CN106011084B - 猪流行性腹泻病毒地方变异株及其应用 - Google Patents

猪流行性腹泻病毒地方变异株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种猪流行性腹泻病毒地方变异株及其应用。该猪流行性腹泻病毒地方变异株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株，保藏号为CCTCC NO：V201624。该毒株可应用于猪流行性腹泻病毒灭活疫苗、弱毒疫苗，亚单位疫苗、或多品种菌和/或毒的联合疫苗开发及在检测诊断中的应用。

Description

猪流行性腹泻病毒地方变异株及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及猪流行性腹泻病毒地方变异株及其应用。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是引起猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)的主要病原，该病是一种高度接触性肠道传染病，临床特征主要表现为呕吐、水样腹泻、脱水，不同生长阶段的猪均易感，尤其对哺乳仔猪影响较大、致死率最高可达100％，给养猪业造成了巨大的经济损失。猪流行性腹泻于1971年在英国的架子猪和育肥猪中首次流行，1978年，PED的病原在英国和比利时首次得到鉴定。此后，除美洲外，欧洲多个国家和地区均有PED的报道。20世纪80年代和90年代，PED在欧洲的流行逐渐减少，相反，在亚洲呈爆发流行，包括中国、日本、韩国、泰国等国均爆发过此病。我国自1995年开始使用二联灭活苗或弱毒苗进行PED的预防，但是从2006年开始免疫过的猪场依旧爆发PED，尤其从2010年起，我国多个省份报道了PED的流行和爆发，并引起仔猪大量死亡。2013年，美国也报道PED流行和爆发。目前，PED已然成为规模化养猪场腹泻病的主要疫病之一，开展PEDV的研究刻不容缓。
PEDV基因组是具有浸染性的的单股正链RNA病毒，全长约28kb，与其他冠状病毒相似，其基因组在胞浆中复制，病毒粒子也在胞浆中成熟。PEDV mRNA 5'端有一个帽子结构(cap)，3'端有一个Poly(A)尾。PEDV至少含有7个开放阅读框，编码4种结构蛋白以及3种非结构蛋白，从5'端至3'端依次为5'-replicase-(1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3'。研究表明，猪流行性腹泻病毒的纤突蛋白(Spike，S蛋白)由S基因编码，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，是位于病毒粒子表面的主要结构蛋白，约由1383个氨基酸组成，预测分子量为180kD-220kD。S蛋白从N端到C端有三个结构域，分别是大的胞外结构域、跨膜结构域、小的胞内结构域，其中胞外结构域可介导机体产生中和抗体、同时作为受体结合域与宿主细胞表面大分子结合；胞内结构域主要负责对整个S蛋白的固定。S蛋白不仅具有良好的免疫原性，而且在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程起着重要作用。因此，PEDV S基因也常用作其的遗传演化分析的靶基因。
目前，猪流行性腹泻病的防控常采用返饲、自己苗或含CV777毒株的商品化疫苗等措施，但效果不一。因此，开发含有流行株猪流行性腹泻病毒抗原、且免疫效果好的疫苗成为当前该病防控的首要任务。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种高滴度的地方猪流行性腹泻病毒变异株及其应用。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种猪流行性腹泻病毒地方变异株，该腹泻病毒变异株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为猪流行性腹泻病毒ZJ 15XS0101株((Porcine Epidemic DiarrheaVirus strain ZJ 15XS0101，以下简称PEDV)，保藏号为CCTCC NO：V201624。
