CN112501133B - 一种伪狂犬病毒qd株三基因缺失致弱株 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种猪伪狂犬病毒QD株gE^‑/gI^‑/11K^‑三基因缺失致弱株，是对猪伪狂犬病病毒株进行gE和gI和11K基因进行缺失后制成的。所述的猪伪狂犬病病毒株，为猪伪狂犬病病毒株PRV‑QD株，其保藏编号为CGMCC No.10266。本发明制备的疫苗株可有效预防猪伪狂犬病，而且作为抗原的猪伪狂犬病病毒为基因缺失株，通过水平传播感染在小鼠体连续传代，均未见毒力返强现象，遗传性稳定，符合猪伪狂犬病病毒缺失疫苗株无毒力返强的标准，制成的疫苗能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

Description

一种伪狂犬病毒QD株三基因缺失致弱株

技术领域

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种伪狂犬病毒QD株gE^-/gI^-/11K^-三基因缺失致弱株。

背景技术

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的急性传染病。PRV为疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，主要感染对象为猪也可以感染牛、羊、犬等家畜和部分野生动物。猪是PRV的主要传染源，主要表现为母猪繁殖性障碍和仔猪死亡，15日龄内的仔猪死亡率高达100％。PRV的传播给养猪业带来的巨大损失。目前无特效药物治疗伪狂犬病，疫苗是用于防范此病的主要方法。现今使用最广泛的PRV疫苗株是Bartha-K61，Bartha株可为猪场提供良好的保护。但近来Bartha株的免疫不能完全保护猪只免受PRV野毒株的攻击，因此需要针对流行毒株制备相应的基因缺失疫苗，以用于PRV流行毒株的防控工作。

由于伪狂犬病毒基因组庞大，通过直接的基因编辑方法无法达到期望的效率。目前常用方法有如下两种，第一种方法是同源重组的方法，即依据伪狂犬病毒的复制特性将病毒基因组和重组质粒共同转染易感细胞发生自然重组，通过蚀斑纯化的方法得到重组的单克隆病毒。这种方法操作相对简便，具有较高的成功率。第二种方法是人工染色体的方法，即将完整的伪狂犬病毒整合入特殊的大肠杆菌基因组中，此后的重组工作均在人工染色体上操作，然后将编辑过的基因组转染易感细胞得到重组病毒。由于细菌生长迅速便于筛选极大地增加后期操作效率，但人工基因组的构建门槛较高不易得，不适合快速操作。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病毒QD株gE^-/gI^-/11K^-三基因缺失致弱株，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种猪伪狂犬病毒基因缺失株，是对猪伪狂犬病病毒株进行gE和gI和11K基因进行缺失后制成的。

所述的猪伪狂犬病病毒株，为猪伪狂犬病病毒株PRV-QD株，其保藏编号为 CGMCCNo.10266。

本发明所提供的猪伪狂犬病毒基因缺失株可以用作疫苗株来制备疫苗；

所述的疫苗为活疫苗。

本发明再一个方面提供一种猪伪狂犬病病毒疫苗，由抗原和保护剂组成的，其中抗原包含有上述的猪伪狂犬病毒基因缺失株。

本发明制备的疫苗株可有效预防猪伪狂犬病，而且作为抗原的猪伪狂犬病病毒为基因缺失株，在保留免疫原性的同时极大的降低了病毒毒力且遗传稳定性良好，符合猪伪狂犬病病毒缺失疫苗株无毒力返强的标准，制成的疫苗能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

附图说明

图1：重组质粒构建示意图；

图2：pB-arm质粒酶切鉴定图，其中M为DL5000 Marker；1为pB-arm质粒EcoRI单酶切片段；

图3：pB-EGFP-arm质粒酶切鉴定图，其中M为DL5000 Marker；1为 pB-EGFP-armEcoRI单酶切片段；

图4：重组病毒蚀斑纯化照片图；

图5：纯化蚀斑重组鉴定图，其中上EGFP重组鉴定扩增片段；下gE/gI基因缺失鉴定扩增片段，M为DL2000 Marker；P为PRV母本毒株阳性对照；1～6为不同蚀斑鉴定；

图6：纯化病毒绿色荧光鉴定图(×200)；

图7：PRV QD-gE-/gI-株PCR鉴定图，其中M为DL5000 Marker；1为PRV 母本毒株对照扩增片段；2为基因缺失毒株扩增片段；

图8：PRV QD-gE-/gI-株gE/gI基因mRNA转录鉴定图，其中M为DL2000 Marker；1为PRV母本毒株gE mRNA扩增片段；2为PRV母本毒株gI mRNA扩增片段；3为PRV母本毒株11KmRNA扩增；4～为6PRV QD-gE-/gI-/11K-gE、 gI、11K mRNA扩增；

