CN101942419A

CN101942419A - 犬细小病毒弱毒疫苗株及其应用

Info

Publication number: CN101942419A
Application number: CN 201010244838
Authority: CN
Inventors: 刘大飞; 张洪英; 曲联东; 王牟平; 刘立奎
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2010-07-30
Filing date: 2010-07-30
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2030-07-30
Also published as: CN101942419B

Abstract

本发明公开了犬细小病毒弱毒疫苗株及其应用。本发明将所分离的犬细小病毒强毒株通过细胞上传代，培育了犬细小病毒弱毒疫苗株，其微生物保藏号是：CGMCC No.3841。安全性和免疫原性试验结果表明，本发明弱毒疫苗株CPV-YNR株对同源强毒攻击的犬可以提供很好的保护力，具有良好的免疫原性，本发明弱毒疫苗株CPV-YNR可制备成单苗或联苗，可有效预防或治疗由犬细小病毒所致疾病。本发明弱毒疫苗株CPV-YNR遗传性稳定，具有免疫持久、效果好、安全可靠、保存期长等优点。

Description

犬细小病毒弱毒疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及一株病毒弱毒疫苗株，尤其涉及一株由犬细小病毒强毒株CPV-YN传代致弱的弱毒疫苗株CPV-YNR，本发明还涉及该弱毒疫苗株在制备预防或治疗由犬细小病毒所致疾病的药物中的用途，属于犬细小病毒的防制领域。

背景技术

犬细小病毒于1978年首次被发现(AppelM J，Scott FW，CarmichaelL E.Isolation and immunization studies of a canine parco-like virus from dogs withhaemorrhagic enteritis.Vet Rec，1979，105(8)：156-159.)，此后本病流行于世界各地，我国于1982年证实存在犬细小病毒感染(梁士哲，渠川玫，魏喜仁，等.犬传染性肠炎的研究I-腹泻犬粪便中检出的细小病毒颗粒.上海畜牧兽医通迅，1982，2(4)：172.)，次年徐汉坤等正式报道了本病的流行(徐汉坤，郭保发，金淮，等.血凝和血凝抑制试验在犬群暴发犬细小病毒肠炎中的应.中国畜禽传染病，1983(4)：43-45.)。犬细小病毒是引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎的病原(A fshar A..Canine Parvovirus infection-a review.Vet Bull，1981，51：605-612.)，主要危害幼犬，特别是2～6月龄犬。该病发病急，病程短，死亡率高，传染性强，对实验犬，军犬，警犬等犬群以及宠物犬均具有很大的危险性。

国外为预防与控制该病，已研制出多种商品用单苗与联苗；国内已有犬用五联苗(狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒2型病和细小病毒病)、犬用三联苗(犬瘟热、狂犬病和犬细小病毒)研制成功的报道。哈尔滨兽医研究所也研制成功犬瘟热单苗。但目前以上疫苗存在造价昂贵，抗原针对性不强等缺点，因此开发一种新型高效的CD疫苗已迫在眉睫。

发明内容

本发明目的之一是提供一株由犬细小病毒强毒株传代致弱的弱毒疫苗株。

本发明目的之二是将上述弱毒疫苗株应用于预防或治疗由犬细小病毒所致的各种疾病。

本发明目的是通过以下技术方案来实现的：

犬细小病毒强毒株的分离与鉴定：2002年冬季哈尔滨市道外区某养殖场的犬群暴发流行病，患病犬表现为呕吐，腹泻，粪便呈红色胶冻状或水样，病死率较高。剖检可见肠管膨大，肠壁上充血或出血，肠道内充满着胶冻状内容物或血水，4～6周龄幼犬剖检后可见心室扩张，怀疑为犬细小病毒感染引起的出血性肠炎和心肌炎。通过CRFK细胞分离病毒，对分离毒进行形态学观察，血凝、血凝抑制、特异性鉴定、动物回归试验及生物学鉴定，证明分离的病毒为犬细小病毒，命名为CPV-YN株。

