CN113073083A - 犬细小病毒弱毒株、及其制备的疫苗组合物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种犬细小病毒弱毒株JM35株，其保藏号为CCTCC NO.V201965。本发明还提供了包含免疫量的犬细小病毒弱毒株JM35株或其培养物的疫苗组合物，本发明的疫苗组合物不仅能针对不同血清型犬细小病毒、和不同地域来源的犬细小病毒进行完全的预防和保护，同时还能阻断犬细小病毒的连续感染。

Description

犬细小病毒弱毒株、及其制备的疫苗组合物和应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及犬细小病毒弱毒株、及其制备的疫苗组合物和应用。
背景技术
犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)是世界范围内存在的一种高发病率、高死亡率、病毒性疾病，伴随着生态环境的变化及动物和病毒的进化，其宿主已由传统的犬科(包括犬、狐狸、貉子等)、浣熊科和鼬科(水貂等)动物扩展到食肉目所有8个科及偶蹄目猪科、灵长目猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物，并且CDV的宿主范围呈现不断扩大的趋势。
犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)于1978年首次被发现，目前流行于世界各地。犬细小病毒是引起犬急性出血性肠炎和幼犬心肌炎的病原，主要危害犬，尤其是2～6月龄幼犬。该病发病急、病程短、死亡率高、传染性强，对犬、狐狸、水貂、貉子和狼等均具有很大的危害。
临床上CPV单独感染约占30％左右，与其他病毒(包括CDV、CCV、CAV、RV、CPIV)的混合感染高达50％以上，特别是混合感染的病例治愈率比单纯感染的低70％。
目前商品化的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗中，犬瘟热病毒疫苗株(Onderstepoort株、Snyder Hill株)为美洲-1型，而国内主要流行亚洲-1型，同样的，犬细小病毒疫苗株(NL-35-D株、154株)均为早期出现的CPV-2型，随着犬细小病毒的不断进化，CPV-2型毒株已经被突变株new CPV-2a型、new CPV-2b型、CPV-2c型所代替，而目前国内主要流行new CPV-2a型，并且国内流行的new CPV-2a型毒株与CPV-2型毒株在核苷酸、氨基酸水平上存在差异，不能对犬进行有效保护。
特别是这些商品化进口疫苗自引入国内起，犬瘟热病毒、犬细小病毒单独或混合感染的临床病例均未得到显著抑制或减少，仍然给宠物犬、养犬业和毛皮经济动物等养殖行业造成极大危害和严重的损失。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种new CPV-2a型犬细小病毒弱毒株，所述犬细小病毒弱毒株具有安全性高和良好的免疫原性的特点，其制备的疫苗能够抵抗现有流行株感染，且对不同宿主的感染均有良好的预防和控制作用。
为此，本发明提供犬细小病毒JM35株，保藏号为CCTCCNO.V201965。
犬细小病毒JM35株(Canine Parvovirus,Strain JM35)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201965，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2019年10月22日。
致病性试验表明，犬细小病毒JM35株培养1代至100代之间，对犬致病力显著降低。犬在接种后观察10天，不出现临床症状，剖检组织器官无变化。因此，该病毒与亲本强毒犬细小病毒JM株相比，致病力显著降低，是人工致弱的病毒株。
免疫原性试验表明，犬细小病毒JM35株培养至第100代，仍具有良好的免疫原性。犬在接种后14天，可抵御强毒犬细小病毒JM株的攻击。同时，未接种JM35株培养物的犬，则不能抵御犬瘟热病毒JM株的攻击，全部发病。
毒力返强试验表明，培养1代至100代之间的病毒，接种后在犬体内连续继代多次，不发生返强。因此，病毒接种犬群后，不会重新演变为强毒而发病，安全性有保证。
与其犬细小病毒亲本强毒株相比，VP2基因的63位核苷酸由A→G发生稳定同义突变；VP2基因的1660位核苷酸由A→G稳定突变，导致VP2蛋白氨基酸序列具有以下突变位点：N554D；基因组5’端非编码区稳定插入1个拷贝的51bp序列。
作为本发明的一种实施方式，所述犬细小病毒JM35株VP2基因的第63位核苷酸发生稳定同义突变，由A→G，VP2基因的第1660位核苷酸稳定突变，由A→G；所述犬细小病毒JM35株基因组4541～4591位为插入的51bp序列，所述51bp序列如SEQ ID NO.1所示。
犬细小病毒JM35株第1代至第100代的培养物，病毒各基因编码的氨基酸共性出现导致VP2蛋白N554D氨基酸变异，基因组4541～4591位插入51bp序列，如SEQ ID NO.1所示。
犬细小病毒JM35株不同代次培养物病毒基因编码的氨基酸出现的共性的特征性变化很有可能是其亲本强毒株毒力降低的原因，同时这些变化并未导致其免疫原性的变化。
本发明的犬细小病毒弱毒株其VP2蛋白氨基酸序列发生的点突变、5’端插入的51bp序列，较亲本强毒株毒性降低，且具有遗传稳定性。