图9：毒株增殖曲线图。

具体实施方式

本发明所使用的猪伪狂犬病病毒PRV-QD流行毒株(猪伪狂犬病病毒QD株疱疹病毒Ⅰ型)(porcine herpesvirus Type)，由我实验室分离鉴定与保存。 2015年3月6日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10266，保藏地址中国北京。

对PRV-QD毒株进行PCR检测，测序后进行blast分析，发现保该病毒株的 gE基因与2012年之后报道的猪伪狂犬病病毒的相对应的序列虽然存在至少2个氨基酸的差异，但是亲缘关系较近，均处于一个相对独立的分支中，与之前分离的毒株亲缘关系较远。且与最近分离的毒株具有相同的分子特征，即在gE基因第48位和第492-496位各有1个天冬氨酸的插入。因此可以推测上述的差异正是导致已有的猪伪狂犬病病毒疫苗免疫效果不佳的原因所在。

该毒株作100倍稀释后，与等量猪伪狂犬病病毒抗血清中和，病毒均能被高免血清特异性中和；而与等量猪细小病毒、猪流感病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒抗血清中和组，细胞呈现明显的细胞病变，可见该病毒特异性好。

在该保藏毒株的基础上，通过同源重组方法缺失gE、gI、11K三个基因片段来降低野毒株毒力，从而可以直接使用基因缺失株来制备活疫苗。

实施例1：构建PRV-QD的gE、gI、11K三个基因缺失株

1、重组载体的构建

以PRV HLJ8株(Genebank：KT824771)为参考，设计缺失短独特区(Unique Short，US)完整US7(gI)基因，完整的US8(gE)基因以及US9(11K)基因。分别设计引物扩增缺失基因两侧同源臂，引物见表1。

表1：引物的序列信息表

分别使用5'arm F/5'arm R和3'arm F/3'arm R引物建立50μL扩增体系： 2×PrimeSTAR HS GC Buffer 25μL；dNTP(2.5mM each)4μL；Forward primer 1μL；Reserveprimer 1μL；PRV基因组DNA 1μL；PrimeSTAR HS 0.5μL；去离子水17.5μL。反应条件：98℃预变性3min；98℃10s，55℃5s，72℃ 1kb/min，扩增30循环。扩增产物分别为同源重组所需的5’端arm片段和3’ arm片段，两片段送由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。提取pBluescript II KS(+)质粒，经BamHI和SalI双酶切获得线性质粒片段。使用ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit试剂盒50℃连接15min，将5’arm和3’arm片段同时连入pBluescript II KS(+)载体中并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，获得重组质粒经测序正确后命名为pB-arm。

以pcDNA3.1-EGFP质粒为模板，以EGFPcas F/EGFPcas R为引物扩增EGFP 表达盒片段，反应体系和条件同上。表达盒序列原件包括CMV启动子、EGFP阅读框及bGH polyA加尾信号。扩增EGFP表达盒片段和pB-arm质粒经EcoRI酶切，使用DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒4℃连接过夜，连接产物转化DH5 α大肠杆菌感受态细胞。

提取PRV QD株病毒基因组DNA，分别扩增得到约824bp的5’arm片段和 878bp的3’arm片段。将5’arm和3’arm片段同时连入pBluescript II KS(+) 克隆质粒，通过引入的EcoRI酶切位点酶切后，可获得约4700bp线性质粒片段，图2。测序正确后命名为pB-arm。EGFP表达盒序列通过EcoRI酶切位点引入到 pB-arm质粒中。连接质粒通过EcoRI酶切鉴定，可获得约4700bp的载体片段和 1750bpEGFP表达盒片段。经测序正确后命名为pB-EGFP-arm。

2、PRV-QD株重组毒株的构建与筛选

PRV-QD株按MOI＝0.1接种PK-15细胞，接毒细胞37℃培养箱内继续培养 48h～72h至细胞完全病变。病变细胞置于-80℃冰箱内冻存，反复冻融三次充分裂解细胞，5000g离心15min去除细胞碎片并吸取上清。细胞上清液提取PRV病毒基因组DNA备用。无内毒素提取pB-EGFP-arm质粒。生长状态良好的PK-15 细胞接种6孔板，待细胞覆盖孔底约60％～70％时进行转染。参照磷酸钙转染试剂盒说明书，每孔转染3μg pB-EGFP-arm质粒和7μg PRV-QD株病毒基因组DNA。转染后48h，待细胞出现明显病变后収毒，反复冻融三次后细胞上清按1％体积比传代后再次収毒保存。