本发明犬细小病毒弱毒株CDV-YBR的培育：将本发明分离的犬细小病毒(CPV-YN株)通过连续同步接种CRFK细胞传代至110代，在传代过程中，病毒的滴度逐渐提高，毒株越来越适应CRFK细胞。与之相反，病毒对犬的致病力随着传代次数的增加而逐渐减低；通过形态学鉴定、纯粹性检验、病毒的特异性和外源病毒检验等试验结果验证了培育的CPV-YN弱毒株(CPV-YNR)具有典型的细小病毒粒子特征，纯净无外源病毒污染。本发明将所分离的CPV-YN弱毒株(CPV-YNR)提交专利认可的机构保藏，其微生物保藏号是：CGMCCNo.3841；分类命名为：犬细小病毒；保藏时间是：2010年5月14日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明将所分离的犬细小病毒强毒株CPV-YN通过在CRFK细胞上传代，培育了CPV-YN致弱毒株(CPV-YNR)，致弱评价试验证明了致弱毒株培育成功。通过对致弱毒株病毒的形态学观察、纯净性检验、病毒的特异性和外源病毒检验等试验结果验证了本发明所培育的CPV-YN弱毒株(CPV-YNR)具有典型的细小病毒粒子特征，纯净无外源病毒污染。免疫效力试验结果表明，本发明犬细小病毒弱毒疫苗株(CPV-YNR)对同源强毒攻击的犬可以提供很好的保护力。安全性和免疫原性试验结果表明，本发明弱毒疫苗株CPV-YNR株对同源强毒攻击的犬可以提供很好的保护力。由此可见，CPV-YNR株具有良好的免疫原性，本发明弱毒疫苗株CPV-YNR可制备成单苗或联苗(活疫苗或灭活疫苗)，可有效预防或治疗犬瘟热。本发明弱毒疫苗株CPV-YNR遗传性稳定，有免疫持久、效果好、安全可靠、保存期长等优点。

附图说明

图1本发明将所分离的犬细小病毒强毒株CPV-YN的病毒电镜照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1犬细小病毒强毒分离株(CPV-YN)的分离鉴定

1材料和方法

1.1材料

1.1.1病料哈尔滨市道外区谊农综合养殖场的发病死亡犬。

1.1.2细胞CRFK(65～95代下同)，购自中国兽医药品监察所，按常规方法培养。

1.1.3试验动物选用2～4月龄幼犬(CPV抗体效价≤1∶2)，购自哈尔滨医科大学实验动物学部，经驱虫和1周观察后，确定健康备用。

1.1.4血清CPV标准阳性血清(抗体效价≥1∶16)、CPV阴性血清，由哈尔滨兽医研究所提供。

1.2分离方法

1.2.1病毒的分离5份患病犬带血粪便病料用MEM细胞营养液制成1∶9的悬液，混匀，5000r/min离心10min，取上清，0.22μm微孔滤膜过滤，置-20℃保存。

1.2.2病毒的培养处理的样品按培养液体积同步接种CRFK细胞(购自中国兽医药品监察所)，37℃静止培养，同时设正常细胞对照。每天观察细胞贴壁生长情况和细胞病变，若无CPE，则于培养的第4～5天收取上清，细胞继续按常规传代培养，至第5代仍无病变视为阴性，出现细胞病变的经-20℃冻融3次后收毒，置-20℃保存。

1.2.3病毒的鉴定

1.2.3.1电镜观察

取培养72h的CPV第五代细胞培养液作负染色，电镜观察病毒形态。

1.2.3.2耐酸性试验

取CPV第5代细胞培养物，调pH至3.0，于37℃下作用2h后，与pH为7.2的细胞培养物同时分别接种CRFK，在37℃培养96h，收获后测定其病毒含量，观察该培养物抗酸能力。