本发明提供还提供了一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的所述的犬细小病毒JM35株或其培养物，所述犬细小病毒JM35株培养物为1～110代次的培养物，所述犬细小病毒JM35株或其培养物含量为≥105.0FAID50/头份。
本发明的疫苗组合物能对现有流行株进行保护，不仅具有预防效果，还能治疗感染的犬只，更可阻断犬细小病毒的连续感染。
本发明的疫苗组合物能对现有犬细小病毒流行株多个血清型newCPV-2a型强毒、new CPV-2b型强毒、CPV-2c型强毒进行保护，保护率100％(5/5)，说明了本发明提供的犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗具有广谱的免疫原性，对不同血清型犬细小病毒均能提供完全保护。
本发明的疫苗组合物免疫不同地区发病犬后，均可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％保护，说明本发明的犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗在临床能治疗感染了犬细小病毒的犬，具有很好的保护力，针对不同地域犬细小病毒感染显示出很好的免疫保护和安全性。
本发明犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗具有很好的保护力，可阻断犬细小病毒的连续感染本发明的组合物的成分或组分的量优选地是免疫有效量。所述免疫有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬细小病毒JM35株含量为105.0～106.0FAID50/头份。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述疫苗组合物还包括冻干保护剂。
还可以包含可用于本发明的可药用载体或者稀释剂的其他实例包括稳定剂，如SPGA、糖类(例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、蛋白质，如白蛋白或者酪蛋白、含有蛋白质的物质，如牛血清或者脱脂乳和缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。
特别当将这种稳定剂加入疫苗时，疫苗非常适于冷冻干燥。因此，在该实施方案的更优选的形式中，活的减毒疫苗是冷冻干燥的形式。作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述的疫苗组合物进一步包含免疫量的犬瘟热病毒HL001-M3株或其培养物，所述犬瘟热病毒HL001-M3株保藏号为CCTCC NO.V201940。
犬瘟热病毒HL001-M3株(Canine Distemper Virus,StrainHL001-M3)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.V201940，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2019年6月19日。本发明的疫苗组合物中，犬瘟热病毒HL001-M3株为亚洲-1型，能对国内主要流行野毒株进行完全保护，保护率100％(5/5)。
本发明的二联疫苗组合物能对犬瘟热病毒国内主要流行野毒株、犬细小病毒国内主要流行野毒株进行完全保护，且针对现有流行株显示出比现有商品化疫苗更好的免疫保护和安全性。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒HL001-M3株培养物为1～80代的培养物。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒HL001-M3株含量为≥104.5FAID50/头份。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒HL001-M3株含量为104.5～105.5FAID50/头份。
本发明还提供了一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：步骤(1)扩增所述犬细小病毒JM35株或其培养物；以及步骤(2)在所述步骤(1)扩增的犬细小病毒JM35株或其培养物中添加冻干保护剂，混匀。
作为本发明的一种优选的实施方式，在本发明所述的制备疫苗组合物的方法中，所述犬细小病毒弱毒株培养物包括犬细小病毒弱毒株1～100代的培养物。
任选地，可以向疫苗中加入具有佐剂活性的一种或多种化合物。根据本发明的活的减毒的犬细小病毒不一定需要这种佐剂来实现功效，但是特别对应包含根据本发明的活的减毒的犬细小病毒和来自另一致病病毒或微生物的抗原性物质的组合疫苗，将值得加入佐剂。佐剂是免疫系统的非特异性刺激剂，它们增强宿主对疫苗的免疫应答。本领域中已知的佐剂的实例是弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、ISCOMs(免疫刺激复合体，参考例如欧洲专利EP 109942)、皂苷、矿物油、植物油，和Carbopol。
因此，在该实施方案的优选形式中，根据本发明的活的减毒疫苗包含佐剂。
本发明还涉及一种制备上述包含犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗的方法：(1)分别培养犬瘟热病毒弱毒株、犬细小病毒弱毒株；(2)混合犬瘟热病毒弱毒株和犬细小病毒弱毒株；以及(3)加入冻干保护剂。
本发明提供的所述疫苗组合物在制备预防和治疗犬细小病毒感染的药物中的应用。