根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒地方变异株，其特征在于，该病毒基因组长为28067nt，从5’端到3’端依次为5’-UTR、ORF1ab、S、ORF3、E、M、N和3’-UTR，其中，ORF1ab、S、ORF3、E、M和N基因分别编码6795、1386、224、76、226和441个氨基酸。
猪流行性腹泻病毒ZJ 15XS0101株的全基因组序列如SEQ ID NO:1所示；其5’-UTR核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，ORF 1ab基因氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，S基因氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，ORF 3基因氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，E基因氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，M基因氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，N基因氨基酸序列如SEQ IDNO：8所示，3’-UTR核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
本发明还提供了所述猪流行性腹泻病毒地方变异株在制备猪流行性腹泻病毒灭活疫苗、弱毒疫苗，亚单位疫苗中的应用，或者是在多品种菌和/或毒的联合疫苗的开发中的应用；以及所述疫苗在检测诊断中的应用。
上述腹泻病毒变异株PEDV ZJ15XS0101分离自浙江萧山某一发病猪场1日龄仔猪的小肠组织。与现有疫苗毒株CV777相比，在S基因上存在着氨基酸的插入和突变，遗传进化分析显示两者位于不同的基因群。PEDV ZJ15XS0101感染Vero细胞后9小时，即可产生细胞病变，12-16小时可见细胞圆缩、拉网、脱落和核胞体等病变。该病毒可在Vero细胞中稳定地连续传代、高效增殖，第16代的病毒滴度可达107.5半数组织培养感染剂量(TCID50)。在Vero细胞上连续传35代其S基因亦稳定。该毒株对3日龄仔猪具有较强的致病性，仔猪给予1000TCID50后，48小时内引起仔猪100％腹泻，以及在96小时内可致试验猪80％以上的死亡。以此毒株为抗原制备的灭活疫苗免疫母猪， 诱导母猪产生高效价抗体滴度、且维持时间长，诱导的抗体可提供免疫母猪所产仔猪的被动免疫保护。
具体的处理步骤包括：
(1)PEDV临床阳性样本采集及其全基因测序和分析；
(2)利用步骤(1)采集的阳性样本，组织匀浆后加入胰酶过滤，收获的滤液感染Vero细胞(第一次感染细胞后收获的病毒液标记为PEDV ZJ15XS0101-P1代，以此类推为PEDV ZJ15XS0101-P2……PEDV ZJ15XS0101-Pn)；
(3)利用步骤(2)收获的P1代次的病毒液进行连续2次挑斑纯化，经过2次纯化后的病毒进行鉴定；
(4)对步骤(3)鉴定正确的病毒继续在Vero E6细胞上进行传代，并对不同代次的ZJ15XS0101进行细胞病变观察、病毒滴度测定、外源微生物检测以及S基因克隆分析；
(5)利用步骤(4)获得的P16代次病毒，取1000TCID50进行3日龄检测合格的仔猪攻毒，以观察其致病性；
(6)利用步骤(4)获得病毒液，用灭活剂灭活后进行母猪产前免疫，免疫后用ELISA检测母猪中的抗体水平，同时对其所产仔猪利用步骤(5)建立的方法进行攻毒，以观察该毒株诱导抗体能力及被动免疫保护效果。
本发明中，在步骤(1)和(4)中PEDV ZJ15XS0101株病毒基因片段扩增时，利用RT-PCR方法和下述特异性引物：