二次收毒液使用细胞完全培养基5倍倍比稀释，稀释液接种6孔板，每个稀释梯度接种4孔。病毒吸附3h后，弃去接毒液并使用PBS充分洗涤，吸干洗涤液后均匀平铺2％血清的DMEM琼脂，待凝固后置于37℃培养箱内继续培养直至产生肉眼可见的蚀斑。

转染后经48h即可观察到明亮的绿色荧光及CPE。将增殖病毒倍比稀释后 48～72h，在稀释倍数适宜的孔中可观察到病毒蚀斑(图4)

荧光倒置显微镜蓝色激发光下观察蚀斑，选择带有绿色荧光的最大稀释倍数孔，标记荧光蚀斑并使用白色枪头挑取，白枪头在300μL完全培养基中充分振荡洗涤。挑取的病毒液置于-80℃冰箱中保存，即纯化一代。按照上述流程进一步单克隆纯化病毒十代，提取病毒基因组DNA进行检测。以PRV-QD株基因组 DNA为对照，使用Retest引物测定整合是否正确，Deltest引物测定缺失基因。选取鉴定正确毒株命名为PRV-QD gE-/gI-/11K-/EGFP+。

经多次蚀斑纯化后使用重组引物鉴定能够扩增出约1500bp的重组片段，而母本毒株无扩增产物。EGFP表达盒已整合入单克隆病毒的基因组中且位置正确。使用缺失片段检测引物检测重组病毒未得到扩增产物，而母本毒株有大小约670bp的扩增产物。说明纯化的病毒单克隆已得到纯化，无母本毒株掺杂(图 5)。纯化病毒增殖后可观察到明亮的绿色荧光，并产生PRV典型的CPE。母本毒株仅能产生CPE而无荧光显示(图6)。纯化重组正确的毒株，扩大培养并命名为PRV-QD gE-/gI-/11K-/EGFP+株。

3、PRV-QD株基因缺失株的构建与筛选

PK-15细胞培养PRV-QD gE-/gI-/11K-/EGFP+株并提取毒株基因组DNA。无内毒素提取pB-arm质粒。病毒基因组DNA 7μg和3μg pB-arm质粒共转染6 孔板，方法如前所述。按照相同方法挑取不含有EGFP绿色荧光的蚀斑，并连续单克隆纯化十代。提取纯化毒株基因组DNA，以PRV-QD株为对照，使用Deltest 引物测定缺失基因是否正确。选取鉴定正确毒株命名为PRV-QD gE-/gI-/11K- 株。

提取PRV-QD gE-/gI-/11K-/EGFP+株基因组DNA与pB-arm质粒共转染 PK-15细胞，转染后48h可观察到细胞CPE及绿色荧光。通过上述相同多轮蚀斑纯化方法挑取无荧光的蚀斑，最终获得纯化的缺失毒株。ReTestF2/ReTestR引物鉴定，纯化毒株扩增条带单一约为2000bp。同样条件下PRV QD株扩增条带约为5400bp(图7)。所有片段经测序进一步确认扩增正确。

纯化毒株未检测到gE、gI和11K基因mRNA转录。PRV QD母本毒株在相同的检测条件下，gE扩增出约590bp片段，gI检测引物可扩增出约520bp的条带， 11K检测引物测得160bp扩增条带(图8)。扩增条带送测序进一步确认正确。纯化的缺失毒株命名为PRV QD-gE-/gI-/11K-株。

实施例2：PRV-QD gE-/gI-/11K-株的免疫活性

1、PRV-QD gE-/gI-/11K-株稳定性及生长特性测定

PRV QD株和PRV QD-gE-/gI-株分别按照MOI 0.1比例接种铺满单层的PK-15 细胞，置于培养箱内继续培养。每隔12h收取病毒液测定TCID50，并绘制生长曲线。PRV QD-gE-/gI-株连续传代至15代次，使用RetestF2/RetestR引物扩增重组区域并测序鉴定。

2、PRV-QD gE-/gI-/11K-小鼠半数感染量

65只6周龄Balb/c雌性小鼠5只一组，随机分配13组。PRV QD株及PRV QD-gE-/gI-细胞上清液使用生理盐水10倍梯度倍比稀释，稀释至10-6倍。小鼠腹部皮下注射0.2mL各稀释度病毒液，阴性对照组注射0.2mL生理盐水。隔离饲养并每天观察小鼠死亡情况。PRV QD株采用相同方法测定作为母本毒株对照。

结果表明通过同源重组的方法将PRV QD流行株的gE、gI和11K基因敲除，获得的基因缺失毒株毒力显著减弱，小鼠LD50由4.16降到1.67，为制备弱毒疫苗或灭活疫苗提供了基础。