本发明的犬细小弱毒株具有稳定的生物学特性，且具有良好的免疫原性，安全可靠，制备的弱毒活疫苗能够产生较高水平的抗体，能够对流行株犬细小强毒攻击具有良好的保护效果，且对不同宿主感染犬细小病毒均具有良好的保护效果。
本文所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制犬瘟热病毒和/或犬细小病毒感染或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使犬瘟热病毒和/或犬细小病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。
具体实施例
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1犬细小病毒JM35株的获得
1.取生长良好的猫肾细胞(F81细胞)，用胰酶消化，接种于细胞瓶内，以含有90％～98％体积比的RPMI 1640培养液和2％～10％体积比的新生牛血清的细胞生长液(pH调整为6.8～7.2)于33℃～37℃条件下培养，用于接种病毒。
2.将犬细小病毒JM株同步接种上述传代细胞，用含有90％～98％体积比的RPMI1640培养液和2％～10％体积比的新生牛血清的细胞生长液(pH调整为6.8～7.2)于33℃～37℃条件下继续培养，于72h～120h后，当细胞80％以上发生病变时，收获细胞培养病毒液。
3.重复上述步骤连续传代培养获得犬细小病毒弱毒株，将获得的犬细小病毒弱毒株进行测序，结果显示VP2基因的第63位核苷酸由A→G发生稳定同义突变；第1660位核苷酸由A→G稳定突变，导致VP2蛋白N554D氨基酸变异；基因组4541～4591位插入51bp序列。将该犬细小病毒弱毒株命名为犬细小病毒JM35株，提交保藏。
实施例2犬细小病毒JM35株生物学特性研究
1.致病性试验
2～3月龄的健康易感抗原抗体阴性犬15只随机分成3组，每组5只，分组和攻毒情况见表1。
表1犬细小病毒JM35株致病性试验动物分组
组别 接种用毒株 接种剂量
1 JM35株 皮下注射4ml(10<sup>6.5</sup>FAID<sub>50</sub>/ml)
2 JM株 皮下注射4ml(10<sup>6.5</sup>FAID<sub>50</sub>/ml)
3 RPMI 1640培养基 皮下注射4ml
病毒接种后观察10日，每日对犬的精神、食欲、粪便等临床表现进行观察记录，具体结果见表2。
表2犬细小病毒JM35株对犬的致病性
Figure BDA0002355570600000071
结果显示，犬细小病毒JM株可以导致犬100％发病(5/5)，而犬细小病毒JM35株无临床症状。
致病性试验表明，犬细小病毒JM35株与亲本强毒株JM株相比，致病力显著降低，是致弱的病毒株。
同时，为验证犬细小病毒JM35株不同代次致病力的稳定性，用第1代、20代、40代、60代、80代、100代的犬细小病毒JM35株培养物，各接种一组犬细小病毒抗原抗体阴性犬(5只)，皮下注射4ml(106.5FAID50/ml)/只，5头犬作为对照组。每日观察、记录犬的临床变化，直至接种10天。
结果显示，第1代、20代、40代、60代、80代、100代的犬细小病毒JM35株培养物，接种后观察10天，无临床症状。
不同代次致病性试验表明，犬细小病毒JM35株不同代次培养物致病力显著降低，是致弱的病毒株。
2.免疫原性试验
在免疫后第14天，对犬细小病毒JM35株接种的犬5只，以及对照组5只，均用犬细小病毒JM株以皮下注射4ml(106.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的精神、食欲、粪便等临床表现进行观察记录，具体结果见表3。
表3犬细小病毒JM35株对犬的免疫原性
Figure BDA0002355570600000081
Figure BDA0002355570600000091
结果显示，犬细小病毒JM35株接种过的犬全部保护，而对照组犬全部发病。
免疫原性试验表明，犬细小病毒JM35株具有良好的免疫原性，能对犬细小病毒JM株攻击产生良好的保护作用。
同时，为验证犬细小病毒JM35株不同代次免疫原性的稳定性，对分别免疫第1代、20代、40代、60代、80代、100代的犬细小病毒JM35株培养物后第14天，各免疫组连同对照组均用犬细小病毒JM株以皮下注射4ml(106.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的精神、食欲、粪便等临床表现进行观察记录。
结果显示，第1代、20代、40代、60代、80代、100代的犬细小病毒JM35株培养物接种过的犬全部保护，对照组犬全部发病。
不同代次免疫原性试验表明，犬细小病毒JM35株不同代次培养物均具有良好的免疫原性，能对犬细小病毒JM株攻击产生良好的保护作用。
3.毒力返强安全性试验
将犬细小病毒JM35株第1代病毒液(106.5FAID50/ml)通过皮下注射4ml的方式接种8周龄左右健康易感比格犬，同时设不接种对照犬。
选取病毒载量高的肠道，经研磨处理后作为继代接种物，如此连续接种5次。
每次接种后，每日观察犬的精神状态、食欲、体温等临床表现，剖检时观察犬的肠道病变情况。
结果显示，犬细小病毒JM35株第1代在犬体内连续传代5次，接种犬的精神状态、食欲、体温等均未见异常，剖检观察接种犬的肠道均未见明显病理变化，表明犬细小病毒JM35株第1代未发生毒力返强，是一株安全性良好的弱毒株。