1.2.3.3耐热性试验

取CPV的第5代细胞培养物，置56℃水浴中作用不同时间，取出后分别接种CRFK，37℃培养96h，收获后测定其病毒含量，观察该培养物耐热能力。

1.2.3.4耐乙醚试验

取CPV的第5代细胞培养物，加乙醚至20％，在4℃作用24h后取出，去掉乙醚，接种CRFK，37℃培养96h，观察该培养物对乙醚的耐受能力。

1.2.3.5核酸型鉴定

将加有5-溴脱氧尿苷(BUDR)的CPV第5代细胞培养物，接种CRFK，37℃培养96h，收获后测定其病毒含量，观察两组病毒增殖情况，确定病毒核酸的类型。

1.2.3.6血凝(HA)试验

取CPV毒株第5代细胞培养物用1％猪红细胞(RBC)进行HA试验。

1.2.3.7病毒含量测定

将CPV的第5代细胞培养物作10倍系列稀释，取10^-6、10^-5、10^-4三个稀释度，分别接于6瓶CRFK悬液内，每瓶1ml。于37℃培养96h，观察CPE，按Reed-Muench法计算其病毒含量。

1.2.3.8特异性测定

将CPV第5代毒用MEM液稀释成100TCID₅₀，与等量抗犬细小病毒特异性血清混合，置37℃水浴中和1h后，同步接种CRFK，每瓶1ml，观察5d，逐日记录CPE。同时设CPV 5代毒同步接种CRFK对照。

1.2.3.9动物感染试验

将6只2～4月龄犬随机分成2组，对照组2只，实验组4只，试验组动物口服分离细胞培养病毒1ml，对照组犬口服细胞培养液1mL，每天观察临床表现，每天测体温2次，观察14d，并对死亡犬观察剖检变化。

2实验结果

2.1CPV分离与培养

接种第5代病毒的细胞，在72h左右开始出现肿胀、圆缩、凝聚成团，并在细胞核内形成圆形和椭圆形嗜酸性、大小不等的包涵体等规律性细胞病变，该分离病毒命名为CPV-YN株。

2.2CPV毒株的鉴定

2.2.1电镜观察

在培养72h的病毒培养物负染电镜标本中，可见到多数为空芯，少数为实芯、直径为20nm、呈圆形的细小病毒粒子，见图1。

2.2.2耐热性试验

CPV-YN第5代细胞培养物经56℃处理30min和60min，TCID₅₀基本无变化，说明分离的病毒具有耐热性。

2.2.3耐酸性试验

CPV-YN5培养物经pH3.0处理，TCID⁵⁰为10^5.7/0.1ml与对照无明显差别，说明分离的CPV-YN对pH3.0有一定的抵抗力。

2.2.4耐乙醚试验

经乙醚处理的试验组与未处理的对照组的TCID₅₀无明显差别，说明该分离毒对20％乙醚具有一定耐受力。

2.2.5核酸型鉴定

CPV-YN5经BUDR处理后，病毒含量为10^2.9TCID₅₀/1ml，说明BUDR使病毒增殖受到了明显抑制，表明该分离病毒是DNA病毒。

2.2.6HA试验CPV-YN5细胞培养物的HA效价为1∶256。

2.2.7病毒含量测定

测定第5代病毒培养物的病毒含量，其结果为10^6.0TCID₅₀/0.1ml。

2.2.8病毒特异性试验

中和后的CPV-YN第5代培养物接种CRFK，观察5d，细胞无CPE，对照组在90～120h出现典型的CPE。

2.2.9动物感染试验

用细胞分离病毒液感染健康犬6d后，试验组4只幼犬有2只先后发病。2只临床表现为精神不振、食欲减退、呕吐，发热，次日发病幼犬精神高度沉郁，食欲废绝，剧烈呕吐、腹泻，排出暗红色、有强烈腥臭味的粪便，严重脱水，体温稍高，第7d死亡1只。剖检病死幼犬发现；肠道粘膜出血、脱落，心脏肿大、发炎，其他器官无特征性变化。对照组2只幼犬临床上无任何异常。

