如下：
按常规方法提取HVT病毒基因组DNA，根据Genebank中发表的HVT-FC126株的全基因序列，设计扩增UL55和LORF4区域的左右同源臂，用来扩增左同源臂的引物如下：ULL-F：AAGCTTacaagtaaaatacccaacac(前端添加Sal I酶切位点)，基因序列如Seq ID No：2所示，ULL-R：GTCGACaattattttatttaataaca(前端添加Sal I酶切位点)，基因序列如Seq ID No：3所示，ULL预期扩增大小为3000bp，其基因序列如Seq ID No：4所示；用来扩增右同源臂的引物如下，ULR-F：GAATTCgtttaatgttagtttattca(前端添加EcoR I酶切位点)，基因序列如Seq IDNo：5所示，ULR-R：gaattctttgttccttgaaatgccga(前端含有EcoR I酶切位点)，基因序列如Seq ID No：6所示，ULR预期扩增大小约为1400bp，其基因序列如Seq ID No：7所示，具体的构建过程如附图5所示。
重组病毒rHVT(rHVT-VP2)的构建：
利用同源重组的方法构建重组病毒rHVT-VP2，步骤如下：
(1)如Morgan等所述制备HVT FC126毒株的病毒DNA的方法(Morgan RW，Cantello JL，McDermott CH.Transfection of chicken embryo fibroblastswith Marek′s disease virus DNA.Avian diseases 1990，34(2)：345-351.)获得感染性HVT基因组DNA，经同源重组质粒PUC19-UL-VP2与上述提取的感染性HVT基因组DNA利用磷酸钙转染法共转染入鸡胚成纤维细胞(CEF)中。
(2)将经转染的CEF细胞培养于一次性塑料六孔细胞培养板中，并进行温育，直到病毒噬斑变得可见。
(3)可见的噬斑包括重组病毒以及亲本野生型病毒，因此重组病毒要从野生型病毒中通过一系列的有限稀释法得以纯化。每次纯化时，采用抗IBDV-VP2的单克隆抗体证实VP2基因的表达，重复纯化操作直到每个获得的噬斑均由抗IBDV-VP2抗体染色呈现阳性，纯化的重组病毒为rHVT-VP2；
重组病毒rHVT-VP2的验证：
在IBDV-VP2表达盒的两侧设计引物，引物序列如下：rHVT-VP2-JC-F：TGAATAAACTAACATTAAAC，其基因序列如Seq ID No：8所示；rHVT-VP2-JC-R：TGTTATTAAATAAAATAATT，其基因序列如Seq ID No：9所示。以上述获得的rHVT-VP2为模板利用此引物进行扩增，可以扩增出3083bp的特异性片段，经测序验证，此3083bp的片段除含有两队引物序列外，还含有3043bp的IBDV-VP2表达盒序列，可知获得的重组病毒rHVT-VP2中成功插入了含鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因的表达盒；
将100PFU病毒量的rHVT-VP2接种于6孔细胞培养板上。培养4d出现明显噬斑后，将生长液倒掉，用冷的丙酮∶乙醇(3∶2)固定液固定10min，PBS洗1次，每个孔中加入0.5mL(1∶100稀释)IBDV-VP2单抗，放置于37℃恒温培养箱中反应1h，用PBS清洗3次，每孔加上0.5mL FITC标记抗鼠IgG荧光抗体，放置于37℃恒温生化培养箱中反应1h，用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察，细胞噬斑出现了特异性绿色荧光，而对照组HVT感染CEF细胞后无荧光，表明IBDV-VP2基因能够良好的正确表达。
为了验证所获得的重组病毒rHVT-VP2体内和体外的稳定性，发明人还进行了rHVT-VP2的体外体内的稳定性实验如下：
将rHVT-VP2在CEF细胞中传代50次，利用上述引物(rHVT-VP2-JC-F；rHVT-VP2-JC-R)进行扩增，结果仍能扩增出3083bp的条带，表明所发明的rHVT-VP2在细胞中传50代后仍保持稳定。
将2500PFU的rHVT-VP2皮下接种SPF鸡。在接种3、4、5及6周后，从接种的鸡只收集外周血并接种CEF细胞，培养5-7天，待生长出噬斑后，用抗IBDV-VP2的单克隆抗体进行染色，所有噬斑均能表达IBDV VP2基因，表明rHVT-VP2在体内传代是稳定的。
进一步的，发明人将重组病毒rHVT-VP2应用于含有母源抗体的商品鸡中的免疫实验中，具体步骤如下：