分别将犬细小病毒JM35株第20代、40代、60代、80代、100代病毒液参照上述病毒返强试验步骤进行验证，结果显示接种犬精神状态、食欲、体温等均未见异常，剖检观察接种犬的肠道均未见明显病理变化，表明犬细小病毒JM35株第20代、40代、60代、80代、100代未发生毒力返强。
因此，犬细小病毒JM35株不会重新演变为强毒而引起发病，安全性有保证。
4.基因序列分析
将犬细小病毒JM35株第1代至第100代的培养物，用PCR方法，进行基因组扩增(不同代次培养物分别扩增)。将获得的基因扩增产物回收、纯化，连接到测序质粒载体中，测定病毒基因的核苷酸序列，并用计算机软件转化成病毒的氨基酸序列。用序列分析软件，将获得氨基酸序列与亲本强毒株JM株氨基酸序列进行比较，描述病毒氨基酸序列特征。
结果显示，犬细小病毒JM35株第1代至第100代的培养物，病毒各基因编码的氨基酸共性出现导致VP2蛋白N554D氨基酸变异，基因组4541～4591位插入51bp序列。
表明，犬细小病毒JM35株不同代次培养物病毒基因编码的氨基酸出现的共性的特征性变化很有可能是其亲本强毒株毒力降低的原因。
实施例3犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗的制备
1.病毒的增殖
将实施例1制备的犬细小病毒JM35株毒种同步接入F81细胞悬液，加入含有90％～98％体积比的RPMI 1640培养液和2％～10％体积比的新生牛血清的细胞生长液(pH调整为6.8～7.2)于33℃～37℃条件下培养。待细胞病变达到80％左右时冻融收毒，并进行病毒含量测定，置低温保存。
2.保护剂的配制
每100ml去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置高压蒸气灭菌(121℃30min)。
3.疫苗的制备
将上述制备并保存的病毒液与保护剂按1:1(体积比)混合，冻干。疫苗含量具体配比见表4。
表4犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗含量配比
组分 疫苗1(FAID50)/头份 疫苗2(FAID50)/头份
JM35株抗原 10<sup>5.0</sup> 10<sup>6.0</sup>
保护剂(V/V) 50％ 50％
实施例4犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗的免疫原性试验
28日龄以上的犬细小病毒抗原抗体阴性犬15只随机分成3组，每组5只，免疫实施例3制备的犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗。第4组免疫疫苗1，第5组免疫疫苗2，第6组为对照组。免疫14日后攻毒，均用犬细小病毒JM株以皮下注射4ml(106.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的精神、食欲、粪便等临床表现进行观察记录。具体结果见表5。
表5犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗的免疫原性试验结果
Figure BDA0002355570600000111
结果显示，采用实施例3制备的犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗免疫犬后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护，而对照组犬攻毒后全部发病。
证明了两个试验组犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗具有很好的保护力，显示出很好的免疫保护和安全性。
实施例5犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗广谱性试验
28日龄以上的犬细小病毒抗原抗体阴性犬30只随机分成6组，每组5只，免疫实施例3制备的犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗。第7组～第9组分别免疫疫苗1，第10组～第12组为对照组。免疫14日后攻毒，均以皮下注射4ml(106.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，第7组、第10组试验犬用犬细小病毒SD15株(new CPV-2a型)强毒攻毒；第8组、第11组试验犬用犬细小病毒S0425株(new CPV-2b型)强毒攻毒；第9组、第12组试验犬用犬细小病毒F4株(CPV-2c型)强毒攻毒；攻毒后每日对犬的精神、食欲、粪便等临床表现进行观察记录。具体结果见表6。
表6犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗的广谱性试验结果
Figure BDA0002355570600000121
结果显示，采用实施例3制备的犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗免疫犬后，可阻断犬细小病毒流行株多个血清型感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)，而对照组犬攻毒后全部发病。
证明了本发明提供的犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗具有广谱的免疫原性，对不同血清型犬细小病毒均能提供完全保护。
实施例6犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗的临床试验