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
该毒株可应用于猪流行性腹泻病毒灭活疫苗、弱毒疫苗，亚单位疫苗、或多品种菌和/或毒的联合疫苗开发及在检测诊断中的应用。
附图说明
图1PEDV-ZJ15XS0101-P1和P10感染Vero细胞病变。
图2病毒空斑试验。
图3PEDV ZJ15XS0101分离株病毒液的Western Blot分析。
图4PEDV ZJ15XS0101分离株的IFA检测。
图5PEDV ZJ15XS0101P10透射电镜观察。
图6PEDV ZJ15XS0101感染vero细胞后不同时间细胞病变。
图7不同感染(收获)时间对病毒TCID50(A)和RNA拷贝数(B)的影响。
图8冻融次数对病毒TCID50(A)和RNA拷贝数(B)的影响。
图9PEDV ZJ15XS0101不同代次、不同接种比、不同吸附时间对病毒TCID50和RNA拷贝数的影响.A、C和B、D分别为P15和P25代次病毒；1:25和1:50分别为200μL和100μL的病毒液接种于25cm2细胞培养瓶后加入终体积为5mL培养液。
图10攻毒组仔猪和空白对照组仔猪组织病理学观察和免疫组化分析。
图11粪样和/或呕吐物病毒分离结果。
具体实施方式
毒株说明：
本发明通过分离鉴定获得了猪流行性腹泻病毒地方变异株，该病毒变异株保藏于中国典型培养物保藏中心，该中心的地址为中国武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。提供保藏的生物材料(株)为猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株，保藏名称为猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株(Porcine Epidemic Diarrhea Virus strain ZJ 15XS0101)，保藏号为CCTCC NO：V201624，保藏日期为2016年5月20日。
实施例1：猪流行性腹泻病毒临床株(PEDV ZJ15XS0101)分离纯化鉴定
1.1病料来源
病料来源于2015年1月浙江省萧山某一发病猪场，母猪规模1300头，1日龄发病哺乳仔猪表现为呕吐，而后出现腹泻、脱水和死亡等临床症状，小于7日龄仔猪的平均发病率为48％，平均死亡率为60％。剖检可见小肠、肠系膜和肠系膜淋巴结出血，肠管气胀、变薄等病变。研究采集1日龄发病哺乳仔猪小肠组织用于病毒分离。
1.2病毒分离
过滤的组织悬液感染Vero细胞后，第一代病毒于26h左右出现细胞圆缩、脱落及合胞体(图1)。随着病毒传代次数的增加，第10代病毒液感染细胞，于11h出现细胞病变，表现为细胞圆缩、脱落及合胞体(图1)。
1.3PEDV流行株挑斑纯化
图2为空斑的观察结果。结果显示，ZJ15XS0101-P2代在培养30h后出现的空斑。重复2次挑斑纯化，获得ZJ15XS0101-P5代次病毒100μL，将获得的病毒液转接于12-well板逐步进行扩大培养。
1.4PEDV临床分离株不同代次病毒拷贝数检测
PEDV ZJ15XS0101分离株P1、P10、P12、P14和P16代次qPCR检测结果见表1。结果显示，标准曲线的扩增效率为103.5％，斜率为3.324，R2＝0.976。不同代次PEDV平均RNA拷贝数维持在较高水平(>7.98Log10/μL)，且相对稳定。
表1不同代次PEDV ZJ15XS0101分离株RNA拷贝数、病毒滴度和外源微生物检测
1.5PEDV临床分离株WB分析
PEDV ZJ15XS010P1和P10代次病毒液的WB分析结果见图3。结果显示，PEDVZJ15XS010P1和P10代次病毒液在预测的55-70kDa处可见与抗PEDV N单抗(mAb-N)反应的特异性条带，而阴性(Neg-Ab)单抗则无条带。
1.6PEDV临床分离株IFA分析