120只1日龄商品鸡，随机分成3组，通过ELISA方法检测其母源抗体为阳性。第一组接种rHVT-VP2，免疫剂量为2500PFU/只。第二组在14日龄时接种BJ836活疫苗，免疫剂量为每只鸡1个推荐免疫剂量。第三组为非免疫攻毒组，第四组为非免疫非攻毒组。35日龄进行IBDV CJ801强毒攻击，攻击后5d剖杀，进行肉眼病理观察并取免疫中枢器官法氏囊组织用10％甲醛固定以作组织病理学观察。结果表明，在含有母源抗体的商品鸡中，rHVT-VP2免疫组的保护率(93.3％)仅略低于BJ836活疫苗的保护率(96.7％)。
同时，发明人还将重组病毒rHVT-VP2制备成疫苗，以方便进行免疫操作，疫苗的制备方法如下：
rHVT-VP2接种鸡胚成纤维细胞，转瓶接种密度为每1cm2面积接种1000-2000PFU的重组病毒，接种后，每日观察1-2次，一般在接种后48-72小时，有70％以上单层细胞出现典型的细胞病变(CPE)时，倒去培养液，加入适量胰酶消化液，在室温下消化10分钟左右，细胞单层出现疏松拉网接近脱离瓶壁现象时，立即加入与消化液等量的含10％牛血清的营养液，停止消化。轻轻摇动转瓶，使细胞全部脱离瓶壁，离心收集的细胞用超声波裂解后加入适量SPGA稳定剂，摇匀后分装冻干。
综上所述，本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒(rHVT-VP2)，其实际上是将含鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因与火鸡疱疹病毒HVT结合在一起，获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒，该病毒rHVT-VP2同时也是一种马立克氏病和鸡传染性法氏囊病的二联疫苗，通过将由启动子控制下的VP2基因插入到HVT基因组中，rHVT-VP2不仅可以对鸡MD起到良好的免疫保护作用，而且在具有高IBDV母源抗体水平商品化鸡群中可以诱导抗IBDV的持久保护性免疫。
发明人对本发明所公开的重组的火鸡疱疹病毒(rHVT-VP2)进行了生物保藏，具体保藏信息如下：
保藏信息
保藏时间：2012年3月13日
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏编号：CGMCC No.5890
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
分类命名：马立克氏病病毒
附图说明
图1为rHVT-VP2重组病毒的DNA序列模式图；
图2为rHVT-VP2重组病毒中的含有传染性法氏囊病毒VP2(IBDV-VP2)基因的表达盒的序列示意图；
图中下划线部分为启动子调控序列(Murine cytomegalovirus enhancer DNAsequence)，斜体部分为IBDV-VP2基因，加粗部分为SV40终止序列；
图3为PUC19-VP2构建过程示意图；
图4为重组质粒PUC19-UL-VP2的结构图；
图5为PUC19-UL-VP2构建过程示意图；
图6为实施例3中扩增结果电泳示意图。
具体实施方式
实施例1含鸡传染性法氏囊病毒的VP2(IBDV-VP2)基因的表达盒的制备：
IBDV-VP2基因表达盒序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。IBDV-VP2表达盒包括启动子序列(Murine cytomegalovirus enhancer DNA sequence)、鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因及SV40终止序列。启动子序列(Murinecytomegalovirus enhancer DNA sequence)(ACCESSION NO.L06570)依据参考文献设计(K Dorsch-Hasler，A long and complex enhancer activatestranscription of the gene coding for the highly abundant immediate earlymRNA in murine cytomegalovirus，PNAS：1985 vol.82 no.248325-8329；M Messerle，Structure and expression of murine cytomegalovirusimmediate-early gene 2，J.Virol.March 1991 vol.65 no.31638-1643)；IBDV VP2序列参考Cu-1wt株设计(ACCESSION NO.AF362747)。该表达盒的基因序列如Seq ID No：1所示，序列的示意图如附图2所示。将上述制备的表达盒克隆入PUC19载体中，该质粒命名为PUC19-VP2，其构建过程如附图3所示；