分别挑选北京、陕西、江苏、湖南四地发生犬细小病毒感染的犬场，对未出现临床症状的犬进行隔离，采集肛拭子进行PCR检测，并免疫实施例3制备疫苗1，每日对犬的精神、食欲、粪便等临床表现进行观察记录。具体结果见表7。
表7犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗的临床试验免疫结果
Figure BDA0002355570600000131
结果显示，采用实施例3制备的犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗免疫不同地区发病犬后，均可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％保护(治疗)，说明本发明的犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗在临床能治疗感染了犬细小病毒的犬。
证明了本发明犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗具有很好的保护力，针对不同地域犬细小病毒感染显示出很好的免疫保护和安全性。
进一步将免疫前感染犬细小病毒的犬在逐步恢复正常后每组(13～16组)随机选取5只，另再选取犬细小病毒抗原抗体阴性犬5只作为对照，均用犬细小病毒JM株以皮下注射4ml(106.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的精神、食欲、粪便等临床表现进行观察记录。具体结果见表8。
表8犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗的临床试验攻毒结果
Figure BDA0002355570600000141
结果显示，各免疫过实施例3制备的犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗的犬，在攻毒后均未出现临床症状，能为犬提供100％(5/5)保护；对照组犬攻毒后全部发病。
进一步证明了本发明犬细小病毒JM35株弱毒活疫苗具有很好的保护力，可阻断犬细小病毒的连续感染(治疗)。
实施例7犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗的制备
1.病毒的增殖
将犬瘟热病毒HL001-M3株毒种同步接种Vero细胞悬液，以含有90％～98％体积比的DMEM培养液和2％～10％体积比的新生牛血清的细胞生长液(pH调整为6.8～7.2)于33℃～37℃条件下培养。待80％细胞病变后，收获病毒，测定病毒滴度，置低温保存。
2.保护剂的配制
每100ml去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置高压蒸气灭菌(121℃30min)。
3.疫苗的制备
将上述制备并保存的犬瘟热病毒HL001-M3株病毒液和实施例3制备并保存的犬细小病毒JM35株病毒液按比例混合，并与保护剂按1:1(体积比)混合，冻干。疫苗含量具体配比见表9。
表9犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗含量配比
组分 疫苗3(FAID50)/头份 疫苗4(FAID50)/头份
HL001-M3株抗原 10<sup>4.5</sup> 10<sup>5.5</sup>
JM35株抗原 10<sup>5.0</sup> 10<sup>6.0</sup>
保护剂(V/V) 50％ 50％
实施例8犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗的免疫原性试验
28日龄以上的犬瘟热、犬细小病毒抗原抗体阴性犬30只随机分成6组，每组5只，免疫实施例7制备的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗。第18组、第19组免疫疫苗3，第20组、第21组免疫疫苗4，第22组、第23组为对照组。
第18组、第20组和第22组免疫21日后攻毒，均用犬瘟热病毒HL001株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表10。
表10犬二联活疫苗犬瘟热部分免疫原性试验结果
Figure BDA0002355570600000151
结果显示，采用实施例7制备的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗免疫犬后，可阻断犬瘟热病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)，而对照组犬攻毒后全部发病。
第19组、第21组和第23组免疫14日后攻毒，均用犬细小病毒JM株以皮下注射4ml(106.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的精神、食欲、粪便等临床表现进行观察记录。具体结果见表11。
表11犬二联活疫苗犬细小部分免疫原性试验结果
Figure BDA0002355570600000161
结果显示，采用实施例7制备的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗免疫犬后，可阻断犬细小病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)，而对照组犬攻毒后全部发病。