PEDV ZJ15XS010P10代病毒液感染Vero细胞14h后IFA检测结果见图4。结果显示，经DAPI染色后可见明显的合胞体，而且在胞浆中有特异的红色荧光。
1.7PEDV ZJ15XS010P10电镜观察
收获PEDV ZJ15XS010P10感染9h的Vero细胞后，透射电镜观察结果见图5。结果显示，视野中存在与冠状病毒相似的病毒粒子，病毒呈球形或多形性，大小为80-120nm，包含囊膜、病毒表面为20nm球棒状的“刺突”蛋白。
1.8PEDV-ZJ15XS0101S基因序列分析
PEDV-ZJ15XS0101S基因均为4161bp，编码1387个氨基酸，其全基因组序列如SEQID NO:1所示。与GenBank中参考毒株氨基酸核苷酸和氨基酸的相似性分别为93.8％-99.8％和92.1％-99.9％。这些毒株的S基因与参考毒株相比，除了存在点突变，还存在插入、缺失和重组现象，选取其中变异性较大的S1序列与经典毒株CV777、SM98、attDR13、virDR13进行比对，发现以下碱基变化，在第58位至61位插入NQGV、在136位插入N、在225位碱基由E突变为Q等。
1.9PEDV S基因的遗传进化分析
基于PEDV S基因的PEDV ZJ15XS0101分离株及参考株遗传进化分析显示，PEDV可分为2群(Group I和Group II)，两个群分别又可以分为Group I a和Group I b以及GroupII a和Group II b两个亚群。其中Group I a亚群包含了CV777、SM98和DR13等疫苗株，在Group I b亚群中除了KNU 1406(2014South Korea)、15V010-BEL-2015(2015Belguim)和CH-STC-12(2014China)外，其余均为2011年以前获得的PEDV毒株；在Group II a亚群中包含了3个韩国的毒株和1个中国的分离株，绝大部2010年以后的PEDV ZJ15XS0101分离株均位于Group II b亚群，也包括了2013年以后分离的10个浙江及1株上海分离株。
实施例2：PEDV ZJ15XS0101生长特性研究
2.1不同收获时间对PEDV滴度和RNA拷贝数的影响
PEDV ZJ15XS0101P16感染vero细胞后，不同感染时间细胞病变(图6)以及收获时间的病毒滴度和RNA拷贝数(图7)。结果显示，PEDV ZJ15XS0101P16感染后10.5h，Vero细胞即出现大面积的膜融合现象，14.5h时，细胞空泡化明显，19.5h细胞基本全部脱落。经检测，感染后14.5h收获的病毒液具有较高的病毒滴度；与10.5h、 19.5h和23.5h收获病毒液的病毒滴度相比，14.5h收获病毒液的平均lg10TCID50分别高出0.33、0.32和0.49，但差异不显著(P>0.05)(图7，A)；PEDV RNA拷贝数也是14.5h时高，与23.5h相比，差异极显著(P<0.01)，但与10.5h和19.5h之间差异不显著(P>0.05)(图7，B)。
2.2冻融对PEDV滴度和RNA拷贝数的影响
反复冻融对PEDV滴度和RNA拷贝数的影响见图8。结果显示，1次冻融收获后的病毒液lg10TCID50与2次、3次和次反复冻融相比，分别高0.55、0.33和0.44，但差异不显著(P>0.05)(图8，A)；然而，RNA拷贝数以2次冻融后的最高，但与其他组的值差异不显著(P>0.05)(图8，B)。
2.3PEDV ZJ15XS0101不同代次、吸附时间和接种比例的吸附效率
PEDV ZJ15XS0101不同代次、吸附时间和接种比例的吸附效率见图9(接种前的病毒核酸拷贝数设为1)。结果显示，不同代次PEDV ZJ15XS0101株均可吸附于vero细胞，在1:25接种比例条件下，P15代次病毒吸附效率高于P25代次，但差异不显著，相反，在1:50接种比例下，P25代次要高于P15代次，为疫苗毒株在规模化生产提供了方便。不同吸附时间对病毒的吸附效率具有一定的影响，在1:50接种条件下，高代次(P25)4小时吸附与1小时吸附差异显著(P<0.05)。
实施例3：PEDV ZJ15XS0101不同代次遗传稳定性研究