实施例2重组病毒rHVT-VP2的构建：
利用同源重组的方法构建重组病毒rHVT-VP2，步骤如下：
(1)在上述质粒PUC19-VP2的基础上发明人构建了含有HVT基因组非必需区的重组质粒PUC19-UL-VP2作为同源性质粒，其结构如附图4所示，具体步骤如下：除下述内容外，其他均采用现有技术中的构建方法，
按常规方法提取HVT病毒基因组DNA，根据Genebank中发表的HVT-FC126株的全基因序列，设计扩增UL55和LORF4区域的左右同源臂，用来扩增左同源臂的引物如下：ULL-F：GTCGACacaagtaaaatacccaacac(前端添加Sal I酶切位点)，基因序列如Seq ID No：2所示，ULL-R：GTCGACaattattttatttaataaca(前端添加Sal I酶切位点)，基因序列如Seq ID No：3所示，ULL预期扩增大小为3000bp，其基因序列如Seq ID No：4所示；用来扩增右同源臂的引物如下，ULR-F：GAATTCgtttaatgttagtttattca(前端添加EcoR I酶切位点)，基因序列如Seq IDNo：5所示，ULR-R：gaattctttgttccttgaaatgccga(前端含有EcoR I酶切位点)，基因序列如Seq ID No：6所示，ULR预期扩增大小约为1400bp，其基因序列如Seq ID No：7所示，具体的构建过程如附图5所示。
(2)如Morgan等所述制备HVT FC126毒株的病毒DNA的方法(Morgan RW，Cantello JL，McDermott CH.Transfection of chicken embryo fibroblastswith Marek′s disease virus DNA.Avian diseases 1990，34(2)：345-351.)获得感染性HVT基因组DNA，步骤如下：每瓶细胞(约1×106细胞)用胰酶消化后，3000r/min离心5min，去上清。在细胞沉淀中加500μL消化缓冲液(100mmol/LNaCl，10mmol/L Tris-Cl pH8.0，0.25mmol/L EDTA pH8.0，0.5％SDS)悬浮细胞后，加入5μL蛋白酶K(100μg/mL)，56℃消化2h，用等体积的苯酚/氯仿抽提一次，转移上清到一支新的离心管，加入上清1/10体积3mol/L醋酸钠后混匀，用2倍体积无水乙醇-20℃沉淀2h，12000r/min离心20min。DNA沉淀经70％乙醇洗涤一次，空气中自然干燥后，溶解于50μL TE Buffer(10mmol/LTris-Cl，1mmol/L EDTA，pH8.0)中，待用。经同源重组质粒PUC19-UL-VP2与上述提取的感染性HVT基因组DNA利用磷酸钙转染法共转染入鸡胚成纤维细胞(CEF)中。
(3)将经转染的CEF细胞培养于一次性塑料六孔细胞培养板中，并进行温育，直到病毒噬斑变得可见。
(4)可见的噬斑包括重组病毒以及亲本野生型病毒，因此重组病毒要从野生型病毒中通过一系列的有限稀释法得以纯化。每次纯化时，采用抗IBDV-VP2的单克隆抗体证实VP2基因的表达，重复纯化操作直到每个获得的噬斑均由抗IBDV-VP2抗体染色呈现阳性，纯化的重组病毒为rHVT-VP2；
在IBDV-VP2表达盒的两侧设计引物，引物序列如下：rHVT-VP2-JC-F：TGAATAAACTAACATTAAAC，其基因序列如Seq ID No：8所示；rHVT-VP2-JC-R：TGTTATTAAATAAAATAATT，其基因序列如Seq ID No：9所示。以上述获得的rHVT-VP2为模板利用此引物进行扩增，可以扩增出3083bp的特异性片段，经测序验证，此3083bp的片段除含有两队引物序列外，还含有3043bp的IBDV-VP2表达盒序列，可知获得的重组病毒rHVT-VP2中成功插入了含鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因的表达盒。