3实验小结

3.1对分离毒的培养和电镜观察表明，CPV-YN株同步接种CRFK，CPE出现比较规律，即接毒后72h，细胞开始圆缩、凝集成团；在电镜下，分离毒为散在实芯和空芯、直径为20nm、圆形、无囊膜的颗粒，通过动物回归试验也证明了分离的是CPV。

3.2分离毒能凝集猪红细胞与CPV标准阳性血清呈特异性结合反应。分离毒有耐酸(pH3.0)、耐热(56℃60min)与抗乙醚的理化学特性。

3.3对爆发流行的犬细小病毒用CRFK传代表明，不同代次的分离毒，其CPE出现时间比较规律，毒价较高也比较稳定，说明分离毒株用CRFK传代，稳定性良好且毒力较强。

实施例2犬细小病毒弱毒疫苗株CPV-YNR的培育

1.1试验材料

试验动物为2～4月龄的健康犬(CPV抗体效价≤1∶2)；抗犬细小病毒特异性血清、0.2％红细胞悬液由本实验室制备，强毒为实施例1所分离的的CPV-YN 6代。

1.2CPV-YN弱毒株的培育与鉴定

1.2.1CPV-YN弱毒株的培育通过CRFK细胞传代CPV-YN至110代。

1.2.2CPV-YN弱毒株的形态学观察

将收获的CPV-YN 5、10、20、30、50、70、90、100、105、110代次病毒细胞培养物5000r/min离心30min，取上清经20000rpm超速离心，4℃离心2h，沉淀用适量的PBS(pH7.0)悬浮，磷钨酸负染电镜观察。

1.2.3CPV-YN的纯静性检验

取CPV-YN的5、10、20、30、50、70、90、100、105、110代次毒，按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行，应无细菌、霉菌和支原体污染。

1.2.4病毒含量测定

取病毒的5、10、20、30、50、70、90、100、105、110代培养物，分别做10倍递进稀释后，各取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7四个稀释度，同步接种CRFK细胞。每个稀释度接种4瓶，每瓶1ml。观察5d，记录各稀释度病变细胞瓶数，按照Reed-Muench法计算TCID₅₀。

1.2.5病毒的特异性检验

分别取CPV-YN的5、10、20、30、50、70、90、100、105、110代次毒，用MEM液稀释成100TCID₅₀/0.1ml，与等量抗犬细小病毒特异性血清混合，置37℃水浴中和1h，同步接种CRFK，每瓶1ml。观察5d，逐日记录CPE。同时设不中和的病毒对照组2瓶。

1.2.6外源病毒检验

1.2.6.1致细胞病变外源病毒的检验

分别取CPV-YN的5、10、20、30、50、70、90、100、105代次毒，将CPV-YN用MEM液稀释成100TCID₅₀/0.1ml，与等量抗犬细小病毒特异性血清混合，置37℃水浴中和1h，取2个方瓶(10ml容量)的CRFK细胞，接种中和后的病毒液1ml，在37℃下吸附1h，观察5-7d，检查是否出现由接种物引起的CPE，同时设未中和的病毒接种细胞2瓶为对照。

1.2.6.2致红细胞吸附的外源病毒检验

将上述接种中和病毒的细胞培养瓶，用PBS洗涤细胞单层3次，加入0.2％红细胞悬液，在4℃培养30min，用PBS洗涤，检查红细胞吸附情况。

1.2.7CPV-YNR株致弱评价试验

55只2～4月龄犬随机分成11组，每组5只，1～10组犬分别用CPV-YN的5、10、20、30、50、70、90、100、105、110代次毒接种，各代次病毒稀释为10^5.5TCID₅₀/1ml，1ml/犬。观察21d，记录临床症状和发病数，设对照5只犬，并接种相同剂量的灭菌生理盐水。