3.1不同代次PEDV ZJ15XS0101全序列分析
PEDV ZJ15XS0101经vero细胞连续传代，第16代次和第32代次病毒进行基因组全序列与第1代次比较结果见表2。结果显示，3个代次病毒全基因组的核苷酸和氨基酸序列的相似性达到99.99％。
表2不同代次ZJ15XS0101核苷酸和氨基酸差异
实施例4：PEDV ZJ15XS0101株致病性及其最小攻毒剂量研究
4.1PEDV ZJ15XS0101F16代次不同剂量攻毒后仔猪临床表现
表3为试验各组仔猪临床症状及其统计结果。结果显示，高剂量组仔猪在攻毒后20h 80％(4/5)表现为腹泻，其中1头(2#仔猪)伴随呕吐症状(在其后的观察中，仅在第84h时有1头仔猪表现为呕吐外，其余均无呕吐现象)；24h时腹泻率达到100％，并以水样腹泻为主(4/5)；36h时全部仔猪呈现水样腹泻；在攻毒后76h时，1头死亡，96h时仔猪死亡率100％，并集中在89-96h之间死亡(4/5)。
中剂量组仔猪在攻毒后，24h时，有3头仔猪食欲下降、2头停食，无呕吐现象，4头表现为腹泻，其中的2头为水样腹泻；36h时，100％试验仔猪表现为腹泻，无呕吐现象；64h时，1头仔猪表现呕吐；在攻毒后72h时，1头死亡，92-144h之间死亡4头(4/5)。
低剂量组仔猪在攻毒后24h时，全部仔猪食欲下降，1头仔猪表现为腹泻；32h时，有2头表现为水样腹泻；48h时，全部仔猪呈现水样腹泻症状，其间1头(11#)伴有呕吐；攻毒后第136h和144h分别死亡1头，160h和164h分别死亡1头，但至试验结束(第7d)仍有1头仔猪存活。
空白对照组于均正常。
表3 PEDV ZJ15XS0101-P16代攻毒后仔猪临床症状统计a
a，统计结果以天(24h)为单元，每天观察6次，每个统计单位中任何次观察结果表现出相应的临床症状即为该次统计单元的临床症状；b，死亡率统计采用累加；c，其中1头死亡；d，96h，仔猪全部死亡；e，72h，1头仔猪死亡；f，96h死亡2头；g，136h和144h分别死亡1头；h，136h和144h分别死亡1头；i，160h和164h分别死亡1头。
4.2仔猪组织病理学观察
攻毒组死亡仔猪和空白对照组仔猪组织病理学观察和免疫组化分析见图10(“→”表示免疫组化阳性)。结果显示，攻毒组仔回肠肠壁变薄，小肠绒毛稀疏，较短，粘膜层变薄，隐窝较浅，局部可见小肠上皮细胞脱落坏死；空肠肠壁变薄，小肠绒毛稀疏，较短，粘膜层变薄，隐窝较浅，局部可见小肠上皮细胞脱落坏死；十二指肠粘膜结构不完整，细胞界限不清晰，小肠绒毛较钝，隐窝较浅；肠系膜淋巴结有淋巴细胞脱落坏死、淋巴细胞密度稍有减少；空白对照组观察各组织未见异常。
免疫组化分析显示，空白对照组均为阴性。然而，攻毒组仔猪攻毒组回肠免疫阳性反应细胞数量较多，三五成群或散在分布于粘膜上皮和固有层中，着色较深，免疫反应产物也见弥散分布于小皮细胞表面和细胞间隙结缔组织中；空肠肠壁偏薄，绒毛钝而短，隐窝浅，小肠绒毛固有层粘膜上皮可见三五成群的阳性细胞分布，阳性细胞在小肠绒毛顶部分布较多。十二指肠小肠绒毛固有层可见较多的棕黄色阳性细胞和粘膜上皮中散在分布或三五成群的阳性小肠上皮细胞，阳性反应产物呈棕黄色，主要位于阳性细胞的胞质中，胞核着色较浅；肠系膜淋巴结有少量淋巴细胞脱落坏死，有少量淋巴细胞免疫组织化学染色阳性。
4.3试验仔猪肛式子中病毒含量检测
PEDV攻毒后仔猪肛式子中PEDV RNA拷贝数见表4。结果显示，所有试验仔猪在第0天时均为阴性。不同剂量攻毒组攻毒后第1天即可检测到病毒，直至试验结束。经统计学分析，仅在第1天时，高剂量攻毒组仔猪肛拭子中PEDV RNA拷贝数(lg10copies/μL)(8.61±0.029)与中剂量(7.66±0.428)、低剂量组(5.60±3.441)之间的差异极显著(P<0.01)，中剂量与低剂量组之间的差异显著(P<0.05)。
表4 PEDV攻毒后仔猪肛拭子中PEDV RNA拷贝数(lg10copies/μL)
*,ND means no detected.&，NA means no assay.