母本PRV QD株和PRV-QD gE-/gI-/11K-/EGFP+生长趋势相同，均在接种后 48h达到峰值，PRV QD株TCID50为10-8.64/0.1mL，PRV QD-gE-/gI-/11k-株 TCID50为10-8.36/0.1mL，病毒培养滴度无显著性差异(P＞0.05)(图9)。PRV QD-gE-/gI-/11k-株连续传代至15代，PCR检测突变区域并测序，突变区域未发生改变。

Balb/c小鼠攻毒后攻毒部位红肿，发病小鼠搔抓攻毒部位直至完全溃烂死亡。PRVQD母本毒株在10倍稀释度下72h内全部死亡，而PRV QD-gE-/gI-/11k- 缺失毒株未出现死亡。剩余攻毒组在72～120h内陆续出现死亡，最终PRV QD株 LD50为10-4.16/0.2mL，PRVQD-gE-/gI-/11k-株为10-1.67/0.2mL，阴性对照无症状(表2)。

表2：小鼠半数致死量测定表

结果表明通过缺失gE、gI、11K三个基因，使得PRV QD株毒力显著减弱， LD50由4.16降至1.67。

3 PRV QD-gE-/gI-/11k-株疫苗制备

常规方法培养PK-15细胞，PRV QD-gE-/gI-/11k-株按MOI为1比例接种铺满单层的PK-15细胞，当超过90％细胞出现CPE是收获细胞，置于-80℃冰箱中反复冻融3次充分破碎细胞并低速离心去除细胞碎片。根据收获病毒液的毒价，进行适当的稀释，稀释后的病毒液与保护剂的体积比为1:1.5，充分混合，其中蔗糖终浓度为20％，明胶终浓度为4.8％。每瓶装2.5mL，并置冻干机中进行冻干。成品检验中包含的性状观察、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、剩余水分及真空度等项目均参照《中国兽药典》进行。

安全检验试验使用6周龄的BALB/C小鼠10只，肌肉注射含10头份量疫苗，观察21日，应全部健活，无任何局部或全身不良反应。

效力检验试验使用6周龄BALB/C小鼠10只，每只肌肉注射疫苗1头份。 21日后，连同10只对照小鼠，后肢肌肉注射100倍LD50剂量，观察14日。对照组应至少8只死亡或出现伪狂犬特异性症状，免疫组应至少8只保护。

疫苗使用效果检验，试验前选取15头30日龄仔猪，随机分成3组，每组5 头并称重，分别注射疫苗株Bartha-K61、PRV QD-gE-/gI-/11k-株疫苗和生理盐水。对照组每头注射2mL生理盐水，其它两组后肢肌肉注射105TCID50病毒剂量的疫苗。免疫后第4周进行攻毒，肌肉注射107TCID50 PRV QD株病毒,观察临床症状，计算保护率情况。

结果显示PRV QD-gE-/gI-/11k-株冻干后含量大于107TCID50/0.1ml。冻干疫苗微黄色海绵状疏松圆块，样品易与瓶身脱离且加入水后能够迅速溶解。随机抽检样品均无细菌、霉菌生长，无支原体生长，外源病毒检测呈阴性。疫苗剩余水分约为2％，所有抽检样品真空度合格。

安全检验试验经10倍剂量注射后小鼠无不良反应，且全部健活。小鼠效力检测实验显示对照组小鼠全部死亡，免疫小鼠全部键活。

疫苗使用后攻毒结果表明，PRV QD-gE-/gI-/11k-疫苗组组保护率明显高于Bartha-K61组，保护率分别为100％和20％。表明本发明的PRV QD-gE-/gI-/11k- 疫苗在临床上的免疫效果明显优于现在广泛使用的Bartha-K61疫苗。检测效果表明，本发明的疫苗对猪伪狂犬病病毒区域流行株(CGMCC No.10266)的免疫效果好于其它疫苗。证明作为母本毒株的猪伪狂犬病病毒(CGMCC No.10266) 具有遗传上的特异性。

Claims (4)

1.一种猪伪狂犬病毒基因缺失株，其特征在于，所述的猪伪狂犬病毒基因缺失株是对猪伪狂犬病病毒株进行gE和gI和11K基因进行缺失后制成的；所述的猪伪狂犬病病毒株的保藏编号为CGMCC No.10266。

2.权利要求1所述的猪伪狂犬病毒基因缺失株在制备疫苗中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为活疫苗。

4.一种猪伪狂犬病病毒疫苗，其特征在于，所述的猪伪狂犬病病毒疫苗的抗原包含有权利要求1所述的猪伪狂犬病毒基因缺失株。

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