将100PFU病毒量的rHVT-VP2接种于6孔细胞培养板上。培养4d出现明显噬斑后，将生长液倒掉，用冷的丙酮∶乙醇(3∶2)固定液固定10min，PBS洗1次，每个孔中加入0.5mL(1∶100稀释)IBDV-VP2单抗，放置于37℃恒温培养箱中反应1h，用PBS清洗3次，每空加上0.5mL FITC标记抗鼠IgG荧光抗体，放置于37℃恒温生化培养箱中反应1h，用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察，细胞噬斑出现了特异性绿色荧光，而对照组HVT感染F细胞后无荧光，表明IBDV-VP2基因能够良好的正确表达。
实施例3rHVT-VP2的体外体内的稳定性实验
将rHVT-VP2在CEF细胞中传代50次，利用上述引物(rHVT-VP2-JC-F；rHVT-VP2-JC-R)进行扩增，结果仍能扩增出3083bp的条带，如附图6所示，表明所发明的rHVT-VP2在细胞中传50代后仍保持稳定。
将2500PFU的rHVT-VP2皮下接种SPF鸡。在接种3、4、5及6周后，从接种的鸡只收集外周血并接种CEF细胞，培养5-7天，待生长出噬斑后，用抗IBDV-VP2的单克隆抗体进行染色，所有噬斑均能表达IBDV VP2基因，表明rHVT-VP2在体内传代是稳定的。
实施例4将重组病毒rHVT-VP2应用于含有母源抗体的商品鸡中的免疫实验
120只1日龄商品鸡，随机分成4组，通过ELISA方法检测其母源抗体为阳性。第一组接种rHVT-VP2，免疫剂量为2500PFU/只。第二组在14日龄时接种BJ836活疫苗，免疫剂量为每只鸡1个推荐免疫剂量。第三组为非免疫攻毒组，第四组为非免疫非攻毒组。35日龄进行IBDV CJ801强毒攻击，攻击后5d剖杀，进行肉眼病理观察并取免疫中枢器官法氏囊组织用10％甲醛固定以作组织病理学观察。免疫效果见表1，通过表1内容可知在含有母源抗体的商品鸡中，rHVT-VP2免疫组的保护率(93.3％)仅略低于BJ836活疫苗的保护率(96.7％)。
表1rHVT-VP2对商品鸡的免疫保护效果
| Vaccines | Challenged with | Mortality | IBD lesions |
| BJ836 | CJ801 | 0/30(0％) | 1/30(3.3％) |
| rHVT-VP2 | CJ801 | 0/30(0％) | 2/30(6.7％) |
| - | CJ801 | 7/30(23％) | 30/30(100％) |
| - | - | 0/30(0％) |
实施例5将重组病毒rHVT-VP2制备成疫苗方法
rHVT-VP2接种鸡胚成纤维细胞，转瓶接种密度为每1cm2面积接种1000-2000PFU的重组病毒，接种后，每日观察1-2次，一般在接种后48-72小时，有70％以上单层细胞出现典型的细胞病变(CPE)时，倒去培养液，加入适量胰酶消化液，在室温下消化10分钟左右，细胞单层出现疏松拉网接近脱离瓶壁现象时，立即加入与消化液等量的含10％牛血清的营养液，停止消化。轻轻摇动转瓶，使细胞全部脱离瓶壁，离心收集的细胞用超声波裂解后加入适量SPGA稳定剂，摇匀后分装冻干即可。
Claims (4)
1.一种重组火鸡疱疹病毒rHVT-VP2，其保藏编号为：CGMCCNo.5890。
2.如权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒rHVT-VP2，其特征在于：其携带在启动子序列控制下的鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因的IBDV-VP2表达盒，该表达盒的基因序列如Seq ID No:1所示。
3.如权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒rHVT-VP2，其特征在于：其可以应用于在禽类宿主中诱导抗禽类疱疹病毒和鸡传染性法氏囊病毒的保护性免疫。
4.如权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒rHVT-VP2，其特征在于：其可以作为疫苗株。
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| CN1772886A (zh) * | 2005-09-02 | 2006-05-17 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株 |
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| CN102634489A (zh) | 2012-08-15 |
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