4.4高剂量攻毒组仔猪组织脏器中病毒含量检测
高剂量攻毒组仔猪组织中PEDV RNA拷贝数见表5。结果显示，PEDV在不同脏器中分布存在一定的差异，RNA拷贝数的几何均数依次为空肠>十二指肠>回肠>肠系膜淋巴结>肾脏>胃>肺门淋巴结。
表5中剂量试验组仔组织中PEDV RNA拷贝数(lg10copies/μL)
4.5病毒分离和检测
采集的粪样进行病毒分离第一次盲传后，于30h左右可见细胞圆缩，形成合胞体，细胞出现拉网、脱落等(图11)，盲传的病毒液Taq-man检测均为阳性。
实施例5：基于PEDV ZJ15XS0101毒株的灭活疫苗免疫效果观察
5.1抗原制备
将ZJ15XS0101-P29代病毒液混合，测定TCID50和外源微生物检测。检测合格后加入0.4％甲醛(v/v 37％)，37℃灭活24h，灭活后进行灭活检验：取灭活的病毒液0.5ml，接种于25cm2的细胞培养瓶Vero细胞培养瓶，37℃吸附1h，补液至10mL。放置5％CO2培养箱培养96小时，收获细胞及培养液，冻融3次，作为盲传的接种物。盲传2代，不应出现细胞病变。
5.2ZJ15XS0101灭活疫苗制备
将灭活检验合格的病毒液与等量的含量为20％的灭菌氢氧化铝胶盐水稀释液均匀混合，在室温下沉淀24h，吸出2/5上清液，即按全量浓缩至3/5，加入终含量为1/1.5万-1/3万硫柳汞溶液，充分混合，即为制成PEDV ZJ15XS0101毒株的灭活疫苗。
5.3PEDV ZJ15XS0101氢氧化铝胶灭活疫苗免疫后母猪血清抗体的转化
母猪于产前28天和14天经PEDV ZJ15XS0101氢氧化铝胶灭活疫苗两次免疫后，血清中抗PEDV-IgG抗体ELISA检测结果见表6。结果显示，母猪在免疫后第0天、28天和56天时，血清中抗PEDV-IgG抗体的S/P值分别为1.33±0.273、5.58±0.17和5.00±0.68，免疫第28天后抗体滴度的离散度为7.48％。说明PEDV ZJ15XS0101氢氧化铝胶灭活疫苗可以诱导特异性的抗体产生，不仅效价高、而且产生抗体的滴度较为一致。
表6免疫后母猪血清中抗PEDV-IgG抗体的变化(S/P)
5.4仔猪血清抗体检测
PEDV ZJ15XS0101氢氧化铝胶灭活疫苗免疫母猪后，其所产仔猪血清中抗PEDV-IgG抗体ELISA检测结果显示，5头3日龄仔猪血清中抗PEDV-IgG抗体的S/P值分别为6.44、6.30、6.22、6.46和5.95。结果说明，母源抗体可以通过初乳提供仔猪的保护。
5.5血清和初乳体外中和效果
采用固定病毒-稀释血清体外中和试验，对收集PEDV ZJ15XS0101氢氧化铝胶灭活疫苗免疫母猪后第28天的血清和初乳分别中和价测定，经Reed-Muench法计算，灭活疫苗可诱导血清和初乳的中和抗体产生，且中和价较高(表7)。
表7母猪免疫后28天血清和初乳体外中和价
5.6仔猪攻毒保护试验
选取上述1头经PEDV ZJ15XS0101氢氧化铝胶灭活疫苗免疫的母猪，对其所产仔猪48h进行1mL(含103TCID50)PEDV 15ZJXS0101P16口服攻毒。在攻毒前、后仔猪采用自由吮吸母乳。经7天观察，5头仔猪无腹泻、呕吐和死亡，全部存活。攻毒后2天的仔猪肛拭子经荧光定量PCR检测，PEDV 15ZJXS0101检测为阴性。

Claims (3)

1.一种猪流行性腹泻病毒地方变异株，其特征在于，该猪流行性腹泻病毒地方变异株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为猪流行性腹泻病毒 ZJ15XS0101株，保藏号为CCTCC NO：V201624。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒地方变异株，其特征在于，该病毒基因组长为28067 nt，从5’端到3’端依次为5’-UTR、ORF1ab、S、ORF3、E、M、N和3’-UTR，其中，ORF1ab、S、ORF3、E、M和N基因分别编码6795、1386、224、76、226和441个氨基酸，其全基因组序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1所述猪流行性腹泻病毒地方变异株在制备猪流行性腹泻病毒灭活疫苗、弱毒疫苗、亚单位疫苗中的应用。
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