1.2.8CPV-YNR株免疫效力初步评价

20只2～4月龄犬随机分成A组、B组、C组和D组，A组、B组和C组均5只，D组5只作为对照，A、B、C组犬分别用CPV-YN的90、105、110代次毒接种，接种剂量为10^4.0TCID₅₀/犬，D组接种灭菌生理盐水1ml。21d后，4组犬皮下攻击同源强毒，剂量为200TCID₅₀/犬。攻毒后观察21d，记录临床保护数。

2结果

2.1CPV-YN弱毒株的培育及形态学观察

将CPV-YN的5、10、20、30、50、70、90、100、105、110代次毒细胞培养物负染电镜标本中，可见到多数为空芯，少数为实芯、直径为20nm、呈圆形的病毒颗粒，未观察到其它病毒的存在。

2.2CPV-YN的纯净性检验细菌、霉菌与支原体检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录所述方法进行，无细菌、霉菌及支原体生长。

2.3病毒含量测定CPV-YN的5、10、20、30、50、70、90、100、105、110代次毒的病毒含量。

2.4病毒的特异性检验CPV-YN的各代毒中和后接种CRFK，观察5d，细胞均无CPE；对照组2瓶细胞在90～120h出现典型的CPE。

2.5外源病毒检验

2.5.1用细胞检验结果

各代次病毒中和后接种CRFK细胞，经观察均无CPE产生，对照组细胞出现明显的CPE。

2.5.1红细胞吸附试验

各代次病毒均不能凝集鸡外周血红细胞，说明病毒液中不含能使鸡外周血红细胞凝集的其它病毒。

2.6CPV-YNR株致弱评价试验

CPV-YN毒株经CRFK传代后对犬的致病力逐渐减弱。CPV-YN第5和第10代次毒对犬的致病力均为100％，但死亡率开始出现下降，发病犬出现体温升高平均在41℃左右、鼻流清液、排稀便等临床症状；CPV-YN第20、30、50代次毒对犬的致病力由80％下降到20％，从50代开始感染犬不出现死亡。从80代开始到110代CPV-YN对犬的发病率和死亡率都降到0。对照犬均正常，见表2。

2.7CPV-YNR株免疫效力初步评价

免疫组(A、B、C组)犬在接种后21天，皮下攻同源强毒，观察21天无发病现象，也无死亡发生。而对照组(D组)犬则有100％发病，死亡率为40％。发病犬表现为体温升高平均在40℃左右、呕吐、排番茄汁样便等临床症状，详见表1。

表1CPV-YNR株免疫效力试验

3.结论

3.1CPV-YN通过在CRFK细胞上传代，培育了CPV-YN致弱毒株(CPV-YN第80代次至第110代次毒)，致弱评价试验证明了致弱毒株培育成功。

3.2通过对病毒的形态学观察、纯净性检验、病毒的特异性和外源病毒检验等试验结果验证了培育的CPV-YN弱毒株(CPV-YNR)具有典型的细小病毒粒子特征，纯净无外源病毒污染。

3.3从免疫效力试验结果可以看出，CPV-YNR株对同源强毒攻击的犬可以提供很好的保护力。由此可见，CPV-YNR株具有良好的免疫原性，可以对犬的细小病毒感染提供较好的免疫保护作用，是理想的疫苗候选毒株。

Claims

1.一株由犬细小病毒(Canine parvovirus)强毒株CPV-YN传代致弱所得到的弱毒疫苗株，其特征在于，其微生物保藏号是：CGMCC No.3841。

2.权利要求1所述的犬细小病毒弱毒疫苗株在制备预防或治疗由犬细小病毒所致疾病药物中的用途。

3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的由犬细小病毒所致疾病包括犬急性出血性胃肠炎或幼犬急性心肌炎。

4.一种预防或治疗由犬细小病毒所致疾病的疫苗组合物，其特征在于：由权利要求1所述的有效量的犬细小病毒弱毒疫苗株和药学上可接受的载体或辅料组成。

5.按照权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于：所述的由犬细小病毒所致疾病包括犬急性出血性胃肠炎或幼犬急性心肌炎。