证明了本发明提供的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗具有很好的保护力，显示出很好的免疫保护和安全性，有效预防犬瘟热、犬细小病毒病的发生。
实施例9犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗免疫原性对比试验
将45日龄犬瘟热、犬细小病毒抗原抗体阴性犬30只随机分成6组，5只/组。第24组、第25组免疫实施例7制备的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗；第26组、第27组免疫商品化犬瘟热、细小病毒二联活疫苗(Onderstepoort株)；第28组、第29组为对照组。
第24组、第26组和第28组免疫21日后攻毒，均用犬瘟热病毒HL001株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表12。
表12犬二联活疫苗犬瘟热部分免疫原性对比试验结果
Figure BDA0002355570600000162
Figure BDA0002355570600000171
结果显示，采用实施例7制备的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗免疫犬后，可阻断犬瘟热病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)；对照组犬攻毒后全部发病；而现有商品化的疫苗不能对犬完全保护。
第25组、第27组和第29组免疫14日后攻毒，均用犬细小病毒JM株以皮下注射4ml(106.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的精神、食欲、粪便等临床表现进行观察记录。具体结果见表13。
表13犬二联活疫苗犬细小部分免疫原性对比试验结果
Figure BDA0002355570600000172
结果显示，采用实施例7制备的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗免疫犬后，可阻断犬细小病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)，对照组犬攻毒后全部发病；而现有商品化的疫苗不能对犬完全保护。
证明了犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗具有很好的保护力，针对现有流行株显示出比现有商品化疫苗更好的免疫保护和安全性。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 普莱柯生物工程股份有限公司
<120> 犬细小病毒弱毒株、及其制备的疫苗组合物和应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
tggtatacaa taactgtaag aaatagaaga acatttagat catagttagt a 51

Claims (10)

1.犬细小病毒JM35株，保藏号为CCTCC NO.V201965。
2.根据权利要求1所述的犬细小病毒JM35株，其中，所述犬细小病毒JM35株VP2基因的第63位核苷酸发生稳定同义突变，由A→G，VP2基因的第1660位核苷酸稳定突变，由A→G；所述犬细小病毒JM35株基因组4541～4591位为插入的51bp序列，所述51bp序列如SEQ IDNO.1所示。
3.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求1或2所述的犬细小病毒JM35株或其培养物，所述犬细小病毒JM35株培养物为1～110代次的培养物。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述犬细小病毒JM35株或其培养物含量为≥105.0FAID50/头份；优选地，所述犬细小病毒JM35株含量为105.0～106.0FAID50/头份。
5.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括冻干保护剂。
6.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述的疫苗组合物进一步包含免疫量的犬瘟热病毒HL001-M3株或其培养物，所述犬瘟热病毒HL001-M3株保藏号为CCTCCNO.V201940。
7.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述犬瘟热病毒HL001-M3株培养物为1～80代的培养物。
8.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述犬瘟热病毒HL001-M3株含量为≥104.5FAID50/头份；优选地，所述犬瘟热病毒HL001-M3株含量为104.5～105.5FAID50/头份。
9.一种制备权利要求3所述疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：
步骤(1)扩增所述犬细小病毒JM35株或其培养物；
步骤(2)在所述步骤(1)扩增的犬细小病毒JM35株或其培养物中添加冻干保护剂，混匀。
10.权利要求3～8所述疫苗组合物在制备预防和治疗犬细小病毒感染的药物中的应用。
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